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Substituierte Tropolone, Verfahren zur Herstellung derselben
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und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen Gegenstand der
Erfindung sind durch Biosynthese zugängliche substituierte Tropolone sowie ein Verfahren
zur Herstellung derselben und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.
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Nicht-substituierte Tropolone und isopropyl-substituierte Tropolone
wurden bereits aus Naturprodukten isoliert, und zwar wurde nicht-substituiertes
Tropolon aus Pseudomonaskulturen (speziell Pseudomonas ATCC 31099) isoliert und
als antimikrobiell wirkend bezeichnet (G.D. Lindberg und J.M.
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Larkin, in J. Nat. Prod. 43 (1980) Seiten 592 bis 594). Aus Pflanzenpreßsaft
(Zedern) isolierte alkylsubstituierte Tropolonderivate erwiesen sich in vitro als
antibakteriell wirksam (T.J. Trust, Antimicrobial Agents und Chemotherapy 7 (1975)
Seiten 500 bis 506; T.J. Trust und R.W. Coombs, Can. J. Microdiol. 19 (1973) Seiten
1341 bis 1346).
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Aus Pseudomonaskulturen wurden im übrigen antibiotisch wirksame cyclische
Hydroxamsäureverbindungen isoliert (The Journal of Antibiotics 32 (1979) Seiten
1096 bis 1103). Ferner wurden Phenaziniumbetaine aus Pseudomonaskulturen isoliert,
über deren Wirkungsspektrum jedoch keine Angaben gemacht werden (J. Chem.
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Soc. (C) 1969 , Seiten 2517 bis 2520).
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Von H. Ozawa u.a. (Chem. Abssr. 22 (1971) Seite 61884m) wurden schließlich
Isopropyl- bzw. Aminotropolone untersucht, die als analgetisch9 antiinfl&mmatorisch
und hypothermisch wirksam beschrieben werden. Gemäß der Erfindung wurden nun ausgehend
von Pseudomonaskulturen neue antibakteriell wirksame Substanzen mit einem breiten
Wirkungsspektrum isoliert.
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Diese durch Biosynthese zugänglichen substituierten Tropolone gemäß
der Erfindung entsprechend der Formel
in der X für eine Hydroxy- oder Tropolonylmercaptogruppe steht.
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Diese beiden Tropolone, und zwar das Bis E3-hydroxy-2-oxo-cycloheptatrien
(3,5,7) -yl 3 sulfid der Formel
nachstehend kurz Ditropolonylsulfid genannt, und das 7-Hydroxytropolon der Formel
sind biosynthetisch aus Pseudomonaskulturen zugänglich.
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Zwar können Tropolone prinzipiell synthetisch erzeugt werden, jedoch
erweist sich die biosynthetische Gewinnung als wirtschaftlich günstiger und gemäß
der Erfindung werden die substituierten Tropolone der vorstehenden Formeln dadurch
erhalten, daß man eine zur Bildung der Tropolone befähigte Pseudomonasspezies, nämlich
Pseudomonas cepacia, Hinterlegungs-Nr. ATCC 17759 und Pseudomonas Stämme Vv, hinterlegt
bei DSM unter den Nummern DSM 2180 und DSM 2181, auf einem geeigneten festen Nährboden
oder in flüssigem Nährmedium züchtet und das gebildete Tropolon vom erhaltenen Zellmaterial
isoliert.
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Geeignete Nahrmedien für solche Pseudomonaskulturen sind flüssige
Nährmedien (meist auf Glucose- oder Gluconatbasis) oder feste Agarnährböden, die
jeweils Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat und Kalilauge
enthalten und einen nahezu neutralen pH-Wert haben. Bei der Züchtung auf festen
Nährboden werden die gebildeten Kolonien durch Abkratzen geerntet und das gefriergetrocknete
gesammelte Material wird mit einem mit rauchender Salzsäure versetzten Extraktionsmittel
wie Methanol oder Chloroform etwa 1 Stunde lang zur Extraktion gerührt und der Extrakt
sSurefrei gewaschen und eingeengt.
