JPH0147149B2 - - Google Patents
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Landscapes
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は新規な高活性のリパーゼ(油脂分解酵
素)生産能力を有するキヤンデイダ・シリンドラ
セ(Candida cylindracea)の変異菌を培養して
リパーゼを製造する方法に関する。 リパーゼを生産する微生物としてキヤンデイダ
属、アスペルギルス属、リゾプス属、ペニシリウ
ム属、シウドモナス属などが知られているが、工
業的にリパーゼを大量生産する際に用いられる菌
としてキヤンデイダ・シリンドラセATCC14830
がよく知られている。しかし、この菌のリパーゼ
生産はまだ低く、更に高単位のリパーゼを生産す
る菌が望まれている。 そこで本発明者等は、高単位のリパーゼを生産
するキヤンデイダ・シリンドラセを見出すべく研
究を重ねた結果、キヤンデイダ・シリンドラセ
ATCC14830より変異誘導されたキシロースの資
化性のない変異株がより高単位のリパーゼを生産
することを見出した。本発明はこの知見に基いて
完成されるに到つたものである。 すなわち、本発明はキヤンデイダ・シリンドラ
セから変異誘導され、キシロースの資化性がな
く、培地中に800単位/培養液ml以上のリパーゼ
を生産する能力を有するキヤンデイダ・シリンド
ラセの変異菌であり、また本発明は上記キヤンデ
イダ・シリンドラセの変異菌を培地に培養し、培
養物より生成したリパーゼを採取することを特徴
とする高活性リパーゼの製造法である。 本変異菌の親株はリパーゼ生産菌として知られ
ているキヤンデイダ・シリンドラセATCC14830
(又はキヤンデイダ・ルゴツサATCC14830)であ
る。この親株より本発明の変異菌を変異誘導する
方法としては、N−メチル−N′−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸、
メチルメタンスルホン酸アクロフラビン、及びア
クリジンオレンヂ等の変異剤に接触させたり、紫
外線やX線を照射する通常の変異誘導方法が適宜
適用できる。 本発明の変異菌を得る変異誘導方法の具体例を
示すと次のとおりである。 加糖ニユートリエント液体培地で17時間振とう
培養したキヤンデイダ・シリンドラセ
ATCC14830の菌体を遠心分離により集め、殺菌
水で洗浄後、再び遠心分離して菌体を集め、160
ミリモル濃度のリン酸緩衝液(PH7.0)に懸濁し
た。これに300μg/mlの濃度になるようにN−
メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
を加え、25℃にて10〜90分間ゆつくり撹拌しつつ
変異誘導を行つた。ついで菌体を遠心分離して集
め、上記リン酸緩衝液でよく洗浄する工程をくり
返してN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジンを除去した。 変異剤を除去した菌体を上記リン酸緩衝液に懸
濁し、この0.1mlをこうじ寒天平板培地に接種し、
25℃にて4〜5日培養した。こうじ寒天平板培地
に生育しコロニーを形成した菌はレプリカ法
(「酵母の分類同定法」飯塚、後藤著1969年3月東
大出版会、第47頁)によりキシロースを唯一の炭
素源としたウイツカーハム(Wickerham)の炭
素源資化試験用寒天培地に移し、更に一週間培養
した。こうじ寒天培地に生育し、キシロースを含
むウイツカーハムの培地に生育しない菌を採取
し、そのリパーゼ生産能を調べると、その殆んど
が高いリパーゼ生産能を有していたが、その内特
にリパーゼ生産能の高い菌株としてNo.1号、No.10
号、No.401号、及びNo.414号が採取された。 これらの菌株は、それぞれ工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌第6137号、第6134号、第
6135号及び第6136号として寄託されている。 これらの変異株及び親株の性質を比較すると、
以下に述べる通りでキシロースの資化性が変つて
いることは明らかであるが、ガラクトースの発酵
性に変異が起つているものもあつた。その他の形
態的、生理的性質については殆んど変化が見られ
ず、特公昭39−2987号公報に記載してあるキヤン
デイダ・シリンドラセの性質に非常によく似てい
た。 又、これら4株の変異菌の性質はよく似てお
り、リパーゼの生産性及びガラクトースの発酵性
に差がある他は殆んど区別がつけ難い。強いて区
