DE2945010C2 - Verfahren zur Herstellung von durch Schutzgruppen N-acylierten Aminoglycosiden - Google Patents

Description

gekennzeichnet durch:

a) Umsetzung eines die Struktur C) aufweisenden Aminoglykosids mit 1 bis 6 MoI eines Zinksalzes pro MoI Aminoglykosid in

ai) Dimethylsulfoxid,

a?) wässerigem Dimethylsulfoxid.

as) Dimethylformamid,

Sa) wässerigem Dimethylformamid,

a?) einer Mischung aus Dimethylsulfoxid und

Dimethylformamid,
ae) Tetrahydrofuran,
Zt) wässerigem Tetrahydrofuran,
a₈) einer Mischung aus Dimethylsulfoxid und

Tetrahydrofuran,
ag) einem niederen Alkanol oder
am) wässerigem Methanol

und jeweils in an sich bekannter Weise durchgeführte

b) Acylierung des so erhaltenen Arninoglykosid-Zinkkomplexes, in welchem die 1- und die 3"-Aminogruppe durch komplex gebundene Zinkionen selektiv blockiert sind, mit zur

Acylierungsmitteln und

c) Abtrennung der Zinkionen.

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufe a) als Umsetzung mit Zinkacetat oder Zinkchlorid in einer Menge von 2,3 bis 6 Mol pro Mol Aminoglykosid, gegebenenfalls in Gegenwart von Natriumacetat durchführt.

Die Erfindung betriff! ein Verfahren zur Herstellung von durch Schutzgruppen N-acylierten Aminoglykosiden, in denen

A) die Aminogruppen in 1- und 3"-Stellung nicht geschützt,

B) alle übrigen Aminogruppen jedoch durch Schutzgruppen acyliert sind und deren Struktur den

C) 6-O-(3"-Amino-3"-desoxyglykosyl)- oder 6-O-(3"-

AJkylamino-3"-desoxyglykosyl)-2-desoxystreptaminen, deren Desoxystreptamin-Rest gegebenenfalls in der 4-O-Stelhing mit einer Aminoglykosylgruppe verknüpft ist entspricht

Für den selektiven Schutz von Aminogruppen und/oder Hydroxylgruppen in Aminoglykosiden sind bereits verschiedene Methoden entwickelt worden. Diese sind mit Erfolg anwendbar, soweit es sich um den

ίο selektiven Schutz von Hydroxylgruppen handelt Für den selektiven Schutz von bestimmten unter den zahlreichen vorhandenen Aminogruppen der Aminoglykoside sind jedoch die bisher bekannten Methoden nur schwierig und zeitraubend durchzuführen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß alle Aminogruppen in den Aminoglykosiden nur geringe Unterschiede in der Reaktionsfähigkeit aufweisen. Ein Beispie¹ für diese Tatsache liefert die u'-Arninogruppe von Kanamycin A. Eine solche Aminogruppe oder Methylaminogruppe, weiche an ein Kohlenstoffatom gebunden ist das seinerseits an nur ein Kohlenstoffatom im Aminoglykosid-MoIeküI gebunden ist weist eine höhere Reaktionsfähigkeit auf als die Amino- oder Methylaminogruppe, welche an ein Kohlenstoffatom gebunden ist das zwei oder mehr Kohienstoffatome im Aminoglykosid-Molekül verbindet Die erstgenannte Art von Amino- oder Methylaminogruppen reagiert wesentlich besser mit einem Acylierungsmittel und das entsprechende, durch eine Acylgruppe N-geschützte Derivat kann in einer höheren Ausbeute gewonnen werden als anderweitig N-geschützte Derivate. Es ist bekannt, daß benachbarte Amino- und Hydroxylgruppen des Aminoglycosid-Moleküls durch Behandlung mit Natriumhydrid selektiv gleichzeitig unter Bildung eines cyclischen Carbamates blockiert werden können, ohne daß es zu einer Blockierung der anderen Aminogruppen, weiche im gleichen Molekül vorhanden sind, kommt (siehe »Journal of Antibiotics«, 25, 741-742 (1972); US-PS 39 25 354 und 39 65 089).

Vor kurzem haben Nagabhushan und Mitarbeiter gefunden, daß bei der Umsetzung eines Salzes eines zweiwertigen Übergangsmetalles(M®®) aus der Gruppe Kupfer-(II), Nickel-(II), Kobalt-(H) und Cadmium-(II) mit einem Aminoglykosid in einem inerten organischen Lösungsmittel fz. B. einem Vertreter der Klasse der

4-0-(AminogIykosyl)-6-O-(aminoglykosyl)-2-desoxystreptaminasen wie Kanamycine. Gentamicine und Sisomicin) dieses zweiwertige Übergangsmetallion komplex an ein Paar benachbarte Amino- und

Hydroxylgruppen gebunden wird (vgl. japanische veröffentlichte Patentanmeldung Sho-52-1 53 944 und DE-OS 27 26 172). In diesem Aminoglycosid-Übergangsmetallion-Kornplex ist die Aminogruppe durch das zweiwertige Übergangsmetallion blockiert. Wird Hjeser Kor"?'**" an«rhlipßpnd mit einem Acvlierungsmittel umgesetzt so werden im wesentlichen nur die nicht komplexgebundenen Aminogruppen, d. h. die nicht durch das zweiwertige Metallion blockierten Aminogruppen acyliert, so daß ein selektiver N-Schutz

W mit der Acylgruppe erzielt wird.

Werden zweiwertige Übergangsmetallionen (M⁵¹®), z.B. Kupfer-(H)-, Nickel-(Il)-, Kobalt-(II)- oder Cadmium-(II)-Ionen mit Kanamycin A umgesetzt so tritt eine Komplexbildung zwischen dem zweiwertigen Metallion

(Μ®®) und der 1-Aminogruppe und der 2"-Hydroxylgruppe sowie zwischen der 3"-Aminogruppe und der ^'-Hydroxylgruppe des Kanamycin-A-Moleküls ein. wie durch die Formel I dargestellt.

6"

H₂NCH₂

HO y

Νί®®

Aus der obigen Koi iplexbildungsreaktion ist ersichtlich, daß mindestens 2 Mol Übergangsmetallsalz für 1 MoI Kanamycin A erforderlich sind. Im erhaltenen Metallkomplex sind gleichzeitig die 1-Amino- und die 3"-Aminogruppe blockiert Wenn dieser Komplex der Formel I mit einem Acylierungsmitte! der üblicherweise bei der Synthese von Polypeptiden benutzten Art behandelt wird, werden nur die nicht-komplex gebundene 3-Amino- und 6'-Aminogruppe acyliert, so daß man das 3,6'-di-N-acylierte Derivat erhält (vgl. J. Amer. Chem.Soc 100,525^-5254(1978)).

Im Zusammenhang mit der· vorliegenden Erfindung wurden jetzt Untersuchungen über die Umsetzung weiterer Metallionen mit Aminoglykosiden wie beispielsweise Kanamycin A und K.anL.tiycin B sowie semisynthetischen Derivaten solcher Aininoglykosid-Antibiotika durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß

zweiwertige Zinkionen, obwohl sie sich wesentlich anders verhalten als die oben erwähnten zweiwertigen Nickel-, Kobalt-, Kupfer- und Cadmium-Ionen, doch zu einer starken Komplexbildung sowohl mit der 1 -Amino- oder 1-Alkylaminogruppe, als auch der 3"-Aminogcuppe (oder 3"-Alkylaminogruppe) eines Aminoglykosides (z.B. Kanamycin A, B oder C), welches einen Desoxystreptaminteil mit f.iner an die 6-HydroxyIgruppe desselben gebundenen (3"-AminoglykosyI- oder Alkylaminoglykosylgruppe enthält, befähigt ist und daher diese genannten Aminogruppen in 1- und 3"-Stellung blockieren kann.

Gemäß Nagabhushan und Mitarbeiter könnte erwartet werden, daß, wenn zweiwertige Nickel-, Kobalt-, Kupfer- oder Cadmiumionen z. B. mit Kanamycin B umgesetzt werden, ein Kanamycin B-Metallsalz-Komplex der folgenden Formel II entstehen würde:

6'

H₂NCH₂

3
NH₂

NH₂

HO /y \r

\j NH₂ HOCH₂

Diese Erwartung stützt sich auf die Ausführungen von Nagabhushan und Mitarbeiter im oben genannten Artikel in J. Amer. Chem. Soc, gemäß welchem benachbarte Amino-Hydroxyl-Gruppen-Paare mit den zweiwertigen Übergangsmetallionen reversible Komplexe bilden sollten, sowie auf die Tatsache, daß Kanamycin B drei Paare benachbarter Amino-Hydroxylgruppen enthält, nämlich in den Stellungen 1 und 2", in den Stellungen 2' und 3' und in den Stellungen 2" und 3" des Kanamycin-Moleküls. Es wurde jedoch gefunden, daß der nach der Umsetzung von Kanamycin B mit Zinkionen gebildete Kanamycin B-Zinksalz-Komplex freie 2'-Amino- und 3'-Hydroxylgruppen enthält, welche nicht durch das Zinkion blockiert wurden, was im Gegensatz zur Annahme von Nagabhushan steht. Selbst wenn eine Komplexbildung zwischen Zinkion und 2'-Amino- und 3'-Hydroxylgruppe auftritt, ist die kcmplexbildende Kraft sehr gering, so daß in der Praxis

die 2'Amino- und 3'-HydroxyIgruppen nicht blockiert sind.

Wird der Kanamycin B-Zinkionen-Komplex anschließend acyliert, z. B. durch Umsetzung mit N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid, so erhält man das tri-3,2',6'-N-acylierte Derivat, in welchem drei Aminogruppen, nämlich die 3-, 2'- und 6'-Am>nogruppen acyliert wurden, und zwar in einer höheren Ausbeute als die auf andere Weise N-acylierten Derivate. Das 3,5'-di-N-acylierte Derivat llßt sich jedoch nicht erhalten (vgl. auch Beispiel 19). Diese experimentelle Tatsache laut darauf schließen, daß das Zinkion ein anderes Verhalten zeigt als die oben genannten vier Ube.gangsmetallionen, indem das Zinkion keinen Komplex mit --->m Paar der benachbarten 2'-Amino- und S'-Hydroxyi^.-^pe bildet.