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Aus flüssigen Kulturen werden die Zellen abzentrifugiert und getrocknet
(beispielsweise durch einstündiges Rühren in der 10-fachen Acetonmenge und Abzentrifugieren
des Materials), wonach das gebildete Tropolon durch Extraktion isoliert wird.
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Proben, die weiße, schleimige Kolonien bilden, werden verworfen. Gezüchtet
wird der pigmentierte schleimige, insbesondere braune Kolonietyp.
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Cysteinzusätze zum Nährmedium (etwa 50 mg/l) und die Zugabe von L-Phenylalanin
erweisen sich als günstig. 0.1 % Hefezusatz fördert das Wachstum und die Ausbeute
der Kultur ebenso wie der Zusatz von Phenylessigsäure zum Gluconatmedium.
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Die Züchtungstemperatur liegt vorteilhaft im Bereich von etwa 30 bis
37° C, insbesondere bei 300 C und die Bebrütungsdauer liegt vorteilhaft bei etwa
2 bis 4 Tagen, insbesondere bei 3 Tagen.
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Obwohl die Pseudomonaskulturen Sauerstoff benötigen und bei Züchtung
in flüssigen Medien Schichtdicken über 5 cm un-,günstig sind, erweist sich ein direktes
Durchleiten von Sauerstoff zumindest in späteren Entwicklungsstadien bei eisenhaltigen
Kulturen als nachteilig.
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In der beschriebenen Weise wurde ausgehend von dem Pseudomonas cepacia
Stamm mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 17759 Ditropolonylsulfid der Formel I als leuchtend
gelbe Substanz erhalten.
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Ditropolonylsulfid kristallisiert monoklin (Raumgruppe P21)
mit
starker Neigung zur Zwillingsbildung. Die im Hochvakuum bei 1400 C sublimierbare
Substanz verfügt über einen Schmelzbereich von 209 bis 2110 C. Sie ist in Dimethylsulfoxid
sehr gut, in niederen Alkoholen, Chloroform, Tetrahydrofuran und Aceton gut, in
Essigester und Äther weniger gut und in Wasser sowie aliphatischen und aromatischen
Kohlenwasserstoffen praktisch nicht löslich.
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Durch Umsetzung mit Natriumhydroxyd in einem geeigneten organischen
Lösungsmittel, beispielsweise in Tetrahydrofuran läßt sich das Ditropolonylsulfid
in ein gut wasserlösliches Natriumsalz überführen.
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Die Elementaranalyse bestätigt die Summenformel C14H1004S.
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Durch Röntgenstrukturanalyse wurde festgestellt, daß das Ditropolonylsulfid
monoklin kristallisiert mit 4 Formeleinheiten in der nicht zentrosymmetrischen Raumgruppe
P21.
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Die Gitterkonstanten wurden mit dem Einkristalldiffraktometer an Hand
von 25 genau vermessenen Reflexen durch eine Ausgleichsrechnung erhalten. Sie betragen:
a = 7.612 + 0.003 i b = 13. 265 + 0.002 i c = 11.812 t 0.003 i R = 90.280 + 0.030
Grad Zelivolumen: V = ;192.600 i 3 Die monokline Elementarzelle enthält zwei symmetriunabhängige
Molekülsorten, die sich nahezu wie Bild und Spiegelbild verhalten. Sie unterscheiden
sich jedoch etwas in dem Winkel, um
den die beiden Tropolonringe
eines Moleküls gegeneinander verdreht sind, die 77.74° bzw. -73.57° betragen. Die
Tropolonringe sind innerhalb der Fehlergrenzen eben.
