DE1620547B - Verfahren zur Herstellung von 5-Ribnucleotiden - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden durch Umsetzung von Ribonucleosiden mit einem speziellen Phosphorylierungsmittel in Gegenwart von bestimmten Phenolen und anschließende Hydrolyse.

Ribonucleoside haben drei Hydroxylgruppen in 2'-, 3'- und 5'-Stellung an ihrer Ribosekomponente. Wenn Ribonucleoside direkt der Phosphorylierung unterworfen werden, entsteht ein Gemisch von Ribonucleosid-2',5'-diphosphat und -3',5'-diphosphat. Zur selektiven Herstellung von 5'-RibonucIeotiden aus dem entsprechenden Ribonucleosid war es daher notwendig, die Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stellung mit geeigneten Substituenten zu schützen, bevor die Phosphorylierung in der 5'-Stellung vorgenommen wurde.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotid aus dem entsprechenden Ribonucleosid bestehen darin, daß man die 2'- und 3'-Hydroxylgruppen an der Ribosekomponente mit einem Acylrest (z. B. mit einem Acetylrest oder Benzoylrest) oder einer Isopropylidengruppe schützt und anschließend die freie 5'-Hydroxylgruppe durch geeignete Mittel phosphoryliert, worauf die schützenden Gruppen entfernt werden, oder aber daß man in Gegenwart von Ketonen arbeitet.

Es wurde nun überschaschenderweise gefunden, daß nur eine OH-Gruppe in der 5'-Stellung des Ribonucleosids selektiv phosphoryliert wird, ohne daß ein Schutz der Hydroxylgruppen in der T- und 3'-Stellung vor der Phosphorylierung erforderlich ist, wenn das Ribonucleosid mit einem Phosphorylierungsmittel in Gegenwart von bestimmten Phenolen umgesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleosiden durch selektive Phosphorylierung von Ribonucleosiden in 5'-Stellung mit Pyrophosphoryltetrachlorid oder Phosphoroxychlorid, das auch teilhydratisiert bzw. -alkoholisiert sein kann und anschließender Hydrolyse des zurächst erhaltenen Phosphorylierungsproduktes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Phosphorylierung in Phenol, Chlorphenol, Kresol und/oder Xylenol als Lösungsmittel durchführt, ohne die Hydroxylgruppen in 2'-, 3'-Stellung vorher besonders zu schützen.

Beim Verfahren der Erfindung werden die 5'-Ribonucleotide in guter Ausbeute in einfacher Weise erhalten.

Für die Zwecke der Erfindung kommen natürliche und synthetische Ribonucleotide in Frage, die eine Purinbase (z. B. Adenin, Hypoxanthin, Guanin), eine Pyrimidinbase (z. B. Cytosin, Uracil, Thymin) und eine Pyridinbase (z. B. Nikotinamid und Ribonucleosid) enthalten.

In das Verfahren der Erfindung werden Phenol, o-Chlorphenol, Kresol (o-, m-, p-Kresol oder deren Gemische) und Xylenol als Lösungsmittel eingesetzt.

Als Phosphorylierungsmittel werden Pyrophosphoryltetrachlorid, Phosphoroxychlorid, teilweise hydrolysiertes oder teilweise alkoholisiertes Phosphoroxychlorid in das Verfahren der Erfindung eingesetzt. Diese Verbindungen werden allein oder in Kombination verwendet.

Die obengenannten Ribonucleoside, Phenole oder Phosphorylierungsmittel müssen nicht unbedingt in reiner Form verwendet werden.

Die verwendeten Mengen der Phenole und des Phosphorylierungsmittels sind verschieden, je nach der Art des Ribonucleosids, der Phenole oder Phosphorylierungsmittel. Das Phosphorylierungsmittel wird in einer Menge von etwa 1 bis 30 Mol, vorzugsweise von etwa 2 bis 15 Mol, bezogen auf das Ribonucleosid, verwendet. Die verwendete Phenolmenge beträgt wenigstens etwa 10 Mol, bezogen auf das Ribonucleosid. Die Phenole werden in einer Menge von etwa 10 bis ICO, vorzugsweise von etwa 15 bis 50 Mol pro Mol Ribonucleosid verwendet.

ίο Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur ab. Gegebenenfalls kann während der Reaktion erhitzt oder gekühlt werden.

Da die Phenole als Lösungsmittel wirken, ist kein weiteres Lösungsmittel für die Reaktion erforderlich.

Gegebenenfalls kann jedoch ein geeignetes Lösungsmittel (z. B. Benzol, Xylol, Dioxan) zusammen mit den Phenolen verwendet werden, solange es die Reaktion nicht hemmt. Insbesondere kann bei Verwendung von Benzol zusammen mit den Phenolen als Lösungsmittel die Menge der Phenole verringert werden.

