DE2461081C3

DE2461081C3 - Verfahren zur Herstellung von Monophosphaten von Aminoglykosid-Antibiotica

Info

Publication number: DE2461081C3
Application number: DE19742461081
Authority: DE
Inventors: Shinichi Kanagawa Kondo; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa; Morimasa Tokio Yagisawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1973-12-25
Filing date: 1974-12-23
Publication date: 1980-11-13
Also published as: DE2461081B2; FR2255378A1; DE2461081A1; GB1485797A; JPS5645596B2; JPS50105885A; FR2255378B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der

A) 3'-Monophosphate der Kanamycine, der Neomycine, der Paromomycine, des Neamins, des Paromamins, des Ribostamycins oder der Butirosine oder der

B) 5"-Monophosphate der Lividomycine oder der

C) 3"-Monophosphate des Streptomycins und des Dihydrostreptomycins durch enzymatische Phosphorylierung des jeweiligen Aminoglykosids in wäßriger Lösung.

Es ist bekannt, daß, wenn Kanamycine, wie Kanamycin A, B oder C, Neamin, Paromamin, Neomycine, wie Neomycin B oder C, Promamycine, wie Paromamycin I oder II, Ribostamycin oder Butirosine, wie Butirosin A oder B, die zu den Aminoglykosid-Antibiotica gehören, der Einwirkung eines phosphorylierenden Enzyms unterworfen werden, das durch einen Mikroorganismus erzeugt wird, zum Beispiel ein Bakterium, wie Escherichia coli JR66/W677, Escherichia coli K 12 ML 1629, Escherichia coli K-12 ML 1410 R-81, Pseudomonas aeruginosa H 9 und andere, die Hydroxylgruppe in 3-Stellung des o-Amino-o-deoxy-D-glucopyranosyl- oder des 2,6-Diamino-2,6-dideoxy-D-glucopyranosyl- oder des 2-Amino-2-deoxy-D-glucopyranosyl-Restes, der an die 4-Stellung des Deoxystrept-amin-Restes des antibiotischen Moleküls gebunden ist, mit Vorteil phosphoryliert werden kann (die vorgenannte 3-Stellung des Glucopyranosyl-Restes wird nachstehend als 3'-Stellung dieser Aminoglykosid-Antibiotica bezeichnet). Dies ist zum Beispiel beschrieben in den Literaturstellen »Science« 157 (1967), 1559—1561; »Journal of Antibiotics« 21 (1968), 13-29, 22 (1969), 273—282; sowie »Progress in Antimicrobial and Anticancer Chemotherapy« 2 (1970), 566—571.

Es ist auch bekannt, daß, wenn Lividomycine, wie Lividomycin A oder B, der Einwirkung eines phosphorylierenden Enzyms, wie Pseudomonas aeruginosa TI-13 oder Escherichia coli K-12 ML 1410 R-81 unterworfen

ίο werden, die Hydroxylgruppe in 5-StelIung des D-Ribofuranosyl-Restes (diese 5-StelIung wird nachstehend als 5"-Stellung bezeichnet), der an die 5-Stellung des Deoxystreptamin-Restes des Lividomycin-Moleküls gebunden ist, mit Vorteil phosphoryliert wird (vgl.

»Antimicrobial Agents and Chemotherapy« I (1972), 17—21, und »Journal of Antibiotics« 25 (19721. 483—486). Dieses phosphorylierende Enzym phosphoryliert auch die Hydroxylgruppe in der 3'-Stellung von Kanamycin A und wird deshalb als kanamycin-phosphorylierendes Enzym oder kanamycin-neomycin-phosphorylierendes Enzym bezeichnet (vgl. »Journal of Antibiotics« 26 [1973], 407—411). Weiterhin ist es bekannt, daß, wenn Streptomycin oder Dihydrostreptomycin der Einwirkung eines anderen phosphorylierenden Enzyms (sirepiomycin-phosphorylierendes Enzym) von Escherichia coli JR66/W677 unterworfen wird, die Hydroxylgruppe in der 3-Stellung des 2-Deoxy-2-methylamino-L-glucopyranosyl-Restes des Streptomycin-Moleküls (diese 3-Stellung wird nachstehend als 3"-StelIung bezeichnet) mit Vorteil phosphorylkrt wird (vgl. »FEBS Letters« 14 [ 19711293 - 296).

Hamao Umezawa und Mitarbeiter haben festgestellt, daß gegen Heilmittel resistente Bakterien, wie den R-Faktor aufweisende Escherichia coli, gegen Heilmittel resistente Staphylococcus aureus und resistente Pseudomonas aeruginosa einen Resistenzmechanismus gegen Kanamycine oder Paromamin besitzen, daß die vorgenannten Bakterien ein derartiges Enzym zur Phosphorylierung der 3'-Hydroxylgruppe von Kanamyein oder Paromamin in Gegenwart von Adenosin-triphosphat (ATP) erzeugen und die Aminoglykosid-Antibiotica durch die Einwirkung dieses phosphorylierenden Enzyms inaktivieren (vgl. »Science« 157 [1967], 1559, und »Progress in Antimicrobial and Anticancer Chemotherapy« 2 [1970], 567). Ausgehend von dieser Erkenntnis des Resistenzmechanismus der gegen Heilmittel resistenten Bakterien sind in den letzten Jahren ausgedehnte Studien gemacht worden, solche Derivate von Aminoglykosid-Antibiotica zu synthetisieren, die gegenüber den gegen Heilmittel resistenten Bakterien aktiv sind. Als Ergebnis dieser Bemühungen sind

3'-Deoxy kanamycin,
3',4'-Dideoxy-kanamycin B,

3',4'-Dideoxy-neamin,

3',4'Dideoxy-ribostamycin und
3'-Deoxy-neamin und andere

synthetisiert worden (vgl. »Journal of Antibiotics« 21 [1971], 274-275, 24 [1971], 485-487 und 711-725, und 25 [1972], 613-617; sowie IP-AS 80 038/74). Diese Deoxy-Derivate der Aminoglykosid-Antibiotica sind — so wurde gefunden — aktiv gegenüber den gegen Heilmittel resistenten Bakterien. Kürzlich ist gefunden worden, daß Monophosphate von Aminoglykosid-Antibiotica, die durch Umsetzen von Aminoglykosid-Antibiotica mit einem phosphorylierenden Enzym eines Mikroorganismus erzeugt worden sind, sehr wertvoll als Ausgangssubstanz für eine chemische Synthese neuer

24 61 OSl

Derivate von Aminoglykosid-Antibiotica sind, da diese Monophosphate der Aminoglykosid-Antibiotica chemisch in die entsprechenden Deoxy-Derivate dieser Antibiotica umgewandelt werden können, zum Beispiel durch Umsetzen der Phosphatgruppe mit einem Halogenierungsmittel und durch anschließende Hydrierung.

Aufgabe bei vorliegender Erfindung war es nun, ein Verfahren zur Herstellung eines Monophosphats eines Aminoglykosid-Antibioticums unter Verwendung von Phosphotransferasen zur Verfügung zu stellen, das mit verbesserter Ausbeute und in einfacher Weise durchführbar ist

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man entweder Kanamycine, Neomycine, Paromomycine, Neamin, Paromamin, Ribostamycin, Butirosine, Lividomycine, Streptomycin oder Dihydrostreptomycin mit Adenosintripbosphat, Guanosintriphosphat, Inosintriphosphat oder deren Alkalimetallsalzen an einer durch kovalente Bindung an einen in Wasser unlöslichen Träger immobilisierten Phosphotransferase, die aus Zellen von kanamycin-resistenten Bakterien oder streptomycin-resistenten Bakterien durch Extrahieren und Verknüpfung mit Agarose, vernetztem Dextran, Cellulose, carboxymethyliertem Dextran, Carboxymethylcellulose oder phosphorylierter Cellulose hergestellt wurde, umsetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt eine wesentliche Verbesserung der Ausbeute der Monophosphate der Aminoglykosid-Antibiotika im Vergleich zu vorbekannten Arbeitsweisen unter Anwendung einer Lösung des rohen Enzyms, die durch Homogenisieren der Zellen von phosphorylierendes Enzym produzierenden Bakterien erhalten wurde. (Vergleiche beispielsweise Journal of Antibiotics, Vol. XXI, Nr. 1, Seiten 22-28.)

Obwohl die allgemeine Arbeitsweise der Immobilisierung von Enzymen bekannt ist, war es bislang weder bekannt noch wurde es für möglich gehalten, ein Enzym vom Transferaselyp zu immobi'isieren. Wie sich aus Tabelle 1 auf Seite 749 von Jorunal of Antibiotics, Vol. XXV, Nr. 12, Seiten 748-750, ergibt, sind die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Phosphotransferasen selbst sehr hitzeinstabil. Diese bekannte Hitzeinstabilität der Phosphotransferasen würde jedoch den Durchschnittsfachmann davon abhalten, die Immobilisierung der erfindungsgemäß verwendeten Phosphotransferasen zu versuchen.

Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß die gemäß der Erfindung verwendeten, immobilisierten Phosphotransferasen eine erhebliche Hitzestabilität besitzen, wie durch Vergleichsversuche gezeigt werden konnte.

Die unerwartete Verbesserung der Hitzestabilität der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten, immobilisierten Phosphotransferasen ermöglicht jedoch die wiederholte Verwendung des Enzyms für die Phosphorylierungsreaktion, während Phosphotransferasen ohne Immobilisierung durch Erhitzen inaktiviert werden und nach nur einmaliger Verwendung für die Phosphorylierung verworfen werden müssen.

Phosphotransferasen für Aminoglykosid-Antibiotica, die bis jetzt bekanntgeworden sind, sind intracellulare Enzyme, die von Bakterien erzeugt werden und ausschließlich in den Zellen von Bakterien existieren. Ein intracellulares Enzym wird innerhalb der Zelle von Bakterien erzeugt, doch kommt es normalen, eise nicht durch die Zellwandungen aus der Zelle heraus, wenn die Bakterien in üblicher Weise in einem flüssigen Nährmedium kultivier! werden. Demzufolge reichert sich das intracellulare Enzym nicht in der flüssigen Phase der Nährflüssigkeit an. Unter diesen Umständen ist es in zahlreichen Fällen schwierig, ein Monophosphai eines Aminoglykosid-Antibioticums zu erzeugen und in hoher Ausbeute in dem flüssigen Nährmedium anzureichern, wenn die Bakterien, die ein phosphorylierendes Enzym erzeugen, in dem Nährmedium in Gegsnwart eines Aminoglykosid-Antibioticums kultiviert werden.

ίο Deshalb ist es üblich, daß der ein phosphorylierendes Enzym für ein Aminoglykosid-Antibioticum erzeugende Mikroorganismus in einem bekannten flüssigen Nährmedium kultiviert wird, daß dann die Zellen des Mikroorganismus aus der Nährflüssigkeit isoliert und danach in bekannter Weise homogenisiert werden. Das von diesem Mikroorganismus erzeugte phosphorylierende Enzym wird dadurch *us den Zellmaterialien extrahierbar gemacht Die homogenisierten Zellmaterialien werden mit einer geeigneten Pufferlösung sowie einem Extraktionslösungsmittel vermischt, und dann wird das Gemisch zur Abtrennung der Feststoffe davon zentrifugiert. Auf diese Weise wird eine rohe Enzymlösung hergestellt Früher ist ein Monophosphat eines Aminoglykosid-Antibioticums gewöhnlich durch Zugabe des Aminoglykosid-Antibioticums zu dieser rohen Enzymlösung zusammen mit Adenosin-triphosphat, das als Phosphorsäure-Donator wirkt, erzeugt worden, wobei dann die Reaktion des Aminoglykosid-Antibioticums mit dem in der rohen Enzymlösung vorliegenden phospnorylierenden Enzym bewirkt wird. Nach diesem früheren Verfahren ist jedoch die Isolierung und Reinigung des Monophosphats des als Reaktionsprodukt erzeugten AminoglykosidAntibioticums stets kompliziert und schwierig, so daß das erwünschte Reaktionsprodukt nur in geringer Ausbeute gewonnen werden kann. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die rohe Enzymlösung, die dann als Enzym-Reaktionsteilnehmer eingesetzt wird, beträchtliche Mengen Proteine, färbende Substanzen und Polysaccharide als Verunreinigungen neben dem erwünschten aktiven phosphorylierenden Enzym enthält, so daß einige Arbeitsgänge erforderlich sind, diese Verunreinigungen zu entfernen. Wenn außerdem das Reaklionsgemisch nach Beendigung der enzymatischen Reaktion immer noch eine restliche enzymatische Aktivität zeigen sollte, ist es notwendig, das Enzym durch Denaturieren zu entfernen, zum Beispiel durch Erhitzen, und dadurch das denaturierte Enzym aus dem Reaktionsgemisch auszufällen, bevor ein Extrahieren des gewünschten Reaktionsproduktes aus dem Reaktionsgemisch erfolgt. Dies bedeutet, daß das phosphorylierende Enzym in einer unwirtschaftlichen Weise eingesetzt wird.

Es ist bekannt, daß zahlreiche Enzyme, die zur Phosphorylierung von Aminoglykosid-Antibiotica geeignet sind, mittels bekannter Mikroorganismen erzeugt werden können, zum Beispiel mittels der Stämme Escherichia coli K-12 ML 1629 (vgl. »Science« 157 [1967], 1559), Escherichia coli K-12 ML1410 R-81, Escherichia coli K-12 J5 Rl 1-2 (vgl. »Journal of Antibiotics« 26 [1973], 407), Escherichia coli JR66/W677 (vgl. »Journal of Antibiotics« 25 [1972], 748), Pseudomonas aeruginosa H -9 (vgl. »Journal of Antibiotics« 21 [1968], 154), Pseudomonas aeruginosa Tl-13 (vgl. »Journal of Antibiotics« 25 [1972], 483) und Staphylococcus aureus B294 und B295 (vgl. »Applied Microbiology« 16 [1968], 1282). Da derartige zur Erzeugung von Phosphotransferasen geeignete Stämme in der Natur weit verbreitet sind und nicht auf die vorgenannten

Stämme beschränkt sind, ist es möglich, die verschiedensten Mikroorganismen zu verwenden.

Die Stämme von Pseudomonas Tl-13, Escherichia coli K-12 ML 1629 und Escherichia coli JR66/W677 sind bei der japanischen öffentlichen Hinterlegungsstelle »Permentation Research Institute«, Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry, Inage, Chiba (Japan), unter de<i Hinterlegungsnummern »FERM-P. 2385«, »FERM-P. 2387« und »FERM-P. 2388« deponiert worden. Diese hinterlegten Stämme sind beispielhaft für bekannte Mikroorganismen, die ein phosphorylierendes Enzym zum Gebrauch bei der Herstellung eines immobilisierten phosphorylierenden Enzyms nach vorliegender Erfindung ergeben.

Vorzugsweise wird ein phosphorylierendes Enzym, das zuvor gereinigt worden ist, zur Herstellung des immobilisierten Enzyms eingesetzt, welches bei der Durchführung des Verfahrens vorliegender Erfindung zu verwenden ist, da in diesem Falle natürlich ein solches immobilisiertes Enzym erhalten werden kann, das eine höhere enzymatische Wirksamkeit oder Aktivität besitzt. Ein derartiges immobilisiertes Enzym, das eine zur Erreichung des Ziels vorliegender Erfindung ausreichende Wirksamkeit oder Aktivität besitzt, kann jedoch auch unter Verwendung einer rohen Enzymlösung, die Proteine, färbende Substanzen und Polysaccharide als Verunreinigungen neben dem aktiven phosphorylierenden Enzym enthält, sowie auch unter Verwendung einer solchen rohen Enzymlösung, hergestellt werden, die in bekannter Weise zumindest teilweise gereinigt worden ist. Es ist wünschenswert, daß eine derartige rohe Enzymlösung, die wenigstens von den Verunreinigungen mit niedrigen Molekulargewicht durch eine Reinigungsbehandlung, wie Dialyse und/oder Aussalzen, gereinigt worden ist, bei der Herstellung des immobilisierten Enzyms ?u verwenden ist.

Ganz allgemein kann ein wasserunlösliches Polysaccharid oder dessen Derivat als Trägermaterial oder Vehikel eingesetzt werden, an das die Phosphotranferase chemisch gebunden oder gekuppelt ist, um das immobilisierte Enzym nach vorliegender Erfindung herzustellen. Die als Trägermaterialien verwendeten Polysaccharide oder deren Derivate müssen selbstverständlich in Wasser unlöslich sein und sollten erwünschtermaßen mit Wasser quellbar sein. Derartige Trägermaterialien, die erfindungsgemäß einsetzbar sind, sind Agarose, vernetztes Dextran (zum Beispiel ein durch Umsetzung mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran-Gel), Cellulose, carboxymethyliertes Dextran, Carboxymethylcellulose oder phosphorylierte Cellulose. Bevorzugt wird eine Agarose, die als Handelsprodukt unter der Bezeichnung »Sepharose 4B«® der Firma Pharmacia Co., Schweden erhältlich ist (Agarose-Kügelchen, die aus 4 Prozent Agarose-Gel hergestellt worden sind), wobei dieses Trägermaterial durch Umsetzen mit Bromcyan aktiviert worden ist.

Es ist allgemein bekannt, daß ein Enzym chemisch an ein Trägermaterial entweder durch eine covalente Bindung oder durch ..,.ic .onenbindung gebunden oder gekuppelt werden kann (vgl. zum Beispiel »Annual Review of Biochemistry« 35 [1966], 873—908). Die zur Verfügung stehenden Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms durch eine chemische Bindung an ein Trägematerial mittels einer covalenten Bindung schließt ein Alkylierungsverfahren, ein Verfahren zur Bildung einer Amid-Bindung, ein Verfahren zur Bildung eines Imidocarbonats, eines Isoharnstoffs oder eines Urethans mittels eines Halogencyans und andere Verfahren ein (vgl. »Nature« 214[1964], 1302-1304).

