JPH0640822B2 - 微生物リポプロテインリパ−ゼの製造方法 - Google Patents
微生物リポプロテインリパ−ゼの製造方法Info
- Publication number
- JPH0640822B2 JPH0640822B2 JP60280537A JP28053785A JPH0640822B2 JP H0640822 B2 JPH0640822 B2 JP H0640822B2 JP 60280537 A JP60280537 A JP 60280537A JP 28053785 A JP28053785 A JP 28053785A JP H0640822 B2 JPH0640822 B2 JP H0640822B2
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- Japan
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- lpl
- microbial
- lipoprotein lipase
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- producing
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、接合菌類に属する菌を使用して微生物リポプ
ロテインリパーゼ（酵素番号3.1.1.３４）を製造する方
法、詳しくは、接合菌類に属する菌を豆乳又はその乾燥
粉末を含有する培地中で培養し、微生物リポプロテイン
リパーゼを多量に、且つ安定的に生成させる方法に関す
るものである。
ロテインリパーゼ（酵素番号3.1.1.３４）を製造する方
法、詳しくは、接合菌類に属する菌を豆乳又はその乾燥
粉末を含有する培地中で培養し、微生物リポプロテイン
リパーゼを多量に、且つ安定的に生成させる方法に関す
るものである。
一般にリポプロテインリパーゼ（以下、ＬＰＬと略記す
る）は、生体の血清中に存在するカイロミクロンや、超
低比重リポ蛋白質（Very low den sity lipoprotein）
等のリポ蛋白質のトリグリセリドを加水分解する酵素と
して古くから知られていたが、これは生体内現象として
とらえられているに過ぎなかった。しかし、特公昭４１
−７８３６号公報及びアグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biolog
ical Chemistry)４４巻４号７９９頁（１９８０年）等
に記載されている如く、ムコール(Mucor)属及びリゾー
プス（Rhizopus）属の接合菌類によって生体内ＬＰＬと
類似の作用を有するリパーゼが生産され、微生物ＬＰＬ
と称されるに至った。
る）は、生体の血清中に存在するカイロミクロンや、超
低比重リポ蛋白質（Very low den sity lipoprotein）
等のリポ蛋白質のトリグリセリドを加水分解する酵素と
して古くから知られていたが、これは生体内現象として
とらえられているに過ぎなかった。しかし、特公昭４１
−７８３６号公報及びアグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biolog
ical Chemistry)４４巻４号７９９頁（１９８０年）等
に記載されている如く、ムコール(Mucor)属及びリゾー
プス（Rhizopus）属の接合菌類によって生体内ＬＰＬと
類似の作用を有するリパーゼが生産され、微生物ＬＰＬ
と称されるに至った。
この微生物ＬＰＬは大量生産が可能であることから、そ
の利用のための開発が盛んとなり、特に近年いわゆる診
断薬関係の開発が活発となり、血中トリグリセリド定量
用試薬として微生物ＬＰＬを用いる方法が開発されてき
たのである。
の利用のための開発が盛んとなり、特に近年いわゆる診
断薬関係の開発が活発となり、血中トリグリセリド定量
用試薬として微生物ＬＰＬを用いる方法が開発されてき
たのである。
前述の様な用途に微生物ＬＰＬを使用する場合は、微生
物ＬＰＬの価格が高価格では企業化する際に支障となる
のでコスト的に安価な微生物ＬＰＬの製造方法が要求さ
れる。
物ＬＰＬの価格が高価格では企業化する際に支障となる
のでコスト的に安価な微生物ＬＰＬの製造方法が要求さ
れる。
従って、本発明の目的は、微生物ＬＰＬを簡単な手段で
安価且つ多量に製造する方法を提供することにある。