別をあげればMY寒天培地上での巨大コロニーの
形態にやや差が見られる場合もあるが、いずれも
以下に記載した性質の内での微少な変化にすぎ
ず、特に生理的性質ではガラクトースの発酵性を
除き全く差が見られなかつた。更にくわしくこれ
ら4菌株の性質を示すと以下の通りである。 (a) 各培地における生育状態 MY液体培地 栄養細胞の形態は長い卵形で円筒形あるい
は偽菌糸状をなすこともある。細胞の大きさ
は0.8〜3.5μ×2〜20μで、単独、対あるいは
偽菌糸状に連る。増殖は出芽により行われ
る。液体培地の表面にはしわのよつた真性皮
膜が形成される。 MY寒天培地 平板上での巨大コロニーは周辺が波状又は
裂片状で、半レンズ状又は凸状にもり上り、
表面はしわ状でバター様をなす。 斜面培地ではよく生育し、灰白色をなし、
表面は網状でしめつたしわ状をなす。 バレイシヨ寒天培地 偽菌糸状によく生育する。 (b) 子嚢胞子を形成しない。 (c) 射出胞子を形成しない。 (d) 生理的性質 生育温度は30℃が最適で、37℃以上で生育
しない。 PH3〜9の間で生育し、生育の最適PHは4
付近である。 硝酸塩は同化しない。 脂肪はよく分解する。 尿素は分解しない。 ゼラチンは液化しない。 好浸透圧性及び耐浸透圧性はない。 カロチノイドは生成しない。 顕著な有機酸の生成はない。 デンプン様物質は生成しない。 生育にビオチンを必要とする。 (e) 炭素源の資化性と発酵性 炭素源の資化性は第1表の通りである。
素)生産能力を有するキヤンデイダ・シリンドラ
セ(Candida cylindracea)の変異菌を培養して
リパーゼを製造する方法に関する。 リパーゼを生産する微生物としてキヤンデイダ
属、アスペルギルス属、リゾプス属、ペニシリウ
ム属、シウドモナス属などが知られているが、工
業的にリパーゼを大量生産する際に用いられる菌
としてキヤンデイダ・シリンドラセATCC14830
がよく知られている。しかし、この菌のリパーゼ
生産はまだ低く、更に高単位のリパーゼを生産す
る菌が望まれている。 そこで本発明者等は、高単位のリパーゼを生産
するキヤンデイダ・シリンドラセを見出すべく研
究を重ねた結果、キヤンデイダ・シリンドラセ
ATCC14830より変異誘導されたキシロースの資
化性のない変異株がより高単位のリパーゼを生産
することを見出した。本発明はこの知見に基いて
完成されるに到つたものである。 すなわち、本発明はキヤンデイダ・シリンドラ
セから変異誘導され、キシロースの資化性がな
く、培地中に800単位/培養液ml以上のリパーゼ
を生産する能力を有するキヤンデイダ・シリンド
ラセの変異菌であり、また本発明は上記キヤンデ
イダ・シリンドラセの変異菌を培地に培養し、培
養物より生成したリパーゼを採取することを特徴
とする高活性リパーゼの製造法である。 本変異菌の親株はリパーゼ生産菌として知られ
ているキヤンデイダ・シリンドラセATCC14830
(又はキヤンデイダ・ルゴツサATCC14830)であ
る。この親株より本発明の変異菌を変異誘導する
方法としては、N−メチル−N′−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸、
メチルメタンスルホン酸アクロフラビン、及びア
クリジンオレンヂ等の変異剤に接触させたり、紫
外線やX線を照射する通常の変異誘導方法が適宜
適用できる。 本発明の変異菌を得る変異誘導方法の具体例を
示すと次のとおりである。 加糖ニユートリエント液体培地で17時間振とう
培養したキヤンデイダ・シリンドラセ
ATCC14830の菌体を遠心分離により集め、殺菌
水で洗浄後、再び遠心分離して菌体を集め、160
ミリモル濃度のリン酸緩衝液(PH7.0)に懸濁し
た。これに300μg/mlの濃度になるようにN−
メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
を加え、25℃にて10〜90分間ゆつくり撹拌しつつ
変異誘導を行つた。ついで菌体を遠心分離して集
め、上記リン酸緩衝液でよく洗浄する工程をくり
返してN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジンを除去した。 変異剤を除去した菌体を上記リン酸緩衝液に懸
濁し、この0.1mlをこうじ寒天平板培地に接種し、
25℃にて4〜5日培養した。こうじ寒天平板培地
に生育しコロニーを形成した菌はレプリカ法
(「酵母の分類同定法」飯塚、後藤著1969年3月東
大出版会、第47頁)によりキシロースを唯一の炭
素源としたウイツカーハム(Wickerham)の炭
素源資化試験用寒天培地に移し、更に一週間培養
した。こうじ寒天培地に生育し、キシロースを含
