DD212391A3 - Verfahren zur herstellung von (gamma-hoch 32 p)adenosin-5'-triphosphat hoher spezifischer aktivitaet - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von (Gamma-hoch 32 P) Adenosin-5'-triphosphat (ATP) mit hoher spezifischer Aktivitaet der Formel I. Die Erfindung hat das Ziel, ein technisch einfaches, schnelles Verfahren zu entwickeln, das gute Ausbeuten liefert. Erfindungsgemaess wird in einem kleinen Ansatzvolumen Adenosin-5'-diphosphat im Mymol-Massstab unter bestimmten Konzentrationsverhaeltnissen entsprechender Substrate enzymatisch zu (Gamma-Hoch 32 P) ATP phosphoryliert. Nach kurzer Reaktionszeit kann das Produkt in einem einfachen Verfaren saeulenchromatographisch isoliert werden.

Description

Dr. E. Bauschke R. Berger ZfK M. Kießling ZfK H. Kreißl

"Verfahren zur Herstellung von /J- P/ Adenosin 5'-triphosphat hoher spezifischer Aktivität"

Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verj Adenosin-5'-tripho^phat (ATP) der Formel I

32 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur P-Markierung von

0 0 0 _θΟ-32_Ι__Ο-!_θ-|-Ο

M⁺ = H⁺ oder andere Kationen.

Anwendungsgebiet sind die radiochemische Synthese und die Nucleotidchemie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt sind in der Literatur eine Reihe von Verfahren, die es gestatten, Q- P_-/ ATP zu erhalten.

Nach Waiseth (T. P. Walseth, R, A. Johnson Biochem et Biophys. Acta 5ji£ (1979) 11 - 31) wird durch Reaktion von ³²P-Phosphat mit D-Glycerinaldehyd-3-phosphat, das durch Trioseisomerase aus Dihydrosyacetonphosphat dargestellt wurde, das gewünschte 1,3 Diphosphoglycerat hergestellt, das selbst mit Adenosin-5'-diphosphat (ADP) enzymatisch reagiert.

»Hi» αλλ a. ,. ι\er ε: ι·*-*

232854 7

In. diesem. Ansatz, wird, ein sehr komplexes Enzymgemisch, eingesetzt. Enzyme sind, gegen ß-Strahlung- höherer" Intensität, sehr empfindlich. Daher wird, von Walseth. als obere radiochemische

TO-

Konzentration: 10 mCi H, P0«/50 All Reaktionsvolumen "be·* schrieben." : ' . .

Ein wesentlich einfacheres Verfahren nach Gilbert, Mazam (W. Gilbert,; A. M- Maxam,. Labormitteilung und. I.. M. Glynn, J. "B.. Chappell.Biochem., ~<T. £0 ζ1964) 147 - 149) ergibt nicht so. hohe spezifische¹ Aktivitäten-., - "·;.'·

Zur Synthese; von Zp- P/ ATP: niederer spezifischer Aktivität;, ein Verfahren von, R.' Gibbs, E. l/L. Röddy, E.. Titus¹ CJ* -

Biol. Chem. 240.(1965) 2181) veröffentlicht worden. " Eine Synthesevorschrift, für- ^f-- PJT ATP hoher spezifischer-Aktivität war-je.doch. nicht beschrieben: worden:

Ziel, der- Erfindung · ·..'"' . ' ' Die Erfindung- hat: das.¹ Ziel,, ein technisch, möglichst- einfaches Verfahren, zu: entwickeln,, das die- Herstellung: von, nmol-Mengen an- spezifisch hochmarkier tem. ffi- XJ ATP durch. Einwirkung . eines komplexen. Enzymgemisches. im kurzer Zeit gewährleistet..

