CH650004A5 - Verfahren zur herstellung eines selektiv geschuetzten n-acylierten aminoglycosid-antibiotikums. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verfahren zur Herstellung eines selektiv geschützten N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikums, in welchem einige Ami-no- oder Alkylaminogruppen in besonderen Stellungen des Aminoglycosidmoleküls selektiv geschützt oder blockiert wurden mit der Acylgruppe. Diese Erfindung bezieht sich soJ 650 004

mit auf neue Verfahren zum selektiven Schutz gewisser Amino- oder Alkylaminogruppen in besonderen Stellungen des Aminoglycosid-Antibiotikums. Die Erfindung findet ihre Anwendung bei der Herstellung eines selektiv geschützten N-5 acylierten aminoglycosidischen Antibiotikums, welches einen Deoxystreptaminteil enthält, der eine 3-Aminoglycosyl-gruppe oder 3-Alkylaminoglycosylgruppe gebunden an eine 6-Hydroxylgruppe des Deoxystreptaminteils im Aminoglyco-sidmolekül aufweist. Das aminoglycosidische Antibiotikum, 1C auf welches die vorliegende Erfindung anwendbar ist, kann insbesondere als ein Aminoglycosid-Antibiotikum bezeichnet werden, welches aus einem 6-0-(3"-Amino- oder 3"-Alkyl-amino-3"-deoxyglycosyl)-2-deoxystreptamin besteht, welches gegebenenfalls einen 4-0-6'-Aminoglycosyl-Substituenten i5 tragen kann, und typische Beispiele solcher Verbindungen sind die Kanamycine, die Gentamicine, Sisomicin, Netilmicin und Verdamicin. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner eine Anwendung dieser neuen Verfahren auf die Herstellung eines 1 -N-(a-Hydroxy-co-aminoalkanoyl)-aminoglycosid-An-20 tibiotikums, welches bekannt ist als nützliches semisynthetisches antibakterielles Mittel, welches wirksam ist gegen Arzneimittel resistente Bakterien.

Aminoglycosidische Antibiotika, wie z.B. Kanamycine, sind Substanzen, welche mehrere Aminofunktionen und Hy-2s droxylfunktionen mit einem verhältnismässig hohen und verschieden starken Reaktionsgrad aufweisen. Zahlreiche Arten semisynthetischer Aminoglycosid-Antibiotika, welche von den Stamm-Aminoglycosid-Antibiotika abgeleitet sind, wurden bereits hergestellt.Bei der Semisynthese dieser Derivate ist 3o es oft notwendig oder wünschenswert, sicherzustellen, dass einige Aminogruppen und/oder einige Hydroxylgruppen im Ausgangsaminoglycosid-Antibiotikum selektiv geschützt oder blockiert werden mit einer oder mehreren geeigneten Schutzgruppen.

35 Für den selektiven Schutz von Aminogruppen und/ oder Hydroxylgruppen in dem Aminoglycosid-Antibiotikum wurden verschiedene erfolgreiche Methoden entwickelt und diese stehen zur Verfügung, soweit es sich um den selektiven Schutz von Hydroxylgruppen handelt. Für den selektiven Schutz von 40 einigen besonderen, unter den zahlreichen vorhandenen Aminogruppen des Aminoglycosid-Antibiotikums sind jedoch die bisher bekannten Methoden entweder zu schwierig durchzuführen oder sie erfordern gewisse komplizierte Operationen. Dies beruht darauf, dass alle Aminogruppen im Aminoglyco-45 sid-Antibiotikum keinen grossen Unterschied in der Reaktionsfähigkeit aufweist. Ein demonstratives Beispiel wird durch die ó'-Aminograppe von Kanamycin-A geliefert, doch weist eine solche Aminogruppe oder Methylaminogruppe, welche an ein gewisses Kohlenstoffatom gebunden ist, das sei-50 nerseits an nur ein Kohlenstoffatom im Aminoglycosid-Mo-lekül gebunden ist, eine höhere Reaktionsfähigkeit auf als die Amino- oder Methylaminogruppe, welche an ein gewisses Kohlenstoffatom gebunden ist, das zwei oder mehr Kohlenstoffatome in diesem Aminoglycosid-Molekül verbindet. Aus 55 diesem Grund ist die erstgenannte Art von Amino- oder Methylaminogruppen befähigt, wesentlich bevorzugter mit einem Acylierungsmittel zu reagieren, welches eine in die Aminoschutzgruppe einzuführende Acylgruppe enthält, als die letztgenannte Art von Amino- oder Methylaminogrup-6o pen, wobei das N-geschützte Derivat, welches die erstgenannte Art von Amino- oder Methylaminogruppen preferen-tiell mit der Acylgruppe blockiert hat, in einer höheren Ausbeute erzeugt werden kann als die anderweitig N-geschützten Derivate. Vor einigen Jahren wurde gefunden, dass, wenn die es Aminogruppe und die Hydroxylgruppe in der sterischen Konfiguration des Moleküls des Aminoglycosid-Antibiotikums zu einem Paar benachbart sind, diese Amino- und Hydroxylgruppen selektiv miteinander vereint werden können

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unter Bildung eines cyclischen Carbamates durch Behandlung mit Natriumhydrid, so dass das Paar von Amino- und Hydroxylgruppen gleichzeitig im cyclischen Carbamat blok-kiert werden kann, ohne die anderen Aminogruppen, welche im gleichen Molekül vorhanden sind, zu blockieren [siehe «Journal of Antibiotics», 25, No. 12,741-742 (1972); US-Pa-tente No. 3 925 354 und No. 3 965 089].

Vor kurzem haben Nagabhushan und Mitarbeiter gefunden, dass, wenn ein Salz eines bivalenten Transitionsmetalles (M+ +), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kup-fer-(II), Nickel-(II), Kobalt-(II) und Cadmium-(II) in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einem aminoglycosidischen Antibiotikum umgesetzt wird, welches zu der Klasse der4-0-(Aminoglycosyl)-6-0-(aminoglycosyl)-2-deoxy-streptaminasen gehört, wie sie durch Kanamycine, Gentami-cine und Sisomicin vertreten wird, dieses bivalente Transi-tionsmetallkation mit einem Paar der Amino- und Hydroxylgruppen komplex gebunden wird, welche an besonderen, vici-nalen Stellen des Aminoglycosid-Moleküls vorhanden sind, wodurch der aminoglycosidische Antibiotikum-Transitions-metallkation-Komplex gebildet wird [siehe japanische veröffentlichte Patentanmeldung Sho-52-153944 und US-Patent No. 4 136 254], In diesem aminoglycosidischen Antibioti-kum-Transitionsmetallkation-Komplex ist die komplexgebundene Aminogruppe durch das bivalente Transitionsme-tallkation blockiert. Wenn dieser Komplex anschliessend mit einem Acylierungsmittel, welches eine Acylgruppe enthält, umgesetzt wird, können zur Hauptsache nur die nicht-kom-plexierten Aminogruppen im Metallkomplex, welche nicht durch das bivalente Metallkation blockiert sind, acyliert werden, so dass ein selektiver N-Schutz mit der Acylgruppe erzielt wird. Dies ist weiter unten unter Bezugnahme aufKana-mycin-A als Beispiel näher illustriert. Wenn somit ein bivalentes Transitionsmetallkation (M++), ausgewählt aus Kup-fer-(II)-, Nickel-(II)-, KobaIt-(II)- und Cadmium-(II)-Katio-nen mit Kanamycin-A umgesetzt wird, tritt eine Komplexbildung des bivalenten Metallkations (M++) zwischen der 1-Aminogruppe und der 2"-Hydroxygruppe sowie zwischen der 3"-Aminogruppe und der 4"-Hydroxygruppe des Kana-mycin-A-Moleküls ein, wie durch die Formel I unten dargestellt.

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In der obigen Komplexbildungsreaktion ist daher ersichtlich, dass mindestens 2 Mol des Transitionmetallsalzes für 1 Mol Kanamycin-A erforderlich sind. Im erhaltenen Metall-komplex sind gleichzeitig die 1-Amino- und die 3"-Amino-j gruppen blockiert. Wenn dieser Komplex der Formel I mit einem Acylierungsmittel behandelt wird, welches eine Acylgruppe aufweist, die als eine in den üblichen Synthesen von Polypeptiden bekannte Aminoschutzgruppe zur Verfügung steht, werden nur die nicht-komplex gebundenen 3-Amino-l0 und 6'-Aminogruppen zur Hauptsache acyliert, um das 3,6'-di-N-acylierte Derivat zu ergeben [siehe «Journal of American Chemical Society», 100,5253-5254 (1978)].

Die obige Tatsache hat sich als richtig erwiesen, doch wurden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung 1S weitere Untersuchungen über die Interaktion anderer, verschiedener Metallkationen mit aminoglycosidischen Antibiotika, wie Kanamycin-A und Kanamycin-B sowie mit semisynthetischen Derivaten der aminoglycosidischen Antibiotika durchgeführt. Als Resultat wurde gefunden, dass sich zwei-2o wertige Zinkkationen, obwohl sie sich wesentlich anders verhalten als die oben erwähnten zweiwertigen Nickel-, Kobalt-, Kupfer- und Cadmium-Kationen, sie letztlich befähigt sind, eine starke Komplexbildung sowohl mit der 1-Amino- oder 1-Alkylaminogruppe, wie mit der 3"-Aminogruppe (oder 25 3"-Alkylaminogruppe) einer Aminoglycosidverbindung (wie z.B. Kanamycin-A, -B oder -C) einzugehen, welche einen Deoxystreptaminteil enthält, der eine 3"-Aminoglycosyl-oder 3"-Alkylaminoglycosylgruppe an die 6-Hydroxylgruppe des Deoxystreptaminteiles gebunden enthält, und diese ge-30 nannten Aminogruppen in 1- und 3"-Stellung zu blockieren.

Gemäss Nagabhushan und Mitarbeiter, könnte erwartet werden, dass, wenn bivalente Nickel-, Kobalt-, Kupfer- oder Cadmiumkationen z.B. mit Kanamycin-B umgesetzt werden, ein Kanamycin-B-Metallsalz-Komplex der folgenden Formel 35 II entstehen würde:

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Diese Erwartung stützt sich auf die Ausführungen von Nagabhushan und Mitarbeiter im oben genannten Artikel in «Journal of American Chemical Society», gemäss welchem 65 vicinale Amino-Hydroxyl-Gruppen-Paare mit den bivalenten Transitionsmetallkationen reversible Komplexe bilden sollten, und in Anbetracht der Tatsache, dass Kanamycin-B drei Paare vicinaler Amino-Hydroxyl-Gruppen enthalten, näm-

lieh in den Stellungen 1 und 2", in den Stellungen 2' und 3' und in den Stellungen 2" und 3" des Kanamycin-Moleküls. Es wurde jedoch gefunden, dass wenn Kanamycin-B mit einem zweiwertigen Metallkation, nämlich Zinkkation umgesetzt wird, der tatsächlich gebildete Kanamycin-B-Zinksalz-Komplex freie 2'-Amino- und 3'-Hydroxylgruppen enthält, welche nicht durch das Zinkkation blockiert wurden, was im Gegensatz zur Annahme von Nagabhushan steht. Selbst wenn die Komplexbildung des Zinkkations mit der 2'-Ami-no- und 3'-Hydroxylgruppe auftritt, ist die komplexierende Kraft sehr gering, so dass im wesentlichen in der Praxis die 2'-Amino- und 3'-Hydroxylgruppen nicht blockiert sind.

Wenn daher der Kanamycin-B-Zinkkationen-Komplex anschliessend acyliert wird, z.B. durch Reaktion mit N-Ben-zyloxycarbonyloxysuccinimid, um die Benzyloxycarbonyl-gruppe als Aminoschutz-Acylgruppe einzuführen, wird das tri-3,2',6'-N-acylierte Derivat erhalten, in welchem drei Aminogruppen, nämlich die 3-, 2'- und 6'-Aminogruppe acyliert wurde, und zwar tatsächlich in einer höheren Ausbeute als die auf andere Weise N-acylierten Derivate, aber dann kann das 3,6'-di-N-acylierte Derivat nicht erhalten werden (siehe Beispiel 19 weiter unten). Diese experimentelle Tatsache lässt darauf schliessen, dass das Zinkkation ein anderes Verhalten zeigt als die oben genannten vier Transitionsmetallkationen, insbesondere, indem das Zinkkation keinen Komplex mit dem benachbarten Paar der 2'-Amino- und 3'-Hydroxyl-gruppe bildet.

