DE69304839T2 - Verfahren zur Herstellung von Nukleosidderivaten - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Didesoxynukleosids und insbesondere von 2',3'- Didesoxynukleosid-Derivaten, die bereits als Anti-AIDS-Mittel und Anti-Virus-Mittel genehmigt worden sind oder sich noch in der Prüfungsphase befinden. 2',3'-Didesoxyinosin (ddI), 2',3'-Didesoxycytidin (ddC) und 3'-Desoxy-3'- azidothymidin (AZT) sind bereits durch die FDA-Behörde (Federal Food and Drug Administration) als Anti-AIDS-Mittel genehmigt worden.
- Für die Isolation und Reinigung von 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivaten aus rohen Reaktionsprodukten sind bereits verschiedene Verfahren beschrieben worden. Ein Verfahren betrifft die Reinigung durch Umkristallisierung aus einem organischen Lösungsmittel (McCarthy et al., J. Am. Chem. Soc., (1966) 88, 1549, Mansun et al., J. Org. Chem., (1989) 43, 4780 und Robins et al., Tetrahedron Lett., (1984) 25, 367). Ein anderes Verfahren stellt die Reinigung mittels Kieselgel-Chromatographie oder mit synthetischen Adsorptionsharzen (US-Patent 3,817,982 und Chu et al., J. Med. Chem., (1990) 33, 1553) dar. Wenn 2',3'-Didesoxyadenosin (ddA) unter Verwendung von Adenosin als Ausgangsmaterial synthetisiert wird, werden Nukleinsäurebasen, wie Adenin, das bei der Spaltung der Glycosidbindung des Adenosins als Ausgangsmaterial entsteht, und Nukleoside, wie Adenosin (nichtumgesetztes Ausgangsmaterial), und Desoxyadenosin (Nukleinsäure-Derivate) als Nebenprodukte hergestellt. Wenn 2',3'-Didesoxyinosin (ddI) aus Inosin als Ausgangsmaterial synthetisiert wird, werden Nukleingäurebasen, wie Hypoxanthin durch die Spaltung der Glycosidbindung des Inosins als Ausgangsmaterial hergestellt und Nukleoside, wie Inosin, das nichtumgesetztes Ausgangsmaterial ist, und Desoxymosin (Nukleinsäure-Derivat) als Nebenprodukte gebildet. DdA oder ddI werden nach an sich bekannten Verfahren, die die Umkristallisierung, die Kieselgel-Chromatographie und die Reinigung auf einem Harz umfassen, aus einer Reaktionsmischung, die diese Nebenprodukte enthält, isoliert und gereinigt. Da allerdings physiko-chemische Ähnlichkeiten zwischen den gewünschten Verbindungen und den Nebenprodukten bestehen, erzeugen die bekannten Trennungs- und Isolationsverfahren lediglich ddA oder ddI als die gewünschte Verbindung in außerordentlich niedrigen Ausbeuten, wenn sie in hoher Reinheit erhalten werden sollen, und wenn komplizierte Verfahrensvorgänge erforderlich sind. Demzufolge stellen diese Verfahren keine industriell anwendbaren Reinigungsmethoden dar.
- Wenn es im Hinblick auf das vorstehend gesagte erwünscht ist, ddA aus einer Mischung aus ddA und Adenin, Adenosin, Desoxyadenosin oder dergleichen zu isolieren, oder wenn es erwünscht ist, ddI aus einer Mischung aus ddI und Hypoxanthin, Inosin, Desoxymosin oder dergleichen mittels Reinigung über ein Harz zu isolieren, ist eine Modifizierung, die bereits versucht worden ist, die Verwendung eines nicht-polaren porösen Harzes (Z.B. "SP-207", hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.), welches oftmals für die Reiniqung von Nukleinsäure-Derivaten verwendet wird. Hierbei wird eine wäßrige Losung von ddA oder ddI (pH 7-10) mit dem Harz in Kontakt gebracht, wobei dann ddA oder ddI selektiv adsorbiert werden. Das adsorbierte ddA oder ddI wird dann mit einem Alkohol eluiert. Diese Technik führt zur Reinigung. von ddA oder ddI (japanische Patentoffenlegungsschriften HEI 1-98496, Hei 1-175990, Hei 1-165390 und Hei-1- 175991). Allerdings sind die Reinheit und die Ausbeute der gewünschten Verbindungen nicht immer zufriedenstellend. Es besteht daher ein Bedarf für ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von ddA oder ddI.
- In der WO-A-89/04662 wird auf Seite 31 die Herstellung von 2-substituierten 2'-Desoxynukleosiden mittels übertragung der Desoxyribose-Einheit von Thymidin auf die entsprechende Adeninbase unter Katalyse durch teilweise gereinigte Trans-Desoxyribosylase beschrieben. Die Reaktionslssung dieses enzymatischen Verfahrens wird auf einen pH-Wert von 12 eingestellt, auf ein Harz in der Formiatform gegeben und mit 20 %igem Methanol in NH&sub4;OH eluiert.
- Das Beispiel 13 der EP-A-0 199 451 beschreibt die Herstellung eines Mononatriumsalzes des 3'-Azido-3'-desoxythymidins durch Lösen von AZT in wäßriger NaOH-Lösung, wonach ein Gefriertrocknen folgt. Dieses Verfahren sieht keinen Reinigungsschritt vor.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Angabe eines industriell vorteilhaften Verfahrens zur Isolierung und Reinigung von 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivaten in hoher Reinheit und mit hohen Ausbeuten aus Mischungen, die als Verunreinigungen die entsprechenden Nukleosid- und. Monodesoxynukleosid-Derivate enthalten.
- In kurzen Worten, diese Aufgabe und auch andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die nachfolgend ohne weiteres ersichtlich werden, können durch ein Verfahren zur Reinigung einer rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Verbindung gelöst werden, wobei eine rohe 2',3'-Didesoxynukleosid-Verbindung, die Verunreinigungen in Form von Nukleinsäuren enthält, in einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von nicht weniger als 12 gelöst wird und anschließend die Verbindung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert oder diese aus der alkalischen wäßrigen Lösung kristallisiert wird.
- In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das rohe 2',3'-Didesoxynukleosid gereinigt, indem eine alkalische wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von nicht weniger als 11, die ein rohes 2',3'-Didesoxynukleosid-Material enthält, mit einem nicht-polaren porösen Harz in Kontakt gebracht wird, wobei die Verbindung an das Harz adsorbiert und das in dieser Weise adsorbierte Derivat von dem Harz durch Behandlung mit einer wäßrigen Lösung eines Alkohols als Eluant, d.h. Elutionsmittel, desorbiert wird.
- Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und viele der damit verbundenen Vorteile werden ermöglicht durch ein besseres Verständnis dieser unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung in Verbindung mit den dazugehörigen Zeichnungen , worin:
- Fig. 1 ein Beispiel für ein Verfahren zur Synthese von ddA und ddI zeigt;
- Fig. 2 eine Elutionskurve aus Vergleichsbeispiel 1 zeigt;
- Fig. 3 eine Elutionskurve aus Vergleichsbeispiel 2 zeigt;
- Fig. 4 eine Elutionskurve aus Beispiel 6 zeigt;
- Fig. 5 eine Elutionskurve aus Beispiel 7 zeigt; und
- Fig. 6 eine Elutionskurve aus Beispiel 8 zeigt.
- Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu reinigenden Verbindungen ddA und ddI können, wie beispielsweise in Fig. 1 gezeigt, ausgehend von Adenosin bzw. Inosin synthetisiert werden, indem beide Hydroxylgruppen an den 2'- und 3'-Positionen reduziert werden. Am Ende der Reaktion ist ein Schritt zur Entfernung einer Schutzgruppe für die 5'-Hydroxylgruppe des Nukleinsäure-Derivats vorgesehen. Die Entfernung der Schutzgruppe kann folgendermaßen erfolgen. Aus der Reaktionslösung, die aus der Reduktionsreaktion resultiert, wird in einem Schritt vor dem Entfernungsschritt das organische Lösungsmittel durch Einengen entfernt. Zu dem Konzentrat wird Wasser hinzugefügt und die Mischung durch Zugabe von beispielsweise einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung alkalisch gemacht. Die Schutzgruppe wird dabei entfernt.
- Nach der Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppe sind in der Endreaktionslösung zusätzlich zu dem gewünschten ddA Adenin, Adenosin, Desoxyadenosin oder ähnliche Nebenprodukte vorhanden. Durch Extraktion der Lösung gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit beispielsweise 2-Propanol wird das ddA, während die Reaktionslösung alkalisch gehalten wird, selektiv in das 2-Propanol extrahiert, während das Adenin, Adenosin und Desoxyadenosin in der alkalischen wäßrigen Lösung verbleiben, so daß im Ergebnis die gewünschteverbindung und die Verunreinigungen mit hoher Selektivität getrennt werden können. Im Falle des ddI sind in der Endreaktionsiösung zusätzlich zu dem gewünschten ddI nach der gleichen Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppe Hypoxanthin, Inosin, Desoxymosin und ähnliche Nebenprodukte zugegen. Mit einer Alkoholextraktion unter den gleichen Bedingungen wird das ddI selektiv in den Alkohol extrahiert, während die Nebenprodukte in der alkalischen wäßrigen Lösung verbleiben, so daß im Ergebnis die gewünschte Verbindung und die Verunreinigungen mit hoher Selektivität getrennt werden können.
- Wenn weiterhin eine alkalische wäßrige Lösung mit einem pH- Wert von nicht weniger als 12, die ddA, Adenin, Adenosin, Desoxyadenosin und dergleichen enthält, oder eine alkalische wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von nicht weniger als 12, die ddI, Hypoxanthin, Inosin, ein Desoxymosin und dergleichen enthält, einer Kristallisation beispielsweise durch Einengung und/oder Kühlung unterworfen wird, kann das ddA oder ddI selektiv als Kristalle mit hoher Reinheit und in hohen Ausbeuten erhalten werden. Hierbei wird der Vorteil ausgenutzt, daß die Löslichkeit der 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivate abfällt, während die Löslichkeiten der analogen Substanzen nicht beträchtlich abfallen, wobei die gewünschten Verbindungen in hohen Ausbeuten erhalten werden können. Die gewünschten Verbindungen können außerdem als Kristalle mit einer größeren Kristallgröße erhalten werden, was wiederum bedeutet, daß sie verbesserte Eigenschaften zur Kristallabtrennung aufweisen. Wie bereits oben beschrieben wurde, kann die Kristallisation unter den erfindungsgemäßen alkalischen Bedingungen eine industriell überlegene Reinigungsmethode darstellen.
- Ein Produkt mit höherer Reinheit kann natürlich dadurch erhalten werden, indem das gewärischte 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivat, wenn es einmal nach dem oben genannten Extraktionsverfahren mit dem organischen Lösungsmittel gereinigt worden ist, in eine alkalische wäßrige Lösung gegeben wird und die entstandene Lösung dann den oben genannten Kristallisationsverfahren unterworfen wird. Alternativ kann dies ebenfalls erreicht werden, indem die beiden Methoden in umgekehrter Reihenfolge angewendet werden, d.h. zunächst die Kristallisationsmethode und dann die Extraktionsmethode mit dem organischen Lösungsmittel. Wie nachfolgend beschrieben wird, sind ebenfalls andere Kombinationen der beiden Methoden möglich.
- Die erfindungsgemäßen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivate sind beispielsweise 2',3'-Didesoxyformen von Purinnukleosiden, wie Guanosin, Adenosin und Inosin und Pyrimidinnukleoside, wie Uridin und Cytidin; 2',3'-Dideshydroformen dieser 2',3'-Didesoxyformen und Derivate dieser 2',3'-Didesoxyformen und solcher 2',3'-Dideshydroformen an deren Zucker- oder Basenbereich. Zu spezifischen Beispielen zählen beispielsweise 2',3'-Didesoxynukleoside, wie 2',3'-Didesoxyadenosin (ddA) und 2',3'-Didesoxymosin (ddI); 2',3'-Didesoxy-2',3'- dideshydronukleoside; 2',3'-Didesoxy-3'-azidonukleoside; 2',3'-Didesoxy-2'-fluornukleoside, wie 2',3'-Didesoxy-2'- fluoradenosine und 2',3'-Didesoxy-2'-fluorinosin; und 2',3'-Didesoxy-3'-fluornukleoside. Andere, die auch genannt werden können, sind beispielsweise 2',3'-Didesoxyformen von Ribonukleosiden mit einer Purinbase, wie 2,6-Diaminopurin, 6-Chlorpurin und 2-Aminopurin und Pyrimidinnukleoside, wie 5'-Methyluridin. Es sollte daher festgestellt werden, daß die erfindungsgemäßen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivate im weitesten Sinne definiert sind und 2',3'-Didesoxynukleioside per se, wie ddA und ddI, einschließen.