Darlegung des· Wesens der Erfindung: .·.-.. .: Erfindungsgemäß werden Verbindungen, der Formel. X hergestellt, indem: man: in einem Eintopfverfahren, die: entsprechende- Aktivi-

32"

tätsmenge an trägerfreier H-, PO,, welche: zuvor lyophilisiert worden ist, in einem. Substratgemisch aufnimmt.. Die Reaktion wird durch Zugabe speziell, gereinigter Enzyme gestartet und nach einigen. Minuten z. B'.. durch Ethanol gestoppt... Hach Lyophilisation und Wiederaufnahme in. etwas Wasser wird das Reaktionsgemisch auf. eine Anionenaustauscher-Säule, z. B.. DEAE-Sephadex: A 25V: gegeben und durch Elution das gewünschte Produkt isoliert- E±ne^ Hochleistungsflüssigchromatographie-Trennung an reversed phase ist ebenfalls möglich..

UHUJ

Ausführungsbeispiel

Das folgende Ausführungsbeispiel erläutert die Erfindung näher., ' . .

925 MBg. trägerfreier E₃ ³²PO₄ CROTOP-H₃ ³²PQ₄, ZfK-Rossendorf) wurden in einem. Plastikröhrchen. lyophilisiert» Das lyophilisat wurde in. 80 All. eines Substratgemisches aufgenommen, das· 60 mit an TRIS/EC1; pH = 8;. 0,6.mffi an Nicotinamid-adenin-dinucleotid; 0,37 mM'an. ADP;. 0,-58 mM Fructose-1, 6-diphosphatr 1.5· naM an, MgCl2; 1,3 mit an Chelaplex III war·. Dazu wurden. TOO; /Ug- des Ehzymgemisches von Aldolase, Phosphoglycerat- -kinase., Glyßeraldehydphosphatdehydrogenase (Massenverhältnis 2 :·. .1' : 2) in.-1'O; /Ul 0,_:1 M TRIS/HCl-Puff er,. "pH - 8, gegeben.. 'Fach 5 Minuten wurde das Gemisch, mit. 300 yul absolutem. Ethanol-versetzt.. Die Df *2j ATP -Ausbeut e war* größer als 80 %... Uach Lyophilisation, und. Aufnahme, des Rückstandes in 0,.5^ml H₂O wird auf. eine DEAE-Sephadex A 25-Säule in (HCO₃")' Form aufgetragen und mit. kontinuierlichem Gradienten TOO ml HpO zu. 100 ml T K Triäthylammoniumbicarbonatlösung eluiert... Dia. Dimension, der Säule, betrug 1 χ 10 cm.

Zwischen; 110: -120 ml, wurde eine Fraktion, aufgefangen, die- '' ΈΖ &.ΤΈ mit einer radiochemischen Reinheit-von. 98 % enthielt.. · ;

Die Produktcharakterisijerung erfolgte dünnschichtchromatographisch mit. inaktivem ATP als Vergleich.

Rrv = 0,28 -auf" Polyethylenimin-Cellulose Fertigplatten der Fa.

Merck . '

Laufmittel: 0,5 MKH₂PO₄, pH= 3,5-

Claims (1)

1. L JZ834 J

   32_r

   Verfahren zur Herstellung von /γ-- P/ATP hoher spezifischer

   Aktivität der Formel

   O O

   32» 't

   jO- Π³-O-P-O-P-0

   k % o*

   4M

   M⁺ = H⁺ oder andere Kationen

   dadurch gekennzeichnet* daß Adenosin-5'-diphosphat in einem Substratgetnischi, bestehend aus TRIS/HCl,; Nicotinamid-adenindinucleotid,r ADP^ Fructose-lie-diphosphat, MgCl₀ und Chela-

   32
   plex ΙΙΓ,ί mit trägerfreier H₃ PO₄ innerhalb von 2 - 15 Minu ten durch ein Enzyrasystera,. bestehend aus Aldolase, Phosphoglyceratkinasei; Glyceraldehydphosphatdehydrogenase enzymatisch phosphorylierir wird*