Wenn als weiteres Beispiel Kanamycin-A mit Zinkkationen umgesetzt und anschliessend mit einer die Benzyloxycar-bonylgruppe abgebenden Verbindung acyliert wird (siehe Formel I oben) wird die Tatsache beobachtet, dass 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonylkanamycin-A als hauptsächliches Acylie-rungsprodukt gebildet wird, sofern das Zinkkation in einer Menge von genau 1 Mol oder etwas mehr pro Mol Kanamycin-A zur Verfügung steht. In diesem Fall ist zu beachten,

dass diese Acylierungsreaktion die Bildung des 1,3,6',3"-Te-tra-N-benzyloxycarbonylderivates von Kanamycin-A und die Bildung von nicht-acyliertem, ursprünglichem Kanamycin-A gleichzeitig einem gewissen Ausmass ergibt, jedoch die Bildung des Tri-N-benzyloxycarbonylderivates von Kanamycin-A lediglich in sehr niederer Ausbeute erfolgt, trotzdem die Aufklärung des Reaktionsmechanismus durch Nagabhushan und Mitarbeiter erwarten lässt, dass das Tri-N-benzyloxycar-bonylderivat in einer höheren Ausbeute gebildet würde als die anderen N-acylierten Derivate (siehe Beispiel 7 weiter unten).

In der Beschreibung und insbesondere in Anspruch 4 des US-Patentes No. 4 136 254 haben Nagabhushan und Mitarbeiter daraufhingewiesen, dass ein Salz eines bivalenten Transitionsmetalles, wie Kupfer-(II), Nickel-(II), Kobalt-(II). usw. in einer Gesamtmenge von mindestens 2 Mol pro Mol Kanamycin-A für die Bildung von Kanamycin-A-Transi-tionsmetallsalz-Komplex benötigt wird, wie aus Formel I oben ersichtlich ist. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen haben "jedoch ergeben, dass im Gegensatz zu den vier genannten Transitionsmetallkationen, das Zinkkation befähigt ist, die Wirkung der Blok-kierung der 1-Amino- und 3"-Aminogruppe von Kanamycin-A zu erzielen, wenn Zinkkationen in einer Gesamtmenge von mindestens 1 Mol pro Mol Kanamycin-A verwendet werden.

Gemäss dieser Untersuchung wurde gefunden, dass, wenn ein Nickelsalz in einer Menge von etwas über 1 Mol pro Mol Kanamycin-A zur Reaktion gebracht wird und anschliessend der erhaltene Kanamycin-A-Nickelsalz-Komplex mit einer Benzyloxycarbonyl abgebenden Verbindung acyliert wird, das 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonylkanamycin-A nur in sehr

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geringer Ausbeute erhalten wird, während es in einer bedeutenden Ausbeute erhalten wird, wenn der Kanamycin-A-Zinksalz-Komplex acyliert wird (siehe Beispiel 7 weiter unten). Aufgrund der obigen Tatsachen wird geschlossen, dass 5 das Zink-(II)-Kation einen Mechanismus zur Komplexbildung mit einem Aminoglycosid anwendet, welcher verschieden ist von demjenigen der Nickel-(II)-, Kobalt-(II)-, Kupfer-(II)- und Cadmium-(II)-Kationen, und dass der Aminoglyco-sid-Zinkkationen-Komplex eine Komplexierungsstabilität io aufweist, welche verschieden ist von derjenigen des Komplexes des Aminoglycosids mit Nickel-(II)-, Kobalt-(II)-, Kup-fer-(II)- oder Cadmium-(II)-Kationen. Für die Komplexbildung des Zinkkations mit dem Aminogylcosid-Antibiotikum kann das Zinkkation in Form eines Zinksalzes verwendet i5 werden, welches mit Vorteil ein billiges Zinksalz ist und kaum als Quelle von Umweltverschmutzungen in Frage kommt.

Es wurde demzufolge überraschenderweise gefunden,

dass, wenn Zinkkationen in einem inerten organischen Lö-2o sungsmittel mit einem aminoglycosidischen Antibiotikum umgesetzt werden, welches einen Deoxystreptaminteil enthält, der eine 3-Aminoglycosyl- oder 3-Alkylaminoglycosyl-gruppe gebunden an die 6-Hydroxylgruppe des Deoxystrept-aminteiles und gegebenenfalls eine Aminoglycosylgruppe ge-25 bunden an die 4-Hydroxylgruppe des Deoxystreptaminteiles aufweist, die Zinkkationen komplex mit den Amino-Hydro-xyl-Paaren an bestimmten Stellen, welche je nach der Natur des aminoglycosidischen Antibiotikums variieren können, komplex gebunden werden und diese blockieren, und dass, 30 wenn der derart gebildete aminoglycosidische Antibiotikum-Zinkkationen-Komplex mit einem Acylierungsmittel umgesetzt wird, welches eine Acylgruppe enthält, welche üblicherweise zur Einführung einer Aminoschutzgruppe bei der Synthese von Polypeptiden verwendet wird, dieses Acylierungs-35 mittel mindestens eine dieser Aminogruppen im aminoglycosidischen Antibiotikum acyliert, welche nicht mit dem Zink-kationen-Komplex gebunden und daher nicht blockiert ist, so dass die derart aeylierte Aminogruppe geschützt ist, und dass ferner, wenn das erhaltene Acylierungsprodukt (d.h. der ami-40 noglycosidische Antibiotikum-Zinkkationen-Komplex, welcher eine oder mehrere aeylierte Aminogruppen enthält) mit einem geeigneten Reagens behandelt wird, welches die Zinkkationen aus dem Acylierungsprodukt entfernt, der Zinkkomplex zersetzt wird, wobei ein selektiv geschütztes N-acy-45 liertes Derivat des aminoglycosidischen Antibiotikums erhalten wird, in welchem die ursprünglich nicht mit Zink komple-xierten Aminogruppe(n) selektiv durch die Acylgruppe(n) geschützt wurde(n).

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird daher ein Ver-50 fahren zur Herstellung eines selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikums geschaffen, welches aminoglycosidische Antibiotikum einen Deoxystreptaminteil enthält, der eine 3-Aminoglycosyl- oder 3-Alkylaminoglycosylgruppe an die 6-Hydroxylgruppe des Deoxystreptaminteiles gebunden 55 enthält, und das selektiv N-acylierte Antibiotikum einige Aminogruppen aufweist, welche selektiv durch eine Acylgruppe geschützt sind, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man

60 (a) ein Acylierungsmittel mit einer als Aminoschutzgruppe einzuführenden Acylgruppe mit einem aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationen-Komplex umsetzt, welcher durch Reaktion des aminoglycosidischen Antibiotikums mit einem Zinksalz in einem inerten organischen T .fisnngsm.it-65 tel gebildet wurde, um einen Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum, welcher die ursprünglich nicht komplexierten Aminogruppen acyliert enthält, zu bilden, und

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(b) der erhaltene Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikums mit einem Reagens umsetzt, welches die Zinkkationen aus dem Komplex entfernt, um das gewünschte selektiv N-acylierte aminoglycosidische Antibiotikum zu erzeugen.

Das Verfahren gemäss der vorhegenden Erfindung ist nützlich zur Herstellung eines solchen selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikums durch Acylierung einiger anderer Aminogruppen als die 1- und 3"-Aminogruppen der Ausgangsverbindung und ein solches selektiv N-geschütztes Antibiotikum ist nützlich bei der chemischen Synthese von 1-N-aminoacylierten aminoglycosidischen Antibiotika, wie z.B. den Kanamycinen, einschliesslich Amikacin [Journal of Antibiotics, 25,695 bis 708 (1972)], welches sich in den letzten Jahren als wirkungsvolles antibakterielles Arzneimittel erwiesen hat. Diese 1-N-aminoacylierten aminoglycosidischen Antibiotika schliessen jene ein, welche von einem grossen Bereich von Aminoglycosiden abgeleitet sind, wie Kanamy-cin-A, Kanamycin-B, Kanamycin-C, Gentamicine, Sisomicin und anderen, sowie verschiedenen Deoxyderivaten davon, welche jedoch alle das gemeinsame Merkmal haben, dass ihre 1-Aminogruppe mit einer a-Hydroxy-co-aminoalkanoyl-grappe acyliert ist [siehe US-Patente No. 3 781 268, No. 3 939 143, No. 3 940 382 und No. 4 001 208]. Durch diese 1 -N-Aminoacylierung wird den aminoglycosidischen Antibiotika eine antibakterielle Wirksamkeit gegen solche resistente Bakterien verliehen, gegen welche die stammaminogly-cosidischen Antibiotika nicht aktiv sind, und ferner wird den aminoglycosidischen Antibiotika eine verbesserte antibakterielle Wirksamkeit gegen eine grössere Vielfalt von Bakterienstämmen im Vergleich zu den stammaminoglycosidischen Antibiotika verliehen.

Im folgenden wird die Ausführung des Verfahrens nach der Erfindung näher beschrieben.

Das aminoglycosidische Antibiotikum, welches mit dem Zinkkation zur Reaktion gebracht werden soll, um den Zinkkomplex zu bilden (welcher auch als Zinkkomplexsalz bezeichnet werden kann) umfasst solche aminoglycosidische Antibiotika, welche einen Deoxystreptaminteil enthalten, deren 6-Hydroxygruppe mit einer 3-Aminoglycosyl- oder

3-Alkylaminoglycosylgruppe substituiert ist und deren

4-Hydroxygruppe gegebenenfalls mit einer Aminoglycosyl-gruppe substituiert sein kann. Insbesondere können die erfin-dungsgemäss für die Bildung des Zinkkationen-Komplexes verwendbaren aminoglycosidischen Antibiotika als solche definiert werden, welche 6-0-(3"-Amino- oder 3"-Alkyl-amino-3" -deoxyglycosyl)-2-deoxystreptamin enthalten, welches gegebenenfalls eine 4-0-(Aminoglycosyl)-gruppe enthalten kann. Ausserdem kann das aminoglycosidische Antibiotikum ein 1-N-Alkylaminoglycosid sein, wie z.B. Netilmicin. Beispiele der aminoglycosidischen Antibiotika der für die vorliegende Erfindung geeigneten Klasse sind z.B. die Antibiotika der Kanamycin-A-Gruppe, einschliesslich Kanamy-cin-A selbst, 6'-N-Alkylkanamycin-A, insbesondere 6'-N-Methylkanamycin-A, 3'-Deoxykanamycin-A, 6'-N-Methyl-3'-deoxykanamycin-A, 4'-Deoxykanamycin-A, 6'-N-Methyl-4'-deoxykanamycin-A, 3',4'-Dideoxykanamycin-A [siehe japanische Patentanmeldung No. 11402/79] und 6"-Deoxy-oder 4",6"- Dideoxykanamycin-A [siehe japanische Patentanmeldung No. 54733/79]; Antibiotika der Kanamycin-B-Gruppe, einschliesslich Kanamycin-B selbst, 3'-Deoxykan-amycin-B (d.h. Tobramycin), 4'-Deoxykanamycin-B, 3',4' -Dideoxykanamycin-B (d.h. Dibekacin), 3',4'-Dideoxy-3'-enokanamycin-B, 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin-B; Antibiotika der Kanamycin-C-Gruppe, einschliesslich Kana-

mycin-C selbst, 3'-Deoxykanamycin-C, 3',4'-Dideoxykana-mycin-C; Gentamicine-A,-B und -C; Verdamicin; Sisomicin und Netilmicin, d.h. 1-N-Äthylsisomicin, sowie die anderen bekannten Aminoglycoside. Selbstverständlich ist das Ver-5 fahren gemäss der vorliegenden Erfindung nicht nur auf neue aminoglycosidische Antibiotika, welche jetzt noch nicht bekannt sind, jedoch in der Zukunft entdeckt werden, anwendbar, sondern auch auf neue semisynthetische aminoglycosidische Antibiotika-Derivates welche in der Zukunft durch che-io mische Transformation bekannter aminoglycosidischer Antibiotika entwickelt werden.