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Die Berechnung der Bindungslängen lieferte folgende Werte: für die
S-C-Bindung 1.780 i (was auf eine kovalente Einfachbindung hinweist) für die C-C-Bindung
in 3-4, 5-6 u. 1-7 Position 1.360 i (welcher Wert zwischen dem Erwartungswert von
1.340 i für eine C-C-Doppelbindung und von 1.40 R für eine C-C-Bindung im aromatischen
System liegt) für die C-C-Bindung in 1-2 u. 2-3 Position 1.460 Å für die 2-C-O-Bindung
1.250 Å (C=O Ervartungswert von 1.230 i) für die 1-C-O-Bindung 1.340 Å Die H- und
13C-NMR-spekroskopischen Befunde stehen im Einklang mit den obigen, durch die Röntgenstrukturanalyse
erhaltenen Ergebnissen.
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1H-NMR-Spektrum und IR-Spektrum der Substanz sind als Figur 1 bzw.
2 ersichtlich.
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Das oben genannte 13C-NMR-Spektrum geht aus Figur 3 hervor.
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Massenspektrometrisch wurde neben dem Molekülpeak bei 274 ein durch
den Schwefel im Molekül bedingter relativ großer N+2 Peak gefunden. Die Fragmentpeaks
bei 246 (M-CO) und 218 (M-2CO) bestätigen die Tropolonstruktur.
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Eine eingehende Diskussion der ermittelten Daten führt zu der Annahme
der beiden Grenzstrukturen für den Tropolonylrest
von denen der Grenzform A sicherlich das höhere Gewicht zukommt.
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Bei pharmakologischen Untersuchungen zeigte das Ditropolonylsulfid
in vitro ausgeprägte antibakterielle Wirkungen gegenüber einer Vielzahl von Bakterienstämmen
der Spe, es Staph.
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aureus, Staph. epidermidis, ß-hämat. ctrept. (Gruppe A und B), Enterokokken
(Strept. faecalis), E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter,
Serratis marcescens, Indol positiven und -negativen Proteusarten.
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In vivo wurde bei der Maus eine starke Beeinflussung der Infektion
mit Streptokokken und Pneumokokken festgestellt.
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Die DL50-Werte liegen bei intragastraler Applikation in der Größenordnung
der Werte für Tropolon und Bromtropolon. Die Verbindungen wurden als Natriumsalze
in wässriger Lösung bei der Maus getestet. Folgende Werte wurden erhalten: Ditropolonyl-(3',3')-sulfid
... .283 mg/kg Bromtropolon ...................255 255 mg/kg Tropolon .......................385
385 mg/kg Ferner wurden bei Mäusen beiderlei Geschlechts und 13 bis 17 g Körpergewicht
bzw. 17 bis 19 g Körpergewicht die DL50-Werte des in 1 % Methylcellulose suspendierten
Ditropolonylsulfids subkutan, peroral und intraperitoneal bestimmt.
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folgende Werte wurden erhalten: subkutan subkutan 190.5 mg/kg peroral
167.0 mg/kg intraperitoneal ........ 90.0 mg/kg Zum Nachweis der antibakteriellen
Wirksamkeit wurden Blättchentests durchgeführt, deren Ergebnisse in der nachfolgenden
Tazelle zusammengefaßt sind. Bei einer Beschickung der Testplättchen mit je 20 pg
Ditropolonylsulfid konnte (abgesehen von Pseudomonas aeruginosa) ein überraschend
breites Wirkungsspektrum festgestellt werden. Bei allen als "empfindlich" bezeichneten
Bakterienstämmen war um die Testblättchen ein deutlicher Hemmhof zu beobachten.