Die gängigen Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms durch eine chemische Bindung an ein Trägermaterial durch eine Ionenbindung schließt ein Verfahren unter Verwendung zahlreicher Arten von ionenaustauschbaren Trägermaterialien ein. Es ist gefunden worden, daß ein wasserunlösliches bzw. ein in Wasser quellbares Polysaccharid mit zahlreichen Hydroxylgruppen im Molekül, wie Agarose, Dextran (zum Beispiel ein durch Umsetzen mit Epichlorhydrin hergestelltes vernetztes Dextran-Gel, das unter dem Warenzeichen »Sephadex®« von der Firma Pharmacia

π Co, Schweden, verkauft wird) und Cellulose, zur Verwendung als Trägermaterial geeignet ist an das das phosphorylierende Enzym mittels covalenter Bindung gebunden ist Ferner ist gefunden worden, daß Derivate dieser Polysaccharide, wie carboxymethyliertes Dexträn. Carboxymethylcellulose und phosphorylierte Cellulose, zur Verwendung als Trägermaterialien geeignet sind, mit denen ein phosphorylierendes Enzym mittels einer Ionenbindung verbunden ist.

Durch weitere Untersuchungen bezüglich einer Unlöslichmachung eines phosphorylierenden Enzyms für die Aminoglykosid-Antibiotica ist gefunden worden, daß ein solches immobilisiertes phosphorylierendes Enzym, das in seiner enzymatischen Aktivität sehr beständig ist und eine enzymatische Phosphorylierung mit hoher Wirksamkeit erreichen kann, in einfacher Weise und unter milden Bedingungen durch Aktivieren von Agarose, Dextran oder Cellulose durch deren Umsetzung mit einem Halogencyan hergestellt werden kann. In diesem Falle werden einige Hydroxylgruppen von Agarose, Dextran oder Cellulose in Reste der Art R-O-C = N umgewandelt, wobei R für den Agarose-, Dextran- oder Cellulose-Rest steht.

Diese Cyanatgruppen reagieren dann mil den Aminogruppen des phosphorylierenden Enzyms mittels einer covalenten Reaktion, so daß das Trägermaterial, wie Agarose, Dextran oder Cellulose, an das Enzym über eine Imidocarbonat-, Isoharnstoff- oder Urethan-Bindung gebunden wird, die sich zwischen den Hydroxylgruppen des Trägermaterials und den Aminogruppen des Enzyms ausbildet. Das für diese Zwecke verwendete Halogencyan ist vorzugsweise Bromcyan. Eine durch Bromcyan aktivierte Agarose, die zu diesem Zwecke geeignet ist, ist unter der Bezeichnung »cyangen-bromide-activated Sepharose® 4B« der Firma

so Pharmacia Co., Schweden, im Handel.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die immobilisierte Phosphotransferase mit einem Aminoglykosid-Antibiolicum in wäßriger Lösung und in Gegenwart eines Phosphorsäure-Donators in Berührung gebracht, der Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat, Inosintriphosphat oder deren Alkalimetallsalze, insbesondere deren Natriumsalze, ist, so daß die enzymatische Phosphorylierung des Antibioticums stattfindet. Die Reaktion kann bei Reaktionstemperaturen von 20 bis 50⁰C, vorzugsweise von 30 bis 40⁰C, und bei einer Reaktionszeit von 15 bis 30 Minuten unter leichtem Schütteln oder Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt werden. Auf diese Weise kann das im Reaktionsgemisch vorliegende Aminoglycosid-Antibioticum vollständig selektiv phosphoryliert werden, und man erhält ein Monophosphat des Aminoglycosid-Antibioticums, das an einer einzigen Hydroxylgruppe je nach der Art des eingesetzten phosphorylierenden

Enzyms phosphoryliert worden ist. Obwohl die enzymatische Reaktion absatzweise durchgeführt werden kann, ist es auch möglich, die enzymatische Reaktion in kontinuierlicher Weise auszuführen, indem die wäßrige, das Aminoglycosid-Antibioticum als Substrat enthaltende Lösung und der Phosphorsäure-Donator durch eine Säule mit dem immobilisierten phosphorylierenden Enzym bei der vorgenannten Reaktionstemperatur geleitet werden. Dieses kontinuierliche Verfahren ist zur Phosphorylierung großer Mengen an Aminoglycosid-Antibiotica zweckmäßig. Die Durchsatzgeschwindigkeit der Subslratlösung durch die Säule mit dem immobilisierten Enzym kann zweckmäßigerweise derart sein, daß die Raumgeschwindigkeit der Substratlösung (Liier Lösung je ! Ltr. der Enzym-Säule je Stunde) is in der Größenordnung von 2,0 liegt. Die Konzentration des Substrats in der wäßrigen Substratlösung kann unter 500 g/Liter liegen. Der Anteil des in dieser Lösung vorliegenden Phosphorsäure-Donators kann vorzugsweise mindestens äquimolar zur Menge des Substrats sein. Die Säule des immobilisierten Enzyms kann von beliebiger Form sein, solange sie ein gleichmäßiges Inberührungbringen der Substratlösung mit dem Enzym mit einer großen Berührungsoberfläche erlaubt.

Wenn das Verfahren der Erfindung absatzweise durchgeführt wird, wird das das gewünschte Reaktionsprodukt sowie das immobilisierte Enzym enthaltende Reaktionsgemisch zum Entfernen des Enzyms nach Beendigung der enzymatischen Reaktion filtriert. Wenn andererseits das vorliegende Verfahren in konlinuierlieher Weise unter Verwendung einer Säule mit dem immobilisierten Enzym angewendet wird, ist das aus der Enzym-Säule austretende Eluat (das Reaktionsgemisch) bereits frei von Enzym. Für die Gewinnung des Monophosphats des Aminoglycosid-Antibioticums als erwünschtes Reaktionsprodukt aus dem Reaktionsgemisch (aus der Lösung) ist es zweckmäßig, daß das vom Enzym befreite Reaktionsgemisch durch die Säule eines Kationenauslauschharzes geschickt wird, das Carboxylgruppen als funktioneile Gruppen aufweist, zum Beispiel »Arnbcrlätc®« IRC 50 oder CG 50. die Handelsprodukte der Firma Rohm & Haas Co, V. St. A, sind, und zwar in der Ammoniumform, um das Monophosphat an das Harz zu adsorbieren. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen und anschließend mit wäßrigem 0.1 n- bis 0.2 η-Ammoniak eluierL Auf diese Weise kann ohne weiteres eine wäßrige Lösung des gewünschten Monophosphats erhalten werden, das im Verlauf des Gewinnungsverfahrens gereinigt wird. Beim Eindampfen der gereinigten wäßrigen Lösung zur Trockne unter vermindertem Druck erhält man das erwünschte Monophosphat des Aminoglycosid-Anlibiolicums in hoher Ausbeute. Wenn das vorgenannte Gewinnungsund Reinigungsverfahren angewendet wird, werden die im Reaktionsgemisch vorliegenden Nucleotide an das Kationenaustauscherharz nicht adsorbiert, während nicht umgesetzte Ausgangsverbindungen, nämlich die Aminoglycosid-Antibiotica. die möglicherweise im Reaktionsgemisch verblieben sein können, an das Harz adsorbiert werden. Das nicht umgesetzte, an das vorgenannte Kationenaustauscherharz adsorbierte Antibioticum kann jedoch nicht unter Verwendung des vorgenannten wäßrigen Ammoniaks von niedriger Konzentration, nämlich 0,1 n- bis 0,2 n, eluiert werden, mit Ausnahme des Paromamins. Wenn Streptomycin. das unter basischen Bedingungen verhältnismäßig instabil ist, nach dem Verfahren vorliegender Erfindung phosphoryliert wird und wenn das Monophosphat des Streptomycins dann aus dem Reaktionsgemisch mittels des vorgenannten Gewinnungs- und Reinigungsverfahren erhalten werden soll, ist es vorteilhaft, daß die Säule des Kationenaustauscherharzes mit dem daran adsorbierten Steptomycin-monophosphat mit verdünnter Salzsäure eluiert wird und daß das erhaltene Eluat chromatographisch mit Aktivkohle unter Verwendung von Wasser als Entwicklungsmittel für Reinigungszwekke zu behandeln ist. Wenn das das gewünschte Monophosphat als Reaktionsprodukt enthaltende Reaktionsgemisch eine hohe Konzentration an anorganischen Salzen aufweist, kann es vorzugsweise mit Wasser verdünnt werden, um die Fähigkeit des gewünschten Reaktionsproduktes zu steigern, an das Kationenaustauscherharz adsorbiert zu werden, bevor es auf die Harzsäule gegeben wird.

Nachstehend werden einige Beispiele von Monophosphaten von Aminoglycosid-Antibiotica hinsichtlich ihrer Eigenschaften beschrieben, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind.