Typische Beispiele aminoglycosidischer Antibiotika, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, umfassen 15 Kanamycin-A, Kanamycin-B, Kanamycin-C und Deoxyderi-vate dieser Kanamycine, sowie 6'-N-Alkylderivate davon, welche alle durch die folgende allgemeine Formel III dargestellt werden können:

20

25

30

35

40

[III]

45

in welcher R1 die Hydroxylgruppe oder Aminogruppe, R2 und R3 jedes Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe und R4 so die Hydroxylgruppe oder Aminogruppe oder eine Alkylami-nogruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methylaminogruppe bedeuten.

Um den aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkatio-55 nen-Komplex durch Umsetzung des aminoglycosidischen Antibiotikums mit Zinkkationen gemäss der vorliegenden Erfindung zu bilden, kann ein jeweiliges aminoglycosidisches Antibiotikum entweder in Form der freien Base oder in Form eines Säureadditionssalzes davon in einem geeigneten organi-60 sehen Lösungsmittel oder einem wässerigen organischen Lösungsmittel aufgelöst oder suspendiert werden, und zu der erhaltenen Lösung oder Suspension wird ein geeignetes Zinksalz in einer Menge von mindestens 1 Mol pro Mol des verwendeten aminoglycosidischen Antibiotikums zugesetzt. Je-65 des übliche organische Lösungsmittel kann zu diesem Zweck verwendet werden, sofern der nach Zusatz des Zinksalzes gebildete Zinkkomplex mindestens teilweise darin löslich ist. Die Verwendung eines grossen Volumens eines polaren orga

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nischen Lösungsmittels und insbesondere ein grösseres Volumen an Wasser sollte jedoch mit Vorteil vermieden werden, weil die Gegenwart eines polaren organischen Lösungsmittels und Wasser die Stabilität des erhaltenen aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationen-Komplexes leicht herabsetzen kann, so dass die anschliessende Acylierungsreaktion zur Einführung der Aminoschutzgruppe unbefriedigende Resultate ergeben kann.

Es ist daher wünschenswert, ein organisches Lösungsmittel von hoher Lösungskraft, wie z.B. Dimethylsulfoxid, als Lösungsmittel zu verwenden, in welchem der Zinkkomplex gebildet werden soll, doch ist es durchaus annehmbar, wässeriges Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, wässeriges Dimethylformamid, ein Gemisch von Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, wässeriges Tetrahydro-furan und sogar ein niederes Alkanol, wie Methanol, Äthanol und wässriges Methanol zu verwenden.

Die Zinkkationen können in Form eines Zinksalzes zum Reaktionsgemisch zugeführt werden, in welchem der Zinkkomplex gebildet wird. Jedes Zinksalz, welches durch Reaktion von Zinkkationen mit einer gewöhnlichen anorganischen oder organischen Säure gebildet wird, kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Im allgemeinen ist es jedoch wünschenswert, ein Zinksalz einer schwachen Säure, wie z.B. Zinkacetat, zu verwenden, weil es üblich ist, dass unter den aminogruppenhaltigen Metallkomplexen ein Komplex einer nicht-quaternären Ammoniumgruppe mit einem Metallsalz stabiler ist als ein Komplex eines Amins vom Ammoniumtypus mit einem Metallsalz, und das die Verwendung des Zinksalzes einer schwachen Säure üblicherweise nicht zur Bildung des verhältnismässig unstabilen Metallkomplexes, welcher das Amin vom Ammoniumtypus enthält, führt. Wenn das Zinksalz einer starken Säure, z.B. Zinkchlo-rid, verwendet wird, kann der Zinkkomplex, wie erwünscht, ebenfalls gebildet werden, doch wird bevorzugt, ein schwach alkalisches Salz, wie Natriumacetat, zusätzlich zum Zinksalz zuzusetzen, um das Medium zu neutralisieren. Ebenso ist es wünschenswert, eine gewisse Menge an Natriumacetat oder Natriumhydroxid als Neutralisierungsmittel zuzusetzen,

wenn das Ausgangsaminoglycosid-Antibiotikum in Form seines Säureadditionssalzes mit einer starken Säure, wie Salzsäure, verwendet wird. In diesem Fall sollte jedoch darauf geachtet werden, die Verwendung unnötigerweise überschüssiger Mengen des Neutralisierungsmittels zu verhindern, da sonst Zinkhydroxid ausgefällt würde, was die Bildung des Komplexes stören würde. Beispielsweise, wenn ein aminogly-cosidisches Antibiotikum-Tetrahydrochlorid zur Komplexbildung verwendet wird, sollte bevorzugt 4 Mol Natriumhydroxid zugesetzt werden, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren.

Solange die gesamte molare Menge an verwendetem Zinksalz mindestens gleich der molaren Menge an aminoglycosidi- 55 schem Antibiotikum ist, kann die Komplexbildungsreaktion stattfinden. Es ist jedoch vorzuziehen, das Zinksalz in einer Menge von wesentlich mehr als 1 Mol pro Mol des aminoglycosidischen Antibiotikums zu verwenden, so dass das Gleichgewicht der Komplexbildungsreaktion zu Gunsten der Komplexbildung verschoben wird. Günstige Ausbeuten an Zinkkomplex können erhalten werden, wenn das Zinksalz in einer Menge von etwa 2,3 bis 6 Mol pro Mol des Aminoglycosides verwendet wird, doch wird in der Praxis am meisten bevorzugt, das Zinksalz in einer Menge von 4 bis 5 Mol pro Mol des Aminoglycosides zu verwenden. Die zur Vollendung der Komplexbildungsreaktion nach Zusatz des Zinksalzes erforderliche Zeit kann je nach der Natur des verwendeten organischen Lösungsmittels variieren und kann im Bereich von «sofort» (bei Verwendung eines wässerigen organischen Lösungsmittels) bis zu 20 Stunden liegen. Die Komplexbildungsreaktion kann üblicherweise bei Zimmertemperatur 5 verlaufen, doch können auch höhere oder tiefere Temperaturen verwendet werden.

In dieser Weise wird eine Lösung oder Suspension, welche den Zinkkomplex des aminoglycosidischen Antibiotikums enthält, hergestellt, zu welcher dann ein Acylierungsmittel, io welches eine als Aminoschutzgruppe einzuführende Acylgruppe enthält, zugesetzt werden.

Das erfindungsgemäss verwendete Acylierungsmittel kann ein übliches Aminoschutzmittel sein, und wird verwendet, um sicherzustellen, dass die freien, nichtkomplex gebun-15 denen Aminogruppen im erhaltenen Aminoglycosid-Antibiotikum-Kationenkomplex durch die Acylgruppe des Acylie-rungsmittels acyliert und dadurch blockiert wird. Die Äcyl-gruppe kann eine Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine Alkanoxycarbonylgruppe, eine Aralkyloxycarbonylgruppe, 20 eine Aryloxycarbonylgruppe, eine Alkylsulfonylgruppe, eine Aralkylsulfonylgruppe oder eine Arylsulfonylgruppe sein, welche alle konventionelle Aminoschutzgruppen darstellen.

Die zu diesem Zweck verfügbaren Acylierungsmittel können entweder eine Carbonsäure der folgenden allgemeinen 25 Formel IVa sein:

R5COOH

[IVa]

in welcher R5 Wasserstoff, eine Alkylgruppe, insbesondere 3o eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-gruppe, insbesondere die Phenylgruppe, oder eine Aralkyl-gruppe, insbesondere die Benzylgruppe, sein, und diese Gruppen können gelegentlich weiter substituiert sein, oder ein Säu-rehalogenid, ein Säureanhydrid oder ein aktiver Ester dieser 35 Carbonsäure (IVa); oder ein Chlorformiat der allgemeinen Formel IVb:

R50-C0-C1 [IVb]

40 oder ein p-Nitrophenylcarbonat der allgemeinen Formel IVc: R50-C0-0-C6IVp-N02 [IVc]

oder ein aktiver N-Hydroxysuccinimidester der Formel IVd:

50

RS0— CO— o — N

[IVd]

60

oder ein Azidoformiat der Formel IVe: R50-C0-N3

[IVe]

65 in welchen Formeln R5 dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, oder eine Sulfonsäure der allgemeinen Formel IVf:

R6SO,H

[IVf]

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in welcher R6 Wasserstoff, eine Alkylgruppe, insbesondere tionsgemisch, in welchem der Aminoglycosid-Antibiotikumeine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- Zinkkationen-Komplex acyliert wurde, gelöst befinden oder grappe, insbesondere die Phenylgruppe, oder eine Aralkyl- er kann in ein frisches Volumen eines organischen Lösungsgruppe, insbesondere eine Phenylalkylgruppe, wie die Benzyl- mittels übergeführt sein.

grappe, darstellt und diese Gruppen können gelegentlich wei- 5 Die zur Durchführung dieser ersten Methode geeigneten ter substituiert sein, oder ein Säurehalogenid, ein Säurean- Zinkfällungsmittel umfassen z.B. Schwefelwasserstoff, Alka-

hydrid oder ein aktiver Ester dieser Sulfonsäure. Es ist somit limetallsulfide, wie Natriumsulfid, Ammoniumsulfid, Erdal-

ersichtlich, dass die Acylierungsreaktion zum Schutz der kalimetallsulfide, wie Calciumsulfid, und Alkalimetallcarbo-

Aminograppen gemäss der vorliegenden Erfindung eine Acy- nate, wie Natriumcarbonat, oder Ammoniumhydroxid. In ei-

lierung im weitesten Sinne ist, einschliesslich z.B. die Formy- 10 nigen Fällen kann die Entfernung der Zinkkationen aus dem lierung, Acetylierang, Propionylierung, Trifluoracetylierang, N-acylierten Zinkkomplex durch blossen Zusatz von Wasser

Benzyloxycarbonylierang, p-Methoxybenzyloxycarbonylie- erfolgen. Gemäss dieser ersten Methode erzeugt der Zusatz rang, t-Butoxycarbonylierung, Phenoxycarbonylierung, To- des Zinkfällungsmittels zur Lösung des N-acylierten Zink-

sylierung, Mesylierang und äquivalenten Umsetzungen. komplexes eine verhältnismässig rasche Ausfüllung einer aus

Besondere Beispiele leicht zugänglicher Acylierungsmittel iS den Zinkkationen gebildeten unlöslichen Verbindung, und umfassen Acetoxyformyl, p-Nitrophenylformiat, Essigsäure- dieser Niederschlag kann durch Filtration entfernt werden,

anhydrid, Acetylchlorid, Propionsäureanhydrid, p-Nitro- Das N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum-Derivat, wel-

phenolester der Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäureester, ches sodann in der Filtratlösung verbleibt, kann durch Kon-N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid (ein representativer akti- zentrieren der Lösung oder durch Extraktion aus der Lösung ver Ester) N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid, Benzyloxy- 2o gewonnen werden und, falls notwendig, anschliessend weiter carbonylchlorid, p-Methoxybenzyloxycarbonyloxy-p-nitro- gereinigt werden. Zur Reinigung ist z.B. die Säulenchroma-

phenyl, t-Butoxycarbonylazid, Phenoxycarbonylchlorid, To- tographie mit Silicagel empfehlenswert.

sylchlorid, Mesylchlorid und andere. Eine zweite Methode besteht darin, (a) das Acylierangsre-

Das Acylierungsmittel kann entweder als solches oder als aktionsgemisch durch Verdampfen des Lösungsmittels zu

Lösung in einem Lösungsmittel, wie z.B. Tetrahydrofuran 25 konzentrieren oder zur Trockene zu bringen, oder (b) das Re-und Dimethylsulfoxid oder in einem Gemisch dieser Lösungs- aktionsgemisch mit einem flüssigen Verdünnungsmittel zu mittel, zur Lösung oder Suspension, welche den Aminoglyco- verdünnen, um eine ölige und feste Ausscheidung, Konzen-

sid-Antibiotikum-Zinkkomplex enthält, zugesetzt werden. trat oder Rückstand, zu erhalten, aus welchen sodann das ge-

Die molare Menge an zugesetztem Acylierungsmittel ist übli- wünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum-Derivat cherweise gleich oder etwas grösser als die Anzahl der nicht- 30 auf bekannte Weise gewonnen werden kann. An Stelle des komplex gebundenen Aminogruppen, mit welchen das Acy- oben genannten Acylierangsreaktionsgemisches kann auch lierangsreagens umgesetzt werden soll. In einigen Fällen kann eine frische Lösung des N-acylierten Zinkkomplexes, welcher jedoch die molare Menge des zugesetzten Acylierangsmittels in ein frisches Volumen des organischen Lösungsmittels über-

bis zu einer molaren Menge von etwa dreimal höher als die geführt wurde, zur Durchführung der beiden oben genannten Anzahl der nicht-komplex gebundenen Aminogruppen betra- 35 Varianten verwendet werden. Ein geeignetes flüssiges Ver-

gen. Das Acylierungsmittel kann entweder in einem Mal oder dünnungsmittel zur Verwendung in dieser zweiten Methode in Portionen langsam über eine Dauer von 2 bis 3 Stunden zu- ist Wasser oder eine organische Flüssigkeit, in welcher der N-

gesetzt werden, doch wird es üblicherweise im Verlauf von 30 aeylierte Zinkkomplex als Ganzes oder der N-acylierte Ami-