むウイツカーハムの培地に生育しない菌を採取
し、そのリパーゼ生産能を調べると、その殆んど
が高いリパーゼ生産能を有していたが、その内特
にリパーゼ生産能の高い菌株としてNo.1号、No.10
号、No.401号、及びNo.414号が採取された。 これらの菌株は、それぞれ工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌第6137号、第6134号、第
6135号及び第6136号として寄託されている。 これらの変異株及び親株の性質を比較すると、
以下に述べる通りでキシロースの資化性が変つて
いることは明らかであるが、ガラクトースの発酵
性に変異が起つているものもあつた。その他の形
態的、生理的性質については殆んど変化が見られ
ず、特公昭39−2987号公報に記載してあるキヤン
デイダ・シリンドラセの性質に非常によく似てい
た。 又、これら4株の変異菌の性質はよく似てお
り、リパーゼの生産性及びガラクトースの発酵性
に差がある他は殆んど区別がつけ難い。強いて区
別をあげればMY寒天培地上での巨大コロニーの
形態にやや差が見られる場合もあるが、いずれも
以下に記載した性質の内での微少な変化にすぎ
ず、特に生理的性質ではガラクトースの発酵性を
除き全く差が見られなかつた。更にくわしくこれ
ら4菌株の性質を示すと以下の通りである。 (a) 各培地における生育状態 MY液体培地 栄養細胞の形態は長い卵形で円筒形あるい
は偽菌糸状をなすこともある。細胞の大きさ
は0.8〜3.5μ×2〜20μで、単独、対あるいは
偽菌糸状に連る。増殖は出芽により行われ
る。液体培地の表面にはしわのよつた真性皮
膜が形成される。 MY寒天培地 平板上での巨大コロニーは周辺が波状又は
裂片状で、半レンズ状又は凸状にもり上り、
表面はしわ状でバター様をなす。 斜面培地ではよく生育し、灰白色をなし、
表面は網状でしめつたしわ状をなす。 バレイシヨ寒天培地 偽菌糸状によく生育する。 (b) 子嚢胞子を形成しない。 (c) 射出胞子を形成しない。 (d) 生理的性質 生育温度は30℃が最適で、37℃以上で生育
しない。 PH3〜9の間で生育し、生育の最適PHは4
付近である。 硝酸塩は同化しない。 脂肪はよく分解する。 尿素は分解しない。 ゼラチンは液化しない。 好浸透圧性及び耐浸透圧性はない。 カロチノイドは生成しない。 顕著な有機酸の生成はない。 デンプン様物質は生成しない。 生育にビオチンを必要とする。 (e) 炭素源の資化性と発酵性 炭素源の資化性は第1表の通りである。
【表】
−:菌が生育しないもの
L:遅れて生育したもの
糖類の発酵性は第2表の通りである。
L:遅れて生育したもの
糖類の発酵性は第2表の通りである。
【表】
上記したキヤンデイダ・シリンドラセの変異菌
を用いてリパーゼを製造するには、炭素源、窒素
源、無機塩類および生育因子などを含有する培
地、通常は液体培地に上記のキヤンデイダ・シリ
ンドラセの変異菌を培養する。 培地の炭素源としては、例えばグルコース、ガ
ラクトース、フラクトース、ソルビトール、マン
ニトール、糖密、グリセリン、エタノール、およ
び有機酸類などがあり、窒素源としては、例えば
硫安、硝安、リン酸アンモン、および尿素などが
使用できる。又天然物、例えば米ぬか、大豆粉、
コーンステイープリカー、酵母エキス、およびペ
プトンなども添加使用できる。無機塩類として
は、例えばリン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸
カリウム塩化カリウムなどが挙げられる。更に
又、油脂類や界面活性剤の添加も効果のある場合
がある。 培養の条件としては、液体培地を用いた通気撹
拌培養が望ましく、培養温度は20〜30℃、培養日
数は1〜4日が望ましい。 培養物、通常培養液からのリパーゼの採取方法
は、通常塩析、有機溶媒添加による沈澱、及び等
電沈澱などにより行われるが、減圧加熱又は限外
過などにより濃縮した液状品で使用される場合
もある。更に上記の方法を組み合わせたり、イオ
ン交換やゲル過などを併用して精製リパーゼを
採取することもできる。この様にして採取したリ
パーゼの性質は特公昭39−2987号公報に記載され
ているリパーゼ、更に詳しくは日本農芸化学会英
文誌(Agric.Biol.Chem.30巻、576頁及び1090頁)
に記載されているリパーゼの性質によく似てお
り、作用最適PH、作用最適温度などでは差異が見
られなかつた。 リパーゼ活性の測定法 (i) 試料酵素溶液 培養液中の酵素濃度を(ii)項での0.05N水酸化ナ
トリウム溶液での滴定値が1.0〜2.0mlの範囲にな