Die Hydrolyse wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, indem beispielsweise das Produkt in Wasser gegossen wird oder indem der pH-Wert des in der ersten Stufe erhaltenen Reaktionsgemisches auf einen Wert im schwach sauren Bereich zweckmäßig auf etwa 1 bis 2 eingestellt wird, indem eine Alkaliverbindung (z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat) zugesetzt wird.

Hierbei wird das gewünschte 5'-Ribonucleotid gebildet. So lassen sich gemäß der Erfindung 5'-Ribonucleotide im Vergleich zu bekannten Verfahren, z. B. dem der französischen Patentschrift 1 369 079, unter milderen Bedingungen in kürzerer Reaktionszeit und höherer Ausbeute herstellen.

Beispiel 1

Zu einer Suspension von 196 g Inosin in 3,8 1 m-Kresol wurden 380 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 1O⁰C gegeben. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 13,6 1 Eiswasser gegossen, worauf das Gemisch mit 2 1 Benzol geschüttelt wurde, um das m-Kresol in die Benzolschicht zu überführen. Die Benzolschicht wurde zweimal mit 4,51 Wasser gewaschen. Die mit der Waschflüssigkeit vereinigte wäßrige Schicht wurde mit Benzol geschüttelt. Dann wurde die wäßrige Schicht abgetrennt und mit wäßriger 5 n-Natriumhydroxydlösung auf den pH-Wert 1 eingestellt.

Die Analyse der eingestellten Lösung durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, pH-Wert 9,2) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in quantitativer Ausbeute gebildet worden war.

Die Lösung wurde mit Wasser auf ein Volumen von 50 1 gebracht und an einer Säule adsorbiert, die mit 2 kg Aktivkohle gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,7%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8,6 eingestellt und eingeengt, wobei 240 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 83,5%.

Beispiel 2

Ein Gemisch von 60 ml m-Kresol und 2,7 g Inosin wurde eine Stunde bei 40 bis 5O⁰C gerührt, wobei sich

eine homcgene Lösung bildete. Nach Kühlung der Lösung auf 5°C wurden 20 ml Pyrophosphoryltetrachlorid zugesetzt und das Gemisch 2 Stunden gerührt. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise ergab 3,3 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat. Die Ausbeute betrug 85 %.

Das erhaltene Produkt wurde durch Papierelektrophorese (1. Boratpuffer, pH9,2; 2. Citratpuffer, pH 5,8) und Papierchromatcgraphie (aufsteigende Methode unter Verwendung von 1. Isobuttersäure:: wäßrigem 0,5 n-Ammoniak = 10: 6 und 2. gesättigtem Ammoniumsulfat : Isopropanol: Wasser = 79 : 2 :19) analysiert. Durch die Wanderungsstrecke und den Rf-Wert wurde das Produkt als Inosin-5'-monophosphat identifiziert. Die Perjodsäure-Benzol-Reaktion des Produkts war positiv. Es wurde durch 5'-Nucleotidase aus Stiersamen vollständig dephosphoryliert.

Beispiel 3

Zu einer Suspension von 3,9 g Adenosin in 76 ml m-Kresol wurden 7,6 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 10°C gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 3,3 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Adenosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten. Die Ausbeute betrug 75 %.

Beispiel 4

Zu einer Suspension von 3,9 g Inosin in 76 ml m-Kresol wurden 13,8 g rohes Pyrophosphoryltetrachlorid, das 55 Gewichtsprozent Pyrophosphoryltetrachlorid und 45 Gewichtsprozent Phosphoroxychlorid enthielt, bei 10° C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 4,8 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 84%.

B e i sp i el 5

Zu einer Suspension von 1,9 g Inosin in 56 ml einer Mischung aus 31 Gewichtsprozent Phenol, 12 Gewichtsprozent o-Kresol, 38 Gewichtsprozent m-p-Kresol, 19 Gewichtsprozent Xylenol wurden 5,6 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 1O⁰C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,35 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 85 %·

Beispiel 6

Zu einer Suspension von 1,97 g Guanosin in 36 ml m-Kresol wurden 5,4 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 1O⁰C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,0 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Guanosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 70%.

Beispiel 7

Zu 600 ml o-Chlorphenol wurden 2,7 g Inosin gegeben. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei 4O⁰C gerührt. Nach Abkühlung der Lösung auf 5⁰C wurden 20 ml Pyrophosphoryltetrachlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden gerührt. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 3,3 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat erhalten. Die Ausbeute betrug 85 %.