Minuten bis 1 Stunde zugesetzt. Die Acylierang kann bei ei- noglycosid-Antibiotikum-Derivatteil dieses N-acylierten ner Temperatur zwischen - 20 °C und 100 °C durchgeführt 40 Zinkkomplexes nicht oder nur wenig löslich ist.

werden, doch erfolgt sie üblicherweise bei einer Temperatur Gemäss dieser genannten zweiten Methode wird zunächst im Bereich von 0 °C bis Zimmertemperatur. In einigen Fällen das Acylierungsreaktionsgemisch, welches den N-acylierten kann die Reaktionstemperatur im Zeitpunkt der Acylierungs- Zinkkomplex enthält oder die frische Lösung des N-acylier-mittelzugabe tief gehalten und dann allmählich mit fortschrei- ten Zinkkomplexes, welcher in ein organisches Lösungsmittel tender Acylierang erhöht werden. Üblicherweise kann die 45 übergeführt wurde, konzentriert oder zur Trockene ver-Acylierungsreaktion in situ im organischen Lösungsmittel, in dampft, um den öligen oder festen Niederschlag beziehungsweichem der Aminoglycosid-Antibiotium-Zinkkationen- weise Rückstand zu ergeben. Wenn ein schwer verdampfbares komplex gebildet wurde, durchgeführt werden. Diese Acylie- organisches Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid usw. als rang des Zinkkomplexes erzeugt den N-acylierten Zinkkom- Reaktionsmedium für die N-Acylierang des Zinkkomplexes plex, d.h. den Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv so verwendet wurde, ist es möglich, dass das Acylierangsreak-N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum-Derivat. tionsgemisch, welches den N-acylierten Zinkkomplex enthält,

Gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die mit einer verdünnenden organischen Flüssigkeit, wie Äthyl-Stufe der Acylierang des Aminoglycosid-Antibiotikum-Zink- äther, vermischt wird, so dass das schwer verdampfbare orga-kationen-Komplexes gefolgt von der Stufe der Entfernung nische Lösungsmittelmedium im Verdünnungsmittel gelöst der Zinkkationen aus dem N-acylierten Zinkkomplex, d.h. ss oder damit verdünnt wird, wodurch ein Feststoff oder ein Öl, der Zerstörung des Zinkkomplexes, um das selektiv ge- welcher bzw. welches den N-acylierten Zinkkomplex enthält, schützte N-acylierte Derivat des Aminoglycosid-Antibioti- daraus abgeschieden wird. Auf diese Weise wird eine ölige kums zu ergeben, welches frei von Zinkkationen ist. oder feste Abscheidung oder ein Rückstand erhalten, welche Zur Entfernung der Zinkkationen aus dem N-acylierten üblicherweise ein Gemisch darstellen, zusammengesetzt aus Zinkkomplex ist es notwendig, den N-acylierten Zinkkom- &a (1) dem N-acylierten Zinkkomplex, d.h. dem Komplex, der plex mit einem geeigneten Reagens zu behandeln, welches die Zinkkationen mit dem N-acylierten Aminoglycosid-Antibio-Zinkkationen aus dem N-acylierten Zinkkomplex entfernt. tikum-Derivat, (2) dem N-acylierten Aminoglycosid-Antibio-Zu diesem Zweck gibt es verschiedene Methoden. Die erste tikum-Derivat, welches durch Zerstörung der komplexen As-Methode besteht darin, ein Zink fällendes Mittel, welches fä- sociation in einer Portion des N-acylierten Zinkkomplexes in-hig ist, die Zinkkationen in eine Wasser unlösliche Zinkver- 65 folge der annähernden Abwesenheit des organischen Lö-bindung, wie z.B. Zinksulfid, Zinkhydroxid, oder Zinkcarbo- sungsmittelmediums freigesetzt wurde, (3) einer gewissen nat zu verwandeln, mit dem N-acylierten Zinkkomplex um- Menge des anorganischen Zinksalzes, welches durch die Zerzusetzen. Dieser kann sich noch immer im Acylierangs-Reak- Störung der komplexen Association in der Portion des N-acy-

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lierten Zinkkomplexes gebildet wurde, (4) einer gewissen Menge des Zinksalzes, welches zu Beginn als Überschuss zugesetzt wurde und bei der Komplexbildungsreaktion unum-gesetzt verblieb, und gegebenenfalls (5) einer restlichen Menge des organischen Lösungsmittels, welches in den vorangehenden Stufen verwendet wurde.

Die genannte ölige oder feste Abscheidung oder der Rückstand [des oben genannten Gemisches] können anschliessend nach einem der folgenden Verfahren (a), (b) und (c) behandelt werden.

(a) Die ölige oder feste Abscheidung oder der Rückstand (des genannten Gemisches) wird mit Wasser oder einem solchen polaren organischen Lösungsmittel, einem wässerigen polaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von polaren organischen Lösungsmitteln, welches eine polare organische Flüssigkeit bzw. Flüssigkeiten ist, welche die Wirkung aufweist, die komplexe Association der Zinkkationen indem in der genannten Abscheidung oder dem Rückstand vorhandenen N-acylierten Zinkkomplex zu zerstören, und in welchem Mengen des freigesetzten und des ursprünglich vorhandenen nicht-umgesetzten Zinksalzes löslich sind, jedoch das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum unlöslich ist. Auf diese Weise wird der N-acylierte Zinkkomplex zerstört, um die Zinkkationen daraus freizusetzen, um den Zinkkationen zu ermöglichen, in Wasser oder dem (wässerigen) organischen Lösungsmittel aufgelöst und als Zinksalz extrahiert zu werden, und das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum als unlöslichen Rückstand zu hinterlassen, welcher gewonnen werden kann. Dieser Rückstand kann gegebenenfalls durch Wiederauflösen in einem organischen Lösungsmittel gereinigt werden. Das für dieses Verfahren (a) geeignete polare organische Lösungsmittel ist z.B. Methanol, Äthanol, flüssiger Ammoniak, Äthylamin und Triäthylamin. Diese polaren organischen Lösungsmittel und Wasser dienen demzufolge als das Kationen entfernende Reagens.

(b) Die ölige oder feste Abscheidung oder der Rückstand (des oben genannten Gemisches) werden mit einem andersartigen polaren organischen Lösungsmittel, entweder wasserfrei oder wasserhaltig, gemischt, welches die Wirkung hat, die komplexe Association der Zinkkationen im N-acylierten Zinkkomplex, der in der Abscheidung oder im Rückstand enthalten ist, zu zerstören und in welchem das freigesetzte Zinksalz nicht löslich ist, aber das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum löslich ist, wodurch der N-acy-lierte Zinkkomplex zerstört wird, um das N-acylierte Aminoglycosid" Antibiotikum daraus freizusetzen, und dem letzteren ermöglicht wird, im polaren organischen Lösungsmittel gelöst und damit extrahiert zu werden und dadurch vom Zinksalz abgetrennt zu werden, welches zwar freigesetzt wird, aber ungelöst im polaren organischen Lösungsmittel verbleibt. Auf diese Weise wird die Lösung des gewünschten N-acylier-ten Aminoglycosid-Antibiotikums im polaren organischen Lösungsmittel gewonnen und kann, falls erwünscht, gereinigt werden, z.B. durch Chromatographie, gefolgt von der Konzentration der gereinigten Lösung zur Isolierung des gewünschten N-acylierten Produktes.

(c) Die ölige oder feste Abscheidung oder der Rückstand (aus dem oben genannten Gemisch), wie sie in der oben genannten zweiten Methode erhalten werden, können auch wieder aufgelöst werden als Ganzes in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, welches einen Anteil Wasser enthält, wenn die ganze Abscheidung oder der ganze Rückstand löslich oder im wesentlichen löslich ist in Wasser. Die derart erhaltene Lösung kann dann einer Chromatographie unterzogen werden, während welcher das freigesetzte Zinksalz und das freigesetzte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum getrennt aus der Lösung gewonnen werden können. Es wurde gefunden, dass für diese chromatographische Behandlung verschiedene Arten von Kationenaustauscherharzen, Anio-nenaustauscherharzen, Chelataustauscherharz und Wasser unlösliche hohe Polymere, welche funktionelle Gruppen ent-5 halten, die sich mit einem Metall binden können, wie Chitin oder Chitosan, geeignet sind. Die geeigneten Qualitäten an Kationenaustauscherharzen zu diesem Zweck umfassen jene, welche Carboxylgruppen (-COOH) als Austauscherfunktionen enthalten, und jene, welche Sulfonylgruppen (-S03H) als 10 Austauscherfunktionen enthalten. Wenn ein Kationenaustauscherharz mit carboxylischen Funktionen für die oben genannte chromatographische Behandlung verwendet wird, wird die ölige oder feste Abscheidung oder der Rückstand (die oben genannte Mischung) in einem geeigneten wässerigen 15 organischen Lösungsmittel, z.B. einem Gemisch von Wasser und Methanol, welches 10 bis 90 Volumen-Prozent Wasser enthält oder einem Gemisch von Wasser und Dioxan, welches 10 bis 90 Volumen-Prozent Wasser enthält, gelöst, und die erhaltene Lösung wird auf eine Säule aus dem Kationenaus-20 tauscherharz geleitet. Die Säule wird sodann mit einer weiteren Portion des oben genannten wässerigen organischen Lösungsmittels gut gewaschen und anschliessend entwickelt unter Verwendung einer Portion des oben genannten wässerigen organischen Lösungsmittels, welches ferner eine gewisse 25 Menge Säure oder Base enthält, als Eluierungsmittel. Als Säure kann dazu eine schwache organische Säure, wie z.B. Essigsäure, oder eine verdünnte anorganische Säure, wie z.B. verdünnte Salzsäure, verwendet werden. Als Base eignet sich Ammoniumhydroxid für die meisten Fälle. Die Konzentra-30 tion der Säure oder Base im Entwicklungslösungsmittel (im Eluierungsmittel) kann mit Vorteil 0,01 % bis 5%, bezogen auf das Gewicht des entwickelnden Lösungsmittels betragen. Das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum kann von den komplexbildenden Kationen während der Ent-35 wicklung getrennt werden, weil das verwendete Kationenaustauscherharz verschiedene Adsorptionsaffinitäten gegenüber dem gewünschten N-acylierten Aminoglycosid und den Zinkkationen ausübt, so dass die Kraft des ersteren zur Association mit dem Harz verschieden ist von der Kraft der letzteren 40 zur Association mit dem Harz. Auf diese Weise kann das Eluat in Fraktionen gesammelt werden, so dass Fraktionen, welche das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum frei vom Zinksalz enthalten, erzielt werden, welche sodann konzentriert werden können, um das gewünschte N-45 aeylierte Aminoglycosid-Antibiotikum zu ergeben.

Wenn ein Kationenaustauscherharz, welches Sulfonyl-funktionen enthält, für die oben genannte Chromatographiebehandlung verwendet wird, kann die Trennung und Gewinnung des gewünschten N-acylierten Aminoglycosid-Anti-50 biotikums auf dieselbe Weise wie oben beschrieben durchgeführt werden, weil genau derselbe Mechanismus bei der Trennung des N-acylierten Aminoglycosides von den komplexbildenden Zinkkationen zur Einwirkung gelangt. Andererseits, wenn ein schwach oder stark basisches Anionenaustauscher-55 harz für die Chromatographie eingesetzt wird, wird der Anteil an N-acyliertem Aminoglycosid-Antibiotikum im N-acylier-ten Zinkkomplex, welcher ein oder mehrere nicht-acylierte Aminogruppen enthält, üblicherweise nicht durch das schwach oder stark basische Anionenaustauscherharz adsor-6o biert infolge der ionogenen Abstossung zwischen den beiden, so dass die Entwicklung der Anionenaustauscherharze mit einem geeigneten wässerigen organischen Lösungsmittel erlaubt, das N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum auf der Säule zu eluieren, während die Zinkkationen in der Säule ver-fi5 bleiben.