Wenn als weiteres Beispiel K."nan.yi;in A mit Zinkionen umgesetzt und an?.-h!ie3e . -' .ait einer die Benzyloxycarbonylgruppe ab-r=^«-nuers Verbindung acyiiert "vird (siehe Forme! Ϊ öl· ..i> wird beobachtet,daß 3,6'-Di-N-benzyIoxycarbi τ ''''inamycin A als hauptsächliches AcylierungsprodüM gebildet wird, sofern das Zinkion in einer Menge von genau 1 Mol oder etwas mehr pro MoI Kanamycin A zur Verfugung steht. Diese Acylierungsreaktion führt zur Bildung des 13,6',3"-Tetra-N-benzyloxycarbonylderivates von Kanamycin A neben nicht-acyliertem, unverändertem Kanamycin A, während Jas Tri-N-benzyloxycarbonylderivat von Kanamycin A lediglich in sehr niedriger Ausbeute gebildet wird, obwohl die Aufklärung des Reaktionsmechanismus durch Nagabhushan und Mitarbeiter erwarten läßt, daß das Tri-N-benzyloxycarbonylderivat in einer höheren Ausbeute gebildet würde als die ander-n N-acylierten Derivate (vgl. Beispiel 7).

In der Beschreibung und insbesondere in Anspruch 4 des US-PS 41 36 254 haben Nagabhushan und Mitarbeiter darauf hingewiesen, daß ein Salz eines zweiwertigen Übergangsmetalles, wie Kupfer-(Il), Nickel-(II), Kohalt-(II), usw. in einer Gesamtmenge von mindestens 2 Mol pro Mol Kanamycin A für die Bildung des Kanamycin-A-Überpangsmetallsalz-Komplexes benötigt wird, wie aus Formel 1 oben ersichtlich ist. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen haben jedoch ergeben, daß im Gegensatz zu den vier genannten Übergangsmetallionen, das Zinkkation zur Blockierung der 1 -Amino- und 3"-Aminogruppe von Kanamycin A befähigt ist, wenn die Zinkionen in einer Gesamtmenge von mindestens 1 Mol pro Mol Kanamycin A verwendet werden.

Wird ein Nickelsalz in einer Menge von etwas über 1 MoI pro Mol Kanamycin A zur Reaktion gebracht und wird anschließend der .•"■haltene Kanamycin-A-Nickelsalz-Komplex mit einer Benzyloxycarbonyl abgebenden Verbindung acyliert, so erhält man das 3,6'-Di-N-benzyI-oxycarbonylkanamycin A nur in sehr geringer Ausbeute, während es sich in weit größerer Ausbeute gewinnen ™ßt, wenn der KH:'!?rT}^uC'ⁿ-^-7*ⁿ^^<:flI⁷-KnmnlpTc arvliert wird (vgl. Beispiel 7). Aufgrund dieser Tatsache wird geschlossen, daß der Mechanismus der Komplexbildung zwischen Zink-(II)-Ion und Aminoglykosid verschieden ist von demjenigen der Nickel-(H)-, Kobalt-(il)-, Kupfer-(II)- und Cadmium-(II)-Ionen, und daß der Aminoglykosid-Zinkionen-Komplex eine Stabilität aufweist, welche sich von der des Komplexes zwischen Aminoglykosid und Nickel-(II)-, Kobalt-(Il)-, Kupfer-(H)- oder Cadmium-(II)-Ionen unterscheidet Für die Komplexbildung mit dem Aminoglykosid kann das Zinkion in Form eines billigen Zinksalzes verwendet

ίο werden, welches kaum als Quelle von Umweltverschmutzungen in Frage kommt.

Gegenstand der Erfindung ist infolgedessen das in den Ansprüchen gekennzeichnete und beanspruchte Verfahren.

Das Verfahren gemäß der vorligenden Erfindung dient zur Herstellung selektiv acylierter N-geschützter Derivate von Aminoglykosiden durch Acylierung anderer Aminogruppen als der 1- und 3"-Aminogruppen. Solche selektiv N-geschützten Derivate sind insbesondere nützlich für die chemische Synthese vcn l-N-amincacylierten Derivaten von Aminoglykosid-Antibiotika wertvoll, z. B. für -*'; Synthese von Kanamycinen, einschließlich AmikacH (Journal of Antibiotics, 25, 695 bis 708 (1972)), welches sich in den tetzten Jahren als wirkungsvolles antibaKterielles Arzneimittel erwiesen hat Die erfindungsgemäß für die Bildung, des Zinkionen-Kompiexes verwendbaren Aminoglycoside entsprechen in ihrer Struktur den 6-O-(3"-Amino- oder 3"-AIky!amino-3"-desoxyglykosyI)-2-desoxystreptaminen, weiche gegebenenfalls mit einer 4-O-(AminogIykosyl)-gruppe verknüpft sein können. Geeignet sind auch 1 -N-Aikylaminoglykoside, wie z. B. Neiiimicin. Beispiele für Aminoglykoside der für die vorliegende Erfindung geeigneten Klasse sind z. B. die Antibiotika der Kanamycin Α-Gruppe, einschließlich Kanamycin A selbst, ό'-N-AlkyIanamycin A, insbesondere 6'-N-Methylkanamycin A, 3'-Desoxykanamycin A, 6'-N-Methyl-4'-desoxykanamycin A, 3',4'-Didesoxykanamycin A (vgl. japanische Patentanmeldung 11 402/79) und 6"-Desoxy- oder 4",6"-Didesoxykanamycin A (vgL japanische Patentanmeldung 54 733/79): Antibiotika der Kanamycin B-Gruppe, einschließlich Kanamycin B selbst, 3'-Desoxykanamycin B(d. h.Tobramycin),4'-Desoxykanamycin B, 3',4'-Desoxykanamyc!n B (d. h. Dibekacin), 3',4'-Didesoxy-3'-enokanamycin B, ü'-N-Methyl-3',4'-didesoxykanamycin B; Antibiotika der Kanamycin C-Gruppe, einschließlich Kanamycin C selbst, 3'-DesoxykanamycinC.3',4'-DidesoxykanamycinC;Gentamici- ne-A. -B und -C; Verdamicin; Sisomicin und Netilmicin.

d. h. 1 -N-Äthylsisomicin, sowie die anderen bekannten Aminoglycoside.

Typische Beispiele für Aminoglykoside, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, umfassen Kanamycin A, Kanamycin B, Kanamycin C und Desoxyderivate dieser Kanamycine, sowie 6'-N-Alkvlderivate da^on. welche alle durcn die folgende allgemeine Formel III dargestellt werden können:

NH₂

2 NH₂

OH

im

in welcher R¹ die Hydroxylgruppe oder Aminogruppe. R² und R³ jedes Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe und R⁴ die Hydroxylgruppe oder Aminogruppe oder eine Alkylaminogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methylaminogruppe bedeuten.

Zur Bildung des Zinkionen-Komplexes kann das jeweilige Aminoglykosid entweder in Form der freien Base oder in Form eines Säureadditionssalzes in einem der in Anspruch 1 genannten Lösungsmittel aufgelöst oder suspendiert werden, und zu der erhaltenen Lösung oder Suspension wird ein geeignetes Zinksalz in einer Menge von 1 bis 6 MoI pro Mol des verwendeten Aminoglykosids zugesetzt

Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren sind Dimethylsulfoxid. Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder niedere Alkanole, wie Methanol und Äthanol, weiterhin Mischungen aus Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Tetrahydrofuran, ferner wässeriges Dimethylsulfoxid, wässeriges Tetrahydrofuran, wässeriges Dimethylformamid und wässeriges Methanol.

Die Zinkionen können in Form eines Zinksalzes dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, in welchem der Zinkkorr.plex gebildet wird. Beliebige Zinksalze anorganischer oder organischer Säuren können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist jedoch vorteilhaft, ein Zinksalz einer schwachen Säure, wie z. B. Zinkacetat, zu verwenden, weil unter den aminogruppenhattigen Metallkomplexen Komplexe zwischen einer nicht-quaternären Ammoniumgruppe und einem Metallsalz stabiler sind als Komplexe zwischen Aminen vom Ammoniumtypus und einem Metallsalz, und die Verwendung eines Zinksalzes einer schwachen Säure nicht zur Bildung des verhältnismäßig unstabilen Metallkomplexes, welcher ein Amin vom Ammoniumtypus enthält, führt Wenn das Zinksatz einer starken Sä .re, z. B. Zinkchlorid, verwendet wird, kommt es ebenfalls zur Bildung des Zinkkomplexes, doch setzt man vorzugsweise auch ein schwach alkalisches Salz, wie Natriunpacetat zu. um das Medium zu neutralisieren. Eine gewisse Menge an Natriumacetat oder Natriumhydroxid wird auch ais Neutraüsierungsmittel zugesetzt, wenn das als Ausgangsmaterial benutzte Aminoglykosid in Form seines Säureadditionssalzes mit einer starken Säure, wie Salzsäure, eingesetzt wird. Das Neutralisierungsaiittel sollte jedoch nicht im Oberschuß verwendet werden, weil sonst Zinkhydroxid ausgefällt würde, was die Bildung des Komplexes stören würde. Wird beispielsweise ein Aminoglykosid-Tetrahydrochlorid zur Komplexbildung verwendet sollten 4 MoI Natriumhydroxid zur Neutralisation des Reaktionsgemisches zugesetzt werden.

Solange die molare Menge an verwendetem Zinksalz mindestens gleich der molaren Menge an Aminoglykosid ist, kann die Komplexbildungsreaktion stattfinden. Es ist jedoch vorzuziehen, daß Zinksalz in einer Menge von wesentlich mehr als 1 Mol pro MoI Aminoglykosid zu verwenden, so daß das Gleichgewicht der KomplexbildungsreaKiion zugunsten der Komplexbildung verschoben ist G'ite Ausbeuten an Zinkkomplex können erhalten werden, wenn das Zinksalz in einer Menge von etwa 2,3 bis 6 MoI pro MoI Aminoglykosid verwendet wird; in der Praxis verwendet man das Zinksalz vorzugsweise in einer Menge von 4 bis 5 Mol pro Mol Aminoglykosid

Die zur Vollendung der Komplexbildungsreaktion nach Zusatz des Zinksalzes erforderliche Zeit kann je nach der Natur des verwendeten organischen Lösungsmittels variieren und kann im Bereich von »sofort« (bei Verwendung eines wässerigen organischen Lösungsmittels) bis zu 20 Stunden liegen. Die Komplexbildungsreaktion läuft üblicherweise bei Zimmertemperatur ab, doch können auch höhere oder tiefere Temperaturen angewandt werden.