Beispiel 8

Zu einer Lösung von 4,9 g Uridin in 210 ml m-Kresol wurden 7 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 5°C

ίο gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 5,9 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Uridin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 80%· Das Ultraviolett-Absorptionsverhältnis des Produkts in Wasser von 290 μ/260 μ, 280 μ/260 μ und 250 μ/260 μ wurde mit 0,04, 0,38 und 0,74 bestimmt. Das Produkt wurde durch 5'-Nucleotidase aus Stiersamen vollständig dephosphoryliert.

Beispiel 9

Zu einer Lösung von 3,4 g Cytidin in 300 ml m-Kresol wurden 10 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 5°C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt, wobei eine Reaktion stattfand. Durch Aufarbeitung auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 4,5 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Cytidin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten. Ausbeute 87 %.

Das Produkt wurde durch 5'-NucIeotidase aus Stiersamen vollständig dephosphoryliert.

Beispiel 10

0,98 g Inosin wurden bei 25°C in einer Lösung von 10 g Dioxan in 20 g m-Xylenol suspendiert. Nach Zutropfen von 3,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid wurde das Inosin unter Bildung einer homogenen Lösung gelöst. Das Gemisch wurde bei 25°C gehalten, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,2 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 83,8%.

⁴⁵. Beispiel 11

0,98 g Inosin wurden bei 25⁰C in einer Lösung von 10 g Benzol in 20 g m-Xylenol suspendiert. Nach Zutropfen von 3,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid wurde das Inosin unter Bildung einer homogenen Lösung gelöst. Die Lösung wurde bei 25⁰C gerührt, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,18 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 82,5 %·

B e i s ρ i e 1 12

20 g Phenol wurden exotherm in 3,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid gelöst. Nach Abkühlung der Lösung auf 30⁰C wurden 0,98 g Inosin zugesetzt. Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 30 Minuten gerührt, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,12 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute ■78,3%. ·^;

5 6

B e i s D i e 1 13 chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phos-

phoroxychlorid und 0,01 ml Wasser erhalten worden

17 g Phosphoroxychlorid wurden mit 17 g Xylol war. Das Gemisch wurde 7,5 Stunden bei 5 bis 1O⁰C

gemischt. Nach Abkühlung des Gemisches wurde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml Äther

1 g Wasser zugerührt. Das Uemisch wurde 5 Stunden 5 gegossen, wobei weiße Kristalle gebildet wurden, die

bei 90 bis 95° C gerührt. Nach Auflösung von 20 g abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser gegossen

Phenol wurden 1,% g Inosin zugesetzt. Nach 2 Stun- wurden.

den wurde das Reaktionsgemisch auf die im Beispiel 1 Die hydrolysierte Lösung wurde auf die im Beispiel

angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,38 g Kristalle 16 angegebene Weise behandelt, wobei 600 mg des Di-

des binatriumsalzes von lnosin-5'-monophosphat (ge- 10 natriumsalzes von lnosin-5'-monophosphat erhalten

rechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute wurden. Die Ausbeute betrug 77,4% (gerechnet als

83,1 ^ü/o· Anhydrid).

Beispiel 14 Beispiel 18

0,98 g Inosin wurden in einer Lösung von 5 g Benzol 15 Zu einer Suspension von 560 mg Guanosin in in 10 g Phenol suspendiert. Bei Zugabe von 3,8 g Pyro- 7,5 ml m-Kresol wurde teilweise alkoholisches PhosphosprioryltetractJorid bei 20° C loste sich das Inosin phoroxychlorid gegeben, das durch Mischen von schnell unter Bildung einer homogenen Lösung. Das 4,5 ml Phosphoroxychlorid und 0,2 ml t-Butylalkohol Gemisch wurde 1 Stunde bei der gleichen Temperatur erhalten worden war. Das Gemisch wurde 8 Stunden gehalten, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktions- 20 bei 5 bis 10° C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise in 100 ml Äther gegossen, wobei weil;e Kristalle geaufgearbeitet, wobei 1,21 g Kristalle aes Dinatrium- bildet wurden, die abgetrennt und zur Hydrolyse in salzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Eiswasser gegossen wurden.

Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 84,5 °/₀- Die Analyse des Hydrolysats durch Papierelektro-

25 phorese ergab, daß Guanosin-5'-monopnosphat in

Beispiel 15 einer Ausbeute von 81 % gebildet worden war. Durch

Behandlung der hydrolysieren Lösung auf die im Bei-

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in einem Ge- spiel 16 angegebene Weise wurden 61U mg (Ausbeute:

misch von 20 g m-Kresol und 12 g Benzol wurden 76%) des Dinatriumsalzes von Guanosin-5'-mono-

2,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 10° C gegeben. 30 phosphat erhalten.
Das Gemisch wurde 4 Stunden bei dieser Temperatur

gehalten, wobei eine Reaktion stattfand. Die Auf- Beispiel 19
arbeitung des Gemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise ergab das als Dinatriumsalz vor- Zu einer Suspension von 534 mg Adenosin in 7,5 ml liegende Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als An- 35 m-Kresol wurde teilweise alkoholisches Phosphoroxyhyarid) in einer Ausbeute von 82,2%. chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phos-. . phoroxycnlorid und 0,2 ml t-Butylalkohol erhalten Beispiel 16 worden war. Das Gemisch wurde 7,5 Stunden bei 5 bis

Zu einer Suspension von 504 mg Inosin in 7,5 ml 10° C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml

m-Kresol wurde teilweise alkoholisches Phosphoroxy- 40 Äther gegossen, wobei wei£e Kristalle erhalten wurden,

chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phos- die abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser ge-

phoroxychlorid und 0,2 ml t-Butylalkohol erhalten gössen wurden.

worden war. Das Gemisch wurde 8 Stunden bei 5 bis Die Analyse des Hydrolysats durch Papierelektro-

10°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in ICO ml phorese ergab, daß Adenosin-5'-monopnosphat in

Äther gegossen, wobei weifce Kristalle gebildet wurden, 45 einer Ausbeute von 88 % gebildet worden war. Die

die abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser ge- Behandlung der hydrolysierten Lösung auf die im

gössen wurden. Beispiel 16 angegebene Weise ergab 680 mg (Aus-

Die hydrolysierte Lösung wurde in eine mit Ionen- beute: 86,7%) Dinatriumsalz von Adenosin-5'-mono-

austauschharz gefüllte Säule gegossen, an dem das phosphat.

Produkt adsorbiert wurde. Als Austauschharz wurde 50 B e i s ρ i e 1 20
ein gelförmiges primär, sekundär und tertiär alipha-

tisches Amin-Pl.enol-Formaldehyd-Polykondensat in Zu einer Suspension von 534 mg Adenosin in 7,5 ml der HO-Form verwendet. Die Säule wurde mit 30 ml m-Kresol wurde teilweise hydrolysiertes Phosphoroxy-"Wasser gewaschen und mit wätriger 1 η-Ammoniak- chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phoslösung eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und mit 55 phoroxycnlorid und 0,02 ml Wasser erhalten worden einem gelförmigen Polystyrol, das als aktive Gruppen war. Das Gemisch wurde 8 Stunden bei 5 bis 1O⁰C die Bestandteile C₀H₁SO₃H aufweist, in der Natrium- gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml salzform behandelt, wodurch das Produkt in das ent- Äther gegossen, wobei weii„e Kristalle gebildet wurden, sprechende Natriumsalz umgewandelt wurde. Die so die abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser gebehandelte Lösung wurde auf 4 ml eingeengt und mit 60 gössen wurden.

4 ml Methanol versetzt, wobei 620 mg Kristalle des Die Analyse des Hydrolysats durch Papierelektro-

Dinatriumsalzes von lnosin-5'-monophosphat erhalten phorese ergab, daß Adenosin-5'-monophosphat in

wurden. Die Ausbeute betrug 84,2% (gerechnet als einer Ausbeute von 87% gebildet worden war. Die

Anhydrid). hydrolysierte Lösung wurde auf pH-Wert 1,5 bis 2 ein-

Beispiel 17 ^6s 8^ε5ΐ6Μ ^un<^ ^au^ 2 ml eingeengt. Zu dem so behandelten

Kondensat wurden 8 ml Methanol bzw. 8 ml Aceton

Zu einer Suspension von 530 mg Inosin in 7,5 ml gegeben, wobei 510 mg (Ausbeute: 74%) Kristalle von

m-Kresol wurde teilweise hydrolysiertes Phosphoroxy- Adenosin-5'-monophosphat erhalten wurden.

Claims (7)

1. 7 8
2. Patentanspruch· ^{und anschueßender} Hydrolyse des zunächst erhaltenen Phosphorylierungsproduktes, dadurch
3. Verfahren zur Herstellung von S'-Ribonucleo- gekennzeichnet, daß man die Phosphory-
4. tiden durch selektive Phosphorylierung von lierung in Phenol, Chlorphenol, Kresol und/oder
5. Ribonucleosiden in 5'-Stellung mit Pyrophos- 5 Xylenol als Lösungsmittel durchführt, ohne die
6. phoryltetrachlorid oder Phosphoroxychlorid, das Hydroxylgruppen in 2',3'-Stellung vorher beson-
7. auch teilhydratisiert bzw. -alkoholisiert sein kann, ders zu schützen.