安価且つ多量に製造する方法を提供することにある。
本発明は、上記目的を、豆乳又はその乾燥粉末として、
水浸漬大豆を磨砕し、水と共に加熱若しくは蒸煮し、種
皮等の不溶物を除去したもの、これを更に乾燥したも
の、又は水浸漬大豆を磨砕したものを、固形分として培
地に対し０．３〜１０重量％含有する培地で接合菌類に
属する菌を培養し、培養物中から微生物ＬＰＬを取得す
ることによって達成したものである。
水浸漬大豆を磨砕し、水と共に加熱若しくは蒸煮し、種
皮等の不溶物を除去したもの、これを更に乾燥したも
の、又は水浸漬大豆を磨砕したものを、固形分として培
地に対し０．３〜１０重量％含有する培地で接合菌類に
属する菌を培養し、培養物中から微生物ＬＰＬを取得す
ることによって達成したものである。
以下に本発明の微生物ＬＰＬの製造方法について詳述す
る。
る。
本発明で使用される接合菌類に属する菌としては、例え
ば、リゾープス・デレマー(Rhizopus delemar)ＡＴＣＣ
３４６１２、リゾープス・ジャポニカス(Rhizopus ja
ponicus)ＩＦ ４７５８等のリゾープス属、ムコール
・ジャヴァニカス(Mucor Javanicus)ＩＡＭ ６１０８
等のムコール属等が挙げられる。
ば、リゾープス・デレマー(Rhizopus delemar)ＡＴＣＣ
３４６１２、リゾープス・ジャポニカス(Rhizopus ja
ponicus)ＩＦ ４７５８等のリゾープス属、ムコール
・ジャヴァニカス(Mucor Javanicus)ＩＡＭ ６１０８
等のムコール属等が挙げられる。
尚、ＩＦは財団法人醗酵研究所保存菌株、ＡＴＣＣは
アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション保存
菌株、ＩＡＭは東京大学応用微生物研究所保存菌株を示
し、いずれも一般に入手可能である。
アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション保存
菌株、ＩＡＭは東京大学応用微生物研究所保存菌株を示
し、いずれも一般に入手可能である。
本発明で使用される豆乳又はその乾燥粉末としては、大
豆を水に浸漬し、磨砕し、適量の水と共に加熱し、必要
に応じて蒸煮し、種皮等の不溶物を除去したもの、これ
を更に噴霧乾燥等の適当な方法で乾燥したものを用いる
のが良いが、単に水浸漬大豆を磨砕したものをそのまま
培地に添加しても良い。但し、この場合は不溶物も共に
添加されるので、後処理工程が複雑となる。
豆を水に浸漬し、磨砕し、適量の水と共に加熱し、必要
に応じて蒸煮し、種皮等の不溶物を除去したもの、これ
を更に噴霧乾燥等の適当な方法で乾燥したものを用いる
のが良いが、単に水浸漬大豆を磨砕したものをそのまま
培地に添加しても良い。但し、この場合は不溶物も共に
添加されるので、後処理工程が複雑となる。
而して、本発明の微生物ＬＰＬの製造方法を実施するに
際しては、先ず、上記の接合菌類に属する菌をポテトシ
ュークロース寒天培地等で培養して菌株を増殖させる。
次いで、胞子を形成する場合は胞子を、胞子を形成しな
い場合は菌体を、上記の豆乳又はその乾燥粉末を含有す
る本発明の培地に接種し、培養する。接種量は特に限定
されないが、胞子の場合はおよそ１０４〜１０７個／１
００ml、菌株の場合はおよそ１白金耳／１００mlであ
る。
際しては、先ず、上記の接合菌類に属する菌をポテトシ
ュークロース寒天培地等で培養して菌株を増殖させる。
次いで、胞子を形成する場合は胞子を、胞子を形成しな
い場合は菌体を、上記の豆乳又はその乾燥粉末を含有す
る本発明の培地に接種し、培養する。接種量は特に限定
されないが、胞子の場合はおよそ１０４〜１０７個／１
００ml、菌株の場合はおよそ１白金耳／１００mlであ
る。
本発明の培地は、液体培地であるのが操作上好ましく、
また豆乳又はその乾燥粉末を固形分として培地に対し
０．３〜１０重量％、好ましくは１〜８重量％含有す
る。培地中の豆乳又はその乾燥粉末の濃度が０．３重量
％未満では添加の効果が殆ど見られず、また１０重量％
より多く添加しても増産効果に変化がなく、後処理が複
雑となるばかりで好ましくない。豆乳又はその乾燥粉末
の最適な濃度は培養される菌種によって異なるが、最適
濃度範囲内の低い濃度で添加する方が後処理上では好ま
しい。
また豆乳又はその乾燥粉末を固形分として培地に対し
０．３〜１０重量％、好ましくは１〜８重量％含有す