Wenn die Chromatographie unter Verwendung eines Chelat-Austauscherharzes durchgeführt wird, welches befähigt ist, sich mit Zinkkationen infolge der metallchelierenden

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Eigenschaft des Harzes zu verbinden, wird eine Lösung der oben genannten öligen oder festen Abscheidung oder des Rückstandes (das oben genannte Gemisch) in einem wässerigen organischen Lösungsmittel auf eine Säule aus Chelat-Austauscherharz gegeben, welche sodann mit einem geeigneten Entwicklungslösungsmittel entwickelt wird, um das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum bevorzugt aus der Säule zu eluieren, während die Zinkkationen gebunden im Chelat-Austauscherharz bleiben. Das mit Wasser nichtmischbare Hochpolymer, welches Funktionen enthält, welche befähigt sind, sich mit einem Metall zu vereinen, z.B. Chitin und Chitosan, kann auf dieselbe Weise wie die Chelat-Austauscherharze verwendet werden.

(d) Ausserdem kann eine dritte Methode angewandt werden, in welcher das oben genannte Acylierungsreaktionsgemisch, in welchem die Acylierang des Zinkkomplexes zum Schutz der Aminogruppen durchgeführt wurde, direkt auf eine Säule aus einem Kationen- oder Anionen-Austauscherharz, einem Chelat-Austauscherharz oder einem in Wasser unlöslichen Polymer, welches die metallbindenden Funktionen enthält, geführt werden, so dass der N-acylierte Zinkkomplex durch das Harz oder das Polymer adsorbiert wird. Die Säule kann sodann, falls notwendig, mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel gewaschen und anschliessend mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel, welches gegebenenfalls eine Säure oder eine Base, wie im obigen Verfahren (c) erwähnt, enthält, entwickelt werden, worauf ähnliche Operationen wie im Verfahren (c) durchgeführt werden, wodurch die Entfernung der Zinkkationen aus dem N-acylierten Zinkkomplex wie auch die Gewinnung des gewünschten N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikums gleichzeitig erzielt werden.

(e) Es kann auch eine weitere vierte Methode zur Gewinnung des gewünschten N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikums angewandt werden, bei welcher das oben genannte Acylierungsreaktionsgemisch, welches den N-acylierten Zinkkomplex enthält, sofort mit Wasser behandelt wird durch Vermischen mit Wasser, sofern das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum selbst in Wasser unlöslich oder praktisch unlöslich ist. 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-dibekacin kann als Beispiel eines N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikums genannt werden, welches in Wasser praktisch unlöslich ist. In diesem Fall, wenn das Acylierungsreaktionsgemisch, welches den N-acylierten Zinkkomplex enthält, der ein praktisch wasserunlösliches N-acyüertes Aminoglycosid-Antibiotikum umfasst, unmittelbar mit Wasser gemischt wird, wird die Zinkkomplex bildende Association im N-acylierten Zinkkomplex gelöst und erlaubt dem wasserunlöslichen N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum als fester Stoff aufzufallen, während das aus dem freigesetzten Zinkkationen gebildete Zinksalz in Lösung bleibt, wodurch das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum als praktisch reines Produkt getrennt vom Zinksalz gewonnen werden kann.

Wie oben bereits erwähnt, wird die N-Acylierung, d.h. die Aminoschutzreaktion, mit dem Zinkkomplex des Aminoglycosid" Antibiotikums durchgeführt und der Komplex der Zinkkationen mit dem mono-, di-, tri- oder poly-N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum, welches auf diese Weise gebildet wurde, ist ein Komplex, in welchem die verwendeten Zinkkationen komplex mit der Struktur des N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum associert sind. Wenn daher das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum in Wasser unlöslich oder nur schwach löslich ist, bewirkt die einfache Operation des Vermischens von Wasser mit dem Acylierungsreaktionsgemisch, welches den N-acylierten Zinkkomplex enthält, die Ausfällung des wasserunlöslichen N-acylier-ten Aminoglycosid-Antibiotikuns in Form eines Feststoffes,

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während die durch Auflösung in Wasser freigesetzten Zinkkationen entfernt werden (wie im Fall der vorstehend unter (e) beschriebenen vierten Methode). Der derart erhaltene wasserunlösliche Niederschlag kann sofort als Ausgangsmaterial für s folgende Reaktionen für die semisynthetische Herstellung eines gewünschten Endproduktes verwendet werden. Im allgemeinen jedoch ist das N-acylierte Aminogylcosid-Antibiotikum selbst oft in Wasser ganz oder teilweise löslich, und das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum kann io daher nur in einer wesentlich geringeren Ausbeute gewonnen werden, wenn die einfache Behandlung des Vermischens mit Wasser unmittelbar mit dem Acylierungsreaktionsgemisch durchgeführt wird.

Aus diesem Grunde können bessere Resultate erhalten 15 werden, wenn eines der oben genannten Verfahren (b) oder (c) angewandt werden, bei welchen der N-acylierte Zinkkomplex zuerst aus dem Acylierungsreaktionsgemisch abgetrennt und der derart abgetrennte N-acylierte Zinkkomplex sodann in Wasser oder einem wässerigen organischen Lösungsmittel ge-20 löst und die erhaltene Lösung sodann weiter verarbeitet wird zur Entfernung der Zinkkationen. Eine der einfachen Methoden zur Entfernung der Zinkkationen, welche im allgemeinen auf der Hand hegt, ist eine solche, in welcher Schwefelwasserstoff oder ein Alkalisulfid als Fällungsmittel mit den Zinkka-25 tionen umgesetzt wird, um die letzteren als Zinksulfid auszufallen (wie als eine der Ausführangsformen der ersten Methode im obigen Paragraph (a) beschrieben) Zinksulfid fällt jedoch oft als kolloidaler Niederschlag aus, der schwer abfiltriert werden kann und ausserdem weisen Schwefelwasser-30 stoff und Alkalisulfide einen unangenehmen Geruch auf und sind daher nicht geeignet zur Verwendung in der grosstechnischen Ausführung des Verfahrens. Es wurden daher ausgedehnte Forschungsarbeiten ausgeführt, um eine praktische Methode zur Entfernung der Zinkkationen aus dem Zink-35 komplex ohne Verwendung eines Sulfides zu entwickeln, und es ist nun gelungen, die wirksamen und einfachen Methoden der Zinkkationen-Entfernung unter Verwendung der oben genannten Austauscherharze oder anderer polymerer Materialien, wie in den Verfahren (c) und (d) oben beschrieben zu 40 entwickeln. Diese Verfahren (c) und (d) sind wirtschaftlich sehr vorteilhaft und wertvoll, da sie leicht durchzuführen sind, einen hohen Wirkungsgrad bezüglich der Trennung der Zinkkationen aufweisen und eine hohe Ausbeute an dem gewünschten N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum 45 ergeben.

Die oben beschriebenen Methoden und Ausführangsformen zur Behandlung des N-acylierten Zinkkomplexes mit dem Zinkkationen entfernenden Reagens können somit wie so folgt zusammengefasst werden:

(1) Der Komplex aus Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum wird einmal aus dem Acylierungsreaktionsgemisch abgetrennt, bevor er mit einem Reagens zur Entfernung der Zinkkationen aus dem Komplex ss umgesetzt wird.

(2) Der Komplex aus Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum wird aus dem Acylierungsreaktionsgemisch durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, durch Verdampfen des organischen Lö-

60 sungsmittelmediums aus dem Acylierungsreaktionsgemisch oder durch Verdünnen des Acylierangsreaktionsgemisches mit einem verdünnenden organischen Lösungsmittel abgetrennt, bevor es mit einem Reagens zur Entfernung der Zinkkationen umgesetzt wird.

65 (3) Der einmal abgetrennte Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum wird mit Wasser oder einem polaren organischen Lösungsmittel, welches entweder wasserfrei oder wasserhaltig ist, ver-

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mischt, welches als Zinkkationen-Entfernungsmittel dient. Dieses polare organische Lösungsmittel ist entweder ein solches, in welchem das Zinksalz löslich ist, jedoch das N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum unlöslich ist, oder ein solches, in welchem das Zinksalz unlöslich ist, jedoch das N-acy-lierte Aminoglycosid-Antibiotikum löslich ist.

(4) Der einmal abgetrennte Komplex der Zinkkationen mit dem N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum wird wiederum als Ganzes in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst, welches einen Anteil an Wasser enthält, und die erhaltene Lösung wird einer chromatographischen Behandlung unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, eines Anionenaustauscherharzes, eines Chelat-Austauscherharzes oder eines in Wasser unlöslichen Polymers,welches funktionelle Gruppen enthält, die sich mit einem Metall verbinden können, unterworfen, welche als Zinkkationen entfernende Mittel dienen.

(5) Das Acylierungs-Reaktionsgemisch wird direkt über eine Säule aus einem Kationenaustauscherharz, einem Anio-nenaustauscherharz, einem Chelat-Austauscherharz oder einem in Wasser unlöslichen Polymer, welches Funktionen enthält, die sich mit Metall vereinen können, zur Absorption des Komplexes der Zinkkationen mit dem N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum geleitet, und die Säule wird sodann mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel, welches gegebenenfalls eine gewisse Menge an Säure oder Base enthält, entwickelt, und das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, worauf die Fraktionen, welche das gewünschte selektiv N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum, jedoch keine Zinkkationen enthalten, gewonnen werden.

(6) Wenn das gewünschte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum in Wasser unlöslich oder praktisch unlöslich ist, wird das Acylierungsreaktionsgemisch unmittelbar mit Wasser vermischt, so dass das gewünschte Antibiotikum getrennt von dem in Wasser gelöst verbleibenden Zinksalz ausgefällt wird.

(7) Das Acylierungsreaktionsgemisch wird unmittelbar mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Erdalkalimetallsulfid behandelt, welches die Zinkkationen als Zinksulfid ausfällen oder mit Ammoniumhydroxid, welches die Zinkkationen als Zinkhydroxid ausfällt.

In dem Zinkkomplex, welcher im Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung auftritt, bilden die Zinkkationen hauptsächlich einen Komplex mit den 1-Amino- und 3"-Ami-nogruppen des Aminglycosid-Antibiotikums, und daher ergibt die N-Acylierung des Aminoglycosid-Antibiotikum-Zinkkationen-Komplexes, gefolgt von der Entfernung der Zinkkationen aus diesem Komplex üblicherweise das N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum, in welchem die anderen Amino- und/oder Alkylaminogruppen als die 1-Amino- und 3"-Aminogruppen durch die Acylgruppe geschützt wird. Wenn das derart aus dem Verfahren gemäss der Erfindung erhaltene N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum anschliessend mit einer a-Hydroxy-ra-aminofettsäure in bekannter Weise, wie z.B. in den US-Patenten No. 3 781 268 und No. 3 939 143 beschrieben, 1-N-acyliert wird und anschliessend die restlichen Aminoschutzgruppen aus dem erhaltenen 1-N-acylierten Produkt entfernt werden, wird ein semisynthetisches 1-N-acyliertes Aminoglycosid-Antibiotikum erhalten, welches als nützliches antibakterielles Mittel bekannt ist.

Die Synthese des i-N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikums wird im folgenden unter Bezugnahme auf Kanamy-cin-A als Ausgangsmaterial näher erläutert. Wenn Kanamy-cin-A als Ausgangsmaterial im Verfahren nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind die 1-Amino- und 3"-Aminogruppen des Kanamycin-A zunächst blockiert durch Komplexbildung mit Zinkkationen im Anschluss an die Bildung seines Zinkkomplexes. Wenn demnach der Kana-

mycin- A-Zinkkationen-Komplex mit einem geeigneten Acylierungsmittel gemäss der vorliegenden Erfindung acyliert oder mit einer anderen Art eines Aminoblockierungsmittels umgesetzt wird, können die nicht-komplex gebundenen 5 3-Amino- und 6'-Aminogruppen des Kanamycin-A-Mole-küls durch die Acylgruppe des verwendeten Acylierungsmit-tels oder durch die andere Art von aminoblockierenden Gruppen geschützt werden. Nach anschliessender Entfernung der komplexgebundenen Zinkkationen aus dem N-acylierten 10 Kanamycin-A-Zinkkationen-Komplex wird das erhaltene N-acylierte Kanamycin-A mit einem Acylierungsmittel umgesetzt, welches eine in die 1-Aminogruppe des Kanamycin-A-Moleküls einzuführende Acylgruppe aufweist.