Man erhält auf diese Weise eine Lösung oder Suspension, welche den Zinkkomplex des Aminoglycosids enthält zu welcher dann ein Acylierungsmittel, welches die als Aminoschutzgruppe einzuführende Acylgruppe enthält, zugesetzt wird.

Das erfindungsgemäß verwendete Acylierungsmittel kann ein übliches Aminoschutzmittel sein; es dient zur Blockierung der freien, nicht-komplex gebundenen Aminogruppen im erhaltenen Aminoglykosid-Komplex durch die Acylgruppe des Acylierungsmittels. Die Acylgruppe kann beispielsweise eine Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine Alkanoxycarbonylgruppe, eine Aralkyloxycarbonylgruppe, eine Aryloxycarbonyigruppe, eine Alkylsulfonylgruppe, eine Aralkylsulfonylgruppe oder eine Arylsulfonylgruppe sein.

Die Acylierungsreaktion zum Schutz der Aminogruppen gemäß der vorliegenden Erfindung kann als eine Acylierung im weitesten Sinne angesehen werden; es kann sich um eine Formylierung, Acetylierung, Propionylierung, Trifluoracetylierung, Benzyloxycarbonylierung, p-MethoxybenzyloxycarbonyHerung, t-Butoxycarbonylierung, Phenoxycarbonylierung, Tosylierung, Mesyiierung oder äquivalente Umsetzung handeln.

Beispiele für leicht zugängliche Acylierungsmittel sind: Ameisensäure-essigsäure-anhydrid, p-Nitrophenylformiat Essigsäureanhydrid, Acetylchlorid, Pro-

pionsäurehydrid, p-Nitrophenylester der Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäureester, N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid (ein representativer aktiver Ester), N-Benzyloxyc. bonyloxy phthalimid, Benzyloxycarbonylchlorid, p-Metnoxybenzyloxycarbonyloxy-p-nitrophenyl, t-Butoxycarbonylazid, Phenoxycarbonylchlorid, Tosylchlorid, Mesylchlorid.

Das Acylierungsmittel kann entweder als solches oder als Lösung in einem Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid oder in einem Gemisch dieser Lösungsmittel, zur Lösung oder Suspension, welche den Aminoglykosid-Zinkkomplex enthält, zugesetzt werden. Die molare Menge an zugesetztem Acylierungsmiltel ist üblicherweise gleich oder etwas größer als die Anzahl der nicht-komplex gebundenen Aminogruppen, mit welchen das Acylierungsreagens umgesetzt werden soll. In einigen Fällen kann jedoch die molare Menge an zugesetztem Acylierungsmittel bis auf das Dreifache der Anzahl der nicht-komplex gebundenen Aminogruppen erhöht werden. Das Acylierungsmittei kann entweder auf einmal oder in portionsweise langsam im Verlauf von 2 bis 3 Stunden zugesetzt werden; üblicherweise wird es im Verlauf von 30 Minuten bis 1 Stunde zugesetzt Die Acylierung kann bei einer Temperatur zwischen -20° C und 100⁰C durchgeführt werden, doch erfolgt sie üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 0°C bis Zimmertemperatur. In einigen Fällen kann die Reaktionstemperatur im Zeitpunkt der Acylierungsmittelzugabe tief gehalten und dann allmählich mit fo schreitender Acylierung erhöht werden. Üblicherweise wird die Acylierungsreaktion in situ in dem organischen Lösungsmittel, in welchem der Aminoglykosid-Zinkkomplex gebildet wurde, durchgeführt An die Stufe der Acylierung des Aminoglykosid-Zinkkomplexes schließt sich die Stufe der Entfernung der Zinkionen aus dem N-acylierten Zinkkomplex, d. h. der Zerstörung des Zinkkomplexes an, so daß man das selektiv geschützte N-acylierte Derivat des Aminoglykosids frei von Zinkionen erhält

Zur Entfernung der Zinkionen aus dem N-acyüerten Zinkkomplex gibt es verschiedene Methoden. Die erste Methode besteht darin, die Zinkionen in Form von wasserunlöslichen Verbindungen wie Zinksulfid, Zinkhydroxid oder Zinkcarbonat auszufällen. Die Ausfällung kann direkt aus dem Acylierungs-Reaktionsgemisch erfolgen. Gegebenenfalls kann der Komplex zuvor auch in ein frisches Volumen eines organischen Lösungsmittels übergeführt worden sein.

Die zur Durchführung dieser ersten Methode geeigneten Zinkfällungsrnittel umfassen z. B. Schwefelwasserstoff. Alkalimetallsulfide, wie Natriumsulfid, Ammoniumsulfid, Erdalkalimetallsulfide, wie Calciumsulfid, und Alkalimetallcarbonate, wie Natriumcarbonat, oder Ammoniumhydroxid. in einigen Fällen kann die Entfernung der Zinkionen aus dem N-acylierten Zinkkomplex durch bloßen Zusatz von Wasser erfolgen. Bei dieser ersten Methode erfolgt die Ausfällung des unlöslichen Zinksalzniederschlages rasch; der Niederschlag kann abfiltriert werden. Das N-acylierte Aminogiykosid, welches im Rltrat verbleibt kann durch Konzentrieren oder Extraktion desselben gewonnen und, falls notv/endig, anschließend weiter gereinigt werden. Zur Reinigung ist z. B. die Säulenchromatographie mit Silicagel empfehlenswert

Eine zweite Methode besteht darin, das Acylierungsreaktionsgemisch entweder (a) zur Trockne einzudampfen oder (b) mit einem flüssigen Verdünnungsmittel zu verdünnen, so daß man eine ölige oder feste Ausscheidung, ein Konzentrat oder einen Rückstand erhält, aus welchen sodann das gewünschte N-acylierte Aminoglykosid auf bekannte Weise gewonnen werden kann. An Stelle des Acylierungsreaktionsgemisches selbst kann auch eine frisch bereitete Lösung des N-acylierten Zinkkomplexes in einem organischen Lösungsmittel für eine der beiden oben genannten Varianten verwendet werden. Geeignete flüssige

ίο Verdünnungsmittel für die beschriebene zweite Methode sind Wasser und organische Lösungsmittel, in welchen der N-acylierte Zinkkomplex nicht oder nur wenig löslich ist.
Gemäß dieser zweiten Methode wird das Acylierungsreaktionsgemisch direkt oder die frische Lösung des N-acylierten Zinkkomplexes in einem organischen Lösungsmittel konzentriert oder zur Trockne eingedampft, so daß man einen öligen oder festen Niederschlag beziehungsweise Rückstand erhält. Wenn ein schwer 'erdampfbares organisches Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid als Reaktionsmedium für die N-Acylierung des Zinkkomplexes verwendet wurde, kann der N-acylierte Zinkkomplex aus dem Acylierungsreaktionsgemisch mit einer verdünnenden organi-

sehen Flüssigkeit wie Äthyläther a's Feststoff oder Öl abgeschieden werden. Diese ölige oder feste Abscheidung bzw. der Rückstand stellt üblicherweise ein Gemisch dar, welches wie folgt zusammengesetzt ist: (1) aus dem N-acylierten Aminoglykosid-Zinkkomplex, (2) dem N-acylierten Aminoglykosid, welches bei der Spaltung des Komplexes bei Abwesenheit eines Lösungsmittels gebildet wird, (3) einer gewissen Menge des anorganischen Zinksalzes, welches ebenfalls durch Aufspaltung des Komplexes gebildet worden ist, (4) einer gewissen Menge des Zinksalzes, welches zu Beginn als Überschuß zugesetzt wurde und bei der Komplexbildungsreaktion unumgesetzt verblieb, und gegebenenfalls (5) einer restlichen Menge des organischen Lösungsmittels, welches in den vorangehenden Stufen verwendet wurde.

Die ölige oder feste Abscheidung bzw. der Rückstand können anschließend nach einem der folgenden Verfahren (a), (b) und (c) behandelt werden.

(a) Der ölige oder feste Rückstand wird mit Wasser •»5 oder einem polaren organischen Lösungsmittel, einem

wäßrigen polaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von polaren organischen Lösungsmitteln, versetzt Hierdurch wird der N-acylierte Zinkkomplex zerstört Das freigesetzte und das ursprünglich

so vorhandene nicht-umgesetzte Zinksalz müssen in dem Lösungsmittel löslich, das gewünschte N-acylierte Aminoglykosid jedoch unlöslich sein. Das Zinksalz kann aus der Lösung in Wasser oder dem (wäßrigen) organischen Lösungsmittel extrahiert werden; das

gewünschte N-acylierte Aminoglykosid kann als unlöslicher Rückstand gewonnen werden. Dieser Rückstand kann gegebenenfalls durch Wiederauflösen in einem organischen Lösungsmittel gereinigt werden. Für dieses Verfahren (a) geeignete polare organische Lösungsmit-

tel sind z. B. Methanol, Äthanol, flüssiger Ammoniak, Äthylamin und Triäthylamin. Diese polaren organischen Lösungsmittel und Wasser dienen demzufolge als das Zinkionen entfernende Reagens.

(b) Der ölige und feste Rückstand wird mit einem polaren organischen Lösungsmittel (wasserfrei oder wasserhaltig) vermischt, welches den N-acylierten Zinkkomplex aufspaltet und in welchem das freigesetzte Zinksalz nicht löslich, aber das gewünschte N-acylierte

Aminoglykosid löslich ist. Letzteres kann aus der Lösung im polaren organischen Lösungsmittel extrahiert und so vom Zinksalz abgetrennt werden, welches zwar freigesetzt worden ist, aber ungelöst im polaren organischen Lösungsmittel verbleibt. Die Lösung des N-acylierten Aminoglycosids kann gegebenenfalls z. B. durch Chromatographie, gereinigt und anschließend eingeengt werden.

