JPS5837834B2

JPS5837834B2 - 新規リポプロテイン・リパ−ゼ

Info

Publication number: JPS5837834B2
Application number: JP14317276A
Authority: JP
Inventors: 治寺田; 和夫相阪
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1976-11-29
Filing date: 1976-11-29
Publication date: 1983-08-18
Also published as: JPS5369878A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は微生物にょろりポプロテイン・リパーゼの製造
法に関する。

さらに詳しくは、本発明はりゾープス属に属し、リポプ
ロテイン・リパーゼ生産性を有する微生物を栄養培地に
培養し、リボプロテイン・リパーゼを培養液中に蓄積せ
しめ、該培養液からこれを採取することを特徴とするリ
ポプロテイン・リパーゼの製造法に関する。

その目的とするところは、優れた活性を有するリポプロ
テイン・リパーゼを工業的安価に製造する方法を提供す
るにある。

従来、リポプロテイン・リパーゼ（以下ＬＰＬと略記す
る）は動物および微生物起源のものが知られている。

たとえば動物起源のものとしては種種の動物のヘパリン
静注血漿中にＬＰＬが存在することが古くから知られて
いる。

微生物起源のものとしては特公昭４１−７８３６号公報
ニシュードモナス属、ムコール属、ストレプトミセス属
、セラチア属、エアロモナス属およびバチルス属に属す
る微生物を培養して得られるＬＰＬ、またＡｇｒ１Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ１Ｖｏｌ３３、／Ｉ６．３、ｐ，４
１４〜４２３、１９６９にムコール・ジャバニクスに属
する微生物を培養して得られるＬＰＬの報告がある。

ＬＰＬは人体におげるリポ蛋白質の定量に用いられる
ことはよく知られており、優れた活性を有するＬＰＬ
を安価に工業的に製造する方法を提供することが望まれ
ている。

本発明者らは工業的に安価にＬＰＬを製造する方法につ
いて研究を重ねた結果、リゾープス属に属する微生物を
培養したときに培養液中に優れた性質を有するＬＰＬが
著量に生産されることを見出し本発明を完成するに到っ
た。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明によればリゾープス属に属しＬＰＬの生産能を
有する微生物を培養することにより培養液中に著量のＬ
ＰＬが生産されるので、これを採取する。

本発明に用いるリゾープス属に属する微生物はＬＰＬを
培養液中に生或せしめることができるものであればいか
なる菌株をも用いることができる。

具体的に好適な菌株の一例としては、たとえば次のごと
きものが挙げられる。

（１）リゾープス・ヤボニカスＫＹ″５２１微工研菌寄
第３６５１号（２）リゾープス・カンショＫＹ５２７微工研菌
寄第３６５２号（３）リゾープス・ノドサスＫＹ５３３微工研菌
寄第３６５３号これらの菌種の菌学的性質についてはＪ，Ｇｅｎ，Ａｐ
ｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１．、Ｓｕｐｐ
ｌ，１９６５に記載がある。

本発明で使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物
その他の栄養素を程よく含有する培地ならば合成培地ま
たは天然培地のいずれも使用可能である。

炭素源としてはグルコース、ガラクトース、マンノース
、フラクトース、シュクロース、トレノ）ロース、ラク
トース、セロビオース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉、
澱粉加水分解物などの糖類、グリセリン、ソルビトール
、マンニトールなどの糖アルコール類、酢酸、グルコン
酸、コハク酸、ギ酸、クエン酸、フマール酸、乳酸、ピ
ルビン酸などの有機酸類、メタノール、エタノールなど
のアルコール類などが使用できる。

窒素源としてはアンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
燐酸アンモニウムなどの各種有機および無機のアンモニ
ウム化合物、尿素などの窒素化合物、ペプトン、酵母エ
キス、カゼイン加水分解物、脱脂大豆あるいはその消化
物などの窒素性有機物質などが使用できる。

無機物としてはナトリウム、カリウム、マンガン、マグ
ネシウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、亜鉛、銅
などの金属の塩類、クロム、硫酸、燐酸、硝酸、塩酸な
どの塩類が使用できる。

本発明においては酵素の誘導物質として大豆レシチン、
卵レシチンなどのレシチン類、レシチンを含有する天然
物たとえば大豆抽出物を培地に添加すればより大量のＬ
ＰＬを生成せしめることができる。