Kanamycin A-3'-phosphat ist ein farbloses Pulver, das sich bei 270 bis 280°C braun verfärbt, jedoch bis zu 300⁰C nicht schmilzt. Die Elementaranalyse hat ergeben, daß der Verbindung die Formel

C₁₈H₃₅N₄O₁, · PO(OH)₂- H₂O

zukommt. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophore- -se (pH = 1,8) beträgt das Verhältnis des Wanderungsabstandes dieser Verbindung in Richtung auf die Kathode zu zum Wanderungsabstand des freien Kanamycin A 0.75 :1.

Kanamycin B-3'-phosphat ist ein farbloses Pulver, das sich bei 251 bis 258°C unter Aufschäumen zersetzt. Die Elementaranalyse hat ergeben, daß der Verbindung die Formel

C₁₈H₃₆N₅O₁₀-PO(OH)₂^ H₂O

zukommt. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese (pH = 1,8) beträgt das Verhältnis der Wanderungsabstände dieser Verbindung zum freien Kanamycin B 0,75 :1.

Neamin-3'-phosphat ist ein farbloses Pulver, das sich oberhalb 200° C zersetzt Aufgrund der Elementaranalyse hat die Verbindung die Forme!

C₁₂H₂₅N₄O₆-PO(OH)₂-2 H₂O.

Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese beträgt das Wanderungsverhältnis von dieser Verbindung zum freien Neamin 0.74 :1.

Paromamin-3'-phosphat ist ein farbloses Pulver, das sich bei 260 bis 290" C braun verfärbt, jedoch bis zu 300° C nicht schmilzt. Aufgrund der Elementaranaiyse kommt der Verbindung die Formel

C₁₂H₂₄N₃O₇-PO(OH)₂^ H₂O

zu. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese beträgt das Wanderungsverhältnis von dieser Verbindung zum freien Paromamin 0,65 :1.

Ribostamycin-3'-phosphat ist ein farbloses Pulver, das eine Zersetzungstemperatur oberhalb 200° C zeigt. Aufgrund der Elementaranaiyse hat die Verbindung die Formel

C₁₇H₃₃N₄O₁₀-PO(OH)₂ - 2 H₂O.

Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese beträgt das Wanderungsverhältnis von dieser Verbindung zum freien Ribostamycin 0,73 :1.

Butirosin A-3'-phosphat ist ein farbloses Pulver, das

eine Zersetzungstemperatur oberhalb 200⁰C zeigt. Aufgrund der Elementaranalyse hat die Verbindung die Formel

C₂IH₄₀N₅O₁₂-PO(OH)₂-H₂O.

Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese
trägt das Verhältnis der Wanderungsabstände von dieser Verbindung zum freien Butirosin A 0,77:1.

Lividomycin A-5"-phosphat ist ein farbloses Pulver, das eine Zersetzungstemperatur oberhalb 210⁰C zeigt. Aufgrund der Elementaranalyse hat die Verbindung die Formel

C₂₉H₅₄N₅Oi₈-PO(OH)₂S H₂O.

Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese beträgt das Verhältnis der Wanderungsabstände von dieser Verbindung zum freien Lividomycin A 0,88 :1.

Streptomycin-3"-phosphat-hydrochlorid ist ein farbloses Pulver, das sich bei 215 bis 220⁰C unter Aufschäumen zersetzt. Aufgrund der Elementaranalyse hat die Verbindung die Formel

C₂IH₃₈N₇O₁₂-PO(OH)₂-3 HCl.

Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese
trägt das Verhältnis der Wanderungsabstände von dieser Verbindung zum freien Streptomycin 0,68 :1.

Dihydrostreptomycin-3"-phosphat in Form seines Carbonats ist eine farblose kristalline Substanz vom Zersetzungspiinki 270^cC. Aufgrund der Elementaranalyse hat die Verbindung die Formel

C₂,H₄₀N₇O₁₂· PO(OH)₂- H₂CO₃ ■ 3 H₂O.

Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese beträgt das Verhältnis der Wanderungsabstände von dieser Verbindung zum freien Dihydrostreptomycin 0,67: 1.

Die vorgenannten Monophosphate zeigen beim Infrarot-Absorptionsspektrum ein Maximum bei 955 bis 965 cm-', das auf den Phosphorsäure-ester hinweist. Die Verbindungen sind positiv gegen die Hanes-Reaktion, die die Anwesenheit von Phosphor im Molekül angibt. Weiterhin ergeben diese Monophosphate wieder ihre aminoglycosidischen Ausgangsantibiotica, wenn sie durch Erhitzen in 0,4molarer wäßriger Natriumperchlorat-Lösung bei pH 4 zwanzig Stunden bei 80⁰C hydrolysiert werden oder auch wenn sie durch Umsetzen mit alkalischer Phosphatase hydrolysiert werden. Die chemischen Strukturen dieser Monophosphate sind durch ihre NMR-Spektren und ihren Säureverbrauch bestätigt worden.

Die Erfindung wird jetzt im Hinblick auf die nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
Herstellung einer rohen Enzymlösung

Der Stamm Escherichia coli JR66/W677 wird überimpft auf und inkubiert in 1 Liter eines sterilen Inkubationsmediums, das bei pH 7,4 1 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Fleischextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthält. Die Inkubation wird 16 Stunden bei 37° C unter Schütteln durchgeführt, um eine Zuchtkultur zu erhalten. Diese Zuchtkultur wird dann in 9 Liter eines solchen Kulturmediums überführt, das die gleiche Zusammensetzung wie das vorgenannte Inkubationsmedium aufweist, jedoch zusätzlich 50 mg Kanamycin A enthält, das zur Verhinderung des Wachstums unerwünschter Mikroorganismen zugegeben worden ist Die Kultivierung wird 6 Stunden unter Rühren bei 37°C und Belüften durchgeführt (die Durchsatzgeschwindigkeit beträgt 36 Liter je Minute). Nach Beendigung der Kultivierung werden die Bakterienzellen aus der Kultur durch kontinuierliches Zentrifugieren mit 10 000 Umdrehungen pro Minute (UpM) und unter Kühlung gesammelt. Man erhält eine Ausbeute von 20—25 g (feucht) Zellen je 10 Liter Kulturmedium. Der so erhaltene Zellkuchen wird zweimal mit je 200 ml einer 20 mMol Kaliumphosphat enthaltenden Puffer-Lösung vom pH 7,2 in der Zentrifuge gewaschen und danach in einer weiteren Menge (20 bis 25 ml) der gleichen Puffer-Lösung suspendiert. Dann durchläuft die Suspension eine französische Preßzelle, die mit einem Druck von 1200 kg/cm² betrieben wird, so daß die Zellen homogenisiert werden. Die das homogenisierte ZeIIm*- terial enthaltende Suspension wird dann 90 Minuten einer mit 100 000 g (Gravitation) betriebenen Zentrifuge unterworfen. Die derart erhaltene überstehende Lösung wird als rohe Enzymlösung eingesetzt. Diese rohe Enzymlösung enthält Proteine in einer Menge von 40 bis 80 mg/ml, wie nach der Methode von Lowry bestimmt werden konnte. Das Volumen der rohen Enzymlösung beträgt 30 bis 40 ml.

Das obige Verfahren wird unter Verwendung des Stamms Pseudomonas aeruginosa TI-13 anstelle des Stamms Escherichia coli JR66/W677 wiederholt, wobei die gleiche rohe Enzymlösung erhalten wird.

B e i s ρ i e 1 2

Gewinnung und Reinigung des Kanamycin
phosphorylierenden Enzyms (auch kanamycinneomycin-phosphorylierendes Enzym genannt)

Die nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellte rohe Enzymlösung, die die phosphorylierenden Enzyme von Escherichia coli JR66/W677 enthält, wird durch eine Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von »Sepharose® 4B« (= Agarose-Kügelchen, die von der Firma Pharmacia Co., Schweden, vertrieben werden), an die 3',4'-Dideoxy-kanamycin B chemisch gebunden worden ist, gereinigt. Eine allgemeine Methode der angewendeten Affinitäts-Chromatographie ist von P. Cuatrecasa und C. B. Anfinsen in »Method in Enzymology«, Band XXII, »Enzyme Purification and Related Technique«, Seite 345, Academic Press, New York, 1971, beschrieben. Auf diese Weise erhält man ein gereinigtes Präparat des Kanamycin phosphorylierenden Enzyms von Escherichia coli JR66/W677.

Die »Sepharose 4B« mit dem chemisch daran gebundenen 3',4'-Dideoxy-kanamycin B, die beim vorgenannten Reinigungsverfahren eingesetzt worden ist, wird durch Umsetzen von 15 g einer »Cyanogenbromide-activated Sepharose® 4B« (ein Handelsprodukt der Firma Pharmacia Co, Schweden) mit 3 g 3',4'-Dideoxy-kanamycin B während 16 Stunden bei 4° C in 50 ml einer 0,1-m wäßrigen Natriumbicarbonat-Lösung mit einem Gehalt von 0,5 Mol Natriumchlorid hergestellt Der gebildete Feststoff wird abfiltriert, mit 1 Mol Monoäthanolamin-Chlorwasserstoffsäure vom pH 8,0 umgesetzt und danach mit einer 0,1 -m Acetat-Pufferlösung vom pH 4,0 mit einem Gehalt von 1 Mol Natriumchlorid und mit einer 0,1 -m Borat-Pufferlösung vom pH 8,0 mit einem Gehalt von 1 Mol Natriumchlorid gewaschen.