- Die alkalischen Bedingungen in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ein pH-Wert von nicht weniger als 12, vorzugsweise nicht weniger als 13. Wenn der pH-Wert nicht höher als 11 ist, dann ist die Abtrennung der Verunreinigungen nicht zufriedenstellend. Es kann insbesondere eine alkalische wäßrige Lösung verwendet werden, die durch Lösen eines rohen 2',3'-Didesoxynukleosids in einer wäßrigen Lösung aus einer organischen oder anorganischen Base in einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 25 Gew.-%, erhalten wird.
- Geeignete Basen, die zur Herstellung einer erfindungsgemäßen alkalischen wäßrigen Lösung verwendet werden können, schließen ein Hydroxid eines Alkalimetalls, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid oder ein Hydroxid von einem Erdalkalimetall, wie Calciumhydroxid, ein. Natriumhydroxid ist dabei besonders bevorzugt.
- Wenn die Reaktionslösung beispielsweise einen pH-Wert von nicht weniger als 12 nach Vervollständigung der Reaktion zur Synthese des 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats aufweist, kann diese Reaktionslösung natürlich direkt der erfindungsgemäßen Reinigungsbehandlung zugeführt werden.
- Die alkalische wäßrige Lösung des erfindungsgemäßen rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats enthält wünschenswerterweise 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 20 Gew.-% des Didesoxynukleosid-Derivats aus Gründen der Produktivität.
- Geeignete Extraktionslösungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen organische Lösungsmittel ein, z.B. Alkohole wie 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, 2- Methyl-1-propanol, 2-Methyl-2-propanol und 1-Pentanol; Acetonitril, Carbonsäureester, wie Ethylacetat und Methylacetat, Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Hexan und Toluol; Ether, wie Diethylether, Tetrahydrofuran und Dioxan; habgenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform und Dichlorethan und Ketone wie Methylethylketon. Im Hinblick auf die Extraktionsrate sind allerdings Alkohole bevorzugt. Dieses Lösungsmittel wird in der Regel in einer Menge des 0,1- bis 10-fachen des Volumens der alkalischen wäßrigen Lösung des rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats verwendet.
- Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Extraktionstemperatur und die Extraktion kann bei 0 bis 100ºC durchgeführt werden.
- Die Dauer der Extraktion kann unter diesen Bedingungen durch Schütteln oder Rühren verkürzt werden. Die Extraktion ist in der Regel in etwa 1 Minute bis 24 Stunden vervollständigt.
- Nach Vervollständigung der Extraktion wird die die gewünschte Verbindung enthaltende organische Lösungsmittelschicht abgetrennt und nach an sich bekannten Verfahren eingeengt, wie beispielsweise durch Entfernen des Lösungsmittels durch Destillation, wobei dann das gewünschte 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivat auskristallisiert und aus dem Rückstand leicht entfernt werden kann. Die gewünschte Verbindung kann mit höherem Wirkungsgrad durch Zugabe von Wasser während der Entfernung des Extraktionslösungsmittels und Bildung einer konzentrierten wäßrigen Lösung durch Einengen gewonnen werden. In diesem Fall kann die gewünschte Verbindung mit hoher Reinheit durch Auskristallisieren aus einer alkalischen wäßrigen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert werden.
- Die erfindungsgemäße Kristallisierung kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise durch Einengen einer alkalischen wäßrigen Lösung eines 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats, vorzugsweise unter vermindertem Druck, insbesondere bei 0,13 bis 26,7 KPa (1 bis 200 mmHg) und gegebenenfalls mit Erhitzen auf 30 bis 100ºC, wonach eine Abkühlung folgt. Die Konzentration für die Auskristallisierung variiert in Abhängigkeit von der gewünschten Verbindung und sie liegt normalerweise im Bereich von 5 bis 100 g/dl.
- Wenn die erhaltene eingeengte Lösung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wird oder, falls erforderlich, auf etwa 0ºC abgekühlt wird, fallen die Kristalle des 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats aus, wonach diese dann mit einer Maßnahme, wie einer Filtration, ohne weiteres abgetrennt werden.
- Die 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivate, die erfindungsgemäß zu reinigen sind, wie beispielsweise ddA und ddI, können wie beispielsweise in Fig. 1 gezeigt ist, ausgehend von Adenosin bzw. Inosin durch Reduktion beider Hydroxylgruppen an den 2'- und 3'-Positionen synthetisiert werden.
- Die durch die oben genannte Reaktion erhaltenen rohen Kristalle von ddA und ddI enthalten zusätzlich zu den gewünschten ddA und ddI Verunreinigungen, wie Adenosin (Ausgangsmaterial), Adenin (eine Nukleinsäurebase aus der Spaltung der Glykosidbindung des Adenosins als Ausgangsmaterial), Desoxyadenosin und gleichartige Nebenprodukte im Fall der Synthese von ddA, und Verunreinigungen, beispielsweise Inosin, Hypoxanthin und Desoxymosin in gleicher Weise im Fall von ddI. Die Erfinder konnten erfolgreich ddA und ddI von ihren Verunreinigungen abtrennen, indem die rohen Kristalle in einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einern pH-Wert von nicht weniger als 11, unter Verwendung beispielsweise einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid, gelöst werden und dann die alkalische wäßrige Lösung mit einem nicht-polaren porösen Harz in Kontakt gebracht wird, beispielsweise durch Einfüllen derselben in eine Harzsäule. Es ist festgestellt worden, daß ein beträchtlicher Unterschjed des Adsorptionsvermögens auf dem Harz zwischen dem ddk und solchen Verunreinigungen, wie Adenin, Adenosin und insbesondere Desoxyadenosine, besteht. In gleicher Weise gibt es einen beträchtlichen Unterschied hinsichtlich des Adsorptionsvermögens zwischen ddI und Hypoxanthin, Inosin und insbesondere Desoxymosinen.
- Das Verfahren wird in der Regel wie folgt durchgeführt: Eine alkalische wäßrige Lösung eines rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats wird in eine Säule gegeben, die mit einem nicht-polaren porösen Harz gepackt ist, wobei dann das 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivat auf dem Harz adsorbiert wird und anschließend Neutralität in der Säule hergestellt wird, indem die Säule mit Wasser (ein an sich bekanntes herkömmliches Adsorptionsverfahren) gewaschen wird und anschließend eine wäßrige Lösung aus einem Alkohol durch die Säule gegeben wird, so daß lediglich das gewünschte 2',3'- Didesoxynukleosid-Derivat eluiert wird.