る。培地中の豆乳又はその乾燥粉末の濃度が０．３重量
％未満では添加の効果が殆ど見られず、また１０重量％
より多く添加しても増産効果に変化がなく、後処理が複
雑となるばかりで好ましくない。豆乳又はその乾燥粉末
の最適な濃度は培養される菌種によって異なるが、最適
濃度範囲内の低い濃度で添加する方が後処理上では好ま
しい。
本発明の培地には、通常、KH2PO4やMgSO４等の無機塩が
０．０１〜０．２重量％程度添加されており、その他に
必要に応じてグルコース、シュークロース、可溶性デン
プン等の糖類が０〜４重量％程度添加されていてもよ
く、更にコーンスティーブリカー、脱脂大豆粉、イース
トエキス、ポリペプトン等が添加されていてもよい。上
記糖類は豆乳固型分の添加量が少ない場合は使用した方
がよいが、グルコースの添加は微生物ＬＰＬの生成時期
を遅らせ、培養時間が長引くので適量に止めるべきであ
る。
０．０１〜０．２重量％程度添加されており、その他に
必要に応じてグルコース、シュークロース、可溶性デン
プン等の糖類が０〜４重量％程度添加されていてもよ
く、更にコーンスティーブリカー、脱脂大豆粉、イース
トエキス、ポリペプトン等が添加されていてもよい。上
記糖類は豆乳固型分の添加量が少ない場合は使用した方
がよいが、グルコースの添加は微生物ＬＰＬの生成時期
を遅らせ、培養時間が長引くので適量に止めるべきであ
る。
培養は、pH５．０〜６．５程度で適当な温度例えば２３
〜３３℃で振とう培養、通気撹拌培養等によればよい。
〜３３℃で振とう培養、通気撹拌培養等によればよい。
培養物中からの微生物ＬＰＬの取得は、培養中随時微生
物ＬＰＬ活性を測定し、微生物ＬＰＬ活性がほぼ最大と
なる時点で菌体を濾過等の常法により除去し、濾液をpH
３〜５としてから高速で遠心分離すると微細な沈澱物が
得られ、この沈澱物中に微生物ＬＰＬ活性の９５％以上
が含まれることが多いので、この方法により行うか、一
般的な方法、例えば菌体を濾過等により除去し、濾液を
硫酸アンモニウム沈澱法、アセトンやアルコール等によ
る有機溶媒沈澱法、イオン交換樹脂等による吸着法等で
処理して微生物ＬＰＬを回収する方法等により行うこと
ができる。遠心分離する方法によった場合は、沈澱物を
そのまま固定化微生物ＬＰＬとして使用してもよいし、
更に精製を進めてもよい。
物ＬＰＬ活性を測定し、微生物ＬＰＬ活性がほぼ最大と
なる時点で菌体を濾過等の常法により除去し、濾液をpH
３〜５としてから高速で遠心分離すると微細な沈澱物が
得られ、この沈澱物中に微生物ＬＰＬ活性の９５％以上
が含まれることが多いので、この方法により行うか、一
般的な方法、例えば菌体を濾過等により除去し、濾液を
硫酸アンモニウム沈澱法、アセトンやアルコール等によ
る有機溶媒沈澱法、イオン交換樹脂等による吸着法等で
処理して微生物ＬＰＬを回収する方法等により行うこと
ができる。遠心分離する方法によった場合は、沈澱物を
そのまま固定化微生物ＬＰＬとして使用してもよいし、
更に精製を進めてもよい。
本発明の方法により得られた微生物ＬＰＬは、各種用途
に、従来法により得られた微生物ＬＰＬと同様にして使
用できる。
に、従来法により得られた微生物ＬＰＬと同様にして使
用できる。
以下に本発明の実施例、及び比較例を示すが、本発明は
これらに限定されるものではない。
これらに限定されるものではない。
尚、実施例及び比較例において、微生物ＬＰＬ活性の測
定は、次の方法により行った。
定は、次の方法により行った。
２％ポリビニルアルコール水溶液２２．５mlにオリーブ
油２．０ｇを加えて１０℃以下で乳化したもの１mlと、
成牛血清５０mlとを加えて３７℃で３０分間インキュベ
ートしたものを作成し、これを基質溶液とする。
油２．０ｇを加えて１０℃以下で乳化したもの１mlと、
成牛血清５０mlとを加えて３７℃で３０分間インキュベ
ートしたものを作成し、これを基質溶液とする。
この基質溶液２mlに０．２Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）２m
lを加え３７℃で５分間予熱する。これに０．１Ｍ緩衝
液（pH７．０）で適当に希釈した微生物ＬＰＬ含有液１
mlを加え、３７℃で１０分間反応させ、濁度の減少を６
６０nmの吸光度を測定することにより求める。濁度の減
少量と遊離脂肪酸の生成量とは比例関係が成り立つこと
が知られているので、予めダンコンベの方法〔バイオケ
ミカル・ジャーナル（Biochem．Ｊ）８８巻、７頁（１