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Tabelle: Antibakterielles Wirkungsspektrum von Bis- 3-hydroxy-2-oxo-cycloheptatrien-(D,5,7)-yg
-sulfid geprüfte Bakterienart Zahl der davon Stämme Tropolon-- empfindlich Staphylococcus
aureus 50 49 Koagulase-negative Staphylokokken 50 50 B-haemolysierende Streptokokken
Gruppe A 16 16 B-haemolysierende Streptokokken Gruppe B 7 3 Enterokokken (Strept.
faecalis) 30 30 Escherichia coli 50 50 Klebsielle pneumoniae 50 50 Enterobacter
50 48 Serratia marcescens 49 38 Proteus inconstans (Providencia) 32 32 Pseudomonas
aeruginosa 50 4
Die im Plattentest erarbeitete MHK (Minimale Hemmkonzentration)
des Tropolonderivats lag bei je 10 Staphylococcus aureus Stämmen, koagulase-negativen
Staphylokokken und Mikrokokken zwischen 12.5 und 50.0 Fg/ml. Bei je zwei getesteten
Stämmen von E. coli, Enterobacter, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Serratia
marcescens waren ähnliche MHK-Werte festzustellen. Die beiden Pseudomonas aeruginosa-Stämme
zeigten dagegen MHK-Werte von 100.0 bzw. >100.01ug/ml.
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Als weiteres Tropolonderivat mit besonders intensiver antimikrobieller
Wirksamkeit, insbesondere gegen Staph.
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aureus und Pseudomonas aeruginosa-Stämmen wurde das 7-Hydroxytropolon
der Formel II aus einem Pseudomonas-Stamm isoliert, und zwar wurde aus Rheinwasser
der Pseudomonas Stamm Vv (hinterlegt bei DSM unter der Nr.
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DSM 2180) angezüchtet.
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Ei:ae Mutante dieses Stammes produziert ebenfalls 7-Hydroxytropolon.
Diese Mutante wurde bei DSM hinterlegt unter der Nr. DSM 2181.
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Diese Stämme fallen durch eine starke Hemmwirkung gegenüber anderen
Bakterien auf. Es handelt sich bei diesen Stämmen um streng aerobe, gram-negative,
lophotrisch begeißelte Stäbchen, welche Glucose und Gluconat als einzige C-Quellen,
Ammoniumsalz und Nitrat als einzige N-Quellen verwerten können. Arabinose (d- und
1-), Xylose, Mannit, Inosit, Saccharose, Stärke, Maltose und Cellobiose werden nicht
fermentiert. Alle weiteren Untersuchungsergebnisse sprechen für die Zugehörigkeit
dieser Stämme zur Pseudomonas-Gruppe, eine sichere Spezies-Zuordnung war dagegen
nicht möglich.
Die Züchtung erfolgte auf eisenfreien Glukonatmedien
oder mit Fe+++-Zusatz in Anwesenheit von L-Phenalalanin, Phenylessigsäure oder Phenyläthylalkohol.
Die Substanz wird mit Äther, Chloroform oder Dichloromethan extrahiert.
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Im Falle der Verwendung der oben genannten Mutante Nr. DSM 2181 kann
die Kultivierung vorteilhaft bei Raumtemperatur erfolgen.
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Die erhaltene Verbindung, das 7-Hydroxytropolon, der Elementarzusammensetzung
C7H603 ist außerordentlich flüchtig und bildet weiße Kristalle, die sich durch geringste
Eisenspuren braunrot färben. Sie zeigt das Verhalten einer aromatischen Hydroxysäure
und ist in Bicarbonatlösung leicht löslich.
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Das Massenspektrum dieser Verbindung zeigte von M+ (m/z 138) ausgehend
nur Fragmentierungssequenzen durch sukzessiven Verlust von CO, CHO und H20 in unterschiedlicher
Reihenfolge, das H-NMR-Spektrum ein AA'BB'-Muster (4H), Zentrum bei 7.38 ppm sowie
ein breites Singulett bei 8.37 ppm (2H, das bei Zusatz von D O verschwindet). Im
IR-Spektrum finden sich CO- (1610 cm ) und OH- (3230 cm~1) Banden in dem für Tropolone
typischen Bereich.
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Ein Vergleich der physikalischen Eigenschaften mit Literaturdaten
(Fp, IR-, W- und H-NMR-Spektren) ergibt eindeutig, daß es sich bei der isolierten
Verbindung 7-Hydroxytropolon auch um eine neue Verbindung handelt.