- Die alkalischen Bedingungen in dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform sind ein pH-Wert von nicht weniger als 11, vorzugsweise nicht weniger als 12. Wenn der pH-Wert nicht höher als 11 ist, dann ist die Abtrennung von den Verunreinigungen nicht ausreichend. Es kann insbesondere eine alkalische wäßrige Lösung, die durch Auflösen eines rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats in einer wäßrigen Lösung einer organischen Base mit einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-% erhalten wird, verwendet werden.
- Erfindungsgemäß umfassen die Basen, die zur Herstellung einer alkalischen wäßrigen Lösung aus einem rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivat zu verwenden sind, anorganische Basen, wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid und beispielsweise Ammoniak. Darunter ist Natriumhydroxid bevorzugt. Wenn des weiteren Natriumhydroxid verwendet wird, kann beispielsweise Natriumchlorid in einer Menge, die etwa gleich derjenigen des Natriumhydroxids ist, hinzugefugt werden. Das Salz verbessert weiterhin die Abtrennung, wahrscheinlich wegen der ionischen Wirkung.
- Wenn eine Reaktionslösung beispielsweise einen pH-Wert von nicht weniger als 11 nach der Synthesereaktion eines 2',3'- Didesoxynukleosid-Derivats aufweist, dann kann diese Reaktionslösung natürlich direkt dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden.
- Die erfindungsgemäßen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivate sind dieselben wie diejenigen, die bereits im Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform genannt worden sind.
- Als erfindungsgemäß zu verwendendes nicht-polares poröses Harz können jedes Polymer des Styrol-Divinylbenzol-Systems oder Derivate dieser Polymere verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Mitglied der "Dianion"-Serie und "SP"-Serie (beide hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.), ein "XAD-4" (hergestellt von Rohm & Haas Co.) und ein "OC-1031" (hergestellt von Bayer Co.) verwendet werden. Außerdem können andere nicht-polare poröse Harze verwendet werden, soweit sie ein äquivalentes Leistungsvermögen aufweisen. Insbesondere ist "SP-207", das eine erhöhte Dichte aufweist (hergestellt von Mitsubishi Kasei Co.), ausgezeichnet in der Handhabung, da dieses Harz nicht flottiert.
- Ein nicht-polares poröses Harz und eine alkalische wäßrige Lösung eines rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats werden miteinander in Kontakt gebracht, indem entweder die alkalische wäßrige Lösung, wie bereits oben beschrieben, über eine Harzsäule (Säulenmethode) gegeben wird oder ein nichtpolares poröses Harz zu einer alkalischen wäßrigen Lösung eines 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats gegeben wird, wobei das gewünschte 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivat an dem Harz adsorbiert wird. Danach wird das Harz entfernt (diskontinuierliche Methode). Die Säulenmethode ist bequem zu handhaben und im Hinblick auf ihre Arbeitsleistung bevorzugt.
- Bei der Säulenmethode gibt es keine besondere Einschränkung der Rate des Flüssigkeitsflusses durch die Säule. Der SV- Wert beträgt geeigneterweise 0,5 bis 10, vorzugsweise etwa 1 bis 4.
- Bei der Säulenmethode variiert die Volumenmenge der auf die Säule gegebenen alkalischen wäßrigen Lösung eines rohen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats je nach Art des 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats und Konzentration der Lösung. Angesichts der Trennfähigkeit und auch aus ökonomischen Gründen liegt die Menge des auf die Säule gegebenen 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats im allgemeinen im Bereich von 1 bis 2000 g, vorzugsweise 40 bis 500 g, bezogen auf 1000 ml Harz.
- Bei der diskontinuierlichen Methode wird das nicht-polare poröse Harz in einer Menge von 0,1 bis 100 ml, vorzugsweise 0,5 bis 5 ml pro 1 g rohes 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivat verwendet.
- Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Temperatur beim Kontakt zwischen dem nicht-polaren porösen Harz und der alkalischen wäßrigen Lösung eines rohen 2',3'- Didesoxynukleosid-Derivats und sie liegt in der Regel innerhalb eines Bereichs von 10 bis 50ºC. Das Reinigungsvermögen des Harzes bleibt innerhalb dieses Bereichs im wesentlichen unverändert.
- Die Menge des für die Elution verwendeten Wassers, d.h. für die Desorption des an dem nicht-polaren porösen Harz adsorbierten 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats wird geeigneterweise innerhalb eines Bereichs von 1 bis 20 Residualvolumen (RV) ausgewählt.
- Als Alkohol, der zur Herstellung einer wäßrigen Alkohollösung für die Elution verwendet wird, ist ein niedrig-molekularer Alkohol, wie Methanol, Ethanol oder 2-Propanol bevorzugt. Die bevorzugte Konzentration des Alkohols als geeignete Elutionsbedingung liegt im Bereich von 10 bis 50 Vol-%. Die zu verwendende Menge wird geeigneterweise innerhalb eines Bereichs von 1 bis 20 RV ausgewählt.
- Es gibt keine besondere Einschränkung für das Verfahren zur Gewinnung des 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats als gewünschte Substanz aus dem Eluat. Beispielsweise werden nach Vervollständigung der Elution die eluierten Fraktionen des 2',3'-Didesoxynukleosid-Derivats gesammelt. Der Alkohol wird dann durch Destillation und Einengung unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand wird zur Kristallisation der gewünschten Verbindung eingeengt und die ausgefallenen Kristalle werden schließlich isoliert.
- Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung kann ein weiteres Verständnis erhalten werden durch Bezug auf bestimmte spezifische Beispiele, die lediglich zum Zwecke der Erläuterung vorgesehen sind und, falls nicht anderweitig spezifiziert, nicht einschränken sollen.
