DK145880B - Middel til afproevning af bakteriers foelsomhed over for antifolatmidler og fremgangsmaade til anvendelse heraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK (^)

© da) FREMLÆGGELSESSKRIFT on 11*5880 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 330/76 (51) IntCI.3 C 12 Q 1/48 (22) Indleveringsdag 27* jan. 1976 C 12 N 9/12 (24) Løbedag 27. jan. 1976 (41) Aim. tilgængelig 28. jul. 1976 (44) Fremlagt 28. mar. 1983 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 27- jan. 1975, 5445/75, GB

(71) Ansøger THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, London NW1, GB.

(72) Opfinder Stanley Robert Morris Bushby, US: Thomas Anthony

Krenitsky, US.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bur eau.

(54) Middel til afprøvning af bakteriers følsomhed over for antlfolatmidler og fremgangsmåde til anvendelse heraf.

Den foreliggende opfindelse angår et middel til afprøvning af bakteriers følsomhed over for antifolatmidler, bestående af et bakterielt vækstmedium i kombination med thymidin-phosphorylase. Antifolatmidlerne kan f.eks. være sulfamethoxazol (SMX) og/eller trimethoprim (TMP).

Det har været kendt i en række år, at almindeligvis anvendte XI dyrkningsmedier ofte er uegnede til bestemmelse af bakteriers føl- somhed over for sulfonamider eller trimethoprim, dvs. midler, som 30 griber forstyrrende ind i syntesen af folater i disse organismer.

^ Denne uegnethed giver sig til kende ved utydelige endepunkter, når ” seriefortyndingsmetoden anvendes, og ved delvis vækst inden for hæm- g ningszonerne, når diffusionsmetoden anvendes. Det er blevet påvist 3 2 145880 af Bushby (Med. J. Aust. Special Supplement (1973) 1: 10) og Koch og Burchall (Applied Microbiology (1971) 22: 812), at thymidin i meget stærk grad modvirker eller helt ophæver de hæmmende, dvs. antibakte-rielle virkninger af sulfonamider og trimethoprim.

I 1945 påviste Harper og Cawston (J. Path. Bact., 5T_: 59), at når lyseret hesteblod sattes til et prøvemedium af ringe følsomhed, kunne det omdanne dette til et tilfredsstillende medium. Siden dette tidlige arbejde og flere andre forskeres arbejde er det blevet sædvanlig praksis at inkorporere lyseret hesteblod i antibakterielle følsomhedsprøvemedier for at formindske den delvise vækst, der ofte iagttages inden for de af sulfonamider frembragte hæmningszoner. Senere er det også blevet påvist, at denne metode ligeledes er effektiv ved afprøvning med hensyn til trimethoprim (Bushby, Postgraduate Med. J. (1969) 45: lOf og Darrell et al., J. Clin. Path. (1968) 2JL: 202).

Harper og Cawston fastslog, at a) lyseret hesteblod var mere effektivt end helblod med hensyn til at neutralisere sulfonamid-anta-goniserende stof(fer), b) blod fra adskillige andre arter var inaktivt, c) aktiviteten af lysatet forøgedes med inkubationstid og temperatur (op til 30°), og d) lysatet påvirkede ikke modvirkningen af sulfonamid-hæmning med p-aminobenzoesyre. De konkluderede, at det lyserede blod indeholdt en faktor, som neutraliserer sulfonamid-anta-goniserende stof(fer).

Denne såkaldte Harper-Cawston-faktor er kun effektiv med medier, der indeholder en moderat koncentration af thymidin, dvs. fra ca. 0,1 til 15 ug/ml. Under 0,1 ng/ml antagoniseres virkningen af medikamenterne ikke, således at fjernelse af en så ringe mængde thymidin ikke har nogen virkning på den iagttagne medikament-hæmning. Ved meget høje koncentrationer af thymidin, dvs. større end 15 yg/ml, er virkningen af Harper-Cawston-faktoren ikke tilstrækkelig til at overvinde modvirkningen af virkningerne af sulfonamiderne og trimethoprim, muligvis fordi den høje koncentration af thymin, frembragt som følge af spaltningen af thymidin, kan erstatte det meget mere aktive thymidin med hensyn til modvirkningen.

