DD213223A1 - Verfahren zur herstellung von / alpha hoch 32 p / nucleosid-5'-phosphaten hoher spezifischer aktivitaet - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von &a-32P! Nucleosid-5-phosphaten mit hoher spezifischer Aktivitaet der Formel I. Die Erfindung hat das Ziel, ein technisch einfaches, schnelles Verfahren zu entwickeln, das bei guten Ausbeuten Produkte mit maximaler spezifischer Aktivitaet liefert. Erfindungsgemaess wird in einem kleinen Gesamtvolumen traegerfreie H332PO4 in einer schnellen chemischen Synthese in einem organischen Loesungsmittel mit Nucleosiden umgesetzt. Ohne Zwischenreinigung wird anschliessend im waessrigen Puffersystem das Produkt der ersten Synthesestufen enzymatisch weiterphosphoryliert. Das Produkt wird in einem einfachen Verfahren saeulenchromatographisch isoliert.

Description

-A-

Dr. t. Bauschke

H. Kreißl

A. Münzenberg

32 "Verfahren zur Herstellung von /c^- P/ Nucleosid-5¹-phospha-

ten hoher spezifischer Aktivität"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur £cL- P_7-Markierung von Ribonucleosid- und Desoxyribonucleosid-5'-phosphaten der Formel I

B = Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin, Uracil und deren Derivate

R. = OH R_rt = OH oder H

V-/

pi D^ R = H R₂ = OH oder H

X = Phosphat» Diphosphat» Triphosphat

Anwendungsgebiet ist die Radiocheraische Synthese, Nucleotidchemie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Bekannt sind in der Literatur eine Reihe von Verfahren, die es gestatten, /öC- P_7-raarkierte Nucleotide hoher spezifischer Aktivitäten zu erhalten· Die bekanntesten Verfahren, beschrieben von T. F. Walseth, R. A· Johnson bzw, A. E. Reeve und

R. C. Huang, sind vollenzyraatische 4-Stufen-Reaktionen* Mit

32 träg.erfreiera Pi wird ADP in einer enzymatischen Synthese zu

32 £Τ"" Ρ/ΑΤΗ umgesetzt,, welches unter Wirkung der T4-Polynucleotidkinase 3*XMP an der 5'-Stellung phosphoryliert. Pl-Nuclease spaltet das 3'-Phosphat unter Erhalt von 5*/^ P/XMP_f

das seinerseits durch ein Kinasegemisch zura /cC - PjXTP phosphoryliert wird«

Nachteilig ist bei diesem Verfahren der Einsatz an verschiedenen hochgereinigten Enzymen und Substraten für die Synthese des P32~markierten Nucleosidmonophosphats. Die spezifische Aktivität des Endproduktes liegt unter der spezifischen Aktivität des als Zwischenstufe erhaltenen /f- P/A7P· Von Syraons wurde 1978 ein einfacheres cheraisch-enzymatisches Verfahren beschrieben, wobei in der 1· Stufe ein Gemisch von markierter und unmarkierter H₃PO₄ eingesetzt wurde, das in den Ausbeuten und vor allem in den spezifischen Aktivitäten der Produkte nicht den Anforderungen eines Verfahrens entsprach.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein technisch möglichst einfaches Verfahren zu entwickeln* das die Herstellung von nmol-Mengen

32 an spezifisch höchstmarkierten ^bC- pyNucleosidphosphaten in kurzen Reaktionszeiten und zu guten Ausbeuten ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfirrcftangsgemäß werden Verbindungen der Formal I hergestellt, indem man in einem Eintopfverfahren die entsprechende Aktivi-

tätsmenge an trägerfreier H₃ PO^, welche lyophilisiert wurde, in einer chemischen Reaktion unter Zusatz eines Koraplexbildners« z. B· Fe(III)-EDT mit dem geschützten bzw. ungeschützten Nucleosid unter der Wirkung von Trichloracetonitril/Triäthylamin im optimalen Mengenverhältnis zum Nucleosid-5^f-monophosphat umsetzt· Nach 30-60 min wird das Reaktioosgemisch in Tris-Puffer mit erhöhtem Mg-Gehalt aufgenommen^ nach Zugabe von Substraten und entsprechenden Kinasen wird das /P ./Nucleosid-S'-raonophosphat zum /©C- P/Nucleosid-5*-triphosphat innerhalb von 2-8 h umgesetzt«

Das /xL— P/Nucleosid-S'-triphosphat wird aus dem Reaktionsgeraisch säulenchromatographisch an einem Anionenaustauscher, z« 3. OEAE-Sephadex A25_f abgetrennt« Die Elution erfolgt nach einsrn Gradientenprogratnra«

Die folgenden Äusführuagsbeispiele erläutern die Verbindung näher:

Äusführungsbeispiele 1. Beispiel

%Q rnCi trägerfreie Η-,ΡΟ. aus dem ZfK Rossendorf wurden mit 0,5 .umol Chelaplex II in eineni Plaströhrchen lyophilisiert* Das Lyophilisat wurde in 50 .ul trocknem Dimethylsulfoxid, das 5 rag 2-Oesoxyadenosin enthielt» aufgenommen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ,ul Triethylamin und 10 ,ul einer 20 %igen Trichloracetonitril DMSO-Lösung gestartet. Nach 60 Minuten wurde das Reaktionsgetnisch rait 0,5 ml eines 50 mMol Tris-HCl-Puffers, pH = 8_rl, versetzt, der 20 tnM KCl, 30 mM an MgAc₂, önd 5 .ul Hercaptoethanol, 5 nmol ATP, 5 ,umol PEP enthielt* Mach Zugabe von SO ,ug Myokinase und 100 .ug Pyruvatkin_ase wird die Reaktion gestartet, und nach dem Er-

von

reichen einer Ausbeute an Nucleosidtrxphosphat 50 - 70 % wurde das Reaktionsgeraisch säulenchrotnatographisch an DEAE-Sephadex-A25 in Bicarbonatform aufgetrennt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Säule 0,5 χ 5 era gegeben und mit 20 ml Wasser, danach mit 20 ml 0,3 M Triäthylaramoniunibicarbonat gewaschen« Anschließend wurde im kontinuierlichen Gradienten 25 ml 0,3 M gegen 25 ml 0,7 M Triäthylaramoniumbicarbonat mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 1 ml/min das gewünschte Triphosphat nach ca, 10 ml als 5-7 ml-Fraktion isoliert. Die radiochemische Reinheit der Fraktion betrug 99 %

Nach Lyophilisation und Aufnehmen des ^C- ^dATP in 50 % Ethanol betrug die absolute Ausbeute an Produktaktivität 28 %«

Die Produktcharakterisierung erfolgt dünnschichtchromatographisch mit inaktivem dATP-Vergleich

Rp = 0,31, auf PEI-Cellulose der Fa. Merck Laufmittel 0,5 M KH₃PO₄-PUffer pH = 3,5

2» Beispiel

32 10 tnCi trägerfreie H₃ PQ₄ in 60 ,ul 0,1 N Salzsäure aus dem ZfK Rossendorf wurden mit 10 .ul (1 .umol) einer Chelaplex-II-Lösung versetzt und in einem Plaströhrchen lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 50 ,ul getrocknetem Dimethylsulfoxid, das 5,0 rag 2*-Acetyl-3'-desoxyadenosin enthielt, aufgenommen* Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ,ul Triäthylamin und 10 ,ul einer 20 %igen Trichloracetonitril/DHSQ-Lösung gestartet» Nach 60 Minuten vaurde das Reaktionsgeraisch mit 200 All 25 % NH₄OH versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur belassen, Mach Lyophilisation des Gemisches wurde der Rückstand in 0,5 si 50 mMol Tris-HCl-Puffer, pH = 8,1, versetzt,, der 20 mM an KCl, 30 mH an MgAc₂ war und 5 ,ul Mercaptoethanol, 5 nraol ATP, 5 .umol Phosphoenolpyruvat enthielt. Nach Zugabe von 50 .ug Myokinase und 100 ^ug Pyruvatkinase wurde die Reaktion gestartet und nach dem Erreichen einer Ausbeute an Nucleosid-5¹-triphosphat von 72 % nach 4 Stunden einer siulenchromatographischen Reinigung an DEAE-Sephadex-A25 in Bicarbonatform unterworfen.

Dazu wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule 0,5 χ 5 cm gegeben, mit 20 «al HpO und anschließend mit 20 ml 0,3 M Triathylammoniumbicarbonat gewaschen. Anschließend wurde im kontinuierlichen Gradienten 25 ral 0,3 M gegen 25 ml 0,7 M Triäthy!ammoniumbicarbonat mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 1 ml/min das gewünschte Triphosphat nach ca. 10 ml als 8 ml Fraktion isoliert. Die radiochemische Reinheit der Fraktion betrug 99 % /ct~²P7-3'dATP·

32 Nach Lyophilisation und Aufnehmen des /X- P7-3'dATP in 50 %igem Ethanol betrug die absolute Ausbeute an Produktaktivität 26

Die Produktcharakterisierung erfolgt dünnschichtchromatographisch mit inaktivem Substanzvergleich» Rp = 0,28 auf PEI-Cellulose der Fa· Merck Laufmittel 0,5 M KH₃PO₄-PUffer, pH = 3,5

Claims (1)

1. -i-

   Erfindungsanspruch
   Verfahren zur Hers'
   hoher spezifischer Aktivität der Formel I₁

   32

   Verfahren zur Herstellung von /oL- P7 Nucleosid 5'-phosphaten

   in der B = Adenin, Thyrain, Guanin, Cytosin, Uracil und deren

   Derivate
   R₁^ OH oder H
   R₂= OH oder H

   X = Phosphat» Diphosphat, Triphosphat

   32
   bedeuten^ aus trägerfreier H₃ PO. und Nucleosiden durch eine stufenweise chemisch enzytnatische Synthese» dadurch gekennzeichnet, daß trägerfreie H₃ PO. unter Zusatz eines Komplexbildner, z* B*. Fe(III)-EDT lyophilisiert und mit einem geschützten bzw* ungeschützten Nucleosid unter Zugabe von Trichloraeetonitril und Triäthylainin zum Nucleosid-5'-monophosphat umgesetzt, anschließend in Tris-Puffer mit erhöhtem Magnesium-Gehalt gegeben und nach Zugabe von entsprechenden

   32
   Kinasen nach 2 - 8 h /cC- P? Nticleosid-5'-triphosphat, säulenchromatographisch gev/onnen wird·