(c) Die ölige oder feste Abscheidung oder der Rückstand können auch als Ganzes wieder aufgelöst werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, welches einen Anteil Wasser enthält. Die so erhaltene Lösung kann dann einer Chromatographie unterzogen werden, bei welcher das Zinksalz und das N-acylierte Aminoglykosid freigesetzt werden und getrennt aus der Lösung gewonnen werden können. Für diese chronatographische Behandlung eignen sich verschiedene Arten von Kationenaustauscherharzen, Anionenaustauscherharzen, Chelataustauscherharzen und wasserunlöslichen Polymere, welche funktioneile Gruppen enthalten, die sich mit einem Metall binden können, wie Chitin oder Chitosan. Geeignete Kationenaustauscherharze sind solche mit Carboxylgruppen (-COOH) und Sulfonylgruppen (-SOiH) als Austauscherfunktionen. Wenn ein Kationenaustauscherharz mit Carboxyl-Funktion für die beschriebene chromatographische Behandlung verwendet wird, wird der ölige oder feste Rückstand in einem geeigneten wässerigen organischen Lösungsmittel, z. B. einem Gemisch von Wasser und Methanol, welches 10 bis 90 Volumen-Prozent Wasser enthält, oder einem Gemisch von Wasser und Dioxan, welches 10 bis 90 Volumen-Prozent Wasser enthält, gelöst, und die erhaltene Lösung wird auf eine Säule aus dem Kationenaustauscherharz geleitet. Die Säule wird sodann mit demselben wässerigen organischen Lösungsmittel gut gewaschen und anschließend entwickelt. Für die Entwicklung verwendet man ebenfalls das genannte wässerige organische Lösungsmittel, welchem jedoch eine gewisse Menge Säure oder Base zugesetzt worden ist, als Eluierungsmittel. Als Säure kann dazu eine schwache organische Säure, wie z. B. Essigsäure, oder eine verdünnte anorganische Säure, wie z. B. verdünnte Salzsäure, verwendet werden. Als Base eignet sich Ammoniumhydroxid für die meisten Fälle. Die Konzentration der Säure oder Base im Eluierungsmittel soll vorzugsweise 0,01% bis 5%, bezogen auf das Gewicht des Eluierungsmittel, betragen. Die Trennung des N-acylierten Aminoglycosids von den komplexbildenden Ionen während der Entwicklung ist möglich, weil das verwendete Kationenaustauscherharz unterschiedliche Adsorptionsaffinitäten gegenüber dem N-acylierten Aminoglykosid und den Zinkionen aufweist Auf diese Weise kann das Eluat in Fraktionen gesammelt werden. Die Fraktionen, die das N-acylierte Aminoglykosid frei vom Zinksalz enthalten, werden gesammelt und konzentriert, so daß man das gewünschte Frodukt schließlich in reiner Form erhält

Wird ein Kationenaustauscherharz mit Sulfonylfunktionen für die Chromatographie verwendet, so erfolgt die Trennung und Gewinnung des N-acyiierten Aminoglykosids in derselben Weise wie vorstehend beschrieben, weil der Mechanismus bei der Trennung des N-acylierten Aminoglykosids von den komplexbilclenden Zinkionen derselbe ist Bei Verwendung eines schwach oder stark basischen Anionenaustauscherharzes für die Chromatographie wird dagegen der Teil des N-acylierten Zinkkomplexes, welcher eine oder m "hrere nicht-acylierte Aminogruppen enthält, nicht an dem basischen Anionenaustauscherharz absorbiert und zwar infolge der ionogc-nen Abstoßung zwischen dem Aminoglykosid und dem Harz. Bei der Entwicklung der Anionenaustauscherharze mit einem geeigneten wässerigen organischen Lösungsmittel wird das N-acylierte Aminoglykosid aus der Säule eluiert, während die Zinkionen in der Säule verbleiben.

Bei der Chromatographie mit Chelat-Austauscherharzen, die die Zinkionen komplex binden, wird bei der Entwicklung vorzugsweise das gewünschte N-acylierte Aminoglykosid aus der Säule eluiert. während die Zinkionen im Chelat-Austauscherharz gebunden bleiben. In derselben Weise wie die Chelat-Austauscherharze lassen sif h beispielsweise bestimmte Polymere wie Chitin und Chitosan verwenden.

(d) Bei einer dritten Methode wird das Acylierungsreaktionsgemisch direkt auf eine Säule aus einem Kationen- oder Anionen-Austauscherharz, einem Chelat-Austauscherharz oder einem in Wasser un'öslichen Polymer mit metallbindenden Funktionen gegeben. Die Säule wird dann gegebenenfalls mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel gewaschen und anschließend mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel, welches gegebenenfalls eine Säure oder eine Base, wie im obigen Verfahren (c) erwähnt, enthält, entwickelt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt dann wie unter (c) beschrieben.

(e) Gemäß einer vierten Methode wird das Acylierungsreaktionsgemisch zur Gewinnung des N-acylierten Aminoglykosides sofort, mit V/asser behandelt Diese Methode ist nur anwendbar, wenn das gewünschte N-acylierte Aminoglykosid in Wasser unlöslich oder praktisch unlöslich ist 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyldibekacin kann als Beispiel eines in Wasser praktisch unlöslichen N-acylierten Aminoglykosids genannt werden. Durch die Zugabe von Wasser zu dem Acylierungsreaktionsgemisch wird der Zinkkomplex gelöst und das wasserunlösliche N-acylierte Aminoglykosid fällt als fester Stoff aus, während die Zinkionen in Lösung bleiben. Das N-acylierte Aminoglykosid läßt sich so als praktisch reines Produkt getrennt vom Zinksaiz gewinnen Die Ietztbeschriebene Methode der direkten Vermischung des Acylierungsreaktionsgemisches mit Wasser läßt sich mit Erfolg, d. h. mit guten Ausbeuten an N-acyliertem Aminoglykosid nur anwenden, wenn das letztere in Wasser unlöslich oder nur schwach löslich ist. Der dann erhaltene wasserunlösliche Niederschlag kann direkt als Ausgangsmaterial für weitere Reaktionen verwendet werden.

Im allgemeinen ist das N-acylierte Aminoglykosid jedoch in Wasser ganz oder teilweise lösiich, so daß man es durch einfaches Vermischen des Acylierungsreaktionsgemisches mit Wasser nur in sehr geringer Ausbeute gewinnen kann. Bessere Resultate lassen sich erzielen, wenn eines der vorstehend genannten Verfahren (b) oder (c) angewandt wird, bei welchen der N-acylierte Zinkkomplex zuerst aus dem Acylierungsreaktionsgemisch abgetrennt und dann erst in Wasser oder einem wässerigen organischen Lösungsmittel gelöst wird, worauf aus der erhaltenen Lösung die Zinkionen entfernt werden. Eine einfache Methode zur Entfernung der Zinkionen ist die Ausfällung derselben mit Schwefelwasserstoff oder einem Alkalisulfid. Zink-Sulfid fällt jedoch oft als kolloidaler Niederschlag aus, d:.- schwer abfiltriert werden kann. Außerdem weisen Schwefelwasserstoff und Alkalisulfide einen unangenehmen Geruch auf und sind daher für die großtechnische Durchführung des Verfahrens nicht geeignet Es wurden

dabei umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt, um eine praktische Methods zur Entfernung der Zinkionen aus dem Zinkkornplex ohne Verwendung eines Sulfides zu entwickeln. Dabei ist es gelungen, die wirksamen und einfachen Methoden der Zinkkationen-Entfernung unter Verwendung der obengsnannten Austauscherharze oder anderer polymerer Materialien, wie in den Verfahren (c) und (d) beschrieben zu entwickeln. Diese Verfahren (c) und (d) sind wirtschaftlich sehr vorteilhaft und wertvoll, da sie leicht durchzuführen sind, einen höhen Wirkungsgrad bezug' lieh der Trennung der Zinkkationen aufweisen und eine hohe Ausbeute an dem gewünschten N-acylierten Aminoglykosid ergeben.

Die beschriebenen Methoden und Ausführungsformen zur Behandlung des N-acylierten Zinkkomplexes mit dem Zinkionen entfernenden Reagenz können somit wie folgt zusammengefaßt werden:

(1) Der Komplex aus Zinkionen und dem selektiv N-acyliertjn Aminoglykosid wird zunächst aus dem Acylierungsreaklionsgemisch abgetrennt, bevor er mit einem Rea„inz zur Entfernung der Zinkionen aus dem Komplex umgesetzt wird.

(2) Der Komplex aus Zinkionen und dem selektiv N-acylierten Aminoglykosid wird aus dem Acylierungsreaktionsgemisch durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, durch Eindampfen des Acylierungsreaktionsgemisches oder durch Verdünnen des Acyüerungsreaktionsgemisches mit einem leichten organischen Lösungsmittel abgetrennt, bevor er mit einem Reagenz zur Entfernung der Zinkionen umgesetzt wird.

(3) Der einmal abgetrennte Zinkkomplex mit dem selektiv N-acylierten Aminoglykosid wird zur Entfernung der Zinkionen mit Wasser oder einem polaren organischen Lösungsmittel, welches entweder wasserfrei oder wasserhaltig ist vermischt. Dieses polare organische Lösungsmittel ist entweder ein solches, in welchem das Zinksalz löslich, jedoch das N-acylierte Aminoglykosid unlöslich ist, oder ein solches, in welchem das Zinksalz unlöslich, jedoch das N-acylierte Aminoglykosid löslich ist.

(4) Der einmal abgetrennte Zinkkomplex mit dem N-acylierten Aminoglykosid wird wiederum als Ganzes in einem organischen, wasserhaltigen Lösungsmittel gelöst. Die erhaltene Losung wird einer chromatographischen Behandlung unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, eines Anicnenaustauscherharzes. eines Cheiat-Austauscherharzes oder eines in Wasser unlöslichen Polymers, welches funktionell Gruppen enthält, die sich mit einem Metall verbinden können, unterworfen, wodurch die Zinkionen entfernt werden.

(5) Das Acyüeiungs-Reaktionsgemisch wird direkt über eine Säule aus einem Kationenaustauscherharz, einem Anionenaustauscherharz, einem Chelat-Austauscherharz oder einem in Wasser unlöslichen Polymer, welches Funktionen enthält, die sich mit Metall vereinen können, geleitet. Der Zinkkomplex mit dem N-acylierten Aminoglykosid wird an der Säule adsorbiert Die Säule wird sodann mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel, welches gegebenenfalls eine gewisse Menge an Säure oder Base enthält entwickelt, und das Eluat wird in Fraktionen gesammelt; die Fraktionen, welche das gewünschte selektiv N-acylierte Aminoglykosid jedoch keine Zinkkationen enthalten, werden vereinigt und aufgearbeitet.

