DE1767010A1 - Verfahren zur Reinigung von reduzierten Pyridin-Coenzymen an Ionen-Austauschern - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von reduzierten Pyridin-Coenzymen an Ionen-AustauschernInfo
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Description
CP. Boehringer & Söhne GmbH, Mannheim
an Ionen-Austauschern
Die beiden reduzierten Pyridin-Coenzyme Nicotinamid-adenindinucleotid
und Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADH, NADPH) spielen eine hervorragende Rolle in der biochemischen
Analytik, speziell in ihrer angewandten J?orm in der klinischchemischen Diagnostik. Ihr Einsatz auf diesem Gebiet basiert
auf dem optischen Test von O.Warburg, bei dem die Abnahme
der Absorption des reduzierten Pyridin-nucleotids bei 34o oder 366 nm im Verlauf einer enzymatisehen Dehydrierung gemessen
und zur Aktivität eines Enzyms oder zur Konzentration eines Substrats in Beziehung gesetzt wird. Die Reinheit der
zum Test eingesetzten reduzierten Pyridin-Coenzyme ist dabei von grosser Bedeutung. Je nach Reinheit des als Ausgangsprodukt
dienenden oxydierten Pyridin-Ooenzyms und der Bedingung bei der Reduktion, enthält das reduzierte Pyridin-Goenzym
wechselnde Mengen der oxydierten Form (NAD, NADP),
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von Adenosin-i'-Monophosphat sowie Inhibitoren von Dehydrogenasen.
Der Geahlt an oxydierten Pyridin-Coenzymen wirkt insbesondere bei fluorometrisehen Messungen sBrend; Adenosin-5'-Monophosphat
beeinflusst z.B. die Messung der Phosphorylase-Aktivitäten; auf Inhibitoren schliesslioh, über deren Natur
noch wenig bekannt ist, reagieren einige Dehydrogenasen, besonders Lactat-Dehydrogenase (LDH), sehr empfindlich.
Da die Aktivitätsbestimmung der LDH in Körperflüssigkeiten
besondere diagnostische Bedeutung hat, kommt der Schaffung eines Inhibitor-freien reduzierten Pyridin-Coenzyme besondere
Bedeutung zu.
Die Peinreinigung von reduzierten Pyridin-Coenzymen durch Säulenchromatographie wurde mehrfach beschrieben. Hierbei
wurde jedoch bisher wegen des notwendigen alkalischen Elutionsmilieus ausschliesslich mit Zellulosesäulen gearbeitet, speziell
mit DEAE-Zellulose. Der wesentliche Nachteil dieser
bekannten Verfahren besteht darin, dass sie für eine präparative Darstellung im Labormaßstab oder gar technische Dimensionen
ungeeignet sind, denn Zellulosesäulen sind in grosseren
Dimensionen aufgrund ihrer geringen Kapazität, der Verstopfungsund Infektionsgefahr schwer manipulierbar.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass basische Austausohharze
im alkalischen Milieu ausgezeichnete Trennwirkungen bei reduzierten Pyridin-Coenzymen ausüben.
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Das erfindungsgemässe Verfahren zur chromatographischen
Reinigung von reduzierten Pyridin-Cοenzymen besteht daher
darin, dass nicht in Hydroxylform vorliegende schwach basische Anionenaustauschharze verwendet werden und die
Elution bei einem pH-Wert über 7,51 vorzugsweise von etwa
9-12 durchgeführt wird.
Die erfindungsgemäss verwendeten handelsüblichen Anionenaustausoher
mit optimaler Trennwirkung für Pyridin-Coenzyme und verwandte Nucleotide sind schwach basische Harze, deren
Chromatographiebereich üblicherweise im sauren liegt und deren Kapazität bei pH-Werten über 7 so stark nachlässt,
dass ihre Verwendung bei diesen pH-Werten normalerweise nicht in Betracht gezogen wird. Da die reduzierten Pyridin-Coenzyme
jedoch bekanntlich extrem säurelabil sind und bereits bei neutralem pH-Wert in wässrigen Lösungen nur sehr
begrenzt haltbar sind, war bisher die Verwendung von basischen Austauscherharzen zur Trennung dieser Pyridin-Coenzyme
als nicht möglich angesehen worden, da sie nur bei sauren pH-Werten eine Trennwirkung erwarten Hessen, die reduzierten
Pyridin-Coenzyme aber nur im basischen Bereich gehandhabt werden können, wo die schwach basischen Austauscherharze
für nicht einsetzbar gehalten wurden.