Diese Acylgruppe reagiert nur mit den unblockierten 15 1-Amino- und 3"-Aminogruppen von Kanamycin-A. In diesem Zeitpunkt ist üblicherweise die 1-Aminogruppe etwas reaktionsfähiger als die 3"-Aminogruppe, so dass das gewünschte 1-N-acylierte Kanamycin-A in etwas höherer Ausbeute erhalten werden kann als das 3"-N-acylierte Kanamy-20 cin-A. Anschliessend ergibt die Entfernung der N-Schutz-gruppen aus dem derart erhaltenen 1-N-acylierten Kanamycin-A-Derivat das 1-N-acylierte Kanamycin-A als das gewünschte Endprodukt. Wenn daher das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist ersichtlich, 25 dass das gewünschte 1-N-Acyl-Kanamycin-A in einer höheren Ausbeute erhalten werden kann, als wenn ungeschütztes Kanamycin-A oder 6'-N-geschütztes Kanamycin-A unmittelbar mit einem Acylierungsmittel zwecks 1-N-Acylierung von Kanamycin-A umgesetzt wird. Wenn ein Kanamycin ohne je-30 den N-Schutz mit einem 1-N-Acylierungsmittel umgesetzt wird, wird festgestellt, dass sich gemischt-N-acylierte Produkte bilden, welche einen sehr kleinen Anteil (üblicherweise 1 % bis einige Prozent) des gewünschten 1-N-acylierten Produktes enthalten.

35 Falls das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung auf ein Kanamycin der oben genannten Formel III angewandt wird, werden einige oder alle der anderen Aminogruppen als die 1- und 3"-Aminogruppen dieses verwendeten Ka-namycins geschützt, um ein N-acyliertes Kanamycin zu erge-40 ben, welches durch die folgende allgemeine Formel V dargestellt werden kann:

45

50

55

60

65

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in welcher

R'a eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe (-NH2), eine Gruppe -NHCOR5 oder eine Gruppe -NHCO.OR5 oder eine Gruppe -NHS02R6,

R4a eine Hydroxylgruppe, eine Gruppe -NHCOR5, eine Gruppe r8

-N^

xCOR5

eine Gruppe-NHCO.OR5, eine Gruppe

-N;

R8

^COOR5 eine Gruppe -NHS02R6 oder eine Gruppe

-n:

r/J

\

Rs

SO,R6

12

Acylgruppe acyliert werden soll, z.B. mit der (S)-4-Benzyl-oxycarbonylamino-2-hydroxybutyrylgruppe, kann die Verbindung der Formel V in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie wässerigem Tetrahydrofuran, mit einer ent-5 sprechend substituierten Buttersäure oder einem äquivalenten reaktionsfähigen Antibiotikum davon, wie einem aktiven Ester, z.B. dem N-Hydroxysuccinimidester, dem N-Hydroxy-phthalimidester oder dem p-Nitrophenolester umgesetzt werden, wobei das entsprechende 1-N-Acylierungsprodukt gebil-io det wird. Anschliessend kann die Entfernung der Benzyloxy-carbonylgruppe und der Schutzgruppe (R7) in der Formel V aus dem 1-N-Acylierungsprodukt durch übliche Methoden zur Entfernung der N-Schutzgruppe, z.B. entweder durch Hydrolyse mit Säure oder Base oder durch Reduktion mit 15 einem reduzierenden Metall oder durch katalytische Hydro-genolyse mit Wasserstoff oder durch Radikalreduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak durchgeführt werden, um ein semisynthetisches Kanamycin zu ergeben, welches die (S)-4-Amino-2-hydroxybutyrylgruppe an der 1-Aminogruppe 20 des ICanamycins gebunden enthält, welches wirksam ist gegen die resistenten Bakterien und durch die folgende allgemeine Formel VI dargestellt werden kann:

R2 und R3 jedes dasselbe wie in der allgemeinen Formel

III,

R7 eine Gruppe -COR5, eine Gruppe -CO.OR5 oder eine Gruppe-S02R6,

R5 und R6 dasselbe wie in der Formel IVa bis IVf, und

R8 eine Alkylgruppe, insbesondere mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen.

Falls somit das Verfahren auf ein Kanamycin angewendet wird, wird im allgemeinen ein N-geschütztes Kanamycin der Formel V erhalten, in welchem alle Aminogruppen ausser der Amino- und/oder Alkylaminogruppen in Stellung 1 und 3" des Kanamycin-Moleküls blockiert sind. Wenn allerdings die als Aminoblockierungsgruppe einzuführende Acylgruppe eine verhältnismässig grosse sterische Grösse aufweist, beispielsweise bei der t-Butoxycarbonylgruppe, oder wenn die molare Menge des verwendeten Acylierungsmittels kleiner ist als die stöchiometrisch zur Acylierang aller nicht-komplex gebundener Aminogruppen des Kanamycin-Moleküls erforderliche stöchiometrische Menge, trotzdem die Acylgruppe des verwendeten Acylierungsmittels eine normale Grösse aufweist, oder wenn die Acylierungsreaktion in einem Zwischenstadium unterbrochen wird, wird ein N-geschütztes Kanamycin erhalten, in welchem die Anzahl der acylierten Aminogruppen im Kanamycin-Molekül geringer ist als im oben genannten Fall, und in besonderen Fällen wird ein derartiges beschränkt N-acyliertes Kanamycin erhalten, in welchem exklusiv die 6'-Amino- oder 6'-Alkylaminogruppe acyliert ist, weil diese 6'-Amino- oder 6'-Alkylaminogruppe reaktionsfähiger ist als die anderen Aminogruppen in dem Kanamycin-Molekül.

Das N-acylierte Kanamycin der allgemeinen Formel V ist ein wichtiges Zwischenprodukt, welches nützlich ist in der semisynthetischen Herstellung verschiedener Arten von Kana-mycinen. Die Verbindung der Formel V weist einen erhöhten Wert als Zwischenprodukt für chemische Synthesen auf, z.B. insbesondere, wenn es in ein Verfahren zur Herstellung semisynthetischer 1-N-acylierter Aminoglycosid-Antibiotika eingesetzt wird, welche wirksam sind gegen die Kanamycin resistente Bakterien, durch Acylieren der 1-Aminogruppe der Verbindung der Formel V mit einer a-Hydroxyl-ca-aminofett-säure und anschliessende Entfernung der Schutzgruppen aus den blockierten Amino- und/oder Alkylaminogruppen des erhaltenen 1-N-Acylierungsproduktes.

Wenn z.B. das Zwischenprodukt der Formel V mit einer

NHCO0H(CH2)2NH2 1 0H

40

[VI]

in welcher R1, R2, R3 und R4 dasselbe wie in Formel III bedeuten. Im obigen Verfahren kann im allgemeinen ein N-ge-45 schütztes Antibiotikum einer a-Hydroxyl-co-aminofettsäure der Formel VII:

HOOCCH(CH2)nNH, I

[VII]

50

OH

55

60

in welcher n 1,2 oder 3 bedeutet, anstelle der (S)-4-Benzyloxy-carbonylamino-2-hydroxybuttersäure verwendet werden, um eine 1 -N-((S)-a-Hydroxy-ra-aminoalkanoyl)-Kanamycin-De-rivat zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung eines selektiv geschützten N-acylierten Derivates eines Aminoglycosid-Antibiotikums, welches einen 6-0-(3"-Amino- oder 3"-Alkylamino-3"-deoxyglycosyl)-2-deoxystreptaminteil enthält, der gegebenenfalls eine 4-0-Aminoglycosylgruppe aufweist, in welchem Derivat alle Aminogruppen (einschliesslich der 3"-Aminogruppe) mit Ausnahme der 1-Aminogruppe des Aminoglycosidmoleküls blockiert oder geschützt sind durch gleiche oder verschiedene Acylgruppen.

Gemäss dem Verfahren nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung (im folgenden gelegentlich «Zinkkomplex bildendes Verfahren genannt) ist es möglich, ein solches selektives aber partiell geschütztes N-acyliertes Derivat des

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Aminoglycosid-Antibiotikums zu erzeugen, in welchem alle Aminogruppen ausser den beiden 1-Amino- und 3"-Amino-(oder 3"-Alkylamino)-Gruppen des Aminoglycosid-Mole-küls durch eine Acylgruppe geschützt sind, und daher die 1-Amino- und 3"-Amino- (oder 3"-Alkylamino)-Gruppen ungeschützt verbleiben. Selbst wenn dieses partiell geschützte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum-Derivat mit einer a-Hydroxy-co-aminofettsäure oder deren reaktionsfähigem Äquivalent zwecks Durchführung der 1-N-Acylierung, wie oben erwähnt, umgesetzt wird, werden gemischte Acylie-rungsprodukte erhalten, welche (1) das 1-N-acylierte Produkt, in welchem nur die 1-Aminogruppe des Aminoglycosid-Moleküls mit der a-Hydroxy-co-aminofettsäure acyliert wurde, (2) das 3"-N-acylierte Produkt, in welchem nur die 3"-Amino- oder (3"-Alkylamino)-Gruppe acyliert wurde, (3) das Produkt, in welchem sowohl die 1-Amino- wie die 3"-Amino- (oder 3"-Alkylamino)-Gruppen acyliert wurden, und (4) das nicht-umgesetzte Material, in welchem weder die 1- noch die 3"-Amino- (oder 3"-Alkylamino)-Gruppen acyliert wurden, umfasst. Um das letztlich gewünschte 1-N-Acy-lierungsprodukt aus den obigen gemischten Acylierungspro-dukten zu erhalten ist es daher immer notwendig, eine zusätzliche Stufe durchzuführen, in welcher das 1-N-Acylierungsprodukt mittels Chromatographie oder jeder anderen Isoliermethode aus dem Gemisch isoliert wird. Da die 1-Aminogruppe glücklicherweise stärker reaktionsfähig ist als die 3"-Amino- (oder 3"-Alkylamino)-Gruppe, beträgt die tatsächliche Ausbeute an gewünschtem 1-N-Acylierungsprodukt üblicherweise etwa 40 bis 60%; und übersteigt ein theoretisches Maximum von 25%, welches sich berechnen lässt in der Annahme, dass die Reaktionsfähigkeit von 1- und 3"-Amino- (oder 3"-Alkylamino)-Gruppen einander vollständig gleich sind. Selbst wenn die Reaktionsbedingungen für die 1-N-Acylierung optimal gewählt werden, ist es trotz allem unvermeidbar, dass die unerwünschten N-acylierten Produkte als Nebenprodukte gebildet werden und es ist immer notwendig, eine zusätzliche Stufe zur Entfernung der unerwünschten N-acylierten Nebenprodukte durchzuführen, indem die gemischten acylierten Produkte sorgfältig einer Säulenchromatographie unterworfen werden.

Um diesen Nachteil auszuschalten ist es offensichtlich erforderlich, ein derart selektiv geschütztes N-acyliertes Aminoglycosid-Antibiotikum zu erzeugen, in welchem alle anderen Aminogruppen als die 1-Aminogruppe geschützt wurden. Um diesem Erfordernis nachzukommen wurden weitere Forschungsarbeiten durchgeführt, im Versuch, ein Verfahren zu entwickeln, welches fähig ist, selektiv die 3"-Amino- (oder 3"-Alkylamino)-Gruppe des selektiv aber partiell geschützten N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikum-Derivates, welches freie 1- und 3 "-Aminogruppen enthält, wie es aus dem oben beschriebenen «Zinkkomplex bildenden Verfahren» erhalten wird, zu schützen, während die 1-Aminogruppe un-blockiert verbleibt.