- Es wurden 11,7 ml (1,3 Äquivalentmengen) Trimethylorthoacetat zu einer Lösung aus 20 g (74,9 mMol) Adenosin in 100 ml Essigsäure gegeben und bei 50ºC während 3 Stunden gerührt. Nach Einengung der Reaktionslösung unter vermindertem Druck wurden 100 ml Acetonitril hinzugefügt. Die erhaltene Mischung wurde auf 10ºC abgekühlt und es wurden tropfenweise 22 ml Acetylbromid (4 Äquivalentmengen) über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugegeben. Nach dem Rühren der Reaktionslösung während weiteren 2 Stunden bei 15ºC wurde mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat neutralisiert und dann mit Acetonitril extrahiert. Es wurden 3 g (5 Mol-%) von 10% Palladium auf Kohlenstoff (10%iger Pd-C-Katalysator) zu dem flüssigen Extrakt gegeben und die Hydrierung wurde dann unter Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 5 Stunden durchgeführt, während der pH-Wert des Systems mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumhydroxid (NaOH) auf 9,5 gehalten wurde. Die Reaktionslösung wurde nach Vervollständigung der Reaktion filtriert. Das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat unter vermindertem Druck durch Destillation entfernt und es wurde eine wäßrige NaOH-Lösung zu dem Rückstand hinzugefügt. Die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die in dieser Weise erhaltene 1000 ml wäßrige alkalische Lösung (pH-Wert 12) enthielt verschiedene Nukleinsäure- Derivate in der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung. Tabelle 1: Zusammensetzung A
- Es wurden 11,7 ml (1,3 Äquivalentmengen) Trimethylorthoacetat zu einer Lösung aus 20 g (74,9 mMol) Adenosin in 100 ml Essigsäure gegeben und die Mischung wurde bei 50ºC w:hrend 3 Stunden gerührt. Nach Einengung der Reaktionslösung unter vermindertem Druck wurden 100 ml Acetonitril hinzugefügt. Die erhaltene Mischung wurde auf 10ºC abgekühlt und es wurden tropfenweise über einen Zeitraum von 1 Stunde 22 ml Acetylbromid (4 Äquivalentmengen) hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde für weitere 2 Stunden bei 15ºC gerührt, mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat neutralisiert und dann mit Acetonitril extrahiert. Es wurden zu dem flüssigen Extrakt 7,8 g (2 Äquivalentmengen) Zinkpulver (Zn) hinzugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde in eine Lösung aus 90 g (4 Äquivalentmengen) Dinatriumethylendiamintetraacetat-Dihydrat (EDTA 2Na 2H&sub2;O), die mit einer wäßrigen NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 7 eingestellt war, gegossen und dann mit 200 ml Acetonitril extrahiert. Es wurden 3 g (5 Mol-%) eines 10%igen Pd-C-Katalysators zu dem flüssigen Extrakt gegeben und dann wurde die Hydrierung in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur während 5 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation aus dem Filtrat unter vermindertem Druck entfernt. Es wurde eine wäßrige NaOH-Lösung zu dem Rückstand gegeben und die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die in dieser Weise erhaltene 1000 ml wäßrige alkalische Lösung (pH-Wert 12) enthielt verschiedene Nukleinsäure- Derivate in den in Tabelle 2 gezeigten Mengen. Tabelle 2: Zusammensetzung B
- Es wurden 0,67 ml (37,5 mmol) Wasser und 47,0 g (224,7 mmol, 3 Äquivalentmengen) Acetoxyisobutyrylbromid zu einer aufgeschlämmten Lösung aus 20 g (74,9 mmol) Adenosin in 200 ml Acetonitril gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit einer wäßrigen 10%igen Lösung aus Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und die wäßrige Schicht wurde mit einem Scheidetrichter entfernt. Zu der organischen Schicht wurden 19,3 g (2 Äquivalentmengen) eines Zink/Kupfer-Komplexes (Zn-Cu-Komplex) gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde in eine Lösung aus 90 g (4 Äquivalentmengen) EDTA 2Na 2H&sub2;O, die mit wäßriger NaOH-Lösung auf einen pH- Wert von 7 eingestellt war, gegossen und mit 200 ml Acetonitril extrahiert. Es wurden 3 g (5 Mol-%) eines 10%igen Pd-C-Katalysators zu dem flüssigen Extrakt gegeben und die Hydrierung wurde dann in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur während 5 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation aus dem Filtrat unter vermindertem Druck entfernt. Es wurde eine wäßrige NaOH-Lösung zu dem Rückstand hinzugefügt und die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die in dieser Weise erhaltene 1000 ml wäßrige Lösung (pH- Wert 12) enthielt verschiedene Nukleinsäure-Derivate in den in Tabelle 3 angegebenen Mengen. Tabelle 3: Zusammensetzung C
- Die in Beispiel 1, Synthese (a), erhaltene verseifte Lösung von Zusammensetzung A wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Es wurden aus der pH-eingestellten Lösung vier Proben je 10 ml entnommen und vier Arten von Testlösungen wurden hergestellt mit einer ersten Probe ohne Veränderung und einer zweiten, dritten und vierten Lösung, denen NaOH in solchen Mengen zugefügt wurde, daß sich Konzentrationen von 1, 10 und 20 Gew.-% bildeten. Die pH-Werte der vier Testlösungen betrugen 7, > 13, > 13 und > 13.
- Zu den Testlösungen wurden 10 ml 2-Methyl-1-propanol hinzugefügt, wonach ausreichend gemischt wurde. Jede Mischung wurde dann zum Zwecke der Phasentrennung stehengelassen.
- Die Konzentration jedes Nukleinsäure-Derivats in der organischen Schicht und in der wäßrigen Schicht von allen Zusammensetzungen wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert, um die Verteilungskoeffizienten (organische Schicht/wäßrige Schicht) und die ddA- Reinheit in der organischen Schicht zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
- *1: g/dl (organische Schicht)/g/dl (wäßrige Schicht)
- *2: ddA-Reinheit in der organischen Schicht
- Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, erhöht sich der Verteilungskoeffizient von ddA und die Verteilungskoeffizienten der Verunreinigungen 3'-Desoxyadenosin (3dA), Adenosin (AR) und Adenin (Ad) erniedrigen sich mit der Erhöhung der NaOH-Konzentration. Im Ergebnis bedeutet dieses, daß das ddA in die organische Schicht in hoher Reinheit und großer Ausbeute extrahiert wurde.
- Die in Beispiel 1, Synthesen (b) und (c), erhaltenen verseiften Lösungen von den Zusammensetzungen B und C wurden in der gleichen Weise wie die in Beispiel 1, Synthese (a) erhaltene verseifte Lösung von Zusammensetzung A behandelt, wobei die in den Tabellen 5 bzw. 6 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden. Tabelle 5 Tabelle 6
- Wie aus beiden Tabellen zu ersehen ist, erhöht sich ebenfalls der Verteilungskoeffizient von ddA für die in Beispiel 1, Synthesen (b) und (c), erhaltenen verseiften Lösungen, während sich die Verteilungskoeffizienten der Verunreinigungen AR und Ad mit der Erhöhung der NaOH-Konzentration erniedrigen. Ähnlich wie in Beispiel 1, Synthese (a), wurde das ddA in die organische Schicht in hoher Reinheit mit hoher Ausbeute extrahiert.