Der derart behandelte Feststoff wird in 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 suspendiert und dann als Suspension im Kühlschrank aufbewahrt

Bei dem vorgenannten Reinigungsverfahren werden 35 ml der rohen, das Kanamycin phosphorylierende Enzym enthaltende Enzymlösung durch eine Säule geleilet, die 25 ml der wie vorstehend beschrieben hergestellten, chemisch gebundenes 3',4'-Dideoxykanamycin B enthaltende »Sepharose® 4B« enthält. In diesem Falle laufen größere Anteile der in der rohen Enzymlösung vorliegenden Proteine lediglich durch die vorgenannte Säule, ohne an das Säulenmaterial adsorbiert zu werden, während das Kanamycin phosphorylierende Enzym an das Säulenmaterial adsorbiert wird, nämlich an die chemisch gebundenes 3',4'-Dideoxykanamycin B enthaltende »Sepharose® 4B«. Das an diese Säule adsorbierte Kanamycin phosphorylierende Enzym wird mit 20 mMol Kaliumphosphat-Futteriösung vom pH 7,2 oder mit der gleichen Pufferlösung mit einem zusätzlichen Gehalt von 0,1 oder 0,3 Mol Natriumchlorid nicht aus der Säule eluiert, sondern erst von einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung mit einem Gehalt von 0,6 Mol Natriumchlorid. Die derart erhaltene gereinigte Enzymlösung mit dem Kanamycin phosphorylierenden Enzym von E. coli JR66/W677 zeigt eine 60mal höhere Phosphorylierungsaktivität als die ursprüngliche rohe Enzymlösung, bezogen jeweils auf 1 mg des Proteingehalts.

Beispiel 3

Gewinnung und Reinigung eines Streptomycin phosphorylierenden Enzyms

30

Die nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellte rohe Enzymlösung, die die phosphorylierenden Enzyme von Escherichia coii JR66/W677 enthält, wird durch eine Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von »Sepharose® 4B«, an die 3',4'-Dideoxy-kanamycin B chemisch gebunden ist, wobei die Herstellung im Beispiel 2 beschrieben ist, gereinigt. Bei diesem Reinigungsverfahren laufen 10 ml rohe Enzymlösung durch die mit 10 ml der zuvor beschriebenen »Sepharose 4B« gefüllte Säule. Dann wird die Säule mit 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 und mit der gleichen Pufferlösung, jedoch mit einem Gehalt von 0,1 Mol Natriumchlorid gewaschen. Danach wird die Säule mit 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,18 Mol Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat enthält das Streptomycin phosphorylierende Enzym. Diese gereinigte Lösung des Streptomycin phosphorylierenden Enzyms, nämlich das Eluat, zeigt eine 20- bis 40mal höhere Phosphorylierungsaktivität als die anfängliche rohe Enzymlösung, jeweils bezogen auf 1 mg des Proieirigehsiis.

55

Beispiel 4 Herstellung einer mit Bromcyan aktivierten Agarose

10 ml eines Trägermaterials, das hauptsächlich aus Agarose besteht (die der in den früheren Beispielen genannten »Sepharose® 4B« entspricht) wird mit einer Lösung von 1,5 g Bromcyan in 10 ml Wasser vermischt. Durch Zugabe einer 2 η-wäßrigen Natriumhydroxydlösung wird das Gemisch alsbald unter Rühren auf einen pH-Wert von 11,0 eingestellt Während der nächsten 12 Minuten wird das Gemisch bei 20° C konstant gerade auf pH 11,0 gehalten, indem laufend mittels einer manuell bedienten Titriervorrichtung 2 n-Uatriumhydroxydlösung zugegeben wird, deren Gesamtmenge etwa 8 ml beträgt. Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert. Der Filterkuchen wird mit einer großen Menge 0,1-m wäßriger Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 0,5 Mol Natriumchlorid gewaschen; man erhält 10 ml einer mit Bromcyan aktivierten Agarose, die als Trägermaterial für ein phosphorylierendes Enzym verwendet werden kann, wie das spätere Beispiel 10 zeigt.

Anstelle dieser aktivierten Agarose kann man auch in gleicher Weise die bereits früher erwähnte und im Handel erhältliche »Cyanogen Bromide-activated Sepharose® 4B« verwenden.

Beispiel 5

Herstellung eines mit Bromcyan
aktivierten Dextrans

10 ml eines Trägermateri das hauptsächlich aus Dextran besteht und das unter der Bezeichnung »Sephadex®G-25« der Firma Pharmacia Co., Schweden, im Handel ist und ein im wesentlichen mit einer geringen Menge Epichlorhydrin vernetztes Dextran darstellt, wird mit 1,5 g Bromcyan in der im Beispiel 4 beschriebenen Weise umgesetzt. Es werden 10 ml eines mit Bromcyan aktivierten Dextran hergestellt, das als Trägermaterial für phosphorylierende Enzyme vorteilhaft ist.

Beispiel 6

Herstellung einer mit Bromcyan
aktivierten Cellulose

10 ml gereinigtes Cellulosepulver werden mit 1,5 g Bromcyan in der gleichen Weise wie im Beispiel 4 umgesetzt. Man erhält 10 ml einer mit Bromcyan aktivierten Cellulose, die als Trägermaterial für phosphorylierende Enzyme vorteilhaft ist

Beispiel 7

Herstellung eines immobilisierten phosphorylierenden Enzyms aus einer rohen Enzymlösung

10 ml einer nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellten rohen Enzymlösung, die sowohl das Kanamycin phosphorylierende Enzym als auch das Streptomycin phosphorylierende Enzym von Escherichia coli JR66/W677 enthält, wird durch Vermischen mit 10 ml einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 verdünnt Die verdünnte Lösung wird dann unter Kühlen mit 10,3 g pulverisiertem Ammoniumsulfat vermischt, wobei man eine 75prozentige Sättigung mit Ammoniumsulfat erhält, so daß das vorhandene Protein praktisch vollständig ausfällt Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann 20 Minuten zum Vereinigen des Niederschlags bei 10 000 UpM zentrifugiert. Der entfernte Niederschlag wird in 5 ml einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 gelöst Die erhaltene Lösung wird gegen weitere 3 Liter der gleichen Pufferlösung dialysiert Die dialysierte, im Innenraum befindliche Lösung wird zum Entfernen von Unlöslichem zentrifugiert und die dabei erhaltene überstehende Lösung wird als konzentrierte rohe Enzymlösung verwendet

Diese konzentrierte rohe Enzymlösung wird mit 3 g (Trockengewicht) einer mit Bromcyan aktivierten »Sepharose® 4B« vermischt die mit 1 mMol Chlorwasserstoffsäure gewaschen und dann in 15 ml einer 0,1 -m wäßrigen Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 0,5 Mol Natriumchlorid suspendiert worden ist Das

erhaltene Gemisch wird 16 Stunden unter Kühlen schwach gerührt und dann durch eine gesinterte Glasfritte gesaugt. Anschließend wird der Filterkuchen mit 300 ml einer 0,1-m wäßrigen Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 0,5 Mol Natriumchlorid gewaschen. Man erhält auf diese Weise eine »Sephaiose®4B«, an die die rohen Enzyme von Escherichia coli JR66/W677 gebunden sind, als immobilisiertes Enzym, das dann mit 100 ml einer 1-m Monoäthanol-hydrochlorid-Lösung vom pH 8,0 umgesetzt und anschließend mit 100 ml einer 0,1-m Acetat-Pufferlösung mit einem Gehalt von 1 Mol Natriumchlorid und vom pH 4,0 und schließlich mit 100 ml einer 0,1-m Borat-Pufferlösung mit 1 Mol Natriumchlorid und vom pH 8,0 gewaschen. Das derart erhaltene Enzympräparat wird in einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 suspendiert und die Suspension im Kühlschrank aufbewahrt. Man erhält dieses Enzympräparat, d. h. die »Sepharose 4B< mit dem daran gebundenen phosphorylierenden Enzym in einer Menge von 5,6 g (feucht), d. h. 8,5 ml als Volumen. Es ist festgestellt worden, daß in dem vorgenannten immobilisierten Enzympräparat über 90 Prozent der in der rohen Ausgangsenzymlösung vorhandenen Kanamycin und Streptomycin phosphorylierenden Enzyme an die »Sepharose 4B« gebunden sind.

Wenn man das vorgenannte Verfahren unter Verwendung einer rohen Enzymlösung von Pseudomonas aeruginosa TI-13, wie sie gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist, wiederholt, erhält man das gleiche Enzympräparat, das die Enzyme von Pseudomonas aeruginosa TI-13 zur 5"-Phosphorylierung von Lividomycin A und Kanamycinen sowie zur Phosphorylierung von Streptomycin enthält.