(6) Wenn das gewünschte N-acylierte Aminoglykosid

in Wasser unlöslich oder praktisch unlöslich ist, wird das Acylierungsreaktionsgemisch unmittelbar mit Wasser vermischt, so daß das gewünschte Derivat ausfällt, während das Zinksialz in Wasser gelöst bleibt.

(7) Das Acylierungsreaktionsgemisch wird unmittelbar mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Erdalkalimetallsulfid behandelt, welche die Zinkionen als Zinksulfid ausfällen Oder mit Ammoniumhydroxid, welches die Zinkionen als Zmkhydro :id ausfällt.

In dem bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Zinkkomplex sind die Zinkionen hauptsächlich an die 1-Amino- und 3"-Aminogruppen des Aminoglykosids komplex gebunden. Bei der N-Acylie-

is rung des Aminoglykosid-Zinkionen-Komplexes (gefolgt von der Entfernung der Zinkionen aus dem Komplex) erhält man daher üblicherweise das N-acy!ierte Aminoglykosid, in welchem die anderen Amino- und/oder Alkylaminogruppen als die 1-Amino- und 3"-Aminogruppen durch die Acyigruppe geschützt sind. Durch Umsetzung eines in der beschriebenen Weise gewonnenen N-acylierten Aminoglykobids mit einer «-Hydroxy-cu-aminofettsäure in bekannter Weise, wie z. B. in den US-PS 37 81 268 und 39 39 143 beschrieben, und anschließende Entfernung der restlichen Aminoschi'izgruppen aus dem Produkt lassen sich semisynthetische 1-N-acylierte Aminoglykosid-Antibiotika erhalten, welches als wertvolle antibakterielle Mittel bekannt sind.

Beispiel 1
S.ö'-Di-N-benzyloxycarbonyl-KanamycinA

(1) 2,0 g (4,13 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in einer Mischung aus Dimethylsulfoxid (50 ml) und Tetrahydrofuran (20 ml) suspendiert und 4 g (18,1 mMoi) Zink-(H)-Acetatdihydrat zu der Suspension zugesetzt worauf das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur gerührt wurde, bis eine homogene Lösung entstanden war. Es benötigte etwa 4 bis 5 Stunden zur Bildung des Zinkkomplexes von Kanamycin A und zu dessen Auflösung Die erhaltene Lösung wurde sodann auf 0⁰C gekühlt worauf ihr langsam im Laufe von etwa 1 Stunde eine gekühlte Lösung (bei 0⁰C) von 237 g (9.5 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid

C₆H₅CH₂OCOO-N

gelöst in einem Gemisch (40 ml) von Tetrahydrofuran-Dimethylsulfoxid (1 :1 Volumverhältnis) zugesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde bei Zimmertemperatur während 4 Stunden stehen gelassen; während dieser Zeit erfolgte die Benzyloxycarbonylierung des Zinkkomplexes von Kanamycin A.

Eine Probe, welche der so erhaltenen Reaktionslösung entnommen wurde, wurde der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unterzogen, unter Verwendung der unteren flüssigen Phase eines Gemisches von Chloroform-Methanol-28% wässerigem Ammoniumhydroxid (Volumverhältnis 1:1.1) als Entwicklungslösungsmittel, was einen Hauptfleck des gewünschten

Produktes bei Rf=023 sowie zwei oder drei kleine Flecken, welche Nebenprodukten zugeschrieben wurden, an höheren Punkten ergab.

(2) Die oben erhaltene Reaktionslösung wurde in 500 rnl Äthyläther gegossen, und das ausgeschiedene Öl wurde mehrmals mit weiteren Portionen Äthyläther gewaschen, wobei 83 g eines dicken sirupartigen Materials erhalten wurden.

(3) Die Entfernung der Zinkkationen aus dem sirupartigen Material, welches im wesentlichen den Zinkkomplex enthielt, wurde nach einem der folgenden verschiedenen Verfahren durchgeführt:

(A) Verfahren unter Verwendung eines schwachsauren Kationenaustauscherharzes, welches Carboxylgruppen (-COOH) als funktionelle Gruppen enthält, z.B. dem Produkt Amberlite® CG 50 (rP-Form):

60 ml Amberlifi CG 50 (H®-Form) wurden zunächst tüchtig mit einem Gemisch von Wasser-Dioxan (2:1) gesättigt und anschließend in eine Säule eingefüllt Eine Lösung von 1 g des sirupartigen Materials gelöst in 20 ml Wasser-Dioxan (1:1) wurde sodann durch die Säule geleitet, weiche sodann mit Wasser-Dioxan (2:1), welches 1% Essigsäure enthielt, entwickelt wurde. Dar Eluat wurde in Fraktionen gesammelt Das gewünschte 3,6'-Di-N-benzy;oxycarbonyl-K.anamycin A. welches auf Ninhydrin positiv reagierte, wurde zuerst aus der Säule eluiert und das Zinkacetat, welches eine Farbreaktion mit Diphenyicarbazid ergab, wurde anschließend eluiert Die Fraktionen, welche das gewünschte Produki enthielten, würde vereint und zur Trockene verdampft Der Rückstand wurde mit Äihyläther gewaschen und ergab 340 mg (81%) S.e'-Di-N-benzyloxycarbony'.-Kanamycin A als farblosen Feststoff. [a]£ +76° (c=\. Wasser -Dimethylformamid. 1 :2).

GewichtsanalyseHJrCj₁H^N₄O₁₅ ■ 2CHjCO₂H-H₂O: berechnet: C 51.23. H 6.56. N 6,29%; gefunden: C 51.0Z H 6.71, N 522%.

(B) Verfahren unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes, welches Carboxylgruppen als funktionelle Gruppen enthält, z. B. dem Produkt Amberlite® CG 50(NH4^e-Form):

1 g des im obigen Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials wurde in 20 mi wasser-uioxan (! : 1) gelöst und die Lösung durch eine Säule aus 60 ml Amberlite® CG 50 (NH₄®-Form) geleitet und der graduellen Eluierung mit Wasser-Dioxan (1 :1), welches 0 bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthielt, unterworfen. Es wurden keine Zinkkationen eluiert, jedoch das gewünschte Produkt, nämlich S.ö'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A. Die Fraktionen des Eluates, welche das gewünschte Benzyloxycarbonylierungsprodukt enthielten, wurden gesammelt und zur Trockene verdampft, wobei 328 mg (89%) des gewünschten Produktes als farbloser Feststoff erhalten wurde. [«]y +66" (c-1, Wasser - Dimethylformamid, 1 :2).

Gewichtsanalyse für C34H48N4O15 · '/2 H₂CO₃: berechnet: C 5237, H 630. N 7,15%; gefunden: C52J0, H6J9, N 7,00%.

(C) Verfahren unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, welches stark saure funktionelle Gruppen, -SO3H enthält, z. B. Dowex® 50 W X 2:

30 ml Dowex® 50 W X 2 (H®-Form) in Wasser-Dioxan (2 :1) wurden in eine Säule eingefüllt, durch weiche sodann eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in 20 ml Wasser-Dioxan (2: i) geführt wurde. Die Säule wurde mit Wasser-Dioxan (2:1) gewaschen, bis der Ausfluß aus der Säule eine neutrale Natur ergab, und anschließend erfolgte die Fnear zunehmende Eluierung mit Wasser-

Dioxan (2:1), welches 0 bis 1 N Ammoniumhydroxid enthielt Die Eluatfraktionen, weiche das gewünschte S.ö'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A enthielten, wurden vereint und unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft wobei 311 mg (84%) rines weißen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit dem in Beispiel 1 (3) (B) erhaltenen Produkt

(D) Anderes Verfahren unter Verwendung von Dowex® 50 W X 2:

Eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in 20 ml Wasser-Methanol (3 :1) wurde über eine Säule aus 30ml Dowex® 50WX2 (H^ö-Form), welche zuvor mit Wasser-Methanol (3:1) benetzt worden war, geleitet Die Säule wurde mit Wasser-Meihanol. (3: \) gut gewaschen und anschiie-Bend einer graduellen Eluierung mit Wasser-Methanol (3:1), welches. 0 bis 6 N Salzsäure enthielt unterzogen. Die aktiven Fraktionen, weiche das gewünschte Sü'-Di-N-benzoyloxycarbonvl-Kanamycin A enthielten, wurden gesammelt und 1...1 einem stark basischen

Anionenaustauscherharz, Dowx® 1 X 2 (OH-Form) in genügender Menge vermischt um das Gemisch leicht sauer zu gestalten.

Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene konzentriert wobei SEoifg (72%) des gewünschten Produktes in For?" -^: : uihydrochlorides erhalten wurden. [&] %> + 79° (c= 1, Wasser - Dimethylformamid, 1 :2).

(E) Verfahren unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes, welches stark basische funktionelle quaternäre Ammoniumgruppen enthält z. B. Dowex® 1 X 2:

Eine Lösung von I g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Dioxan (1:1) wurde über eine Säule aus 30 ml Dowex® 1 X 2 (OH-Form), welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1 :1) imprägniert worden war. geleitet und die Säule anschließend mit Wasser-Dioxan (1 :1) bei verhältnismäßig hoher Geschwindigkeit entwickelt Die Eluatfraktionen, weiche das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt

und zur Trockene verdampft, wobei 305 mg (§4%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit demjenigen aus Beispiel 1 (3) (B).

(F) Verfahren unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes, welches schwach basische funktionelle Gruppen enthält, z. B. Dowex® WGR:

1 g des in Beispie! 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials wurden in 20 ml Wasser-Dioxan (2:1) gelöst und die Lösung über eine Säule aus 50 ml Dowex® WGR (Basenform) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan

(2:1) gesättigt worden war, und anschließend mit Wasser-Dioxan (2 : i) ehiicri. Das gcwüiratnic j,u-l^i-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A wurde in einigen Fraktionen zusammen mit einer Spur mitgerissener Zinkkation.'n eluiert. Diese Fraktionen wurden vereint und zur Trockene verdampft, wobei 450 mg eines farblosen Feststoffes erhalten wurden.