Det er blevet rapporteret, at Harper-Cawston-faktoren er thy-midin-phosphorylase (Bushby i Trimethoprim/Sulfamethoxazole in Bacterial Infections: A Wellcome Foundation Symposium. Ed Bernstein & Salter, Churchill Livingston, Edinburgh & London, 1973, p. 31-38, og Bushby, Med. J. Aust. Special Supplement, 1973, 1: 10-18). Det er påpeget i sidstnævnte litteratursted, at "selv om thymidin forstyrrer in-vitro-virkningen af TMP/SMX, er det sædvanligvis ikke til stede i 3 145880 dyr i tilstrækkeligt høje koncentrationer til at påvirke in-vivo-virkningen".

En af ulemperne ved at inkorporere lyseret hesteblod i et dyrkningsmedium er, at det bibringer mediet en rødligbrun farve, og jo større mængden af hesteblod er, desto kraftigere er farven. Denne farvning er uønsket, da den i høj grad forstyrrer bedømmelsen af bakterievækst efter inkubering. I tilfælde af flydende medier nedsætter den forøgede farve f.eks. mediernes transparens, hvilket gør optiske tæthedsmålinger langt mindre nøjagtige. Med faste medier optræder der en nedsættelse af agarens kontrast, hvilket gør det vanskeligere nøjagtigt at måle hæmningszonestørrelser og at bestemme tilstedeværelsen eller fraværelsen af delvis vækst inden for hæmningszonerne. Fordringen om tilsætning af lyseret hesteblod til bakterielle dyrkningsmedier betyder endvidere, at medierne praktisk taget er umulige at definere, hvilket er en noget mindre heldig egenskab. En yderligere ulempe ved at anvende hesteblod består i, at det fås i handelen i meget begrænsede mængder og fra kun meget få leverandører verden over.

Det har nu vist sig, at tilsætningen af det isolerede og rensede enzym thymidin-phosphorylase af bakteriel oprindelse til mange forskellige slags almindelig anvendte dyrkningsmedier forbedrer disse medier med hensyn til afprøvning af bakteriers følsomhed over for an-tifolat-medikamenter.

I overensstemmelse hermed er midlet ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at thymidin-phosphorylasen er et renset produkt af bakteriel oprindelse.

Tilsætning af enzymet thymidin-phosphorylase forbedrer mange medier til følsomhedsafprøvning af bakterier over for antifolat-medi-kamenter, såsom sulfamethoxazol og trimethoprim, f.eks. Mueller-Hinton-næringsvæske og -agar, oxoidfølsomhedsprøvenæringsvæske og -agar, "Wellcotest"-følsomhedsprøveagar (et semi-syntetisk medium med lavt thymidinindhold og indeholdende proteinhydrolysater), hjer-ne-hjerte-infusionsnæringsvæske og -agar og trypton-soja-agar.

Thymidin-phosphorylase er tidligere blevet udvundet i renset tilstand fra bakterier, såsom Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus og Haemophilus influenzae, og navnlig ud fra en stamme af Escherichia coli, der kræver thymin og methionin til væksten. Denne sidstnævnte udvinding er en yderst langvarig proces bestående i udfældning, fraktionering, adskillige chromatografiské trin og dialyse (Schwartz, M., 1971, Eur. J. Biochem. 21: 191-198).

Det ved denne proces udvundne enzympræparat er imidlertid kun 25 gange renere end den rå celleekstrakt.

4 145880

Det har nu vist sig, at visse stammer af bakterier, navnlig en bestemt stamme af E.coli, producerer usædvanligt store mængder thymidin-phosphorylase under passende vækstbetingelser, og at dette enzym kan isoleres og renses ved at bringe celleekstrakten i kontakt med specifikke adsorbenser og eluere det derfra til opnåelse af et meget højere udbytte af et meget renere præparat, end det hidtil har været muligt. Denne nye isolering/rensningsproces kan desuden tilpasses til produktion af enzymet i stor målestok.

Man ekstraherer det rå enzym fra bakterier ud i et vandigt medium og underkaster ekstrakten en fraktioneringsbehandling, som omfatter adsorption, chromatografering og dialyse. Denne fremgangsmåde er karakteristisk ved, at der 1) udvælges en bakteriestamme, som er i stand til at producere høje koncentrationer af thymidin-phosphorylase .under passende vækstbetingelser, og at 2) den derfra opnåede rå celleekstrakt bringes i kontakt med et calciumphosphatgel-adsorbens, der indeholder i det væsentlige ækvivalente mængder af Ca og PO^ , fortrinsvis som et første trin i rensningen. Fortrinsvis bringes elu-enten derefter i kontakt med diethylaminoethyl-cellulose (i det følgende betegnet med forkortelsen DEAE-cellulose) og/eller cellulose-epichlorhydrintriethanolamin (i det følgende betegnet med forkortelsen ECTEOLA-cellulose), idet der udføres dialyse mod vand eller en passende puffer efter elueringen fra DEAE-cellulose og før adsorptionen på ECTEOLA-cellulose.