Beispiel 8

Herstellung eines immobilisierten. Kanamycin

phosphorylierenden Enzyms aus einer gereinigten Enzymlösung

40 ml einer gereinigten Lösung eines Kanamycin phosphorylierenden Enzyms von Escherichia coli JR66/W677, die einen Proteingehalt von 4 mg/ml aufweist und die nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Reinigungsverfahren hergestellt worden ist, wird unter Kühlen mit 18,1 g Ammoniumsulfat vermischt wobei man eine 75prozentige Sättigung an Ammoniumsulfat erhält, so daß das vorhandene Protein praktisch vollständig ausfällt- Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann 20 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert. Der so abgeschiedene Niederschlag wird gesammeli und dann in lOir.l einer 2OmMo! Kalium phosphat-Pufferlösung vom pH 72 gelöst. Die Lösung wird gegen weitere 5 Liter der gleichen Pufferlösung dialysierL Die dialysierle, im Innenraum befindliche Lösung wird zum Entfernen von Unlöslichem zentrifugiert; die dabei erhaltene Oberstehende Lösung wird als gereinigte Enzymlösung verwendet.

Diese konzentrierte gereinigte Enzymlösung wird mit 6 g (Trockengewicht) einer mit Bromcyan aktivierten »Sepharose® 4B« vermischt, die mit 1 mMol Chlorwasserstoffsäure gewaschen und dann in 40 ml einer 0,1-m wäßrigen Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 0,5 Mol Natriumchlorid suspendiert worden ist Das erhaltene Gemisch wird 16 Stunden unter Kühlen schwach gerührt und dann durch eine gesinterte Glasfritte gesaugt Anschließend wird der Filterkuchen mit 500 ml einer 0,i-m wäßrigen Natriumbicarbonatlö-

sung mit einem Gehalt von 0,5 Mol Natriumchlorid gewaschen. Man erhält auf diese Weise eine »Sepharose® 4B«, an die das gereinigte Kanamycin phosphorylierende Enzym von Escherichia coli JR66/W677 chemisch gebunden ist. Dieses Material wird dann mit 200 ml einer 1-m Monoäthanol-hydrochlorid-Lösung vom pH 8,0 umgesetzt und danach mit 200 ml einer 0,1 -m Acetat-Pufferlösung mit 1 Mol Natriumchlorid und vom pH 4,0 und anschließend mit 200 ml einer 0,1-m wäßrigen Borat-Pufferlösung mit 1 Mol Natriumchlorid und vom pH 8,0 gewaschen und schließlich in einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird im Kühlschrank aufbewahrt. Man erhält eine »Sepharose 4B« mit daran gebundenem gereinigten Kanamycin phosphorylierenden Enzym von Escherichia coii JR66/W677 in einer Ausbeute von 15,9 g als feuchte Substanz, d. h. 20,4 ml als Volumen. Es ist festgestellt worden, daß über 95 Prozent des in der gereinigten Enzymlösung vorhandenen Kanamycin phosphorylierenden Enzyms an die »Sepharose 4B« chemisch gebunden sind. Die Menge gebundenes Protein beträgt 30 mg je 1 g (Trockengewicht) der mit dem Kanamycin phosphorylierenden Enzym verbundenen »Sepharose® 4B«.

Beispiel 9

Herstellung eines immobilisierten Streptomycin

phosphorylierenden Enzyms
aus einer gereinigten Enzymlösung

33 ml einer gereinigten Lösung eines Streptomycin phosphorylierenden Enzyms von Escherichia coli JR66/W677, die einen Proteingehalt von 1 mg/ml aufweist und die nach dem im Beispie! 3 beschriebenen Reinigungsverfahren hergestellt worden ist, wird unter Kühlen mit 17,2 g Ammoniumsulfat vermischt wobei man eine 75prozentige Ammoniumsulfat-Sättigung erhält, so daß das vorhandene Protein praktisch vollständig ausfällt Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann 20 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert. Der abgeschiedene Niederschlag wird gesammelt und dann in 4 ml einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 72 gelöst Die erhaltene Lösung wird gegen weitere 3 Liter der gleichen Pufferlösung dialysiert Die dialysierte, im Innenraum befindliche Lösung wird zum Entfernen von Unlöslichem zentrifugiert; die dabei erhaltene überstehende Lösung wird als konzentrierte gereinigte Lösung verwendet

Diese konzentrierte gereinigte Enzymlösung wird mi» 1 g (Trockengewicht) einer mit Bromcyan aktivierten »Scpharosc¹⁵ 4B« vermischt, die mi! ! niMo! Chlorwas serstoffsäure gewaschen und dann in 12 ml einer 0,1-m wäßrigen Natriumbicarbonatlösung mit 0.5 MoI Natriumchlorid suspendiert worden ist Das erhaltene Gemisch wird unter Kühlen 16 Stunden schwach gerührt und dann durch eine gesinterte Glasfritte gesaugt Anschließend wird der Filterkuchen mit 500 ml einer 0,1-m wäßrigen Natriumbicarbonatlösung mit 0,5 Mol Natriumchlorid gewaschen, dann mit 200 ml einer 1-m Mor.oäthanol-hydrochlorid-Lösung vom pH 8,0, danach mit 200 ml einer 0,1 -m Acetat-Pufferlösung vom pH 4,0 und mit einem Gehalt von 1 Mol Natriumchlorid und schließlich mit 200 ml einer 0,1-m Borat-Pufferiösung mit 1 Mol Natriumchlorid und vom pH 8.0 in der gleichen Weise wie im Beispiel 8 behandelt Auf diese Weise erhält man 2,4 g (entsprechend 3,5 ml als Volumen) einer feuchten »Sepharose 4B« mit daran

chemisch gebundenem, Streptomycin phosphorylierendem Enzym von Escherichia coli JR66/W677, die dann in einer 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferiösung vom pH 7,2 suspendiert und im Kühlschrank aufbewahrt wird Es ist festgestellt worden, daß über 95 Prozent des in der gereinigten Enzymlösung vorhandenen Streptomycin phosphorylierenden Enzyms an die »Sepharose® 4B« chemisch gebunden sind.

Beispiel 10

Absatzweises Phosphorylieren von Kanamycin A

mit einem immobilisierten Enzym, das aus einer

rohen Enzymlösung hergestellt worden ist

200 mg im feuchten Zustand befindliches immobilisiei tes Enzym, das nach dem Verfahren des Beispiels 7 aus einer rohen Enzymlösung von Escherichia coli JR66/W677 hergestellt worden ist, werden zu 10 ml einer Lösung gegeben, die 243 μg Kanamycin A, 24,2 mg Dinatrium-adenosin-triphosphat-trihydrat, 21 mg Magnesiumacetat-tetrahydrat, 45 mg Kaliumchlorid und 1 ml einer 1-m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 enthält. Zur Phosphorylierung des Kanamycins A wird das Gemisch bei 37°C schwach geschüttelt. Innerhalb von 15 Minuten ist das gesamte eingesetzte Kanamycin A phosphoryliert und liegt als Kanamycin A-3'-phosphat vor.

30

Beispiel U

Absatzweises Phosphorylieren von Kanamycin A
mit einem immobilisierten Enzym, das aus einer

gereinigten Enzymlösung eines Kanamycin
phosphorylierenden Enzyms hergestellt worden ist

200 mg im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes Enzym, das nach dem Verfahren des Beispiels 8 aus einer gereinigten Enzymlösung mit dem Kanamycin phosphorylierenden Enzym von Escherichia coli JR66/ W677 hergestellt worden ist, werden zu 10 ml einer Lösung gegeben, die 485 μg Kanamycin A, 12,1mg Dinatriumadenosin-triphosphat-trihydrat, 21 mg Magnesiumacetat-tetrahydrat, 45 mg Kaliumchlorid und 1 ml einer 200 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 enthält. Zur Phosphorylierung des Kanamycin A wird das Gemisch bei 37°C schwach geschüttelt. Innerhalb von 15 Minuten sind 77 Prozent und innerhalb von 30 Minuten ist das gesamte eingesetzte Kanamycin A phosphoryliert.

Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert, um das immobilisierte Enzym wiederzugewinnen. Das wiedergewonnene immobilisierte Enzym, d. h. die mit dem gereinigten Kanamycin phosphorylierenden Enzym verbundene »Sepharose® 4B«, wird mit 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 gespült und wieder zur Phosphorylierung einer weiteren Menge Kanamycin A eingesetzt.

Beispiel 12

Absatzweises Phosphorylieren von Streptomycin

mit einem immobilisierten Enzym, das aus einer

gereinigten Enzymlösung eines Streptomycin

phosphorylierenden Enzyms hergestellt worden ist

500 mg sich im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes Enzym, das nach dem Verfahren des Beispiels 9 unter Verwendung einer gereinigten Enzymlösung mit dem Streptomycin phosphorylierenden Enzym von E. coli JR66/W677 hergestellt worden ist.

eo werden zu 5 ml einer Lösung gegeben, die 729 μg Streptomycin-sesquisulfat, 24,2 mg Dinatrium-adenosintriphosphat-trihydrat, 31 mg Magnesiumacetat-tetrahydrat, 23 mg Kaliumchlorid und 0,5 ml einer 200 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 enthält. Zur 3"-Phosphorylierung des Streptomycins wird das erhaltene Gemisch bei 37° C schwach geschüttelt. Innerhalb von 30 Minuten ist das gesamte eingesetzte Streptomycin phosphoryliert.

Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert, um das immobilisierte Enzym wiederzugewinnen. Das wiedergewonnene Enzym wird mit 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 gewaschen und dann wieder zur Phosphorylierung einer weiteren Menge Streptomycin eingesetzt.

Beispiel 13

Absatzweises Phosphorylieren von Streptomycin

mit einem immobilisierten Enzym, das aus einer

rohen Enzymlösung hergestellt worden ist

500 mg sich im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes Enzym, das nach dem Verfahren nach Beispiel 7 aus einer konzentrierten rohen Enzymlösung mit den Kanarr,,ein. Neomycin und Streptomycin phosphorylierenden Enzymen von E. coli JR66/W677 hergestellt worden ist, werden zu 5 ml einer Lösung ■gegeben, die 729 ^g Streptomycin-sesquisulfat, 48,4 mg Dinatrium-adenosin-triphosphat-trihydrat, 11 mg Magnesiumacetat-tetrahydrat, 23 mg Kaliumchlorid und 0,5 ml einer 1-m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 enthält. Zur 3"-Phosphorylierung des Streptomycins wird das erhaltene Gemisch bei 37'C schwach geschüttelt. Innerhalb von 1 Stunde sind 45 Prozent und innerhalb von 2 Stunden sind 80 Prozent des eingesetzten Streptomycins phosphoryliert.

Beispiel 14

Phosphorylieren von Kanamycin A nach dem

Säulenverfahren mit einem immobilisierten.

Kanamycin phosphorylierenden Enzym

970 mg sich im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes Enzym, das nach dem Verfahren des Beispiels 8 unter Verwendung einer konzentrierten gereinigten Enzymlösung mit einen Kanamycin phosphorylierenden Enzym von E. coli JR66/W677 hergestellt worden ist, werden in einem Volumen von 2OmMoI Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 suspendiert. Die so erhaltene Suspension wird dann in eine ummantelte Säule mit 5 mm Innendurchmesser eingebracht und die Flüssigkeit abgezogen, so daß ein säulenartiges Reaktionsgefäß mit einem aufnahmefähigen Volumen von 1,25 ml bereitet wird, das mit dem immobilisierten Enzym gefüllt ist. Durch den Mantel zirkuliert Wasser von 37" C, um den Säuleninhalt bei 37° C zu halten. Währenddessen werden am Kopf des säulenartigen Reaktionsgefäßes 250 ml einer Beschikkungslösung aufgegeben, die 120 mg Kanamycin A, 756 mg Dinatrium-adenosin-triphosphat-trihydrat, 525 mg Magnesiumacetat-tetrahydrat, 1125 mg Kaliumchlorid und 25 ml einer 200 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 enthält. Diese Beschickungslösung durchläuft die Säule mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Stunde. Beim Durchgang durch die Säule wird das gesamte eingesetzte Kanamycin A phosphoryliert.

250 ml der Reaktionslösung, d. h. der aus dem säulenartigen Reaktionsgefäß austretenden Lösung,

030246/177

werden dann durch eine Säule mit 50 ml eines Kationenaustauscherharzes (in der Ammoniumform, Typ I) (»Amberlite® CG-50«, das von der Firma Rohm & Haas Co, V. St. A, vertrieben wird) geleitet, um das Kanamycin A-3'-phosphat an das Harz zu adsorbieren. Die Ha^^äule wird mit 1000 ml entsalztem Wasser gewaschen und dann mit 0,1 n-wäßrigem Ammoniak eluiert, um das Kanamycin A-3'-phosphat zu gewinnen, das an das Harz adsorbiert ist Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, von denen der jeweilige pH-Wert bestimmt wird. Dabei wird festgestellt, daß eine erste Reihe von Fraktionen einen pH-Wert zeigen, der von dem einer zweiten Reihe von Fraktionen verschieden ist Wenn man eine Probe jeder Fraktion der Hochspannungs-Papierelektrophorese und einer anschließenden Färbung aufgrund der Ninhydrin-Reaktion und der Rydon-Smith-Reaktion unterwirft, wird bestätigt, daß sich das Kanamycin A-3'-phosphat in reiner Form in den Eluaten der zweiten Reihe von Fraktionen vorfindet Diese das Kanamycin A-3'-phosphat enthaltende Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft Man erhält 120 mg Kanamycin A-3'-phosphat als farbloses Pulver. Die Ausbeute beträgt 81 Prozent

Beispiel 15

Phosphorylieren von Kanamycin B nach dem

Säulenverfahren mit einem immobilisierten.

Kanamycin phosphoryüerenden Enzym

Das Verfahren des Beispiels 14 wird unter Verwendung von 121 mg Kanamycin B anstelle von Kanamycin A wiederholt. Das erhaltene Phosphorylierungsprodukt wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 14 chromatographisch gereinigt. Man erhält Kanamycin B-3'-phosphat in einer Ausbeute von 115 mg (= 77 Prozent).

Beispiel 16

Phosphorylierung von Streptomycin nach dem

Säulenverfahren mit einem immobilisierten.

Streptomycin phosphorylierenden Enzym

1200 mg sich im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes Enzym, das nach dem Verfahren des Beispiels 9 unter Verwendung einer konzentrierten gereinigten Enzymlösung mit einem Streptomycin phosphorylierenden Enzym von E. coli JR66/W677 werden in einem Volumen von 20 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 suspendiert. Die so erhaltene Suspension wird dann in eine ummantelte Säule mit 7 mm Innendurchmesser eingebracht und die Flüssigkeit abgezogen, so daß ein säulenartiges Reaktionsgefäß mit einem aufnahmefähigen Volumen von 1,8 ml beleitet wird, das mit dem immobilisierten Enzym gefüllt ist. Durch den Mantel zirkuliert Wasser von 37°C, um den Säuleninhalt bei 37°C zu halten. Währenddessen werden am Kopf des säulenartigen Reaktionsgefäßes 250 ml einer Beschickungslösung aufgegeben, die 146 mg Streptomycin-sesquisulfat, 2905 mg Dinatrium-adenosin-triphosphal-trihydrat, 525 mg Magnesiumacetat-tetrahydrat, 1125 mg Kaliumchlorid und 25 ml einer 200 mMol Kaliumphosphal-Pufferlösung vom pH 7,2 enthält. Diese Beschickungslösung durchläuft die Säule mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Stunde. Von dem auf die Säule aufgebrachten Streptomycin-sesquisulfat werden 135 mg phosphoryliert.

250 ml der Reaktionslösung, d.h. der aus dem säulenartigen Reaktionsgefäß austretenden Lösung werden dann durch eine Säule mit 10 ml Aktivkohlt geleitet Das an die Aktivkohle adsorbierte Streptomycin-3"-phosphat wird aus der Säule unter Verwendung eines Gemisches von Methanol und 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure im Verhältnis 1 :1 eluiert Das Eluat wird ir Fraktionen aufgefangen, von denen der jeweilige pH-Wert bestimmt wird. Dabei wird festgestellt, dal;

ίο eine erste Reihe von Fraktionen einen pH-Wert zeigen der von dem einer zweiten Serie von Fraktioner verschieden ist Wenn man eine Probe jeder Fraktior der Hochspannungs-PapierelektrophoresL und einei anschließenden Färbung mittels der Sakaguchi-Reaktion und der Rydon-Smith-Reaktion unterwirft wire bestätigt, daß sich das Streptomycin-3"-phosphat in de^r Eluaten der zweiten Reihe von Fraktionen befindet, di« einen anderen pH-Wert bei der vorgenannten Chromatographie mit Aktivkohle zeigen.

Die das Streptomycin-3"-phosphat in reiner Forrr enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, mit einerr schwachen Anionenaustauscherharz (in der OH-Form' (»Amberlite® IR-45«) neutralisiert und dann untei vermindertem Druck eingeengt Die eingeengte Lösung wird durch eine Säule mit 20 ml eines Kationenaus»au scherharzes (»Amberlite CG 50«), ein Gemisch dei Na-Form und der Η-Form im Verhältnis 7:3, geleitet um eine Adsorption des gewünschten Produktes zi erreichen. Diese Harzsäule wird mit 0,5 n-Chlorwasser stoffsäure eluiert. Das Streptomycin-3"-phosphat finde sich in solchen Fraktionen des Eluats vor, die noch keine Änderung ihrer pH-Werte zeigen. Die das reim Streptomycin-3"-phosphat enthaltenden Fraktioner werden vereinigt und dann durch eine Säule mit 10 m Aktivkohle geleitet Das an die Aktivkohle adsorbieru Streptomycin-3"-phosphat wird mittels eines Gemi sches von Methanol und 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure in Verhältnis 1 :1 eluiert. Die aktiven Fraktionen de: Eluats werden vereinigt, mit »Amberlite® IR-45« (in dei OH-Form) neutralisiert und dann unter verminderten Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 113 mj Streptomycin-3"-phosphat-trihydrochlorid als farblose: Pulver, entsprechend einer Ausbeute von 60 Prozent.