９６３年）〕により生成脂肪酸量と濁度の減少との関係
を求めておき、これにより濁度の減少を遊離脂肪酸の生
成量に換算し、酵素液の微生物ＬＰＬ活性を知る。即
ち、微生物ＬＰＬ活性の１単位とは、１分間当り１マイ
クロ当量の脂肪酸を遊離させる酵素量を示す。
lを加え３７℃で５分間予熱する。これに０．１Ｍ緩衝
液（pH７．０）で適当に希釈した微生物ＬＰＬ含有液１
mlを加え、３７℃で１０分間反応させ、濁度の減少を６
６０nmの吸光度を測定することにより求める。濁度の減
少量と遊離脂肪酸の生成量とは比例関係が成り立つこと
が知られているので、予めダンコンベの方法〔バイオケ
ミカル・ジャーナル（Biochem．Ｊ）８８巻、７頁（１
９６３年）〕により生成脂肪酸量と濁度の減少との関係
を求めておき、これにより濁度の減少を遊離脂肪酸の生
成量に換算し、酵素液の微生物ＬＰＬ活性を知る。即
ち、微生物ＬＰＬ活性の１単位とは、１分間当り１マイ
クロ当量の脂肪酸を遊離させる酵素量を示す。
実施例１〜３及び比較例１〜６ ムコール・ジャヴァニカス(Mucor Javanicus)ＩＡＭ
６１０８菌をポテトシュークロース寒天培地上に生育さ
せ、種菌とした。また、それぞれ下記表−１に示す各種
培地１００mlを含む５００ml容量の坂口フラスコを１２
１℃で１５分間殺菌した。次いで、これらの培地に、そ
れぞれ上記種菌を１白菌耳接種し、２８℃で振巾７cm，
振動数１２０回転／分で３日間振とう培養後、菌体を濾
別し、濾液の微生物ＬＰＬ活性を測定した。その結果は
下記表−１に示す通りであった。
６１０８菌をポテトシュークロース寒天培地上に生育さ
せ、種菌とした。また、それぞれ下記表−１に示す各種
培地１００mlを含む５００ml容量の坂口フラスコを１２
１℃で１５分間殺菌した。次いで、これらの培地に、そ
れぞれ上記種菌を１白菌耳接種し、２８℃で振巾７cm，
振動数１２０回転／分で３日間振とう培養後、菌体を濾
別し、濾液の微生物ＬＰＬ活性を測定した。その結果は
下記表−１に示す通りであった。
濾液のpHを４．０とすると沈澱物が生じ、これを８００
０Ｇで遠心分離し、沈澱物を得た。
０Ｇで遠心分離し、沈澱物を得た。
実施例４〜６及び比較例７〜１２ 菌株としてリゾープス・ジャポニカス(Rhizopus japoni
cus)ＩＦ ４７５８金を用いた以外は全て実施例１〜
３及び比較例１〜６と同様にして実施した。その結果は
下記表−２に示す通りであった。
cus)ＩＦ ４７５８金を用いた以外は全て実施例１〜
３及び比較例１〜６と同様にして実施した。その結果は
下記表−２に示す通りであった。
実施例７及び比較例１３ それぞれ下記表−３に示す各種培地（但し、実施例７は
Ａの培地である）１００mlを含む５００ml容量の坂口フ
ラスコ２本を、１２１℃で１５分間殺菌した。次いで、
ムコール・ジャヴァニカス(Mucor Javanicus)ＩＡＭ
６１０８菌を、それぞれこれらの培地に接種し、２８℃
で２日間振とう培養を行い、種菌とした。次いで、それ
ぞれ下記表−３に示す各種培地（但し、実施例７はＢの
培地である）６を含む１０容量のジャーファーメン
ター中に上記種菌を接種し、１VVM ，２８℃で通気撹拌
培養を行った。定期的に培養液を無菌的に採取し、除菌
後、培養液中の微生物ＬＰＬ活性を測定した。その結果
は下記表−３に示す通りであった。
Ａの培地である）１００mlを含む５００ml容量の坂口フ
ラスコ２本を、１２１℃で１５分間殺菌した。次いで、
ムコール・ジャヴァニカス(Mucor Javanicus)ＩＡＭ
６１０８菌を、それぞれこれらの培地に接種し、２８℃
で２日間振とう培養を行い、種菌とした。次いで、それ
ぞれ下記表−３に示す各種培地（但し、実施例７はＢの
培地である）６を含む１０容量のジャーファーメン
ター中に上記種菌を接種し、１VVM ，２８℃で通気撹拌
培養を行った。定期的に培養液を無菌的に採取し、除菌
後、培養液中の微生物ＬＰＬ活性を測定した。その結果
は下記表−３に示す通りであった。
培養終了後、濾過により菌体を除去し、濾液のpHを４．
０とすると、沈澱物が生じ、これを８０００Ｇで遠心分
離し、沈澱物を得た。沈澱物の酵素活性は全量で４．７
２×１０６単位であり、回収率９６％であった。
０とすると、沈澱物が生じ、これを８０００Ｇで遠心分
離し、沈澱物を得た。沈澱物の酵素活性は全量で４．７
２×１０６単位であり、回収率９６％であった。