I overensstemmelse med det ovenstående er det ifølge opfindelsen fordelagtigt, at thymidin-phosphorylasen er opnået ud fra en stamme af Escherichia coli, og det er ganske særlig fordelagtigt,at stammen af E. coli er B-96 (ATCC 13473). Salmonella typhimurium LT-2 (ATCC 15277) er et eksempel på en anden bakteriestamme, som producerer store mængder thymidin-phosphorylase og således er nyttig ved udøvelse af den foreliggende opfindelse. I visse tilfælde, hvor der ønskes et mere termostabilt enzym, har det fra B.stearothermophilus isolerede enzym vist sig effektivt.

E. coli stamme ATCC 13473 kan dyrkes i et medium med minimalt .saltindhold og indeholdende en passende carbonkilde og desuden puri-„•ner. Alternativt kan bakterierne dyrkes i et gærekstraktmedium. En rå ekstrakt af enzymet kan derefter fremstilles ved udsættelse af bakteriecellerne for lydbehandling i phosphatpuffer efterfulgt af centrifugering til fjernelse af cellebrudstykkerne.

Den rå ekstrakt blandes f.eks. med en lille mængde calcium-phosphatgel og centrifugeres derefter til fjernelse af uønsket pro- 5 145880 tein. Den således opnåede overliggende væske kan derefter blandes med en yderligere mængde calciumphosphatgel, og enzymet kan adsorberes dertil. Enzymaktiviteten kan elueres fra gelen ved flere efter hinanden følgende vaskninger med phosphatpuffer. Enzymet kan derefter adsorberes til DEAE-cellulose, vaskes og elueres derfra. Efter dialyse kan præparatet adsorberes til ECTEOLA-cellulose og elueres derfra.

Kontrollering af eluaterne for enzymaktivitet på alle stadier under rensningen kan bekvemt udføres under anvendelse af en spektro-fotometrisk prøvning ved en udvalgt bølgelængde.

Det således rensede enzym kan bekvemt stilles til rådighed som en suspension i vandig ammoniumsulfatopløsning.

Enzymet er også til stede i en række hvirveldyrvæv og kan udvindes i renset form derfra, men koncentrationerne i pattedyrvæv er almindeligvis meget lavere end i bakterier. Endvidere er renset mikrobiel thymidin-phosphorylase mange gange mere aktiv end det rensede tilsvarende produkt fra pattedyr.

Hesteblod har således vist sig at indeholde ca. 40-100 enheder af thymidin-phosphorylase-aktivitet pr. ml. E. coli-sonificatet fra eksempel 1 indeholder mere end 1000 gange denne koncentration. Fordelene ved en økonomisk fremgangsmåde til fremstilling af det rensede enzym ud fra en bakteriel kilde er således mange og betydningsfulde. Ikke alene er der tale om en lettere tilgængelig, billig kilde for enzymet, men fremgangsmåden til ekstrahering og rensning af det er meget mere økonomisk.

For midlet ifølge opfindelsen gælder, at koncentrationen af thymidin-phosphorylase i vækstmediet fortrinsvis er fra 2 til 200 enheder af enzymaktivitet/ml medium, mere foretrukket fra 5 til 100 en- heder/ml og mest foretrukket fra. 7 til 50 emheder/ml.

1 enhed af enzymaktivitet at renset enzym er den mængde af enzymet, som katalyserer dannelsen af 1 nanomol thymin/minut fra en 1 millimolær opløsning af thymidin ved 25°C i nærværelse af 200 mM kaliumphosphatpuffer ved pH 7,4.

Medier, hvortil der er sat renset thymidin-phosphorylase, kan være egnede til afprøvning af mange forskellige organismers følsomhed over for antifolat-medikamenter, såsom organismerne Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio comma, Erysipelothrix rhusi-opathiae, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Kleb. aerogenes, Sal. typhosa, E. coli, Shigella flexneri, Shig. dysenteriae, Entero-bacter aerogenes, Entero. cloacae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Pr. mirabiles, Pr. rettgeri, og Pseudomonas aeruginosa. Strep.