B e i s ρ i e 1 17

Phosphorylierung von Dihydrostreptomycin nachdem Säulenverfahren mit einem immobilisierten,

Streptomycin phosphorylierenden Enzym

Das Verfahren des Beispiels 16 wird unter Verwen dung von Dihydrostreptomycin (116 mg als freii basische Form) anstelle von Streptomycin-sesquisulfa wiederholt. Das Phosphorylierungsprodukt wird in de gleichen Weise wie im Beispiel 14 gereinigt. Man erhäl 106 mg Dihydrostreptomycin-3"-phosphat als farblose Pulver, entsprechend einer Ausbeute von 70 Prozent.

18

Beispiel

Phosphorylierung von Kanamycin A mit einem

immobilisierten Enzym, das aus einem an Dextran

als Trägermaterial gebundenen. Kanamycin

phosphorylierenden Enzym besteht

10 ml mit Bromcyan aktiviertes »Sephadex® G-25< (ein mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran-Gel, das voi der Firma Pharmacia Co., Schweden, vertrieben wird' das nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahre!

hergestellt worden ist, wird in der gleichen Weise wie in

Beispiel 8 mit einer konzentrierten gereinigten Enzymlösung eines Kanamycin phosphorylierenden Enzyms von E. coli JR66/W677 umgesetzt, die nach Beispiel 8 aus 40 ml einer nach Beispiel 2 gereinigten Enzymlösung hergestellt worden ist. Auf diese Weise werden 10 ml eines immobilisierten Enzyms hergestellt, das aus einem an mit Bromcyan aktiviertes Dextran-Gel gebundenen, Kanamycin phosphorylierenden Enzym besteht Bei diesem Herstellungsverfahren werden über 90 Prozent des in der angewendeten konzentrierten gereinigten Enzymlösung vorliegenden, Kanamycin phosphorylierenden Enzyms an das Dextran gebunden. 0,4 ml des derart hergestellten immobilisierten. Kanamycin phosphorylierenden Enzyms werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 11 mit 500 μg Kanamycin A umgesetzt. Innerhalb einer 30minütigen Reaktion liegt das gesamte eingesetzte Kanamycin A phosphoryfiert vor.

Beispiel 19

Phosphorylierung von Kanamycin A mit einem

immobilisierten Enzym, das aus einem

an Cellulose als Trägermaterial gebundenen.

Kanamycin phosphorylierenden Enzym besteht

10 ml mit Bromcyan aktivierte Cellulose, die nach dem im Beispiel 6 angegebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 8 mit einer konzentrierten gereinigten Enzymlösung eines Kanamycin phosphorylierenden Enzyms von E. coli JR66/W677 umgesetzt, die nach Beispiele aus 40ml einer nach Beispiel 2 gereinigten Enzymlösung hergestellt worden ist. Auf diese Weise werden 10 ml eines immobilisierten Enzyms hergestellt, das aus einem an mit Bromcyan aktivierte Cellulose gebundenen, Kanamycin phosphorylierenden Enzym besteht. Bei diesem Herstellungsverfahren werden über 90 Prozent des in der angewendeten konzentrierten gereinigten Enzymlösung vorliegenden. Kanamycin phosphorylierenden Enzyms an die Cellulose gebunden. 0,1 ml des derart hergestellten immobilisierten, Kanamycin phosphorylierenden Enzyms werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 11 mit 500 μg Kanamycin A umgesetzt. Innerhalb einer 30minütigen Reaktion liegt das gesamte eingesetzte Kanamycin A phosphoryliert vor.

Beispiel 20

Phosphorylierung von Kanamycin A mit einem
immobilisierten Enzym, das aus einem an Carboxymethylcellulose als Trägermaterial gebundenen,
Kanamycin phosphorylierenden Enzym besteht

45

50

40 ml Carboxymethylcellulose, die unter der Bezeichnung »CM-Cellulose®« von der Firma Brown Co., V. St. A., vertrieben wird, wird mit einer konzentrierten gereinigten Enzymlösung eines Kanamycin phosphorylierenden Enzyms von E. coli JR66/W677 umgesetzt, die nach Beispiel 8 aus 40 ml einer nach Beispiel 2 gereinigten Enzymlöseng hergestellt worden ist. Auf diese Weise werden 40 ml eines immobilisierten Enzyms hergestellt, das aus einem an Carboxymethylcellulose mittels ionischer Bindung gebundenen. Kanamycin phosphorylierenden Enzym besteht.

2 ml eines derart hergestellten immobilisierten, Kanamycin phosphorylierenden Enzyms werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 11 mit 500 μg Kanamycin A umgesetzt. Innerhalb einer 30minütigen Reaktion liegt das gesamte eingesetzte Kanamycin A phosphoryliert vor.

Beispiel 21

Absatzweises Phosphorylieren von Lividomycin A,
Kanamycin A oder Streptomycin mit einem
immobilisierten Enzym, das aus einer rohen

Enzymlösung von Pseudomonas aeruginosa TI-13
hergestellt worden ist

22 mg sich im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes Enzym, das nach der erfahren nach Beispiel 7 aus einer rohen Enzymlösung mit den Kanamycin und Streptomycin phosphorylierenden Enzymen von Pseudomonas aeruginosa TT-13 hergestellt worden ist, phosphorylieren nach dem Verfahren des Beispiels 10 vollständig 25 μg Lividomycin A in 30 Minuten, 9 μg Kanamycin A in 30 Minuten oder 5 μg Streptomycin in 60 Minuten. Man erhält Lividomycin A-5"-phosphat, Kanamycin A-3'-phosphat oder Streptomycin-3"-phosphaL

Beispiel 22

Absatzweises Phosphorylieren von Lividomycin A

oder Kanamycin A mit einem immobilisierten Enzym,

das aus einer rohen Enzymlösung von Escherichia

coli K-12 ]5 Rl 1-2 hergestellt worden ist

22 mg sich im feuchten Zustand befindliches immobilisiertes, Kanamycin phosphorylierendes Enzym, das nach den Verfahren nach den Beispielen 1 und 7 aus einer rohen Enzymlösung von Escherichia coli K-12 ]5 Rl 1-2 hergestellt worden ist, phosphorylieren nach dem Verfahren des Beispiels 10 vollständig 38 μg Lividomycin A in 15 Minuten oder 22 pg Kanamycin A in 30 Minuten. Man erhält Lividomycin A-5"-phosphat oder Kanamycin A-3'-phosphat.

Beispiel 23

Unter Verwendung des immobilisierten Enzyms, welches das Kanamycin phosphorylierende Enzym gekuppelt an »Sepharose 4B« enthielt und nach dem Verfahren von Beispiel 8 hergestellt worden war, wurde die Arbeitsweise vom Beispiel 14 mit 16 mg Neamin, 16 mg Paromamin. 23 mg Ribostamycin bzw. 28 mg Butirosin A wiederholt, so daß diese Antibiotika phosphoryliert wurden. Das Reaktionsgemisch wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 14 gereinigt. Es wurden erhalten:

16 mg Neamin-3'-phosphat; Ausbeute = 73%
15 mg Paromamin-3'-phosphat; Ausbeute = 69%
20 mg Ribostamycin-3 -phosphat; Ausbeute = 70%
24 mg Butirosin-A-3'-phosphat; Ausbeute = 73%.

Die Monophosphatprodukte lagen in reinem Zustand vor und besaßen die zuvor beschriebenen, physikalischchemischen Eigenschaften.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung der

B) 5"-Monophosphate der Lividomycine oder der

C) 3"-Monophosphate des Streptomycins und des Dihydrostreptomycins durch enzymatische Phosphorylierung des jeweiligen Aminoglykosids in wäßriger Lösung

dadurch gekennzeichnet, daßman entweder Kanamycine, Neomycine, Paromomycine, Neamin, Paromamin, Ribostamycin, Butirosine, Lividomycine, Streptomycin oder Dihydrostreptomycin mit Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat, Inosintriphosphat oder deren Alkalimetallsalzen an einer durch kovalente Bindung an einen in Wasser unlöslichen Träger immobilisierten Phosphotransferase, die aus Zellen von kanamycin-resistenten Bakterien oder sireptomycin-resistenten Bakterien durch Extrahieren und Verknüpfung mit Agarose, vernetztem Dextran, Cellulose, carboxymethyliertem Dextran, Carboxymethylcellulose oder phosphorylierter Cellulose hergestellt wurde, umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das jeweilige Aminoglykosid 15 bis 30 Minuten an der immobilisierten Phosphctransferase bei Temperaturen von 20 bis 50° C, insbesondere bei 30 bis 40°C, umsetzt.