これら添加物の添加は培養当初からでも培養途中に行っ
てもよい。

添加量としてはレシチンとして０．１〜０．５９７
ｄｌの割合で添加すれば良い結果が得られる。

培養温度は通常２０〜４０℃の範囲で、好適には２８〜
３３℃の範囲で行われる。

培養時のｐＨは通常５．０〜８．０の範囲で、好適には
５．５〜７．０の範囲で行われる。

このような条件下で２０〜４０時間培養すれば培養液中
にＬＰＬが著量生成する。

かくして培養液中に生成七たＬＰＬは次のごとき方法で
採取される。

培養液からｒ過法あるいは遠心分離法によって菌株を除
き、沢液あるいは上清をフラッシュ・エバポレーターな
どを用いる減圧濃縮法によって約１／４容まで濃縮する
。

濃縮液に硫酸アンモニウム、アセトン、エタノールなど
を添加することによって沈殿物を得る。

硫酸アンモニウムを使用する場合は７０％（ｗ／ｖ）飽
和で沈殿する部分を採取する。

アセトン、エタノールを用いるときはそれぞれ８０％（
■／ｖ）になるように加えて沈殿する部分を採取する。

得られた沈殿物を透析あるいはゲルｐ過の処理を行うこ
とによって沈殿物に含まれる塩類を除去する。

透析操作において用いる透析膜はセロファン膜、膀胱膜
、コロジオン膜などがあげられる。

透析液としては０．ＯＩＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）を
用いるのがよい。

ゲル沢過の操作においてはセファデツクスＧ−２５ある
いはセファデツクスＧ−５０、０．ＯＩＭ燐酸緩衝液（
ｐＨ６．５）を用いるとよい。

ついで塩類を除去した処理液のｐＨを塩酸で４．０に下
げ、１０分間放置し、生ずる沈殿を遠心分離で除去し、
上清液を得る。

この上清液にエタノール、アセトンなどの溶剤を添加す
ることにより沈殿物を得る。

これらの溶剤の８０％（ｖ／ｖ）で沈殿する部分を採取
する。

得られた沈殿物を０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．
５）に溶解し上記と同様の方法で透析後、透析液を０
．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化して
おいた力ラム・ライトｆ硅酸アルミン酸マグネシウム〔
Ａｌ２０３、ＭｇＯ、２Ｓｉ０２、ＸＨ２０（Ｘ＝約
４）〕の商品名、富士化学工業社製｝のカラムに通塔す
る。

さらに０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）を通塔する
。

この段階で不純な蛋白質は流出して《る。

次に０．（Ｉ）ＩＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）から１５
％硫酸アンモニウムを含む０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）まで濃度勾配液で溶出を行う。

得られる溶出液を一定量ずつの両分に分画し、各画分中
に含まれるＬＰＬの活性を後で述べる方法で測定して
ＬＰＬ活性のある画分を取出す。

活性画分を集めて硫酸アンモニウムを７０％飽和濃度に
なるように加え、生ずる沈殿を遠心分離法によって集め
、沈殿を０．０１Ｍ燐酸アンモニウム（ｐＨ６．５）で
透析して透析内液を凍結乾燥する。

かくしてＬＰＬの精製酵素粉末を得ることができる。

ＬＰＬの酵素活性は人エリポプロテインを基質として反
応した場合生成するグリセロールをクロモトローブ酸法
で定量することによって算出する。

すなわち、オリーブ油１２を８．９ｒｎｌの３％ポ
リビニールアルコール水溶液に入れ、ウエイビング・ブ
レンダー〔具体的にはユニバーサルホモゲナイザー（日
本精密機械社製）を使用〕を用いて１０分間ホモゲナイ
ズする。

このときの温度は１０℃以下にするとよい。

かくして得られるオリーブ油エマルジョン０．２ｒｒＬ
ｌと仔牛血清９．８ｒｎｌを３７℃、３０分間イン
キュベートすることにより人エリボプロテインを調製し
、これを基質とする。

該基質０，５ｒＩ′Ｌｌ、０．２５Ｍアンモニウム緩衝
液（ｐＨ８．３）０．２ｒｒＬｌ，水０．２−
および酵素液０．１ｒｎｌを混合し、３７℃、１０
分間インキユベートした後、１０％トリクロール酢酸２
ｍｌを加え、よく攪拌した後、３０分間室温に放置する
。