Als Resultat wurde nun gefunden, dass, wenn das partiell geschützte N-acylierte Aminoglycosid-Antibiotikum, wie es aus dem «Zinkkomplex bildenden Verfahren» erhalten wird, mit einem Acylierungsmittel, ausgewählt aus Ameisensäureestern, Dihalogen- oder Trihalogenfettsäureestern und N-Formylimidazol, die 3"-Amino- oder 3"-Alkylaminogruppe bevorzugt zu Blockierungszwecken acyliert werden kann,

ohne die 1-Aminogruppe zu acylieren. Dieses selektive 3"-N-Schutzverfahren kann mit dem oben beschriebenen «Zinkkomplex bildenden Verfahren» kombiniert werden, so dass auf einfache und wirksame Weise ein derartiges selektiv geschütztes N-acyliertes Aminoglycosid-Antibiotikum erhalten wird, welche einen 6-0-(3"-Amino- oder 3"-Alkylamino-3"-deoxyglycosyl)-2-deoxystreptaminteil enthält, in welchem

Derivat alle Aminogruppen mit Ausnahme der 1-Amino-gruppe des Aminoglycosid-Moleküls selektiv mit gleichen oder verschiedenen Acylgruppen geschützt wurden. Durch die Kombination des «Zinkkomplex bildenden Verfahrens» 5 mit dem selektiven 3"-N-Schutzverfahren wird ein Vorteil erzielt, indem das letztlich gewünschte 1-N-ungeschützte, aber anderweitig N-voll geschützte Aminoglycosid-Antibiotikum aus dem Stamm-Aminoglycosid-Antibiotikum-Material in einer Ausbeute von 70% oder mehr erhalten werden kann. 10 Wenn dieses 1-N-ungeschützte, aber anderweitig N-voll geschützte Derivat für die 1-N-Acylierung des Aminoglycosid-Antibiotikums verwendet wird, wird ein weiterer Vorteil vermittelt, indem die unerwünschten N-acylierten Produkte praktisch nicht entstehen, so dass die Gewinnung und Reini-15 gung des gewünschten 1-N-Acylierungsproduktes stark erleichtert wird.

Als wertvolle Anwendung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Verfahren mit hoher Ausbeute für die Herstellung des 1-N-acylierten Aminoglyco-20 sid-Antibiotikums zu erzielen, welches ein bekanntes semisynthetisches antibakterielles Mittel darstellt. So umfasst die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung eines l-N-(a-Hydroxy-eo-aminoalkanoyl)-aminoglycosid-An-tibiotikums, ausgehend aus dem Stamm-Aminoglycosid-An-25 tibiotikum.

Insbesondere wird ein verbessertes Verfahren geliefert zur Herstellung eines l-N-(a-Hydroxy-a>-aminoalkanoyl)-Aminoglycosid-Antibiotikums, welches einen 6-0-(3"-Amino-oder 3"-Alkylamino-3"-deoxyglycosyl)-2-deoxystreptamin-30 teil enthält, der gegebenenfalls eine 4-O-Aminoglycosyl-gruppe aufweist, welches Verfahren die folgenden aufeinanderfolgenden Stufen umfasst:

(a) Die Umsetzung von Zinkkationen mit dem entsprechenden Aminoglycosid-Antibiotikum in einem inerten orga-

35 nischen Lösungsmittel, um den Komplex der Zinkkationen mit dem Aminoglycosid-Antibiotikum zu erzeugen,

(b) die Umsetzung eines Acylierungsmittels, welches eine als Aminoschutzgruppe einzuführende Acylgruppe aufweist, mit dem Aminoglycosid-Antibiotikum-Zinkkationen-Kom-

40 plex aus Stufe (a) in situ in dem inerten organischen Lösungsmittel, um einen Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikums zu bilden, welches die ursprünglich nicht-komplex gebundenen Aminogruppen acyliert enthält,

45 (c) die Umsetzung des selektiv N-acylierten Aminoglyco-sid-Antibiotikum-Zinkkationen-Komplexes aus der obigen Stufe (b) mit einem Reagens, welches die Zinkkationen aus dem N-acylierten Zinkkomplex entfernt, um ein partiell und selektiv geschütztes N-acyliertes Aminoglycosid-Antibioti-50 kum zu erzeugen, welches frei von Zinkkationen ist, und in welchem die 1-Amino- und die 3"-Amino- oder die 3"-Alkyl-aminogruppe ungeschützt sind, aber alle anderen Aminogruppen im Aminoglycosid-Molekül durch die Alkylgruppe geschützt sind,

55 (d) die Umsetzung des partiell und selektiv N-acylierten Antibiotikums aus der obigen Stufe (c) mit einem Fettsäureester der Formel VIII:

RaC-

i II O

-Rb

[VIH]

in welcher Ra Wasserstoff oder eine Dihalogenalkyl- oder Tri-halogenalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Rb 65 eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aral-kyloxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, insbesondere die Benzyloxygruppe, oder eine Aryloxygruppe, insbesondere die Phenoxygruppe, darstellt, oder mit N-For-

650 004 14

mylimidazol als Acylierungsmittel in einem inerten organi- Amino-2-hydroxybuttersäure, entweder in ihrer freien Form sehen Lösungsmittel, um selektiv die 3"-Amino- oder 3"- oder in Form eines reaktionsfähigen Äquivalentes, wie eines

Alkylaminogruppe zu acylieren und dadurch das 1 -N-unge- aktiven Esters, z.B. des Dicyclohexylcarbodiimidesters, des schützte und anderweitig N-voll acylgeschützte Derivat des gemischten Säureanhydrides oder des Säureazides in einem

Aminoglycosid-Antibiotikums zu ergeben, in welchem alle 5 inerten organischen Lösungsmittel erfolgen, wie z.B. Dioxan,

Aminogruppen mit Ausnahme der 1-Aminogruppe mit Acyl- Dimethoxyäthan, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder gruppen geschützt sind, Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser. Isoserin und L-4-

(e) die Umsetzung des 1-N-ungeschützten und anderwei- Amino-2-hydroxybuttersäure können ihre Aminogruppen tig N-voll geschützten Derivates aus der vorgehenden Stufe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert enthalten. Geeignete (d) mit einer a-Hydroxy-ro-aminofettsäure der Formel EX: 10 Aminoschutzgruppen für diesen Zweck können dieselben oder andere sein als jene, welche im 1-N-imgeschützten aber HOOC-C H(CH2)h [IX] anderweitig N-voll geschützten Aminoglycosid-Antibioti-

I kum, welches 1-N-acyliert werden soll, verwendet wurden.

OH Die t-Butoxycarbonylgruppe ist eine bevorzugte Amino-

in welcher m 1 oder 2 ist, oder einem äquivalenten reaktions- 15 schutzgruppe, weil sie leicht entfernbar ist durch Behandlung fähigen Derivat davon, wobei die Aminogruppe entweder un- mit einer verdünnten Säure, wie wässeriger Trifluoressig-

geschützt oder geschützt ist, um die 1 -Aminogruppe des 1 -N- säure, wässeriger Essigsäure oder verdünnter Salzsäure. Die ungeschützten Antibiotikums zu acylieren, und Benzyloxycarbonylgruppe, welche durch übliche katalytische

(f) die Entfernung der restlichen Aminschutzgruppen aus Hydrogenolyse über einem Palladium- oder Platinoxidkata-dem 1-N-Acylierungsprodukt aus der vorstehenden Stufe (e) 20 lysator entfernt wird, wie auch die Phthaloylgruppe, welche nach einer üblichen Methode zur Entfernung der Schutz- leicht durch Hydrolyse mit Hydrazin entfernt wird, sind sehr gruppe. bequem als Aminoschutzgruppen zu dem genannten Zweck.

Im folgenden wird nun die Durchführung dieses Verfah- Die Acylierungsreaktion in der 1-N-Acylierungsstufe (e)

rens näher beschrieben. des Verfahrens kann bevorzugt in einem wässerigen organi-

Die Aminoglycosid-Antibiotika, welche als Ausgangsma- 25 sehen Lösungsmittel unter Verwendung eines aktiven Esters terialien in der ersten Stufe (a) des vorliegenden Verfahrens der a-Hydroxy-oa-aminofettsäure der Formel IX durchge-

verwendbar sind, sind dieselben, wie jene, die oben im Zu- führt werden. Der geeignete aktive Ester kann der N-Hydr-

sammenhang mit dem Verfahren gemäss dem ersten Aspekt oxysuccinimidester von Isoserin oder L-4-Benzyloxycar-

der Erfindung beschrieben wurden, und die Reaktion der bonylamino-2-hydroxybuttersäure sein, und dieser aktive komplexbildenden Zinkkationen mit dem Aminoglycosid- 30 Ester kann in einer Menge von 1 bis 2 Mol, vorzugsweise 1 bis

Antibiotikum wird ebenfalls auf dieselbe Weise wie oben be- 1,5 Mol, pro Mol des 1-N- zu aeylierenden Aminoglycosides schrieben durchgeführt. Die Acylierang des derart in der er- sein. Das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel zur sten Stufe (a) erhaltenen Aminoglycosid-Antibiotikum-Zink- Verwendung im Reaktionsmedium kann bevorzugt Dioxan,

kationen-Komplexes kann in der zweiten Stufe (b) des vorlie- Dimethyloxyäthan, Dimethylformamid, oder Tetrahydrofu-

genden Verfahrens gleich durchgeführt werden wie oben im 35 ran sein.

Verfahren gemäss dem ersten Aspekt der Erfindung beschrieben wurde. Die Entfernung der Zinkkationen aus dem derart Anschliessend an die obige Stufe (e) wird die Entfernung erhaltenen selektiv N-acylierten Aminoglycosid-Antibioti- 4er ^-Schutzgruppe in Stufe (f) durchgeführt, um alle rest-kum-Zinkkationen-Komplex kann in der dritten Stufe (c) des liehen Aminoschutzgruppen aus dem 1 -N-Acylierungspro-vorliegenden Verfahrens auf verschiedene Arten, wie oben be- 40 dukt, welches in der Stufe (e) erhalten wurde, zu entfernen, schrieben, erfolgen, wodurch ein partiell und selektiv ge- Die Entfernung der restlichen Aminoschutzgruppen kann schütztes N-acyliertes Aminoglycosid-Antibiotikum erhalten nach üblichen Methoden zur Entfernung von N-Schutzgrup-wird, welches frei ist von Zinkkationen und in welchem die PeQ erfolgen. Eine solche restliche Aminoschutzgruppe, wel-1-Amino- und die 3"-Amino- oder die 3"-Alkylaminograp- che vom Aralkyloxycarbonyl-Typus ist, wie z.B. die Benzyl-pen ungeschützt sind, aber alle anderen Aminogruppen im 45 oxyearbonylgrappe, wird leicht entfernt durch übliche kataly-Aminoglycosid-Molekül blockiert sind durch die Acylgruppe tische Hydrogenolyse. Wenn alle restlichen Ammoschutz-des in der Stufe (b) des vorliegenden Verfahrens verwendeten gruppen aus dem 1-N-Acylierungsprodukt der Stufe (e) des Acylierungsmittels. Dieses partiell und selektiv geschützte N- vorliegenden Verfahrens entfernt sind, wird das gewünschte aeylierte Aminoglycosid-Antibiotikum wird sodann mit ei- l-N-(2-Hydroxy-3-aminopropionyl)- oder l-N-(2-Hydroxy-nem Fettsäureester der Formel VIII oder mit N-Formylimi- so 4-aminobutyryl)-aminoglycosid-Antibiotikum in hoher Aus-dazol in der Stufe (d) des vorliegenden Verfahrens umgesetzt, beute erhalten.

um die selektive 3"-N-Acylierang des partiell N-geschützten Beispiele der l-N-(a-Hydroxy-ö)-aminoalkanoyl)-amino-

Aminoglycosid-Antibiotikums ohne Acylierang seiner glycosid-Antibiotika, welche nach dem Verfahren gemäss die-

1-Aminogruppe zu erhalten. sem Aspekt der Erfindung hergestellt werden, sind z.B. die

In der fünften Stufe (e) des vorliegenden Verfahrens wird 55 folgenden:

das 1-N-ungeschützte und anderweitig N-vollständig ge- [I] l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Kanamycin-A.

schützte Aminoglycosid-Antibiotikum aus der vorstehenden P] 1 -N-(L-4-Ammo-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxy-Kana-

Stufe (d) mit einer a-Hydroxy-co-aminofettsäure der Formel mycin-A.