6 145880 faecalis er en fremtrædende undtagelse, fordi thymin fra denne organisme er lige så effektiv som thymidin til faktisk at modvirke virkningen af inhibitorer for folat-reduktase, f.eks. trimethoprim.

Det rensede enzym kan sættes til det ønskede medium på ethvert passende fremstillings- eller tilberedningstrin. Det kan f.eks. tilsættes aseptisk som en steril opløsning efter autoklavering af mediet, og efter at temperaturen er faldet til ca. 50-55°C. Efter at enzymet er blevet tilsat, skal mediet behandles så hurtigt som muligt, således at det enzymbehandlede medium ikke holdes ved 50-55°C i mere end ca. 5-10 minutter, for at inaktiveringen af enzymet skal blive mindst mulig.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes der også en fremgangsmåde til anvendelse af det omhandlede middel til afprøvning af bakteriers følsomhed over for antifolatmidler, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man poder midlet med bakterier, lader bakterierne formere sig, anbringer filtrerpapirskiver indeholdende antifolatmidler oven på den bakterielle vækst og inkuberer kulturen yderligere, hvorefter den fremkomne hæmningszone bestemmes.

En særlig fordel ved det omhandlede middel er, at det er lystfarvet og transparent, hvilket letter den nøjagtige bedømmelse af bakterievæksten ved bestemmelse af bakteriers følsomhed over for an-tifolat-medikamenter.

Det er kendt på det omhandlede område, at thymidin-phosphory-lase af bakteriel oprindelse er stabil ved -20°C, men at aktiviteten ved 4°C falder med betydelig hastighed. Det har nu vist sig, at præparater af det rensede enzym kan gøres bemærkelsesværdigt stabile mod sønderdeling ved tilsætning af ammoniumsulfat til præparatet, forudsat at præparatets proteinindhold er mindst 5 mg pro.tein/ml. Proteinindholdet behøver nødvendigvis ikke helt at bestå af enzymet. Koncentrerede opløsninger af enzymet (5 mg protein/ml eller mere) i phosphatpuffer indeholdende 10% ammoniumsulfat kan f.eks. oplagres i lange tidsrum med kun ringe eller uden noget tab i aktivitet. Stabile suspensioner af thymidin-phosphorylase i vandigt ammoniumsulfat kan også fremstilles.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende ek--sempler.

7 145880

Eksempel 1

Udvinding af renset thymidin-phosphorylase.

E. coli B-96 (ATCC 13473) dyrkedes i luftede beholdere ved 34°C i et medium med minimalt saltindhold indeholdende Na2HP04 (18,9 g/1), KH2P04 (6,3 g/1), MgS04· 7H20 (0,2 g/1), (NH4)2S04 (2,0 g/1), adenosin (0,5 g/1) og casaminosyrer (8,0 g/1). Cellerne udvandtes ved centrifugering, når den optiske tæthed af kulturen ved 600 nm (uden fortynding) havde nået 2,0.De følgende operationer udførtes ved 3°C, medmindre andet er anført. Cellepastaen (25 g) suspenderedes i 2 gange dens vægt af 5 mM kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 (puffer A) . Cellesuspensionen underkastedes lydbehandling (sonificeredes) i delmængder på 5 ml, der hver behandledes i to perioder å 12 sekunder med et afkølingsinterval på 50 sekunder. Der anvendtes en Branson Model 5125 Sonic Oscillator med en styrkeindstilling på 6. Sonificaterne hældtes sammen og centrifugeredes i 20 minutter ved 48000 x g. Til den over-liggende væske (trin I - se tabel I nedenfor) sattes langsomt 25 ml af en calciumphosphatgelsuspension (31 mg tørstof pr. ml, modnet ved 3°C i 5 måneder). Den opnåede suspension omrørtes i 10 minutter og centrifugeredes derefter ved 12000 x g i 5 minutter. Den overliggende væske blandedes med yderligere 100 ml af calciumphosphatgelsuspensio-nen, og blandingen omrørtes i 10 minutter og centrifugeredes ved 9700 x g i 15 minutter. Den opnåede gelpellet vaskedes med puffer A (100 ml) ved resuspendering og centrifugering ved 9700 x g i 15 minutter.

Enzymaktiviteten elueredes fra gelpelletten ved to efter hinanden følgende vaskninger, først med 10 mM kaliumphosphatpuffer, pH

8,0 (100 ml) og dernæst med 20 mM kaliumphosphatpuffer, pH 8,0 (100 ml). De to vaskevæsker hældtes sammen (trin II).