この処理液を遠心分離して上清液を得る。

その上清液ｏ，２ｒｕｌに０．１Ｍ過沃素酸ナトリ
ウム溶液０．１ｒｒＬｌを加え、５分間放置後、１０％
亜硫酸水素ナトリウム溶液０．５ｒｆＬｌを加え、
１０分間放置する。

この処理液にさらに１％クロモトローブ酸の濃硫酸溶液
５ｒＩｌｌを加え、攪拌後１ｏｏ℃にて３０分間加温す
る。

この処理液に１ｏ分間水冷後４．６％チオ尿素溶液ｏ、
５ｒＩＬｌを加え、攪拌後光電比色計で５７０ｍμの吸
収値を読む。

対照として１００℃、５分間加熱処理して得た酵素液を
用いて同様の操作を行ない同じ《５７０肌μでの吸収値
を求める。

グリセロール濃度と５７０ｍμにおける吸収値との検量
線を求めておき、酵素液を処理して得られた吸収値から
対照酵素液を処理して得られた値を差し引いた値からグ
リセロールの量を求める。

このグリセロール量は酵素処理によって生成したグリセ
ロール量に相当するから、これをもとにして試料中の酵
素力価を算出する。

酵素活性の表示は、ｐＨ８．３、３７℃、１分間の処理
で１μｍｏｌｅのグリセロールを生或せしめる酵素量を
１単位として行なう。

本発明によって得られるＬＰＬの埋化学的性質を次に述
べる。

■．作用本酵素はオリーブ油、大豆油などのエマルジョンと仔牛
血清とをインキユベートして調製した人エリポプロテイ
ンを、エステル結合に対して位置特異性を示すことなく
完全に脂肪酸とグリ七ロールまでに分解する。

また人血清、仔牛血清中の天然リポプロテインも同様に
完全に分解する。

さらに単なるオリーブ油を分解するというリパーゼ活性
をも有している。

尚、本酵素がエステル結合に対して位置特異性を示すこ
となくリポプロテインを完全に脂肪酸とグリセロールま
でに分解することは次の実験結果から証明された。

実験例基質人エリポプロテイン０．５ｄ，０．２５Ｍアンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ８．３）０．２ｒｒｔｌ、酵
素液（１．７単位／ｒｎｌ）０．３ｒｎｌを混
合し、３７℃で反応を行い、経時的に５ｒｒＬｌのエチ
ルエーテルを添加して反応を停止させるとともに、脂質
の抽出を行った。

抽出液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後
、エーテル層を分取し減圧濃縮した。

濃縮液を薄層クロマトプレート（メルク社製、シリカゲ
ル６０Ｆ２５４，０．２５ｍｍ）にスポッ
トし、リグロイン：エチルエーテル：酢酸（７０：３０
：１）の溶媒を用いて約１時間室温で展開を行う。

展開終了後、薄層クロマトプレートをよく風乾したのち
、５０％（Ｗ／Ｖ）硫酸を噴霧し、１５０℃、２
０分間加熱する。

かくして展開された脂質部分がプレート上に着色スポッ
トとして検出される。

この結果、酵素処理後１時間以内にトリグリセライド部
分のスポットが完全に消失すること、トリグリセライド
の分解過程において、グイグリセライド、モノグリセラ
イドの蓄積が認められないことがわかった。

このことより、本酵素はトリグリセライドの３個のエス
テル結合をそれぞれのエステル結合に対して位置特異性
を示すことなく完全に分解するものと考えられる。

２．基質特異性本酵素はオリーブ油のような天然油脂および炭素数８以
上の長鎖脂肪酸よりなるトリグリセライドたとえばトリ
カプリリン、トリ力プリン、トリオレインなどにも作用
しうるが、トリアセチン、トリプチン、トリカプロイン
などの短鎖脂肪酸よりなるトリグリセライドは分解でき
なかった。

本酵素を下表の基質を用い、ｐＨ８．３、３７℃で１０
分間酵素処理したとき得られる比活性を下表に示す。

３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲本酵素の至適ｐＨは、３７℃、１０分間の反応でｐＨ７
．５〜８．５付近にある。