るように冷蒸溜水を用いて稀釈する。 (ii) 測定法 オリーブ油乳液5mlと0.1Mリン酸緩衝液(PH
7.0)4mlと50ml容共栓三角フラスコに正確にと
り、よく混合し37℃の恒温水槽を用いて10分間予
熱する。これに試料溶液1mlを、一カ所に集中し
ないように、撹拌しながら正確に加え、よく混合
し、正確に20分間後アセトン・エタノール混液20
mlを注ぎ、フエノールフタレイン試液5滴を加
え、0.05N水酸化ナトリウム溶液で滴定する。別
に、オリーブ油乳液5mlと0.1Mリン酸緩衝液
(PH7.0)4mlとを50ml容三角フラスコに正確にと
り、37℃、30分間加温後、アセトン・エタノール
混液20mlを注ぎ、次いで試料溶液1mlを正確に加
え、フエノールフタレイン試液5滴を指示薬とし
て、0.05N水酸化ナトリウム溶液で滴定し対照液
とする。滴定値1.0〜2.0mlの範囲で、酵素量と滴
定値とは比例関係を示す。 (iii) リパーゼの活性単位の計算法 リパーゼの活性(単位/培養液1ml)={試料溶
液滴定値(ml)−対照液滴値(ml)}×培養酵素液
の稀釈倍数×2.5 以下実施例により本発明を具体的に説明する。 実施例 1 大豆粉3.5%、コーンステイープリカー3%、
リン酸二カリ0.5%、硫安0.1%、消泡剤(ポリオ
キシエチレンノニルフエノールエーテル)0.6%
を含む液体培地50mlを500ml容肩つきフラスコに
入れ、115℃にて10分間蒸気殺菌した。この培地
に上記したキヤンデイダ・シリンドラセの変異菌
No.1,No.10,No.401、No.414を別々に植菌し、25℃
にて24時間振とう培養した。この培養液1ml中の
リパーゼ活性は第3表の通りであつた。比較のた
め、キヤンデイダ・シリンドラセATCC14830を
上記と同様に培養した場合の培養液1ml中のリパ
ーゼ活性も第3表に示す。なおリパーゼ活性は山
田等の方法(日本農芸化学会誌36巻、360頁,
1962年)に準じて測定した。
を用いてリパーゼを製造するには、炭素源、窒素
源、無機塩類および生育因子などを含有する培
地、通常は液体培地に上記のキヤンデイダ・シリ
ンドラセの変異菌を培養する。 培地の炭素源としては、例えばグルコース、ガ
ラクトース、フラクトース、ソルビトール、マン
ニトール、糖密、グリセリン、エタノール、およ
び有機酸類などがあり、窒素源としては、例えば
硫安、硝安、リン酸アンモン、および尿素などが
使用できる。又天然物、例えば米ぬか、大豆粉、
コーンステイープリカー、酵母エキス、およびペ
プトンなども添加使用できる。無機塩類として
は、例えばリン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸
カリウム塩化カリウムなどが挙げられる。更に
又、油脂類や界面活性剤の添加も効果のある場合
がある。 培養の条件としては、液体培地を用いた通気撹
拌培養が望ましく、培養温度は20〜30℃、培養日
数は1〜4日が望ましい。 培養物、通常培養液からのリパーゼの採取方法
は、通常塩析、有機溶媒添加による沈澱、及び等
電沈澱などにより行われるが、減圧加熱又は限外
過などにより濃縮した液状品で使用される場合
もある。更に上記の方法を組み合わせたり、イオ
ン交換やゲル過などを併用して精製リパーゼを
採取することもできる。この様にして採取したリ
パーゼの性質は特公昭39−2987号公報に記載され
ているリパーゼ、更に詳しくは日本農芸化学会英
文誌(Agric.Biol.Chem.30巻、576頁及び1090頁)
に記載されているリパーゼの性質によく似てお
り、作用最適PH、作用最適温度などでは差異が見
られなかつた。 リパーゼ活性の測定法 (i) 試料酵素溶液 培養液中の酵素濃度を(ii)項での0.05N水酸化ナ
トリウム溶液での滴定値が1.0〜2.0mlの範囲にな
るように冷蒸溜水を用いて稀釈する。 (ii) 測定法 オリーブ油乳液5mlと0.1Mリン酸緩衝液(PH
7.0)4mlと50ml容共栓三角フラスコに正確にと
り、よく混合し37℃の恒温水槽を用いて10分間予
熱する。これに試料溶液1mlを、一カ所に集中し
ないように、撹拌しながら正確に加え、よく混合
し、正確に20分間後アセトン・エタノール混液20
mlを注ぎ、フエノールフタレイン試液5滴を加
え、0.05N水酸化ナトリウム溶液で滴定する。別
に、オリーブ油乳液5mlと0.1Mリン酸緩衝液
(PH7.0)4mlとを50ml容三角フラスコに正確にと
り、37℃、30分間加温後、アセトン・エタノール
混液20mlを注ぎ、次いで試料溶液1mlを正確に加
え、フエノールフタレイン試液5滴を指示薬とし
て、0.05N水酸化ナトリウム溶液で滴定し対照液
とする。滴定値1.0〜2.0mlの範囲で、酵素量と滴