- Eine Mischung aus 1,0 g ddA, 100 mg 3dA, 100 mg AR und 100 mg Ad wurde zu 100 ml Wasser (Lösungsmittel 1) gegeben und durch Erhitzen auf 60ºC gelöst. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck (10 mmHg) bei Raumtemperatur bis zur Bildung der Kristalle eingeengt und dann auf 5ºC abgekühlt.
- Die Kristalle wurden filtriert und getrocknet. Die getrockneten Kristalle wurden mittels HPLC analysiert, wobei die Reinheit der Kristalle und die Ausbeuten jedes Nukleinsäure-Derivats gemessen wurden.
- Das gleiche Experiment wurde ebenfalls für die anderen in der unten angegebenen Tabelle 7 aufgeführten Lösungsmittel (2) - (6) wiederholt. Die Temperatur für die Auflösung unter Erwärmen betrug allerdings 50ºC für die Lösungsmittel (5) und (6). Tabelle 7
- *1): g/g-Kristall
- Es ist aus der obigen Tabelle zu entnehmen, daß, wenn die Lösungen eine höhere NaOH-Konzentration aufweisen, die ddA- Kristalle durch Umkristallisation in höherer Ausbeute und mit größerer Reinheit, wobei kein 3dA, AR und Ad oder nur geringe Mengen davon enthalten waren, erhalten werden können.
- Zu einem Liter einer verseiften Lösung (die 115,05 g ddA, 13,10 g 3dA, 2,04 g 2dA, 4,07 g AR und 3,67 g Ad enthielt), die nach den gleichen Reaktionsschritten wie in Beispiel 1, Synthese (a), erhalten wurde, wurde 1 Liter einer wäßrigen 25%igen NaOH-Lösung hinzugegeben. Die Mischung wurde dann dreimal extrahiert, wobei jedesmal 1 Liter 2-Propanol verwendet wurde.
- Die extrahierte Propanolschicht wurde eingeengt, während 250 ml Wasser hinzugefügt wurden. Im Verlauf des Verfahrens wurden 200 ml einer wäßrigen 25%igen NaOH-Lösung hinzugegeben und gerührt. Die Mischung wurde dann durch Abkühlen auf 20ºC auskristallisiert. Die reinen ddA-Kristalle wurden filtriert.
- Es wurden ddA-Kristalle von hoher Reinheit durch Kombination der Extraktions- und Kristallisationsarbeitsgänge unter den oben beschriebenen alkalischen Bedingungen erhalten. Die Gehalte und die Zusammensetzungen der Nukleinsäure-Derivate der einzelnen Schritte: verseifte Lösung, 2-Propanolextrakt und Kristalle nach Umkristallisierung wurden mittels HPLC gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
- Es wurden 11,7 ml (1,3 Äquivalentmengen) Trimethylorthoacetat zu einer Lösung aus 20 g (74,9 Iumol) Adenosin in 100 ml Essigsäure gegeben. Die Lösung wurde bei 50ºC während 3 Stunden gerührt. Nach Einengung der Reaktionslösung unter vermindertem Druck wurden 100 ml Acetonitril hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde auf 10ºC abgekühlt und es wurden tropfenweise 22 ml (4 Äquivalentmengen) Acetylbromid über einen Zeitraum von 1 Stunde hinzugegeben. Nachdem die Reaktionslösung für weitere 2 Stunden bei 15ºC gerührt worden war, wurde sie mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat (Na&sub2;CO&sub3;) neutralisiert und dann mit Acetonitril extrahiert. Zu dem flüssigen Extrakt wurden 3 g (5 Mol-%) 10% Palladium auf Kohlenstoff (10%iger Pd-C-Katalysator) hinzugegeben und die Hydrierung wurde dann in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 5 Stunden durchgeführt, während der pH-Wert des Systems mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumhydroxid (NaOH) auf 9,5 gehalten wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation aus dem Filtrat bei vermindertem Druck entfernt und es wurde zu dem Rückstand eine wäßrige NaOH-Lösung hinzugegeben. Die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die in dieser Weise erhaltene 100 ml wäßrige alkalische Lösung enthielt verschiedene Nukleinsäure-Derivate in der in Tabelle 9 gezeigten Zusammensetzung. Tabelle 9: Zusammensetzung D
- Es wurden 11,7 ml (1,3 Äquivalentmengen) Trimethylorthoacetat zu einer Lösung aus 20 g (74,6 mMol) Inosin in 100 ml Essigsäure gegeben und die Mischung wurde bei 50ºC während 3 Stunden gerührt. Nach Einengung der Reaktionslösung unter vermindertem Druck wurden 200 ml Acetonitril hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde auf 5ºC abgekühlt und es wurden tropfenweise über einen Zeitraum von 2 Stunden 22 ml (4 Äquivalentmengen) Acetylbromid dazugegeben. Die Reaktionslösung wurde für weitere 3 Stunden bei 5ºC gerührt, mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat neutralisiert und dann mit Acetonitril extrahiert. Zu dem flüssigen Extrakt wurden 3 g (5 Mol-%) eines 10%igen Pd-C-Katalysators und 30 ml (5 Äquivalentmengen) Triethylamin hinzugefügt. Die Mischung wurde in einer Wasserstoffatomosphäre bei Raumtemperatur während 5 Stunden hydriert. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung filtriert und das Lösungsmittel durch Destillation bei vermindertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde eine wäßrige NaOH-Lösung hinzügegeben. Die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die in dieser Weise erhaltene 1000 ml wäßrige alkalische Lösung enthielt verschiedene Nukleinsäure-Derivate in der in Tabelle 10 gezeigten Zusammensetzung. Tabelle 10: Zusammensetzung E