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Das 7-Hydroxytropolon hat einen Schmelzpunkt von 134 bis 1350 C. Massenspektrometrisch
wurden folgende Daten ermittelt: (Finnigan 3200, 70 eV, direkt) 138 (M+) 49 5',
110 (M-CO) 100 96, 92 (M-CO-H20) 15 96, 82 (M-2CO) 14 96, 81 (M-CO-CHO) 21 5', 64
(M-2CO-H20) 46 96, 63 (M-CO-CHO-H20) 37 5', 53 (M-2CO-CHO) 38 96, 52 17 5', 51 30
96, 50 28 %. IR (Film auf NaCL) 3230, 1610, 1530, 1520, 1435, 1405, 129Q, i270,
1250, 1230, 1180, 1000, 910, 855, 730 cm 1 W (CH3OH) 245 (4.56), 324 (3.78), 355
(Schulter), 365 (3.85), 375 (3.88) nm (log, ). NMR (90 MHz, CDCl3, TMS): AA'3B'-System
zentriert bei 7.38 ppm (4H); breites Singulett 8.37 ppm (2H, verschwindet bei D20-Zusatz).
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Das rein dargestellte 7-Hydroxytropolon wurde auf seine antibiotische
Aktivität überprüft. Die folgenden 183 frisch aus Klinikmaterial angezüchteten Bakterienstämme
wurden getestet:
1.) Gram-positive Erreger: Staphylococcus aureus
10 Stämme Koagulase-negative Staphylokokken 10 1? Nikrokokken 9 Streptococcus faecalis
(Enterokokken) 10 1 Streptococcus pyogenes (Gruppe A) 8 " Streptococcus agalactiae
(Gruppe B) 10 Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) 1 Stamm 2.) Gram-negative
Erreger: Escherichia coli 20 Stämme Citrobacter intermedius 2 " Citrobacter freundii
6 Klebsiella pneumoniae 13 Klebsiella oxytoca 9 Enterobacter cloacae 11 Enterobacter
aerogenes 3 Serratia marcescens 13 " Proteus mirabilis 15 " Proteus morganii 4 Proteus
vulgaris 5 " Proteus rettgeri 1 Stamm
Pseudomonas aeruginosa 20
Stämme Pseudomonas-Gruppe 1 Stamm Acinetobacter calcoaceticus 2 Stämme Die Differenzierung
der Stämme erfolgte nach dem Bergey's Manual (8. Ausgabe). Als Kontrolle wurden
folgende Stämme mitgetestet: Staph. aureus SG 511-Jena Staph. aureus ATCC 25923
E. coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Zur Empfindlichkeitstestung
wurde der Blättchentest auf Müller-Hinton-Agar (Oxoid Nr. 4) herangezogen. Die Vorkultur
der Stämme erfolgte in Müller-Hinton-Bouillon (Oxoid). Bei den Streptokokken und
Pneumokokken wurde dem Agarmedíum 5 % defibriniertes Hammelblut zugegeben. Die Oberfläche
der Agarplatten wurde mit je 1 ml der Übernachtkulturen (Keimkonzentrationen rd.
105 bis 106/ml) beimpft, nach Trocknen wurden die Testblättchen aufgelegt, welche
mit 1007-Hydroxytropolon beschickt worden waren.
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Die Ergebnisse wurden nach 18-stündiger Bebrütung bei 370 C abgelesen.
Alle 183 Bakterienstämme zeigten um die Testblättchen sehr deutliche Hemmhöfe mit
einem Radius vom Blättchenrand aus von 10 bis 30 mm (im Durchschnitt lag der Radius
bei 20 mm).
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Die antimikrobielle Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Tropolonderivate
und ihrer pharmakologisch verträglichen Salze
bietet eine willkommene
Bereicherung der modernen Therapie und die Erfindung umfaßt mithin pharmazeutische
Zubereitungen, die zumindest eines der Tropolonderivate der Formel I oder der Formel
II oder ein pharmakologisch verträgliches Salz derselben, vorzugsweise ein Alkalisalz,
zusarnmen mit üblichen Hilfs- und/oder Trägermitteln enthalten.