Als besonders günstig erwiesen si oh Trennungen von reduzierten Pyridin-Coenzymen und Verunreinig «.agen der oben erwähnten
ein
Art, wenn Elut ions system angewendet v, i„lo; hei dem die
Art, wenn Elut ions system angewendet v, i„lo; hei dem die
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Konzentration des Elutionsmittels zur Ablösung der reduzierten Pyridin-Coenzyme von der Säule so eingestellt wurde»
dass die Bedingungen einer Durohlaufohromatographie annähernd
eingehalten wurden. Hierdurch wurde erreicht, dass etwas weniger stark absorbierte Verunreinigungen die Säule praktisch ohne Wechselwirkung mit dem Austauschbare passieren,
während stärker gebundene Verunreinigungen zur Elution eines konzentrierteren Lösungsmittels bedürfen. Hierbei wird
vorteilhaft beim Elutionsmittel eine Ionenstarke gewählt,
die zu keinem echten Austausoh der Komponenten mit den Gegenionen des Harzes führt, sondern die Trennung nur durch
die relative Verzögerung der verschiedenen Verbindungen beim Durchfluss durch die Säule ermöglicht.
Die Art der Beladung des Austauscherharzes ist nicht kritisch.
Im wesentlichen eignen sich hierfür alle Ionen, die keine mit NADH oder NADPH reagierenden Gruppen enthalten oder
sonstwie die Reaktion stören können. Beispielsweise eignen sich zur Beladung, die normalerweise durch Äquilibrierung
durchgeführt wird, Acetat-, Formiat-, Carbonat- und sogar
SuIfat-J Ionen.
Auch die Art des Elutionsmittels lässt sioh in weiten Grenzen
variieren. Wesentlich ist, dass zur Elution salzhaltige Pufferlösungen verwendet werden, die vorzugsweise das gleiche Anion
enthalten, mit dem der Austauscher äquilibrlert wurde. Beispiele für geeignete Elutionsmittel sind Triäthylammonium-Carbonat, Triäthylammonlum-Formiat, Natrium-Formiat, Trihydroxymethylaminomethan-Formiat und Natriumsulfat.
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Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich, wie erwähnt,
in dem relativ weiten pH-Wert-Bereich von 7f5 bis 13 durchführen.
Vorzugsweise wird zwischen pH- 9 und 12 gearbeitet. Die obere Grenze für den pH-Wert-Bereich wird durch eine
konkurrierende Reaktion, nämlich den Austausoh von Hydroxy 1-ionen
aus dem Medium gegen das Anion des Harzes gesetzt, denn Hydroxyl!onen-beladene Harze zeigen keine Trennwirkung.
Die untere Grenze ist dadurch bedingt, dass bereits bei pH 7,o die Beständigkeit der reduzierten Pyridin-Ooenzyme stark
abnimmt.
Als Harze können alle schwach basisohen Anionen-Austauscherharz
e verwendet werden. Hydroxylionen-beladene Harze zeigen keine Trennwirkung. Typisohe Beispiele für brauchbare handelsübliche
Harze sind die unter den Bezeichnungen Dowez 1x2,
1x4 und Aberlite IR 4 B erhältliohen schwach basisohen
Anionenaustauscher.
Sine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht im Zusatz organischer Lösungsmittel
zu dem Elutionssystem. Hierdurch wird eine präparatlve
Trennung in bisher ungewohnten Substanzkonzentrationen erreicht. Dieser Zusatz hat zur Folge, dass bei einem geeigneten
Mischungsverhältnis duroh Zurüokdrängung der Dissoziation
die Verwendung geringerer Salzkonzentrationen im Elutionspuffersystem möglioh wird und gleichzeitig eine
konzentriertere Elution der gewünschten Substanz von der Säule
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erfolgt. Ein Mischungsverhältnis let dann geeignet, wenn
hierbei nooh eine Dissoziation stattfindet, diese aber deutlich Terringert wird. Im allgemeinen sind Zusätze von
etwa 2o bis 5o Vol. Ji geeignet. Bei höheren Anteilen findet häufig, je naoh dem verwendeten organischen Lösungsmittel,
keine Dissoziation mehr statt. Bei geringeren Mengen ist der Effekt häufig nicht mehr deutlioh ausgeprägt.