本酵素の安定ｐＨ領域は４０℃、２時間の処理でｐＨ６
．０から７．０の間にある。

４．作用適温の範囲本酵素の最適温度はｐＨ８．３、１０分間の反応におい
て３７℃付近にある。

５．ｐＨ、温度などによる失活条件本酵素はｐＨ６．５、７分間の処理で４５℃まで安定、
５０℃で３５％程度失活する。

６．阻害、活性化および安定化（ａ）ＮａＣｌ、プロタミン硫酸の影響酵素反応液に下表に示した濃度のＮａＣｌまたはプロタ
ミン硫酸を加える以外は上記酵素活性の測定法と同様に
行って下表に示すごとき比活性を得た。

動物起源のＬＰＬと同様、本酵素はＮａＣＬプロタミ
ン硫酸により活性が阻害される。

（ｂ）金属イオン、金属キレート剤の影響酵素反応
液に下表に示した濃度の金属イオンまたは金属キレート
剤１ｒｒＬＭを加える以外は上記酵素活性の測定法と同
様に行って下表に示すごとき比活性を得た。

本酵素活性はＦｅ＋イオンによって顕著に阻害された。

またＥＤＴＡのような金属キレート剤によっては活性の
阻害は認められなかった。

（ｃ）ＳＨ試薬の影響酵素反応液に下表に示した濃度のＳＨ保護剤またはＳＨ
阻害剤を加える以外は上記酵素活性の測定法と同様に行
って下表に示すごとき比活性を得た。

本酵素はＰＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によって活性が阻
害されず、またシステイン、グルタチオン、ジチオスレ
イトール、２−メルカプトエタノールのようなＳＨ保護
剤によって活性化されないことより、本酵素の活性発現
にはＳＨ基が関与していないものと推定される。

（ｄ）界面活性剤の影響酵素反応液に下表に示した濃度の界面活性剤を加える以
外は上記酵素活性の測定法と同様に行って下表に示すご
とき比活性を得た。

本酵素はタウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸
ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性
剤によって１．４〜１．５倍活性化された。

トリトンＸ−１００、ツイー７８０のような界面活性剤
では活性の阻害が認められた。

（ｅ）アルブミンの影響酵素反応液に最終濃度２％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミ
ンを加える以外は上記酵素活性の測定法と同様に行った
場合、約１．２５倍の活性化が認められた。

７．分子量セファデツクスＧ−１００ゲルフィルトレーション
法により、本酵素の分子量は約４３０００と算出された
。

８．等電点本酵素は等電点ｐＨ７．３５とｐＨ７．９０を示す蛋
白質を含む。

等電点分画法で両者の蛋白質を分離しＬＰＬ活性を測定
したところ両者にＬＰＬ活性が認められた。

９．電気泳動［）ａｖｉｓらの方法（蛋白質・核酸・酵素・生物化学
実験法４３頁、１９６７参照）に従って、以下のように
行った。

分離用ゲルとして７．５％アクリルアミドゲルを用い、
等電点分画法によって分けた等電点７．３５または７．
９０を示す酵素を含む液０．１ｍｌ（等電点７．３
５の場合は５６μ１、７．９０の場合は４６μグの蛋白
質を含む）をそれぞれゲル上に添加して、上下両電極槽
にトリスーグリシン緩衝液（ｐＨ８．３）を入
れ、下の電極をプラスとして管当り３ｒＩＬＡの電流を
流して約９０分間泳動を行った。

泳動終丁後、ゲルを１％アミドシュワルツ（７％酢酸）
溶液中で１時間煮沸することにより染色した。

脱色は上下両槽に７％酢酸を入れ、下の電極をプラスと
して管当り８ｒｒＬＡの電流を流して泳動を開始した。

この操作で色素は下方へ移動し、泳動は約２時間後に終
了した。

かくして得られた泳動パターンは等電点７．３５および
７．９０両者ともに単一の層を示し、両者が純粋な蛋白
質であることを示している。

１０．結晶構造本酵素は結晶化が困難なため結晶構造の決定はできない
。

本発明による酵素ＬＰＬは従来知られているＬＰＬと
は違った性質を示す新規なＬＰＬであると考えられる。

たとえば、動物起源のＬＰＬはリパーゼ活性はなく、リ
ポプロテイン・リパーゼ活性のみしか示さない本酵素は
リパーゼ活性をも有する。

特公昭４１−７８３６号公報記載のＬＰＬはリハーゼ活
性はなくリポプロテイン・リパーゼ活性のみしか示さな
いし、タウロコール酸によって阻害されるが、本酵素は
リパーゼ活性を有するし、タウロコール酸によって逆に
活性化される。