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Diese Zubereitungen können digestiv verabreicht, injiziert oder lokal
angewendet werden. Sie werden dafür z.B. als Tabletten, DragEes, Kapseln, Zäpfchen,
Lösungen oder Pasten dargeboten. Die Applikation erfolgt z.B. intraperitoneal, intravenös
oder subkutan, vorzugsweise aber per os oder lokal. Die Tagesdosis richtet sich
nach der Schwere der Erkrankung, der Art der Applikation und dem Allgemeinbefinden
des Patienten.
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Nachfolgend wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Tropolonderivate
an Hand vun Beispielen beschrieben: Beisiel 1 Gewinnung von Ditropolonylsulfid ausgehend
von Agar-Plattenkulturen a) Kulturmedium 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0.5 g Magnesiumsulfat
(7H20), 5 g Ammoniumsulfat, 18 g Bacto-Agar und 15 g Natriumgluconat wurden in 1
1 Wasser gelöst und im Dampftopf sterilisiert. t>azu wurden 10 ml einer gesondert
im Dampftopf sterilisierten 0.5 obigen Eisencitratlösung hinzugefügt. Die Mischung
wurde mit 301 %iger KOH auf pH 7.2 eingestellt und in Platten gegossen.
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b) Kulturstamm Als Kulturstamm diente der Pseudomonas cepacia Stamm
mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 17759, mit dem die Kulturplatten geimpft wurden.
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c) Bebrütung Die Bebrütung erfolgte bei 300 C. Die Platten wurden
48 Std. lang bei der Bruttemperatur gehalten.
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Bei Zugabe von 10 0 5' DST-Oxoid-Fertignährböden während der Herstellung
der Kulturplatten wachsen die Kolonien größer (DST-Oxoid-Fertignährboden allein
liefert gelbliche Kolonien im Gegensatz zu den dunkelbraunen Kolonien auf dem vorstehend
genannten Nährsubstrat).
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d) Aufarbeitung Das Bakterienmaterial wurde von den festen Nährböden
abgekratzt und gefriergetrocknet. 600 g gefriergetrocknetes Zellmaterial wurde mit
6 1 Chloroform, dem zuvor 0.4 1 rauchende Salzsäure zugesetzt worden waren, ohne
äußere Wärmezufuhr 2 Stunden lang extrahiert. Danach wurde die Flüssigkeit filtriert
und der Rückstand noch 2mal wie beschrieben behandelt. Die vereinigten Filtrate
wurden säurefrei gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, klarfiltriert und bei
400 C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
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Der dabei verbleibende Rückstand wird 3mal mit je 0.5 1
10
5'iger Natriumcarbonatlösung unter Erwärmen ausgezogen. Die vereinigten, filtrierten
Extrakte werden anschließend mit Salzsäure auf pH 2.0 eingestellt, wobei die Substanz
als hellgelber mikrokristalliner Niederschlag ausfällt. Das Produkt wird abgenutscht,
säurefrei gewaschen und bei 400 C 20 Stunden im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
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Zur weiteren Reinigung wird die Substanz bei 1400 C und 10 5 bar
langsam sublimiert. Es resultieren intensiv gelb gefärbte säulenförmige Kristalle.
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C14H1004S (274.29) berechnet C 61, 32 5'; H 3.67 5'; 0 23.33 5';
S 11.69 % gefunden C 61.22 5'; H 3.65 5'; 0 23.28 5'; S 11.68 % BeisPiel 2 Gewinnung
von Ditropolonylsulfid ausgehend von Flüssigkulturen a) Kulturmedium Für die Flüssigkulturen
wurde das gleiche Nährsubstrat ohne Agar (allerdings wiederum mit DST-Oxoid-Fertignährboden
in gleicher Weise wie in Beispiel 1) verwendet. Das Kulturmedium wurde in 11 Rundkolben
( je 250 ml) gegeben.