- Es wurden 11,7 ml (1,3 Äquivalentmengen) Trimethylorthoacetat zu einer Lösung aus 20 g (74,6 mMol) Inosin in 100 ml Essigsäure gegeben und die Mischung wurde bei 50ºC während 3 Stunden gerührt. Nach Einengung der Reaktionslösung unter vermindertem Druck wurden 200 ml Acetonitril hinzugefügt. Die erhaltene Mischung wurde auf 5ºC abgekühlt und es wurden tropfenweise über einen Zeitraum von 2 Stunden 22 ml (4 Äquivalentmengen) Acetylbromid dazugegeben. Die Reaktionslösung wurde für weitere 3 Stunden bei 5ºC gerührt, mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat neutralisiert und dann mit Acetonitril extrahiert. 7,8 g (2 Äquivalentmengen) Zinkpulver (Zn) wurden zu dem flüssigen Extrakt gegeben und die Mischung wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde in eine Lösung aus 90 g (4 Äquivalentmengen) Dinatriumethylendiamintetraacetat-Dihydrat (EDTA 2Na 2H&sub2;O), die mit einer wäßrigen NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 7 eingestellt worden war, gegossen und mit 200 ml Acetonitril extrahiert. Zu dem flüssigen Extrakt wurden 3 g (5 Mol-%) eines 10%igen Pd-C-Katalysators gegeben und die Mischung wurde dann in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur während 5 Stunden hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert und das Lösungsmittel aus dem Filtrat durch Destillation bei vermindertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde eine wäßrige Lösung aus Natriumhydroxid hinzugegeben und die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die in dieser Weise erhaltene 1000 ml wäßrige alkalische Lösung enthielt verschiedene Nukleinsäure-Derivate in den in Tabelle 11 gezeigten Mengen. Tabelle 11: Zusammensetzung F
- Es wurden 0,67 ml (37,5 mMol) Wasser und 47,0 g (224,7 mMol, 3 Äquivalentmengen) Acetoxyisobutyrylbromid zu einer aufgeschlämmten Lösung aus 20 g (74,6 mmol) Inosin in 200 ml Acetonitril gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden durchgeführt. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde mit einer wäßrigen 10%igen Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (NaHCO&sub3;) neutralisiert und die wäßrige Schicht durch Phasentrennung entfernt. Zu der organischen Schicht wurden 19,3 g (2 Äquivalentmengen) eines Zink/Kupfer-Komplexes (Zn-Cu-Komplex) gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in eine Lösung aus 90 g (4 Äguivalentmengen) EDTA 2Na 2H&sub2;O, die mit einer wäßrigen NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 7 eingestellt war, gegossen und mit 200 ml Acetonitril extrahiert. Zu dem flüssigen Extrakt wurden 3 g (5 Mol-%) eines 10%igen Pd-C-Katalysators gegeben und die Hydrierung wurde dann in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur während 5 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert und das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck aus dem Filtrat entfernt. Es wurde eine wäßrige Lösung aus Natriumhydroxid zu dem Rückstand gegeben und die Mischung wurde für 5 Stunden gerührt, während der pH-Wert der Mischung bei 12 gehalten wurde.
- Die auf diese Weise erhaltene 1000 ml wäßrige alkalische Lösung von ddI enthielt pro 1000 ml verschiedene Nukleinsäure-Derivate in den in Tabelle 12 gezeigten Mengen. Tabelle 12: Zusammensetzung G
- Die in Beispiel 5, Synthese (a), erhaltene verseifte Lösung von Zusammensetzung D wurde mit 4n Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und auf eine Säule (30 mm∅ x 600 mm), die mit einem nicht polaren porösen Harz "SP-207" (ddA 30 g/l - Harzkonzentration) gefüllt war, gegeben. Das ddA wurde dann eluiert, wobei das Elutionsmittel folgendermaßen verändert wurde: Wasser T 15% MeOH T 30% MeOH.
- Die eluierten ddA-Fraktionen überlappten mit denjenigen der Verunreinigungen Ad, AR und 3dA (siehe Fig. 2) und die Reinheit war so niedrig wie 80%, wenn eine 90%ige Fraktion erhalten werden konnte, während lediglich eine etwa 50%ige Fraktion mit einer Reinheit von größer als 99% erhalten werden konnte. Das Elutionsmittel war in einer hohen Menge wie 30 RV, angegeben als Summe aus Wasser und wäßriger Methanol lösung, erforderlich.
- Die in Beispiel 5, Synthese (d), erhaltene verseifte Lösung von Zusammensetzung G wurde mit 4n Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und auf eine Säule, die mit dem "SP-207"-Harz (30 g/l - Harzkonzentration) gepackt war, gegeben. Das ddI wurde dann eluiert, während das Elutionsmittel wie folgt verändert wurde: Wasser T 10% MeOH T 30% MeOH.
- Die eluierten ddI-Fraktionen überlappten mit denjenigen der Verunreinigungen: Hx, HxR und 3dI (siehe Fig. 3) und die Reinheit war so niedrig wie 75%, wenn eine 90%ige Fraktion erhalten werden sollte, während lediglich eine 35%ige Fraktion mit einer Reinheit von höher als 99% erhalten werden konnte. Das Elutionsmittel war außerdem in einer Menge von so viel wie 15 RV erforderlich.
- Zu der in Beispiel 5, (Synthese (a), erhaltenen verseiften Lösung von Zusammensetzung D wurde NaOH gegeben, so daß eine 5%ige Konzentration vorhanden war, und die Mischung wurde auf eine Säule gegeben, die mit dem "SP-207"-Harz gepackt war, wobei die doppelte Menge des Harzes aus Vergleichsbeispiel 1 für die Adsorption auf dem Harz (60 g/l - Harzkonzentration) verwendet wurde. Die Verunreinigungen Ad, AR und 3dA wurden schnell eluiert, während dieses beim ddA nicht der Fall war. Nach der Elution der Verunreinigungen wurde das Elutionsmittel durch Wasser (1 RV) und weiterhin durch 30% MeOH (siehe Fig. 4) ersetzt.
- Im Ergebnis konnte eine ddA-Elutionsfraktion mit großer Reinheit und in hoher Ausbeute (siehe Tabelle 13) und mit einer Gesamtflüssigkeitsmenge von 20 RV gewonnen werden.
- Es wurden ddA-Kristalle mit einer Reinheit von höher als 99% durch Einengunglauskristallisierung aus der Elutionsfraktion in einer Ausbeute von 90% erhalten.
- Es wurde NaOH zu der in Beispiel 5, Synthese (d), erhaltenen Lösung von Zusammensetzung G unter Bildung einer wäßrigen Lösung mit einer NaOH-Konzentration von 5% gegeben. Als die Mischung auf eine Säule, die mit dem "SP-207"-Harz gepackt war, für die Adsorption (30 g/l - Harzkonzentration) gegeben wurde, wurden die Verunreinigungen Hx, HxR und 3dI schnell eluiert, während ddI nicht eluiert wurde. Nach der Elution der Verunreinigungen wurde das Elutionsmittel durch Wasser (1 RV) und weiterhin mit 30% MeOH (siehe Fig. 5) ersetzt.