〔発明の効果〕 本発明の微生物ＬＰＬの製造方法は、豆乳又はその乾燥
粉末を含有する培地で接合菌類に属する菌を培養し、培
養物中から微生物ＬＰＬを取得することを特徴とするも
ので、本発明の方法によれば、コーンスティープリカー
や大豆粉、大豆油糖等を主成分とする培地を用いた場合
に比して培養液当り２〜５倍もの高活性の微生物ＬＰＬ
を生成させることができる。
粉末を含有する培地で接合菌類に属する菌を培養し、培
養物中から微生物ＬＰＬを取得することを特徴とするも
ので、本発明の方法によれば、コーンスティープリカー
や大豆粉、大豆油糖等を主成分とする培地を用いた場合
に比して培養液当り２〜５倍もの高活性の微生物ＬＰＬ
を生成させることができる。
更に、本発明の方法によれば、微生物ＬＰＬを培養物を
酸性とすることによって容易に回収することができるた
め、微生物ＬＰＬを簡単な手段で安価且つ多量に製造す
ることができる。
酸性とすることによって容易に回収することができるた
め、微生物ＬＰＬを簡単な手段で安価且つ多量に製造す
ることができる。
Claims (2)
- 【請求項１】豆乳又はその乾燥粉末として、水浸漬大豆
を磨砕し、水と共に加熱若しくは蒸煮し、種皮等の不溶
物を除去したもの、これを更に乾燥したもの、又は水浸
漬大豆を磨砕したものを、固形分として培地に対し０．
３〜１０重量％含有する培地で接合菌類に属する菌を培
養し、培養物中から微生物リポプロテインリパーゼを取
得することを特徴とする微生物リポプロテインリパーゼ
の製造方法。 - 【請求項２】接合菌類に属する菌が、リゾープス（Rhiz
opus）属、又はムコール（Mucor）属から選ばれた菌で
あることを特徴とする特許請求の範囲第(1)項記載の微
生物リポプロテインリパーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60280537A JPH0640822B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 微生物リポプロテインリパ−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60280537A JPH0640822B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 微生物リポプロテインリパ−ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62138191A JPS62138191A (ja) | 1987-06-20 |
| JPH0640822B2 true JPH0640822B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=17626463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60280537A Expired - Lifetime JPH0640822B2 (ja) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | 微生物リポプロテインリパ−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0640822B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI438279B (zh) | 2007-03-16 | 2014-05-21 | Nisshin Oillio Group Ltd | 脂肪酶粉末製劑，其製造方法及使用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5837834B2 (ja) * | 1976-11-29 | 1983-08-18 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規リポプロテイン・リパ−ゼ |
-
1985
- 1985-12-13 JP JP60280537A patent/JPH0640822B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62138191A (ja) | 1987-06-20 |
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