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b) Kulturstamm Pseudomonas cepacia ATCC 17759 wie in Beispiel 1
c)
Bebrütung Die Bebrütung erfolgte bei 300 C. Bei Bebrütung ohne zusätzliche Belüftung
und Schüttelung wurden die Kulturen frühestens nach 3 Tagen aufgearbeitet. Ein Zusatz
von CyStein (50 mg/l) oder von 0.1 % Hefeextrakt erwies sich als zweckmäßig in bezug
auf Wachstum und Ausbeute.
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d) Aufarbeitung Die bebrüteten Flüssigkulturen wurden vereinigt und
die Zellen nun eine Stunde in etwa der 10-fachen Menge Aceton gerührt, abzentrifugiert
und derselben Behandlung ein zweites Mal unterworfen. Sie wurden nach Abzentrifugieren
(oder Abfiltrieren) gut mit Methanol gewaschen und darauf in der 10-fachen Menge
Methanol suspendiert. Dieser Suspension wurde unter Rühren etwa 5 bis 10 % rauchende
Salzsäure hinzugefügt. Es wurde eine Stunde lang weitergerührt. Nun wurde das gleiche
Volumen Chloroform hinzugefügt und darauf etwa das doppelte Volumen Wasser. Die
Flüssigkeit trennte sich in zwei Schichten. Die Chloroformschicht wurde abgelassen
und zur Beseitigung der entstandenen Emulsion zentrifugiert. Die braune Chloroformlösung
wurde in leichtem Vakuum eingedampft und hinterließ einen braunschwarzen Rückstand.
Dieser wurde mit 10 9diger Natriumbicarbonatlösung behandelt. Das Produkt ging nun
mit gelber Farbe in Lösung. Es wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Dabei
fiel schon der größte Teil des schon fast reinen Antibiotikums aus. Es wurde in
Chloroform aufgenommen und wieder im leichten Vakuum
zur Trockene
gebracht. Zur weiteren Reinigung wurde das gelbe Pulver mit rauchender Salzsäure
24 Std. stehen gelassen, wieder in Chloroform aufgenommen, gut mit Wasser gewaschen
und zur Trockene verdampft. Es wurde zur Analyse aus Aceton umkristallisiert.
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Das Produkt zeigte die gleichen Eigenschaften wie in Beispiel 1.
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Die dünnschichtchromatographische Untersuchung (Cellulose-Fertigplatten
der Fa. Merck, Darmstadt, Fließmittel n-Propanol/Wasser/Essigsäure/Dioxan = 5/15/10/10,
Entwicklung unter Kammersättigung) ergab eine einheitliche Substanz.
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Beisiel 3 Gewinnung von Ditropolonylsulfid aus mannit-oder xylosehaltigem
Nährmedium a) Kulturmedium Das Kulturmedium enthielt 4 g KH2P04, 0.5 g MgS04, 7
H20, 5 g (NH4)2S04, 15 g Mannit oder Xylose auf 1 1 Wasser. Nach dem Sterilisieren
wurde der pH-Wert auf 7.4 eingestellt.
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b) I<ulturstamm Pseudomonas cepacia ATCC 17759
c)
Bebrütung Die Flüssigkulturen wurden unter starker Belüftung durch Rühren bei 300
C bebrütet. Wenn eine kleine Probe bei Zusatz von Fe+++ eine starke Rotfärbung zeigte,
wurde die Kultur aufgearbeitet (nach 3 Tagen).
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d) Aufarbeitung Die Kultur wurde nach Ansäuern (mit HCl) auf pH 3.0
bis 4.0 mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde zur Trockene gebracht
und der Rückstand wurde mit Methanol (zur Entfernung der stark störenden Polyhydroxybuttersäure)
extrahiert. Das Methanol, das die Substanz enthielt, wurde abgedampft und der Rückstand
wurde mit Bicarbonat extrahiert. Nach Ansäuern der Lösung fiel die gesuchte Substanz
aus.