Die Zusammendrängung der einzelnen !Fraktionen hat eine schärfere Trennung und damit eine Verstärkung des oben genannten Effektes zur Folge. Als organische Lösungsmittel
eignen sloh für diesen Zweok die mit Wasser misohbaren
nicht zu stark sauren, keine mit den Pyridin-Coenzymen
reaktionsfähigen Gruppen enthaltenden Lösungsmittel. Lösungsmittel die Methyloarbonylgruppen (CHyCO-) enthalten,
sind im allgemeinen ungeeignet. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind die mit Wasser misohbaren
Alkohole, Diozan, Tetrahydrofuran, und Dimethylformamid. Aus Gründen der bacterizlden Wirkung eignet sioh Isopropylalkohol besonders gut,für den erfindungsgemässen Zusatz.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Trennung
der reduzierten Fyrldin-Coenzyme voneinander und von den
sie begleitenden Verunreinigungen Im präparativem Kaistab
und mit besonders gutem Ergebnis auf einfaohe und rasche Welse. Überraschenderweise zeigte sioh ausserdem, dass
beim erfindungsgemässen Verfahren mit steigender Alkalität
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die sehr störende Reoxydation des NASH zu NAD während
der Chromatographie stark zurückgedrängt wird.
In der beigefügten Zeichnung sind Elutionskurven gezeigt,
welche die Ergebnisse mehrerer in den Beispielen gezeigter Aueführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens
zeigen. Die Elutionskurven wurden mit einem die Absorbtion bei 25o nm automatisch registrierenden Gerät aufgenommen.
Sie zeigen, dass erfindungsgemäss gute Trennungen der reduzierten Pyridin-Coenzyme von allen störenden Begleitstoffen erhalten werden. Bas Verfahren der Erfindung eignet
sich daher zur präparativen Feinreinigung der reduzierten Pyridin-Coenzyme bis hin zum technischen Maßstab.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung!
Dowex 1 χ 2 (1oo - 2oo mesh) wird mit o,4 M Triäthylammoniumformiat pH 7,5 äquilibriert. Der Durchmesser der Säule beträgt 1,8 om, die Länge 75 cm. Aufgesetzt werden 5oo mg NADH
in demselben Lösungsmittel gelöst. Die Elution erfolgt ohne Änderung des Lösungsmittels durchgehend mit o,4 M Triäthyl-■ammoniumfomiat pH 7,5, also demselben Puffer,der zum Xquilibrieren der Säule und zum Auflösen der Substanz verwendet wurde.
Das Diagramm 1 zeigt den Elutionsverx&ui'. Xn den ersten
Gipfeln handelt es sich um Verunreinigungen, wie NAD, AHP
-. 8 -109834/12fcj
und derzeit noch nicht identifizierte Begleitstoffe; öfters
enthält der unmittelbar vor dem wHauptgipfelw (NADH) erscheinende
"Vorgipfel" Inhibitoren der Lactatdehydrogenase.
4o ml Dowex 1 χ 2 (1oo - 2oo mesh) werden mit o,4 M Triäthylammoniumcarbonat-Puffer
pH 7,5 äquilibriert. Die Säule hat einen Durchmesser von 1,5 cm und eine Höhe von 3o cm. 1 g
NADH wird in 2,5 ml o,4 M Triäthylammoniumcarbonat pH 7»5
gelöst und auf den Austauscher gebracht. Anschliessend wird mit demselben Elutionsmittel weiter eluiert. Nach dem Durchlaufen
der beiden ersten Gipfel wird die Konzentration des Puffers auf 1 M Triäthylammoniumcarbonat pH 7»5 erhöht.
Dadurch erscheint der im Diagramm 1 noch breit auseinandergezogene Gipfel des NADH in wesentlich verkUrzterer und
zueammengedrängterer Form, wie Diagramm 2 zeigt.
Diese und die folgenden Formen der Chromatographie sind aufgrund der hohen Belastbarkeit (kurze Säule !) bei der Trennung
besonders für präparatives Arbeiten in technischem Maßstab geeignet.