(G) Verfahren unter Verwendung eines Chelat-Austauscherharzes, welches schwach saure funktionelle Gruppen enthält, z. B. Dowex® Al:

Eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Dioxan (1 :1) wurde über eine Säule aus 50 ml Dowex® A1 geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1 :1), welches 1% Ammoni-

umhydroxid enthielt, gesättigt worden war, und anschließend der graduellen Eiuierung mit Gemischen von Wasser-Dioxan(i : 1), welche 0 bis 1 N Ammoniumhydroxid enthielten, unterworfen. Die — spaten — Eluatfraktionen, welche das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamydn A enthielten, wurden vereint und zur Trockene verdampft wobei 272 mg/74% des gewünschten Produktes als weißer Feststoff erhalten wurden.

(H) Verfahren unter Verwendung von Chitosan (einem in Wasser unlöslichen Polymer, welches funktionelle Gruppen enthält die fähig sind, sich mit einem Metall zu vereinen):

100 ml Chitosan wurden mit Wasser-Methanol (3 :1) gut imprägniert und in eine Säule eingefüllt über welche sodann eine Losung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Methanol (3:1) geleitet wurde. Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (3 :1) entwickelt, wobei das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kamaycin A zuerst und dann das Zinkacetat eluiert wurde. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene verdampft wobei ein Rückstand erhalten wurde, welcher in Wasser-Dioxan (1 :1) gelöst wurde. Die Lösung wurde über eine Säule aus Amberlite® CG 50 (NH4®-Form) geleitet welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1) vorbehandelt worden war. Die Säule wurde mit Wasser-Dioxan (1 :1) gut gewaschen und anschließend der graduellen Eiuierung mit Wasser-Dioxan (i : 1), welches 0 bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthielt unterworfen. Die Fraktionen, welche eine positive Ninhydrin-Reaktion ergaben, wurden vereint und zur Trockene verdampft wobei 301 mg (82%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit dem in Beispiel 1 (3) (B) erhaltenen Produkt

(I) Verfahren unter Verwendung eines carboxymethylsi'bstituierten Dextrangels, z. B. CM-Sephadex® C-25:

Eine Lösung von i g des in Beispie! 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Dioxan (1:1) wurde über eine Säule aus 40 ml CM-Sephadex® C-25 (Ni..³-Form) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1 :1) gut gesättigt worden war. Die Säule wurde mit 200 ml Wasser-Dioxan (1:1) gewaschen und anschließend unter Verwendung von Wasser-Dioxan (1 :1). welches von 0 auf 0.1 N ansteigende Mengen an Ammoniumhydroxid enthielt, eluiert. Es wurden keine Zinkkationen aus der Säule eluiert sondern nur das gewünschte 3.6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A. Das Eluat wurde zur Trockene verdampft und ergab 303 mg (82%) eines farblosen Feststoffes, weicher identisch war mit demjenigen aus Beispiel I (3) (B).

(J) Verfahren unter Verwendung von Schwefelwasserstoff als Zink fällendes Mittel:

1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials wurden in zu mi Wasser-rviexhanoi (i : i) gelöst In die Lösung wurde nach Zugabe von wässerigem Ammoniumhydroxid eine ausreichende Menge Schwefelwasserstoff eingeleitet Das Reaktionsgemisch, welches den gebildeten Zinksulfidniederschlag enthielt, wurde Ober einen Glasfilter, welcher mit Celite®-Filterhilfsmittel gefüllt war, filtriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein sirupartiges Material zurückblieb, welches mit Äthyläther gewaschen wurde, bis der Rückstand fest und trocken war. Dieser Rückstand wurde in Wasser-Dioxan (i : 1) aufgenommen und die Lösung wurde über eine Säule aus 30 ml Amberlite® IRA 900 (OH-Form), einem stark basischen Harz) chromatographiert Wasser-Dioxan (1: t) diente ais EntwicklungslösungsmitteL Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, welche S.e'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A enthielten, wurden vereint und zur Trockene verdampft wobei 235 mg (64%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit demjenigen aus Beispiel ί (3) (B).

ίο Beispiel2

S.ö'-Di-N-benzyloxycarbonyl-KanamycinA

500 mg (1.03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, worauf 420 mg (3,09 mMol) Zinkchlorid und 840 mg (6,18 mMol) Natrhimacetat-trihydrat zugesetzx wurden. Das Gemisch wurde 10 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt worauf dem erhaltenen Gemisch, welches den gebildeten Kanamycin A-Zinkkomplex enthielt langsam im Laufe von 1 Stunde eine Lösung von 675 mg (2£7 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid

C₆H₅-CH₂OCOON

gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 4 Stunden stehengelassen.

Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (I) behandelt, wobei 598 mg (74%) S^'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A in Form eines farblosen Feststoffes erhalten wurden.

Beispiel 3

^ö'-Di-N-benzyloxycarbonyi-Kanamycin A

600 mg (0^5 mMol) Kanamycin A-Tetrahydrochlorid und 150 mg (3,8 mMol) Natriumhydroxid in 15 ml Dimeihyisuifoxid wurden während 1 Stünde geröhrt, worauf 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat zugesetzt wurde und anschließend das Gemisch während weiteren 5 Stunden gerührt wurde. Zu dem erhaltenen Gemisch, welches den gebildeten Kanamycin A-Zinkkomplex enthielt wurde im Laufe von 30 Minut η eine Lösung von 545 mg (2,2 mMoi) N-Benzyioxyearbonyloxysuccinimid gelöst in 5 ml Dimethylsulfoxid-Tetrahydrofuran (1 :1) zugesetzt Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, worauf Äthyläther zugesetzt wurde, um den N-acylierten Zinkkompiex ais Niederschlag auszufällen. Dci Nicuci »Oning

wurde sodann nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 (3) (H) beschrieben behandelt, wobei 581 mg (78%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden.

Beispiel 4
3,6'-Di-N-benzyIoxycarbonyl-Kanamycin A

(1) 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 20 ml einer Mischung aus Wasser und Dimethylsulfoxid (1 :9) gelöst, worauf 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat und anschließend 590 mg (2,4 mMol)

N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt warden. Nachdem das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen worden war, wurde eine große Menge Äthyläther zum Gemisch zugesetzt, was zur Abtrennung einer wässerigen _ sirupartigen Schicht führte, welche mehrmals mit Äthyläther gewaschen wurde.

(2) Das so erhaltene sirupartige Material wurde in Wasser-Methanol (3 :1) gelöst und die Lösung durch eine Säule mit 200 ml Chitosan geleitet Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (3:1) eluiert, und das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt Die auf Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen wurden vereint und auf ein kleines Volumen eingeengt Das Konzentrat wurde auf eine Säule mit Amberlite® CG 50 (NH^-Form) gegeben, welche gut mit einem Gemisch aus Wasser und Dioxan (1:1) gewaschen und anschließend der graduellen Fiuierung mit Wasser-Dioxan (1 :1), welches von 0 auf 0,1 N ansteigende Mengen an Ammoniumhydroxid enthielt, unterworfe=' Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene verdampft, wobei 494 mg (61%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, der identisch mit demjenigen aus Beispiel 1 (3) (B) war.

Beispiel 5
S.ö'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A

500 mg(l,03 mMof) Kanamycin A (freie Base) wurden in 20 ml einer Mischung aus Wasser und Tetrahydrofuran (1 :3) gelöst und anschließend mit 1 g (4,5 mMol) Zinkacetatdihydrat versetzt, gefolgt von dem Zusatz von 590 mg (2,4 mMol) N-Benzjioxyca- Jonyloxysuccinimid. Das Gemisch wurde bei Zu.ime temperatur über Nacht stehen gelassen. Die erhaltene Rtaktionslösung wurde danach unter vermindertem Druck eingeengt Der Rückstand wurde über eine Säule aus 200 ml Chitosan geleitet, und die aus der Säule ausfließende Flüssigkeit anschließend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (2) behandelt, wobei 414 mg (51%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff gewonnen wurden.

Beispiet 6
S.e'-Di-N-benzyloxycarbonyS-Kanamycin A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 15 ml einer Mischung aus Wasser und Methanol (1 :7) gelöst und diese Lösung sodann mit 1,5 g (6,8 mMol) Zinkacetatdihydrat zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 590 mg (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 7 ml Tetrahydrofuran. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen, und die derart erhaltene Reaktionslösung wurde sodann unter vermindertem Druck eingeengt Der Rückstand wird über eine Säule aus 200 ml Chitosan geleitet, und die aus der Säule austretende Flüssigkeit wurde anschließend auf dieselbe Weise wie die von Beispiel 4 (2) behandelt, wobei 442 mg (55%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden.

Beispiel 7
^o'-Di-N-benzyloxycarbonyl-KanamycinA

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 20 ml Dimethyisulfoxid suspendiert und 272 mg (1,24 mMol) Zinkacetatdihydrat dieser Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 10

Stunden gerührt, wobei eine praktisch durchsichtige Lösung entstand, zu welcher sodann in kleinen Portionen im Laufe von etwa 2 Stunden 540 mg (2,17 mMol) N-Benzyfoxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt wurden. Nachdem das erhaltene Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen worden war, wurde eine große Menge Äthyläther zugesetzt, und das abgeschiedene ölige Material abgezogen und mehrmals mit Äthyläther gewaschen, wobei ein dickes sirupartig^s Material erhalten wurde. ,

Die Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit einer Probe dieses sirupartigen Materials unter Verwendung von Chlorofo-m-Methanol-28%iges wässeriges Ammoniumhydroxid (Volumverhältnis 1:1:1, untere Phase) als Entwicklungslösungsmittel ergab folgende Flecken:

— Kleiner Fleck bei Rf 0,4 von U,6'3"-Tetra-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A (welches beim Besprühen mit Schwefelsäure und anschließendem Erwärmen eine Farbreaktion entwickelte);

— schwacher Fleck bei R_f 0,28;

— Hauptfleck bei Rr 0,23 von dem gewünschten Produkt 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyI-Kanamycin A;

— kleiner Fleck bei Rf 0,12 bon ö'-N-Benzyloxycarbonyi-Kanamycin A; und

— äußerst schwacher Fleck bei Rf 0 von nicht-umgesetztem Kanamycin A.