Den resterende del af processen udførtes ved 25°C. De samlede vaskevæsker hældtes på en DEAE-cellulose-kolonne, der var 1,8 cm i diameter og 6 cm høj, og som i forvejen var ligevægtsindstillet med 20 mM kaliumphosphat, pH 6,4 (puffer B). Den påfyldte kolonne vaskedes med puffer B (100 ml), og enzymet elueredes derefter med en phos-phatpuffer af lineært stigende styrke. Denne stigende styrke opnåedes ved under grundig blanding at tilføre 200 mM kaliumphosphatpuffer med pH 6,4 (200 ml) til et blandekammer, der oprindeligt var fyldt med puffer B (200 ml), med en sådan hastighed, at der opretholdes et konstant volumen inde i blandekammeret. De fraktioner, der indeholdt den højeste enzymaktivitet, hældtes sammen (trin III) og dialyseredes under anvendelse af et cellulosedialysatorrør (6,4 mm i diameter) mod 8 145880 vand (21) il time. Dialysen blev gentaget, og dialysatet hældtes derefter på en ECTEOLA-cellulose-søjle (1,8 x 5 cm), som i forvejen var ligevægtsindstillet med puffer A. Den påfyldte kolonne vaskedes med puffer A (100 ml). Enzymet elueredes derefter med en eluent af lineært stigende styrke fremstillet som ovenfor under anvendelse af et blandereservoir, som i begyndelsen var fyldt med puffer A (200 ml) , hvori 200 mM kaliumphosphatpuffer med pH 8,0 (200 ml) indførtes ved tyngdekraftens hjælp, efterhånden som kolonneopløsningen skred fremad. De fraktioner, der indeholdt enzymaktiviteten, hældtes sammen (trin IV), og der tilsattes tilstrækkeligt ammoniumsulfat til opnåelse af en suspension af enzymet i 80% ammoniumsulfatopløsning. Den samlede proces resulterede i 100 ganges forøgelse i specifik aktivitet med hensyn til protein og praktisk taget fuldstændig fjernelse af nucleinsyrer.

Thymidin-phosphorylase-aktiviteten bestemtes spektrofotometrisk ved måling af den formindskelse i absorption ved 290 nm, som ledsagede phosphorylysen af thymidin til thymin. Ved 290 nm og pH

7,4 har thymidin en større ékstinktionskoefficient end thymin (Δε= -480 M 1 cm hvor Δε er ændringen i ekstinktionskoefficient, og M står for molær). Prøveblandingen indeholdt 200 mM kaliumphosphatpuff er, pH 7,4, og 1 mM thymidin i et totalt rumfang på 2,5 ml. 1 enhed af enzymaktivitet er den mængde, som katalyserer dannelsen af 1 nanomol thymin pr. minut ud fra thymidin ved 25°C.

I tabel I er resultaterne af den i dette eksempel beskrevne oprensning sammenfattet. Processen er blevet udført i 60 gange større målestok med lignende resultater.

9 145880 t—i iti •P β (ti tn ti

H

ti 0 I Η O H

ra tn H in o

ti ti H

0 (ti (5 t n 0 +i -P O CM O 00 >ic}p o oo io •tf

Λ H

Ό D

*

IO I

<31 0) β

I -P *H

mø® -Ρ Ρ -P o o o o •h -ri ø o m co o o i-H>rdPlO oo O 00 0 ·Η 0 Qj · · · · O -Ρ ,β * m C' o) Ό ,ϋ β Di m cn co ø rfj ø g ru

H

,β σι Η σι Ο β σι id Η •ri ·γ1 I—I *· ** ^ ρ 0 g ο ο ο ο 0 -Ρ \ tf β 0 tn ϋ Ρ g ω m η Μ Η (ti Ο Ο Ο Ο 0 ρ ο ο ο ο

Λ ΙΗ Ρ Ο Ό Ο CN

(ΰ 0 0 ...

gi ø η τ3 m in ιο ό ιη ø ø tf oo co tf (ΰ +> β σι ό Η ro γΡ ο β >ι Εη 0 ό 'tf -tf ro ρ