- Im Ergebnis konnte eine ddI-Elutionsfraktion von hoher Reinheit in großer Ausbeute (siehe Tabelle 13) und mit einer Gesamtflüssigkeitsmenge von 7 RV gewonnen werden.
- Es wurden NaOH und NaCl zu der in Beispiel 5, Synthese (d), erhaltenen Lösung von Zusammensetzung G unter Bildung einer wäßrigen Lösung mit jeweils einer 2,5%igen Konzentration von NaOH und NaCl gegeben. Als die erhaltene Lösung auf eine Säule, die mit dem "SP-207"-Harz (30 g/l - Harzkonzentration) gepackt war, zum Zwecke der Adsorption gegeben wurde, wurden die Verunreinigungen Hx, HxR und 3dI schnell eluiert, während dieses beim ddI nicht der Fall war. Nach der Elution der Verunreinigungen wurde das Elutionsmittel durch Wasser (1 RV) und weiterhin mit 30% MeOH (siehe Fig. 6) ersetzt.
- Im Ergebnis konnte eine ddI-Elutionsfraktion von hoher Reinheit in großer Ausbeute (siehe Tabelle 13) und mit einer Gesamtflüssigkeitsmenge von 8 RV gewonnen werden. Die Ergebnisse sind im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 7.
- Zur Herstellung einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von NaOH von 5% wurde NaOH zu der in Beispiel 5, Synthese (b), erhaltenen Lösung von Zusammensetzung E gegeben. Als die Lösung auf eine Säule, die mit dein "SP-207"-Harz (30 g/l - Harzkonzentration) gepackt war, zum Zweck der Adsorption gegeben wurde, wurden die Verunreinigungen Hx und HxR schnell eluiert, während dieses beim ddI nicht der Fall war. Nach der Elution der Verunreinigungen wurde das Elutionsmittel durch Wasser (1 RV) und außerdem durch 30% MeOH ersetzt.
- Im Ergebnis konnte eine ddI-Elutionsfraktion von hoher Reinheit in großer Ausbeute (siehe Tabelle 13) und mit einer Gesamtflüssigkeitsmenge von 7 RV gewonnen werden.
- Zur Herstellung einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von NaOH von 5% wurde NaOH zu der in Beispiel 5, Synthese (c), erhaltenen Lösung von Zusammensetzung F gegeben. Als die erhaltene Lösung auf eine Säule, die mit dem "SP- 207"-Harz (30 g/l - Harzkonzentration) gepackt war, zum Zwecke der Adsorption gegeben wurde, wurden die Verunreinigungen Hx und HxR schnell eluiert, während dieses beim ddI nicht der Fall war. Nach der Elution der Verunreinigungen wurde das Elutionsmittel durch Wasser (1 RV) und außerdem durch 30% MeOH ersetzt.
- Im Ergebnis konnte eine ddI-Elutionsfraktion von hoher Reinheit in großer Ausbeute (siehe Tabelle 13) und mit einer Gesamtflüssigkeitsmenge von 7 RV gewonnen werden.
- Die vorangegangenen Ergebnisse sind nun zusammengefaßt in der folgenden Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13
Claims (11)
1. Verfahren zur Reinigung eines rohen
2',3'-Didesoxynucleosid-Derivats, welches als Verunreinigungen das entsprechende
Nucleosid und das Monodesoxynucleosid-Derivat enthält,
welches umfaßt:
die Extraktion des 2',3'-Didesoxynucleosid-Derivats mittels
eines organischen Lösungsmittels aus einer alkalischen
wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von nicht weniger als 12
des rohen 2',3'-Didesoxynucleosid-Produkts.
2. Verfahren zur Reinigung eines rohen
2',3'-Didesoxynucleosid-Derivats, welches als Verunreinigungen das entsprechende
Nucleosid und das Monodesoxynucleosid-Derivat enthält,
welches umfaßt:
die Kristallisation des 2',3'-Didesoxynucleosid-Derivats aus
einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von nicht
weniger als 12 des rohen 2',3'-Didesoxynucleosid-Produkts.
3. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das
2',3'-Didesoxynucleosid-Derivat ein Mitglied, ausgewählt aus
der aus 2',3'-Didesoxynucleosiden, 2',3'-Didesoxy-2',3'-
didehydronudeosiden, 2',3'-Didesoxy-3'-azidonucleosiden,
2',3'-Didesoxy-2'-fluornucleosiden und 2',3'-Didesoxy-3'-
fluornucleosiden bestehenden Gruppe ist.
4. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das
2',3'-Didesoxynucleosid-Derivat 2',3'-Didesoxyadenosin ist.
5. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das
organische Lösungsmittel ein Alkohol ist.
6. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der
pH-Wert der alkalischen wäßrigen Lösung nicht weniger als 13
beträgt.
7. Verfahren zur Reinigung eines rohen
2',3'-Didesoxynucleosid-Derivats, welches als Verunreinigungen das entsprechende
Nucleosid und das Monodesoxynucleosid-Derivat enthält,
welches umfaßt:
Kontaktieren einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pH-
Wert von nicht weniger als 11 des rohen
2',3'-Didesoxynucleosid-Produkts mit einem nichtpolaren porösen Harz, wobei die
Verbindung an dem Harz adsorbiert wird, und darauffolgende
Desorption des so adsorbierten Derivats von dem Harz.
8. Reinigungsverfahren nach Anspruch 7, wobei das 2',3'-
Didesoxynucleosid-Derivat ein Mitglied, ausgewählt aus der
aus 2',3'-Didesoxynucleosiden, 2',3'-Didesoxy-2',3'-
didehydronucleosiden, 2',3'-Didesoxy-3'-azidonudeosiden,
2',3'-Didesoxy-2'-fluornucleosiden und 2',3'-Didesoxy-3'-
fluornucleosiden bestehenden Gruppe ist.
9. Reinigungsverfahren nach Anspruch 7, wobei das 2',3'-
Didesoxynucleosid-Derivat 2',3'-Didesoxyinosin ist.
10. Reinigungsverfahren nach Anspruch 7, wobei das 2',3'-
Didesoxynucleosid-Derivat 2',3'-Didesoxyadenosin ist.
11. Reinigungsverfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10,
wobei der pH-Wert der alkalischen wäßrigen Lösung nicht
weniger als 12 beträgt.
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