Es wurde kein Fleck entsprechend Tri-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A beobachtet, welcher bei R_r 0,28 bis 0,4 hätte auftreten können.
Das obige dicke sirupartige Material wurde in Wasser-Dioxan (1:1) gelöst und die Lösung wurde über eine Säule aus 100 m! CM-Sephadex® C-25 (NH₄®- Form) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1) benetzt worden war. Anschließend wurde die Säule der Eluierung wie in Beispiel 1 (3) (F) beschrieben unterworfen, wodurch die Zinkkationen entfernt wurden, und das gewünschte Produkt von den anderen Produkten getrennt wurde. Man erhielt 412 mg (51%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.

Zum Vergleich wurde das soeben beschriebene Verfahren wiederholt, jedoch das Zinkacetatdihydrat durch 308 mg (1,24 mMol) Nickel-(II)-Acetattetrahydrat ersetzt mit dem Resultat, daß das gewünschte ^o'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin A als farbloser Feststoff nur in der schwachen Ausbeute von 59 mg

so (73%) erhalten wurde.

Beispiel 8

3,6'-Di-N-(p-methoxybenzyloxycarbonyl)-Kanamycin A

500 mg(l,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethyisulfoxid suspendiert und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung entstanden war, zu welcher sodann im Laufe von etwa 30 Minuten eine Lösung von 789 mg (2,6 mMol) p-Methoxycarbobenzoxy-p-nitrophenylester gelöst in 10 ml Dimethyisulfoxid zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschließend auf dieselbe Weise behandelt, wie in Beispiel 1 (2) und (3) (B) beschrieben, wobei 722 mg (83%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff

10

15

20

erhalten wurden. [a]f +87°(c= i, Wasser-Dimethylformamid, I : 2).

Gewichtsanalyse für C₃₆H₅₂N₄Oi₇ · '/2H₂CO₃:
berechnet: C 5135, H 633, N 6,64%;
gefunden: C 51,56, H 6,41, N 6,53%.

Beispiel 9
6'-N-(t-Butoxycarbonyl)-Kanamycin A

Das Verfahren von Beispiel 8 wu: Je wiederholt, mit dem einzigen Unterschied, daß der p-i^thoxycarbobenzoxy-p-Tiitrophenylester durch 22G tu*, {'.;A mMol) i-Butoxycarbonytazid ersetzt wurde Mw- erhielt die Titelverbindung in Form eine* färb!-.-.cj. Feststoffes. Ausbeute: 627 mg. [χ] ²J +96° f«-^i, vVasser-Dimethylformamid, 1 : 2).

Beispiel 10
S.e'-Di-N-trifluoracetyl-Kanamycin \

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde der Suspension zugesetzt Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt bis eine homogene Lösung erhalten worden war, zu welcher eine Lösung von 1,2 g (5,1 mMoi) p-NitrophenoIester von Trifluoressigsäure, gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid, zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschließend mit Äthyläther behandelt wie in Beispiel 1 (2) beschrieben. Das in Äther unlösliche sirupartige Material wurde weiter wie in Beispiel 1 (3) (A) behandelt wodurch man 590 mg (70%) der Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes erhielt, [α]!⁵ +81° (c= 1, Wasser- Dimethylformamid. 1:2).

40

Gewichtsanalyse für
C₂₂H₃₄N₄OuF₆ · 2CH₃CO₂H ■ H₂O:
berechnet: C 3833. H 5,44, N 6,88, F 13.99%;
gefunden: C 38.03, H 5,48. N 6,54%.

45

Beispiel Ii
S.ö'-Di-N-phenoxycarbonyi-Kanamycin A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in einem Gemisch vor Dimethylsulfoxid (15 ml) und Tetrahydrofuran (5 ml) suspendiert, und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt, worauf das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt wurde, bis es eine homogene Lösung gebildet hatte. Die erhaltene Lösung wurde sodann auf 0⁰C gekühlt und anschließend langsam mit einer gekühlten Lösung (auf 0⁰C) von 400 mg (2,55 mMol) Phenoxycarbonylchlorid (C₆H₅OCOCI) in 3 ml Tetrahydrofuran versetzt. Die Reaktionslösung wurde im Laufe von 1 Stunde auf Zimmertemperatur gebracht und anschließend bei dieser Temperatur während 3 Stunden stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde sodann mit Äthyläther behandelt, wie in Beispiel 1 (2) beschrieben, und das in Äther unlösliche sirupartige Material wurde nach demselben Verfahren, wie in Beispiel 1 (3) (A) beschrieben weiterbehandelt, wobei 625 mg (70%) der Titelverbindung ah farbloser Feststoff erhalten wurden. [α]!⁵ +73° (c= !,Wasser -Dimethylformamid,! :2).

Gewichtsanalyse für C₃₂H₄₄N₄Oi₅ - 2 CH₃CO₂H - H₂O: berechnet: C50.ll, H631, N6,49%;
gefunden: C 49,77, H 6,60, N6,il%.

Beispiel 12
S.e'-Di-N-acetyl-Kanamycin A

Das Reaktionsgemisch, welches nach demselben Verfahren wie in Beispiel 8 erhalten worden war, mit Ausnahme, daß 260 mg (2,6 mMol) Essigsäureanhydrid anstelle des p-Methoxycarbobenzoxy-p-nitrophenylesters verwendet wurden, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (3) (A) beschrieben behandelt Auf diese Weise wurden 525 mg (72%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten, [α]!⁵ +93° (c=\. Wasser - Dimethylformamid, 1 :2).

Gewichtsanalyse für CnH₄₀N₄Ou · 2CH₃CO₂H - H₂O: berechnet: C 44,19, H 7,13, N 7,93%;
gefunden: C44,20, H 7,07, N 755%.

Beispiel 13
3,6'-Di-N-formyl-Kanamycin A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt Das Gemisch wurde bei Zi.nmertemperatur gerührt bis eine homogene Lösung vorlag, zu welcher sodann 690 mg (4,12 mMol) p-Nitrophenylformiat zugesetzt wurden. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschließend auf dieselbe Weise behandelt, wie in Beispiel 1 (3) (H) beschrieben. Die auf Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen wurden vereint; in die erhaltene Lösung wurde gasförmiges Kohlendioxid eingeblasen; anschließend wurde zur Trockne eingedampft Auf diese Weise erhielt man 430 mg (67%) der Titel Verbindung als farblosen Feststoff. \*\" +101° (c— 1, Wasser).

Gewichtsanalyse für C₂₀H₃₆N₄0,3 · H₂CO₁ · H₂O:
berechnet: C40.64. H 5,50, NC.03%;
gefunden: C40,43. H 6,47. N 8,83%.

Beispiel 14
3.6'-Di-N tosyl-Kanamycin A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden ir. 15ml Dimethylsulfoxid suspendiert und Ig (4,55 mMcl) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag, zu welcher dann langsam eine Lösung von 400 mg (2,1 mMol) Tosylchlorid in 7 ml Tetrahydrofuran zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatu: während 1 Stunde stehen gelassen, worauf weitere 200 mg Tosylchlorid, gelöst in 3,5 ml Tetrahydrofuran, zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde während weiterer 2 Stunden stehen gelassen und anschließend nach demselben Verfahren, wie in Beispiel 1 (2) und (3) (A) beschrieben, weiterbehandelt wobei 270 mg (28%) der Tiielverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden, [a]I³ +68° Cc=I₁ Wasser—Dimethylformamid, 1 :2).

Gewichtsanalyse für
Cj₂Rf₈N₄Ot₅S₂ - 2 CH₃CO₂H - H₂O:
berechnet: C46,44, H 6,28, N 6,02, S 6,89%;
gefunden: C463L H 5,98, N 6,31, S 6,55%.

Bei der Wiederholung des obigen Verfahrens unter Weglassen des Zinkacetates war die Ausbeute an der Titelverbindung von Beispiel 14 praktisch Null.

Beispiel 15

3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-Kanamycin A

500 mg (1,0 mMol) 6'-N-MethyI-Kanamycin A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und mit 1 g (435 mMol) Zinkacetatdihydrat versetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag, zu welcher sodann im Laufe von 30 Minuten eine Lösung von 550 mg (2,2 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid, gelöst in 5 ml Dimethylsulfoxid-Tetrahydrofuran(l : 1) zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschließend auf dieselbe Weise behandelt, wie in Beispiel 1 (2) und (3) (A) beschrieben, wobei 720 mg (79%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden. [a]i^s +74' (c= 1, Wasser— Dimethylformamid. 1 :2).

Beispiel 16
S.ö'-Di-N-benzyloxycarbonyl-S'-desoxy-KanamycinA

Zur Herstellung dieser Verbindung in Form eines farblosen Feststoffes (Ausbeute: 765 mg = 82%) wurde die Arbeitsweise von Beispiel 15 wiederholt jedoch unter Verwendung von 500 mg (1.07 mMol) 3'-Desoxy-Kanamycin A (freie Base) als Ausgangsmaterial und 610 mg (Z45 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid [&]% +76° (c=\. Wasser- Dimethylformamid, 1:2).

Gewichtsanalyse für Cj₅HwN₄Ou 2CH₃CO₂H - H₂O: berechnet: C 52.16. H 6.68. N 6.40%;
gefunden: C 5159. H 6.75. N 6.20%.

Beispiel 17

3.6'-Di-N-benzyIoxycarbonyl-3^r-desoxy-6'-N-methyl-Kanamycin A

Zur Herstellung dieser Verbindung (Ausbeute: 737 mg = 80%) wurde die Arbeitsweise von Beispiel 15 wiederholt, jedoch mit 500 mg (1,04 mMol) 3'-Desoxy-6'-N-methyI-Kanamycin A (freie Base) als Ausgangsverbindung und 595 mg (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbonylöxysnccinimid. [a]£ +73° (c=t. Wasser— Dimethylformamid,! :2).

Beispiel 18

3,6'-Di-N-benzyIoxycarbonyI-4'-desoxy-Kanamycin A

Ausgehend von 500 mg (1,07 mMol) 4'-Desoxy-Kanamycin A als freie Base [vgL »Journal of Antibiotics«, Bd. 27, Seiten 838-847 (1974); »Bulletin of the Chemical Society of Japan«, Bd 50, Seiten 2362-1268 (1977)], wurde die Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 666 mg (71 %) nach demselben Verfahren wie in Beispiel 15 erhalten, jedoch wurden 580 mg (23 mMol) N-Benzyloxycarborryloxysuccinimid, gelöst in 4 ml Dimethylsulfoxid, langsam im Laufe von 1 Stunde zu der homogenen Lösung zugesetzt. [«]?? +77° (c=*\, Wasser -Dimethylformamid, 1 :2).