Dowex 1 χ 2 (1oo - 2oo mesh) wird mit o,3 H Natriumformiat
in 2o i» Isopropylalkohol von pH 8,5 äquilibriert. Säulemasse
wie bei Beispiel 2. 1 g NADH wird in 5 ml desselben Puffere gelöst und auf den Austauscher gebracht. Die Elution
1 09834/1 295
— Q _
wird ebenfalls mit dem o,3 molaren BTatriumformiat und 2ο j6
Isopropylalkoholgemisoh durchgeführt» bis die ersten beiden
Gipfel im ELuat erscheinen. Hun wird auf 1 H ITatriumformiat
pH 8,5/5o i» Isopropylalkohol erhöht. Dabei kommt das HADH in
so hoher Konzentration von der Säule, dass es aus dem ELuat direkt gefällt werden kann. Diagramm 3 zeigt dies anschaulich·
Dowex 1 ζ 2 (1oo - 2oo mesh) mit o,3 M Natriumformiat /2o i»
Isopropylalkohol, pH 8,5 äquilibriert wie in Beispiel 3· Säulenvolumen und aufgesetzte NADH-Menge entsprechen Beispiel 3· Die
ELution der ersten beiden Gipfel erfolgt wie in Beispiel 3. Nach Durchlauf der ersten beiden Gipfel wird auf o,5 M Hatriumforaiat und 5o % Isopropylalkohol pH 8,5 erhöht. Das FlDH erscheint in nahezu derselben Konzentration wie in Beispiel 2.
Die ansohliessende Erhöhung der Konzentration auf 1 M Hatriumformiat /5o f>
Isopropylalkohol pH 8,5 ergibt einen weiteren Gipfel, der eine stark inhibierende Wirkung auf die Lactat-Dehydrogenase-Aktivität zeigt. Das Diagramm 4 der Zeichnung
zeigt die erzielte Reinigung.
0,4 M Hatriumformiat /2ο Ji Ieopropylalkohol pH 8,5 äquilibriert.
von
Anaohllessend wird eine Miechung/FADP und HADFH (3o bzw. 12o mg)
aufgetragen· Die KLution erfolgt mit einem Gradienten, der von
- 1o -10983A/129S
- 1ο -
o,4 M Hatriumformiat /2 ο i>
Ieopropylalkohol naoh 1 N Hatriumformiat /5o i>
Isopropylalkohol pH 8,5 läuft. Wie das KLutlonediagramm. 5 zeigt, können HiDP and BlSPH unter diesen Bedingungen ausgezeichnet getrennt werden.
Es wird wie in Beispiel 3 beschrieben vorgegangen, jedoch werden die Elutionemittel auf pH 1o,5 eingestellt. Im NADH
sind nur noch o,2 Jf NAD nachzuweisen, im Gegensatz zu o,5
- 1 f> bei schwächer alkalischem Milieu.
Dowex 1 χ 4 (1oo - 2oo mesh) wird mit o,5 H latriumsulfatlösung pH 8,5 in die Sulfatform überführt. Aneohllessend wird
mit sohwaoh alkalisch gemachtem Wasser gewaschen und der Austauscher mit 25o mg IADH in 2 ml Wasser gelöst beladen. Die
ansohliessende Gradientenelutlon mit einem τοη sohwaoh alkalischem Wasser pH 1o,5 naoh o,5 M latriumsulfat pH 1o,5
gehenden Gradienten zeigt ebenfalls eine einwandfreie Trennung von HAD und HADH. Siehe dazu ELutloneAiagramm 7.
Bei allen Beispielen kann das HADH aus den Huaten naoh üblichen Methoden, z.B. durch fraktionierte lallung mit
organischen Lösungsmitteln, z.B. Ithanol oder aber als Bariumsalz abgetrennt werden.
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Claims (3)
1. Verfahren zur chromatographiechen Reinigung von reduzierten
Pyridin-Coenzymen, dadurch gekennzeichnet, dass
nicht in Hydroxylform vorliegende schwach basische Anionenaustauschharze
verwendet werden und die Elution bei einem pH-Wert Über 7»5» vorzugsweise von etwa 9 12
durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
der Austauscher mit dem zur Trennung der Komponenten von der Säule verwendeten Fliessmittel äquilibriert
wird und die Elution bei konstantem pH-Wert und steigender Ionenstärke durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
dass dem ELutionsmittel mit Wasser mischbare, gegenüber
den einzelnen Komponenten inerte organische Lösungsmittel, vorzugsweise in einer Menge von etwa 2o - 5o
Vol. i», zugesetzt werden.
109834/1295
Priority Applications (4)
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| DE19681767010 DE1767010A1 (de) | 1968-03-20 | 1968-03-20 | Verfahren zur Reinigung von reduzierten Pyridin-Coenzymen an Ionen-Austauschern |
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|---|---|
| DE1767010A1 true DE1767010A1 (de) | 1971-08-19 |
Family
ID=5699200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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