前記Ａｇｒ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ記載のムコ
ール・ジャバニカスの生産するＬＰＬはβ位のエステル
結合の氷解速度が他のエステル結合の氷解速度にくらべ
てきわめて遅《、タウロコール酸ナトリウム、デオキシ
コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなどの薬
剤によって阻害を受けるが、本酵素はエステル結合に対
する位置特異性を示さないし、上記薬剤によって逆に活
性化される。

これらのことから本酵素ＬＰＬは従来のＬＰＬとは異
った性質を有する新規なＬＰＬであることがわかる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１リゾープス・ジャポニカスＫＹ５２１を種菌とし
、これをグルコース１？／ｄｌ１酵母エキス０．３ｆ
／ｄｉ、麦芽エキス０．３？／ｄｌ、ペプトン０．
５？／ｄｌ、寒天２．０？／ｄｌの組成を有する培地
（ｐＨ５．５）に植菌し、３０℃で７日間静置培
養を行う。

菌糸に胞子が着生したのち菌体をグルコース１グ／ｄｌ
，ペプトン３？／ｄｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．２ｆ／ｄ
ｌ，ＫＣＩＯ．０５？／ｄｌ，ＭｇＳ０４
・７Ｈ２００．０５？／ｄｉ，ＡＹ−レシチン
（大豆レシチンの商品名、豊年製油社製）０．２
？／ｄｉの組成を有する培地（ｐＨ５．５）３
００縦を含有する２ｌ容三角フラスコに一白金耳植菌
し、３０℃で１７時間ロータリーシェーカーにて培養す
る。

この培養液６００ｒｒＬｌをグルコ−ス１？／ｄｌ、
ペプトン３グ／ｄｉ１ＫＨ２ＰＯ４０．２グ／ｄｉ，
ＫＣＩＯ．０５？／ｄｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２
００．０５タ／ｄｉ、ＡＹ−レシチン０．２？／ｄ
ｉの組成を有する培地（ｐＨ５．５）１５７を含有
する３０ｌジャー・ファーメンターに植菌し、３０℃で
２４時間通気攪拌培養する。

培養液１５Ｊを大型ヌツチェでｒ過し、培養沢液約１５
Ｊを得る。

この培養沢液を約１／４容まで減圧下濃縮する。

この濃縮液に硫安を加え、硫安７０％飽和で沈殿する部
分を採取する。

この沈殿のＬＰＬ活性収率は約６０％で、比活性は約３
倍に上昇している。

この沈殿を５００１ｎｌの０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）に溶解し、透析膜としてセロファンチュ
ーブを使い、８時問おきに透析外液をとりかえながら２
０７の同緩衝液で２４時間透析すると５５０ｒｆＬｌの
透析液が得られる。

ついで透析液５５０ｒｒＬｌのｐＨを塩酸で４．０に調
整し１０分間放置後、生ずる沈殿をＩＯＯＯＯＸ？、２
０分で遠心分離して除いて６００ｒｒＬｌの上清液を得
た。

上清液のＬＰＬ活性収率は９０％で、比活性は約１．５
倍上昇する。

この上清液６００ｒｆＬｌに２４００ｒＩＬｌのエチル
アルコールを添加、攪拌後１０分間放置し、生ずる沈殿
をｉｏｏｏｏｘｙ、２０分で遠心分離して集める。

得られた沈殿を１００ｒｒＬｌの０．０１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解し、上記と同様に透析を行って１
５０ＴＬｌの透析液を得る。

透析液のＬＰＬの活性収率は８０％で比活性は約５倍上
昇する。

この透析液を０．ＯＩＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５
）で平衡化しておいた１ｋｇＯカラムライトを含むカラ
ムに通す。

この操作でＬＰＬはカラムライトに吸着される。

さらに同緩衝液約２ｌで不純蛋白を洗い流す。

次に０．ＯＩＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）から１
５％硫安を含む０．ＯＩＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５
）までの濃度勾配をつくり通塔する。