Gewichtsanalyse für C₃₄H₄₈N₄Oi₈ · 2CH₃CO₂H · H₂O: berechnet: C 52,16, H 6,68, N 6,40%;
gefunden: C51.77, H 6,79, N 631%.

to Beispiel 19

S^'.e'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-KanamycinB

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin B (freie Base) wurden in einem Gemisch von 12 ml Dimethylsulfoxid und 4 ml Tetrahydrofuran suspendiert, und 1 g (435 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde der Suspension zugesetzt Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag und anschließend auf 0⁰C gekohlt Zu der gekühlten Lösung wurde langsam im Laufe von 1 Stunde eine kalte Lösung von 825 mg (33 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid, gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran-Dimethylsulfoxid (1 :1), zugesetzt Das erhaltene Gemisch wurde zunächst bei 0°C 2 Stunden und anschließend bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und danach auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (A) beschrieben behandelt; man erhielt so 740 mg (70%) der Titelverbindung als farblosen Fea, stoff. [«]? +63" (c<=\. Wasser-Dimethylformamid, 1 :2).

Gewichtsanalyse für C₄₂H₅₅N₅Oi₆ ■ 2CHjCO₂J-J₂O: berechnet: C 5355, H 6.40. N 6.84%;
gefunden: C 53.66. H 6.67. N 6.63%.

Beispiel 20
S^'.ö'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Tobramycin

480 mg (1,03 mMol) Tobramycin (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und die Suspension wurde mit 1 g (435 mMol) Zinkacetatdihydrat versetzt Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 1 Stunde gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag. Diese wurde dann im Laufe von etwa 1 Stunde mit einer Lösung von 850 mg (3,4 mMol) N-Benzoyloxycarbonyloxysuccinimid, gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran-Dimethylsulfoxid (1 :1), versetzt Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Durch Zugabe einer großen Menge Äthyläther, wie in Beispiel 1 (2) beschrieben, konnte ein

so dickes sirupartiges Material gewonnen werden.

Dieses sirupartige Material wurde in derselben Weise, wie in Beispiel 1 (3) (A) beschrieben, weiterbehandelt, jedoch unter Verwendung von Wasser-Dioxan (1 :2) anstelle von Wasser-Dioxan (2:1)₍ wobei 810 mg (78%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden. [«]§* +65° (c=*l. Wasser— Dimethylformamid, 1:2).

Gewichtsanalyse für C₄₂H₅₅N₅Oi₅ - 2CH₃CO₂H
berechnet: C54,81, H 630, N 655%;
gefunden: C 54,77, H 6,71, N 6,88%.

Beispiel 21

H₂O:

6'-N-methyI-Tobramydn

Diese Verbindung konnte in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 890 mg (84%)

erhalten werden, wenn man die Arbeitsweise von Beispiel 20, jedoch ausgehend von 500 mg (1,04 mMol) 6'-N-Methyl-Toi ^amycin (freie Base) wiederholte. [«] J^ä +63° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1 :2).

B e i s ρ i e I 22

3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-4'-desoxy-Kanamycin-B

Ausgehend von 480 mg (1,03 mMol) 4'-Desoxy-Kanamycin B als freie Base [vgl. »Bulletin o/ tr-e Chemical Society of Japan«. Bd. 50. Seiten 2362-2368 (1977)], wurde die Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 815 mg (79%) nach demselben Verfahren wie in Beispiel 20 beschrieben erhalten. [<x]% +65° (c=\. Wasser-Dimethylformamid. 1 :2).

B e i s ρ i e 1 23
S^'.ö'-Tri-N-benzyloxyearbonyl-Dibekacin

600 mg (133 mMol) Dibekacin (3',4'-Didesoxy-Kanamycin B) (freie Base) wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, und die Suspension wurde gerührt bis sich eine Lösung gebildet hatte, zu welcher 1,4 g (6,4 mMol) Zinkacetatdihydrat zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde weiter gerührt. Zu der erhaltenen Lösung wurde langsam im Laufe von etwa 1 Stunde eine Lösung von 1,1 g (4,4 mMol) N-Benzyfoxycarbonyloxysuccinimid in 12 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Anschließend wurde ein großes Volumen Äthyläther mit der Reaktionslösung vermischt wobei sich ein öliger Niederschlag abschied (welcher hauptsächlich den N-benzyloxycarbonyliertem Dibekacin-Zinkkomplex und einen gewissen Anteil Dimethylsulfoxid enthielt). Dieser Niederschlag wurde mit Äthyläther gewaschen, wobei ein dickes sirupartiges Material zurückblieb.

Dieses sirupartige Material wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, wodurch der N-acylierte Zinkkomplex zerstört wurde und die freien Zinkionen zusammer. mit dem zugesetzten Überschuß an Zinkacetat entfernt wurden. Auf diese Weise wurden 1,1 g eines in Wasser unlöslichen Feststoffes erhalten, welcher das N-acylierte Dibekacin enthielt. Der Feststoff wurde einer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unterworfen unter Verwendung von Chloroform-Äthanol-18%igem wässerigem Ammoniumhydroxid (1 :1 :1, untere Phase) als Entwicklungslösungsmittel, wobei ein einziger Fleck bei Rf 03 erhalten wurde, was anzeigte, daß der Feststoff im wesentlichen aus 3,2',6'-Tri-N-benzoyloxycarbonyl-Dibekacin mit einer Spur von Zink bestand.

Zur weiteren Reinigung wurde das Rohprodukt wie es oben erhalten wurde, mit 3 M Ammoniumhydroxidlösung gewaschen; das danach vorliegende Produkt wies keine Verunreinigung durch Zinkionen auf. [a]J⁵ +71° (c= 1, Wasser- Dimethylformamid, 1 :2).

B e i s ρ i e 1 24

S^'.ö'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-m ethyl-Dibekacin

500 mg (1,07 mMol) 6'-N-Methyl-Dibekacin (freie Base) und 1,2 g (5,45 mMol) Zinkacetatdihydrat wurden in 20 ml Dimethylsulfoxid gelöst wonach der Lösung langsam im Laufe von etwa 30 Minuten 910 mg (3,6 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt wurden. Die Reaktionslösung wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschließend in derselben Weise, wie in Beispiel 23 beschrieben, behandelt, wobei 910 mg der Titelverbindung erhalten wurden, weiche praktisch rein war.

B e i s ρ i e 1 25
a^'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-C

Die Titelverbindung wurde in Form eines gefärbten Feststoffes in einer Ausbeute von 730 mg (79%) nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1(1), (2) und (3) (A) beschrieben, erhalten, wobei von 500 mg (1,03 mMol) Kenamycin-C (freie Base) ausgegangen wurde. [«]S⁵ +75° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1 :2).

B e i s ρ i e 1 26
ö'-N-Ben.zyloxycarbonyl-Kanamycin A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin A (freie Base) wurden in 20 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, worauf 0,5 g (23 mMol) Zinkacetatdihydrat zu der Suspension gegeben wurden. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung entstanden war, zu welcher sodann 283 mg(i,13 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt wurden. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschließend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (1) beschrieben, behandelt. Man erhielt so 556 mg der Titelverbindung als farblosen Feststoff.[a]5^s +92° (c= I.Wasser).

Beispiel 27
e'-N-Benzyloxycarbonyl-Dibekacin

Nach dem Verfahren von Beispiel 26 wurden 382 mg der Titelverbindung erhalten unter Verwendung von 500 mg Dibekacin (freie Base). 22 ml Dimethylsulfoxid, 0,7 g Zinkacetatdihydrat und 305 mg N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid.[«]S⁵ +105° (c=0J5, Wasser).

B e i s ρ i e 1 28

S^'.e'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxy-3'-eno-KanamycinB

500 mg (1,11 mMol) 3\4'-Didesoxy-3'-eno-Kanamycin B als freie Base [vgL »Bulletin of the Chemical Society of Japan«, Bd. 50, Seiten 1580 bis 1583 (1977)] wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid gelöst Die Lösung wurde mit 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat versetzt und anschlie-

ßend 1 Stunde gerührt. Zur erhaltenen Lösung wurden langsam im Laufe von 30 Minuten 870 mg (3,49 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt Nachdem das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen worden war, wurde es mit einer großen

Menge Äthyläther behandelt wie in Beispiel 1 (2) beschrieben. Man erhielt so ein dickes sirupartiges MateriaL

Das sirupartige Material wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 (3) (B) weiterbehandelt jedoch unter Verwendung von Wasser-Dioxan (1 :2) anstelle von Wasser-Dioxan (2 :1), wobei 784 mg der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden, [λ] ¥ + 30° (c= 1, Wasser— Dimethylformamid, 1 :2).

27 28

Beispiel 29
Si'.ö'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Sisomicin

Die Titelverbindung wurde in Form eines farblosen jedoch ausgehend von 500 mg (1,12 mMol) Sisomicin Feststoffes in einer Ausbeute von 78Ö mg erhalten nach 5 (freie Base).[«J" +110° (c= 1, Wasser- Dimethylformdemselben Verfahren wie in Beispiel 28 beschrieben, amid,) :2).

B e i s ρ i e 1 30
Si'.e'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Geniamicinen

787 mg der Titelverbindung wurden in Form eines ren wie in Beispiel 28 beschrieben, jedoch ausgehend farblosen Feststoffes erhalten nach demselben Verfah- von 500 mg gemischten Gentamicinen (C₁Cu₁Ci etc.).

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von durch Schutzgruppen N-acylierten Aminoglykosiden, in denen

A) die Aminogruppen in 1- und 3"-Stellung nicht geschützt,

B) alle übrigen Aminogruppen jedoch durch Schutzgruppen acyliert sind und deren Struktur den

C) 6-0-(3"-Amino-3"-desoxygIykosyI)- oder 6-O-

(3"-AlkyIamino-3"-desoxygiykosyI)-2-desoxy-streptaminen, deren Desoxystreptamin-Rest gegebenenfalls in der 4-O-Stellung mit einer Aminoglykosylgruppe verknüpft ist entspricht