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Beispiel 4 Gewinnung von 7-Hydroxytropolon a) Kulturmedium Als Kulturmedium
diente ein Gluconatmedium mit 4 g KH2P04, 0.5 g MgSO4, 7 H20, 5 g (NH4)2S04, 10
g Glucose ad 1000 ml aqua dest., pH 7.5.
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bj Kulturstamm Pseudomonas Stamm Vv (DSM Nr. DSM 2180)
c)
Bebrütung Die Flüssigkulturen wurden 3 bis 4 Tage lang bei 30 C ohne zusätzliche
Belüftung durch Schütteln oder Rühren bebrütet.
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d) Aufarbeitung Die gesuchte Substanz wurde aus der Flüssigkultur
nach Ansäuern mit HCl auf pH 3.0 mit Dichlormethan (2 x 250 ml auf 500 ml Kulturflüssigkeit)
extrahiert. Die mit Natriumsulfat getrocknete Dichlormethanlösung hinterließ nach
dem Abdampfen einen gelblich bräunlichen Rückstand, von dem, auch schon ohne daß
ein Vakuum angelegt wurde, der größte Tell sublimierte und sich am oberen Kolbenrand
in Form weißer Kristalle abschied. Diese Kristalle färbten sich schon beim Berühren
mit Eisenspateln oder durch geringste Eisenspuren braunrot. Das Ergebnis der Analyse
dieser Substanz ergab, daß es sich'um das 7-Hydroxytropolon handelt. Fp (im abgeschmolzenen
Röhrchen) 134 bis 1350 C.
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Die Elementaranalyse für C7H603 (M = 138; massenspektrometrisch bestimmt)
ergab folgende Werte: berechnet: 60.85 5' C, 4.38 % H, 34.77 % 0 gefunden: 61.01
% C 4 55 5' H, 34.55 % O.
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Die Lösung gab mit Staph. aureus und verschiedenen Pseudooas aeruginosa
Stämmen starke antibiotische Effekte.
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Das überdestillierte Dichlormethan enthielt noch geringe
Anteile
der außerordentlich flüchtigen Substanz, die mit Bicarbonat wieder ausgeschüttelt
wurden.
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BeisPiel 5 Gewinnung von 7-Hydroxytropolon Kulturstamm: Pseudomonasstamm
Vv (DSM Nr.DSM 2180) Die Anreicherung dieses Produktes wurde in folgendem Medium
durchgeführt: KH2P04 4 g, MgSO4 (7 H20) 0.5 g, (NH4)2 SO4 5 g, Glucose 10 g, pH
7.4 mit KOH. 1 1 dieses Mediums wurde mit dem Pseudomonas vV beimpft, die Bebrütung
erfolgte bei Zimmertemperatur unter starker Belüftung mittels Magnetrührer.
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Nach einem 3-tägigen Wachstum wurde die Kultur auf pH 3.0 angesäuert
und dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde
der Rückstand unter normalem Luftdruck bei 1000 C sublimiert. Dabei konnte als weiße
kristalline Substanz das 7-Hydroxytropolon gewonnen werden.
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Beispiel 6 Gewinnung von 7-Hydroxytropolon a) Kulturmedium Als Kulturmedium
diente ein Gluconatmedium mit 2 mg Eisensulfat, 4 g KH2P04, 0.5 g MgSOlr 7 H20,
5 g (NH4)2S04, 10 g Glucose ad 1000 ml aqua dest., pH 7.5.
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b) Kulturstamm Pseudomonas-Stamm Vv (DSM 2180) c) Bebrütung / Aufarbeitung
Bebrütung und Aufarbeitung wie in Beispiel 4 beschrieben, wobei allerdings die Bebrütungstemperatur
bei Raumtemperatur lag.