溶出液を２０ｒｎｌＥずつの両分で集めるとＬＰＬを含
む活性画分が単一のピークとして得られた。

得られた活性画分をあわせ、これに硫安を加えて、７０
％硫安飽和にする。

生じる沈殿を１００００Ｘｆ、２０分の遠心分離で集め
、イオン交換脱塩水１００ｍｌに溶かす。

この溶液をゼロファンチューブに入れ、透析外液として
０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）約２１を用
いて３回透析した。

透析液を凍結乾燥して淡黄色の粉末約１１を得る。

この粉末は比活性３０単位／ｒｎＩｉｌの精製ＬＰＬ
である。

全体の活性収率は３５％であり、比活性はｉｏｏ倍に達
した。

培地からＡＹ−レシチンを除く以外は上記と同様にして
行った場合、得られるＬＰＬの活性収率は上記の場合に
くらべて約９０％であった。

実施例２使用菌株にリゾープス・カンショＫＹ５２７を用
い、培地をグルコース１？／ｄｌ，尿素０．５’ｆ／／
ｄｉ，ＫＨ２ＰＯ４０．２グ／ｄｉ，ＫＣＩＯ
．０５ｙ／ｃｌｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００．０５
ｙ／ｄｉ，ＡＹレシチン０．２９／ｄｌの組成
を有する塔地（ｐＨ５，５）に替えて行うほかは実施例
１と同様に行って比活性２５単位／■の精製ＬＰＬ約１
２を得た。

収率は３０％であった。

培地からＡＹ−レシチンを除く以外は上記と同様にして
行った場合、得られるＬＰＬの活性収率は上記の場合に
くらべて約２５％であった。

実施例３使用菌株にリゾープス・ノドサスＫＹ５３３を用
い、培地をグルコース１？／ｄｉ、ソイ・ビーン・ミー
ル３グ／ｄｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．２グ／ｄｌ，Ｋ
ＣＩ０．０５グ／ｄｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．０５
グ／ｄｌ、ＡＹ−レシチン０．２９／ｄｌの組成を
有する培地（ｐＨ５．５）に替えて行うほかは実
施例１と同様に行って比活性１０単位／ＷＩ９の精製Ｌ
ＰＬ約０．５１を得た。

収率は３０％であった。培地からＡＹ−レシチンを除く
以外は上記と同様にして行った場合、得られるＬＰＬの
活性収率は上記の場合にくらべて約２０％であった。

Claims

【特許請求の範囲】１リゾープス属に属し、リポプロテイン・リパーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地に培養し、リポプロテイ
ン・リパーゼを培養液中に蓄積せしめ、該培養液からこ
れを採取することを特徴とするリポプロテイン・リパー
ゼの製造法。２ ■ 人エリポプロテインをエステル結合に対して位
置特異性を示すことなく完全に脂肪酸とグリセロールま
でに分解すること、 ■ 人血清、仔牛血清中の天然リポプロテインを完全に
分解すること、 ■ オリーブ油などの天然油脂およびトリカプリン、ト
リオレインなどの炭素数８以上の長鎖脂肪酸よりなるト
リグリセライドを分解すること、■ トリアセチン、ト
リブチンのような短鎖のトリグリセライドは分解しない
こと、 ■ 至適ｐＨが３７℃、１０分間の反応で、ｐＨ７．５
〜８．５にあること、 ■安定ｐＨ領域が、４０℃、２時間の反応でｐＨ６．０
〜７．０にあること、 ■ 作用適温が、ｐＨ８．３、１０分間の反応で３７℃
付近にあること、 ■ ｐＨ６．５、７分間の処理で４５℃まで安定で５０
℃で３５％程度失活すること、 ■ ＮａＣＬプロタミンにより活性が阻害されること、［相］Ｆｅ２＋イオンによって顕著に阻害されること
、＠ＥＤＴＡのような金属キレート剤によって活性
は阻害されないこと、＠ＰＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によって活性が阻害
されないこと、０システイン、グルタチオン、ジチオスティトール、
２−メルカプトエタノールのようなＳＨ保護剤によって
活性化されないこと、 ■ タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナト
リウム、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤に
よって活性化されること、［相］アルキルラウリルポ
リエーテルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレートのような界面活性剤で活性が阻害されるこ
と、［相］牛血清アルブミンの添加により活性化され
ること、０分子量が約４３０００であること、［相］等電点がｐＨ７．３５およびｐＨ７．９０にあ
ること、を特徴とする新規リポプロテイン・リパーゼ。