定値とは比例関係を示す。 (iii) リパーゼの活性単位の計算法 リパーゼの活性(単位/培養液1ml)={試料溶
液滴定値(ml)−対照液滴値(ml)}×培養酵素液
の稀釈倍数×2.5 以下実施例により本発明を具体的に説明する。 実施例 1 大豆粉3.5%、コーンステイープリカー3%、
リン酸二カリ0.5%、硫安0.1%、消泡剤(ポリオ
キシエチレンノニルフエノールエーテル)0.6%
を含む液体培地50mlを500ml容肩つきフラスコに
入れ、115℃にて10分間蒸気殺菌した。この培地
に上記したキヤンデイダ・シリンドラセの変異菌
No.1,No.10,No.401、No.414を別々に植菌し、25℃
にて24時間振とう培養した。この培養液1ml中の
リパーゼ活性は第3表の通りであつた。比較のた
め、キヤンデイダ・シリンドラセATCC14830を
上記と同様に培養した場合の培養液1ml中のリパ
ーゼ活性も第3表に示す。なおリパーゼ活性は山
田等の方法(日本農芸化学会誌36巻、360頁,
1962年)に準じて測定した。
【表】
実施例 2
実施例1に記載したと同様に培養したキヤンデ
イダ・シリンドラセの変異菌No.401の培養液を遠
心分離して菌体等固形分を除去した。この遠心上
澄液100mlに冷アセトン400mlを加え混合すると沈
澱が生じた。この沈澱部分を集め、冷アセトンで
脱水した後真空乾燥しリパーゼ粉末1.7gを採取
した。この粉末リパーゼの活性は58単位/mgであ
つた。
イダ・シリンドラセの変異菌No.401の培養液を遠
心分離して菌体等固形分を除去した。この遠心上
澄液100mlに冷アセトン400mlを加え混合すると沈
澱が生じた。この沈澱部分を集め、冷アセトンで
脱水した後真空乾燥しリパーゼ粉末1.7gを採取
した。この粉末リパーゼの活性は58単位/mgであ
つた。
Claims (1)
- 1 キヤンデイダ・シリンドラセ(Candida
cylindracea)から変異誘導され、キシロースの
資化性がなく、培地中に800単位/培養液ml以上
のリパーゼを生産する能力を有するキヤンデイ
ダ・シリンドラセの変異菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14963481A JPS5851889A (ja) | 1981-09-24 | 1981-09-24 | 高活性のリパーゼ生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14963481A JPS5851889A (ja) | 1981-09-24 | 1981-09-24 | 高活性のリパーゼ生産菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5851889A JPS5851889A (ja) | 1983-03-26 |
JPH0147149B2 true JPH0147149B2 (ja) | 1989-10-12 |
Family
ID=15479507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14963481A Granted JPS5851889A (ja) | 1981-09-24 | 1981-09-24 | 高活性のリパーゼ生産菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5851889A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60227689A (ja) * | 1985-04-05 | 1985-11-12 | Nitto Electric Ind Co Ltd | アクリル酸エステル生産菌によるアクリル酸エステルの製造方法 |
JPS60227688A (ja) * | 1985-04-05 | 1985-11-12 | Nitto Electric Ind Co Ltd | アクリル酸エステル生産菌によるアクリル酸エステルの製造方法 |
JPS62107791A (ja) * | 1985-11-07 | 1987-05-19 | Meito Sangyo Kk | 脂肪酸エステルの製造方法 |
-
1981
- 1981-09-24 JP JP14963481A patent/JPS5851889A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5851889A (ja) | 1983-03-26 |
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