0 I

Ο! ιη CU -Ρ (β 0 0 -Ρ Ρ ο ο ο ο ί Ρ0 ο ο ο ο ρ)>Όι-Ηο ιο m r- 1 ·Η 0 g · · · · β -Ρ β ιο C' ο ο •Η X β ο οι οο ιη <! 0 η •η β · —. ιη •Ρ γΡ γΡ ' 0 g m ό ηι <ο up > ^ νο ο ιη co (ti (Μ tn β · β ·Η Ρ Η Η Η > Ρ Ρ β Η Η Η β ΕΡ Η Μ

β I I

0 Ρ -Η I

Ρ 0 0 Ο 0 I

Ot > β η η ω β Ο ο ιη (ΰ 0 ο η iU U Di Η Η - > -Ρ β 0 -Ρ 0 ·Ρ (0 0 Η Ο β Ρ 00 Ρβ Η I 0 β uOMpa® <!β Ή β ωα-ΡΡΙΗ 0 4PØ-P0 I β Ο 0 Ο ·Η D 0β Η 0 Η 0 0 ββιβ&^βΕΡίη Ρ OP Hg BH U0 m W Η Η Ρ QØ Η Η 145880

Eksempel 2 10

Fast medium.

Mueller-Hinton (Difco) Agar fremstilledes på normal måde og autoklaveredes. Efter at man havde fjernet mediet fra autoklaven og ladet det afkøle til 50^-55°C, tilsatte man aseptisk en steril opløsning af renset thymidin-phosphorylase som fremstillet i eksempel 1 og indeholdende tilstrækkeligt enzym til opnåelse af en slutkoncentration på 40 enheder af det rensede enzym pr. ml medium. Mediet blandedes grundigt og hældtes ud i sterile Petri-skåle, og man lod det afkøle til stuetemperatur.

Eksempel 3 Følsomhedsafprøvning.

Mueller-Hinton-Agar (Wilson) og hjerne-hjerte-infusionsagar (Difco) fremstilledes på normal måde og autoklaveredes (3 portioner af hver). Efter fjernelse fra autoklaven hældtes 1 portion af hvert medium i sterile Petri-skåle. De øvrige 2 portioner af hvert medium lod man afkøle til 55°C. Til 1 portion af hvert medium sattes derefter tilstrækkeligt lyseret hesteblod til opnåelse af en slutkoncen-tration på 5%, og til den sidste portion af hvert medium sattes en tilstrækkelig mængde af en steril opløsning af thymidin-phosphorylase til opnåelse af en slutkoncentration på 40 enheder/ml. Hver portion blandedes grundigt og hældtes derefter i sterile Petri-skåle. Efter afkøling til stuetemperatur podedes hver agarplade med 2 ml af en -4 fortyndet (10 ), i løbet af natten udviklet næringsvæskekultur (Mueller-Hinton-næringsvæske) af E. coli. Man fjernede overskud af væske og lod pladerne tørre. Filtrerpapirskiver indeholdende 1,25 mg TMP, 1,25 mg TMP + 23,75 mg SMX og 23,75 mg SMX anbragtes derefter på overfladen af pladerne, som derpå inkuberedes ved 37°C i 16- timer til opnåelse af et tæppe af ikke helt sammenflydende vækst. Hæmningszonerne bestemtes og udtryktes som afstanden fra kanten af skiven til kanten af væksten af ikke-hæmmede kolonier. Resultaterne er sammenfattet i tabel II.

Tabel II

145880 11 Følsomhedsafprøvning

Størrelse af zone i mm

Medium Modvirknings- TMP SMX TMP 1,25 yg middel + 1,25 yg 23,75 yg SMX 23,75 yg

Thymidin-phos- phorylase 22(25) 17(20) 26(31) 40 enheder/ml

Hjerne- Lyseret heste- hjerte-in- blod 5% 14(22) 12(20) 21(29) fusionsagar (Difco)

Intet (22) (23) (31)

Thymidin-phos- phorylase 24(27) 24(26) 32(36) 40 enheder/ml

Mueller- Lyseret heste-

Hinton- blod 5% 25(28) 24(26) 31(35)

Agar (Wilson)

Intet (25) (26) (35) ( ) Indbefatter zone med delvis hæmning.

Mueller-Hinton-agar forbedres til følsomhedsafprøvning i ca. samme grad ved tilsætning af bakteriel thymidin-phosphorylase som ved tilsætning af lyseret hesteblod. Enzymet forbedrer imidlertid hjerne-hjerte-infusions-agar betydelig mere effektivt, end lyseret hesteblod gør. Desuden kunne de fremstillede, praktisk taget farveløse plader aflæses og bedømmes meget lettere og hurtigere end de farvede hesteblodsplader.