IX, insbesondere mit 3-Amino-2-hydroxypropionsäure (als P] l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3 ,4 dideoxy-Ka-

DL-Isoserin, D-Isoserin oder L-Isoserin) oder mit L-4-Ami- «o namycin-A.

no-2-hydroxybuttersäure, umgesetzt, um die 1-Aminogruppe [4] l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Tobramycm.

des Aminoglycosid-Antibiotikums mit der 3-Amino-2-hydr- [5] l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Dibekacin.

oxypropionyl- oder der 4-Amino-2-hydroxybutyrylgrappe zu [6] l-N-(3-Amino-2-hydroxypropionyl)-Dibekacin. acylieren. Diese 1 -N-Acylierung kann im allgemeinen wie im britischen Patent No. 1 426 908 oder im US-Patent No. 65 Beispiel 1

4 001 208 beschrieben nach bekannten Methoden zur Syn- Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl Kanamycin-A

these von Amiden durch Umsetzung des geschützten Amino- 0) 2,0 g (4,13 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden glycosid-Antibiotikums mit einem Isoserin oder mit L-4- einem Gemisch von Dimethylsulfoxid (50 ml) und Tetra-

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hydrofuran (20 ml) suspendiert und 4 g (18,1 mMol) Zink-(II)-Acetatdihydrat zu der Suspension zugesetzt, worauf das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur gerührt wurde, bis eine homogene Lösung entstanden war. Es benötigte etwa 4 bis 5 Stunden zur Bildung des Zinkkomplexes von Kanamy-cin-A und zu dessen Auflösung. Die erhaltene Lösung wurde sodann auf 0 °C gekühlt, worauf ihr langsam im Laufe von etwa 1 Stunde eine gekühlte Lösung (bei 0 °C) von 2,37 g (9,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid

Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

c,hccho0c00-n 6 5 2

gelöst in einem Gemisch (40 ml) von Tetrahydrofuran-Di-methylsulfoxid (1:1 Volumenverhältnis) zugesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde bei Zimmertemperatur während 4 Stunden stehen gelassen, während welcher Zeit der Zinkkomplex von Kanamycin-A einer Benzyloxycarbonylierung (der Acylierang gemäss dem ersten Aspekt der Erfindung) unterzogen wurde.

Eine Probe, welche der derart erhaltenen Reaktionslösung entnommen wurde, wurde der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unterzogen, unter Verwendung der unteren flüssigen Phase eines Gemisches von Chloroform-Methanol-28% wässerigem Ammoniumhydroxid (Volumenverhältnis 1:1:1) als Entwicklungslösungsmittel, was einen Hauptfleck des gewünschten Produktes bei Rf = 0,23 sowie zwei oder drei kleine Flecken, welche Nebenprodukten zugeschrieben wurden, an höheren Punkten ergab.

(2) Die oben erhaltene Reaktionslösung wurde in 500 ml Äthyläther gegossen, und das ausgeschiedene Öl wurde mehrmals mit weiteren Portionen Äthyläther gewaschen, wobei 8,8 g eines dicken sirupartigen Materials erhalten wurden.

(3) Die Entfernung der Zinkkationen aus dem sirupartigen Material, welches im wesentlichen den Zinkkomplex enthielt, wurde nach einem der folgenden verschiedenen Verfahren durchgeführt:

(A) Verfahren unter Verwendung eines schwachsauren Kationenaustauscherharzes, welches Carboxylgrappen (-COOH) als funktionelle Gruppen enthält und im Handel unter der Marke «Amberlite» CG 50 -Harz (H+-Form) von Rohm & Haas Co., USA, erhältlich ist:

60 ml «Amberlite» CG 50 -Harz (H+-Form) wurden zunächst tüchtig mit einem Gemisch von Wasser-Dioxan (2:1) gesättigt und anschliessend in eine Säule eingefüllt. Eine Lösung von 1 g des sirupartigen Materials gelöst in 20 ml Was-ser-Dioxan (1:1) wurde sodann durch die Säule geleitet, welche sodann mit Wasser-Dioxan (2:1), welches 1 % Essigsäure enthielt, entwickelt wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt. Das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A, welches auf Ninhydrin positiv reagierte,

wurde zuerst aus der Säule eluiert, und das Zinkacetat, welches eine Farbreaktion mit Diphenylcarbazid ergab, wurde anschliessend eluiert. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äthyläther gewaschen und ergab 340 mg (81%) 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-

Kanamycin-A als farblosen Feststoff, [a]^ + 76° (c= 1,

35

Elementaranalyse:

berechnet für: C34H48N40I5-2CH3C02H-H20: 5 C 51,23, H 6,56, N 6,29%;

gefunden: C 51,02, H 6,71, N 5,22%.

(B) Verfahren unter Verwendung eines schwach sauren (?) Kationenaustauscherharzes, welches Carboxylatgruppen als io funktionelle Gruppen enthält (im Handel erhältlich unter der Marke «Amerlite» CG 50-Harz (NH4+-Form) von Rohm & Haas Co.): _

1 g des im obigen Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials wurde in 20 ml Wasser-Dioxan (1:1) gelöst und die i5 Lösung durch eine Säule aus 60 ml «Amberlite» CG 50-Harz (NH4+-Form) geleitet und der linear wachsenden Eluierung mit Wasser-Dioxan (1:1), welches 0 bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthielt, unterworfen. Es wurden keine Zinkkationen eluiert, jedoch das gewünschte Produkt, nämlich 3,6'-Di-20 N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A, wurde eluiert. Die Fraktionen des Eluates, welche das gewünschte Benzyloxy-carbonylierungsprodukt enthielten, wurden gesammelt und zur Trockene eingedampft, wobei 328 mg (89%) des gewünschten Produktes als farbloser Feststoff erhalten wurde.

25 Wp = + 86° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2). Elementaranalyse:

berechnet für: C34H48N4015-l/2 H2C03:

30 C 52,87, H 6,30, N 7,15%

gefunden: C 52,50, H 6,59, N 7,00%.

(C) Verfahren unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, welches stark saure funktionelle Gruppen, -S03H enthält (im Handel erhältlich als «Dowex» 50W X 2-Harz von Dow Chemical Co.):

30 ml «Dowex» 50W X 2-Harz (H+-Form), welche in Wasser-Dioxan (2:1) eingelegt worden waren, wurden in eine Säule eingefüllt, durch welche sodann eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in 20 ml Wasser-Dioxan (2:1) geführt wurde. Die Säule wurde mit Wasser-Dioxan (2:1) gewaschen, bis der Ausfluss aus der Säule eine neutrale Natur ergab, und anschliessend erfolgte die linear zunehmende Eluierung mit Wasser-Dioxan (2:1), welches 0 bis 1 N Ammoniumhydroxid enthielt. Die Eluat-fraktionen, welche das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycar-bonyl-Kanamycin-A enthielten, wurden vereint und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 311 mg (84%) eines weissen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit dem in Beispiel 1 (3) (B) erhaltenen Produkt.

(D) Anderes Verfahren unter Verwendung von «Dowex» 50WX2;

Eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in 20 ml Wasser-Methanol (3:1) wurde über eine Säule aus 30 ml «Dowex» 50WX 2 (H+-Form), welche zuvor mit Wasser-Methanol (3:1) benetzt worden war, geleitet. Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (3:1) gut gewa-60 sehen und anschliessend einer gradienten Eluierung mit Was-ser-Methanol (3:1), welches 0 bis 6 N Salzsäure enthielt, unterzogen. Die aktiven Fraktionen, welche das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A enthielten, wurden gesammelt und mit einem stark basischen Anionenaus-65 tauscherharz, «Dowex« 1X2 -Harz (OH -Form) in genügender Menge vermischt, um das Gemisch leicht sauer zu gestalten.

Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene konzentriert, wobei 285 mg (72%) des gewünschten Produk-

50

55

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tes in Form des Dihydrochlorides erhalten wurden, [«jg + 19° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

(E) Verfahren unter Verwendung eines Anionenaustau-scherharzes, welches stark basische funktionelle quaternäre Ammoniumgruppen enthält (im Handel erhältlieh als «Dowex» 1X 2-Harz von Dow Chemical Co.):

Eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Dioxan (1:1) wurde über eine Säule aus 30 ml «Dowex» 1X 2-Harz (OH-Form), welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1) imprägniert worden war, geleitet und die Säule anschliessend mit Wasser-Dioxan (1:1) bei verhältnismässig hoher Geschwindigkeit entwickelt. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden gesammelt und zur Trockene eingedampft, wobei 305 mg (84%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit demjenigen aus Beispiel 1 (3) (B).

(F) Verfahren unter Verwendung eines Anionenaustau-scherharzes, welches schwach basische funktionelle Gruppen enthält (im Handel erhältlich als «Dowex» WGR-Harz, ein Produkt der Dow Chemical Co.):

1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials wurden in 20 ml Wasser-Dioxan (2:1) gelöst und die Lösung über eine Säule aus 50 ml «Dowex» WGR-Harz (Basenform) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (2:1) gesättigt worden war, und anschliessend mit Wasser-Dioxan (2:1) eluiert. Das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A wurde in einigen Fraktionen zusammen mit einer Spur mitgerissener Zinkkationen eluiert. Diese Fraktionen wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 450 mg eines farblosen Feststoffes erhalten wurden. Der Feststoff konnte direkt als Ausgangsmaterial für die Herstellung von l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Kanamycin-A gemäss der 1-N-Acylierungsmethode des unten stehenden Beispiel 31 verwendet werden, wobei die im festen Ausgangsmaterial verbliebene Spur an Zinkkationen keinen schädlichen Einfluss auf die Acylierungsreaktion in Beispiel 31 ausübte.

(G) Verfahren unter Verwendung eines Chelat-Austau-scherharzes, welches schwach saure funktionelle Gruppen enthält (Im Handel erhältlich als «Dowex» A1 -Harz, ein Produkt der Dow Chemical Co., USA):

Eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Dioxan (1:1) wurde über eine Säule aus 50 ml «Dowex» A 1-Harz geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1), welches 1% Ammoniumhydroxid enthielt, gesättigt worden war, und anschliessend der Gra-dient-Eluierung mit Gemischen von Wasser-Dioxan (1:1), welche 0 bis 1N Ammoniumhydroxid enthielten, unterworfen. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A enthielten und erst in einer späteren Phase als Ausfluss aus der Säule gewonnen wurden, wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 272 mg (74%) des gewünschten Produktes als weisser Feststoff erhalten wurden.

(H) Verfahren unter Verwendung von Chitosan (einem in Wasser unlöslichen Polymer, welches funktionelle Gruppen enthält, die fähig sind, sich mit einem Metall zu vereinen, im Handel erhältlich als ein Produkt der Toko Kasei Koyo Co., Ltd., Japan):

100 ml Chitosan wurden mit Wasser-Methanol (3:1) gut imprägniert und in eine Säule eingefüllt, über welche sodann eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials in Wasser-Methanol (3:1) geleitet wurde. Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (3:1) entwickelt, wobei das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A zuerst eluiert wurde und das Zinkacetat viel später eluiert wurde. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene eingedampft,

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wobei ein Rückstand erhalten wurde, welcher in Wasser-Di-oxan (1:1) gelöst und die Lösung über eine Säule aus «Amberlite» CG 50-Harz (NH4+-Form) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1) vorbehandelt worden war. Die Säule wurde mit Wasser-Dioxan (1:1) gut gewaschen und anschliessend der Gradienten-Eluierung mit Wasser-Dioxan (1:1), welches 0 bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthielt, unterworfen. Jene Fraktionen, welche eine positive Ninhydrin-Reaktion ergaben, wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 301 mg (82%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war mit dem in Beispiel 1 (3) (B) erhaltenen Produkt.

(I) Verfahren unter Verwendung eines Hochpolymeren, welches funktionelle Carboxylgruppen enthält (im Handel erhältlich als «CM-Sephadex» C-25, welches ein Ionenaustau-scher-Gelfiltrationsmittel ist, das aus einem carboxymethyl-substituierten Dextrangel besteht, ein Produkt von Pharmacia Fine Chemical Co., Schweden):

Eine Lösung von 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirup-20 artigen Materials in Wasser-Dioxan (1:1) wurde über eine Säule aus 40 ml «CM-Sephadex» C-25 (NH4+-Form) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1) gut gesättigt worden war. Die Säule wurde mit 200 ml Wasser-Dioxan (1:1) gewaschen und anschüessend der Gradienten-Eluierung, unter Verwendung von Wasser-Dioxan (1:1), welches 0 bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthielt, unterworfen. Es wurden keine Zinkkationen aus der Säule eluiert, sondern nur das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A. Das Eluat wurde zur Trockene eingedampft und ergab 303 mg (82%) eines farblosen Feststoffes, welcher identisch war mit demjenigen aus Beispiel 1 (3) (B).

(J) Verfahren unter Verwendung von Schwefelwasserstoff als Zink fällendes Mittel:

35 1 g des in Beispiel 1 (2) erhaltenen sirupartigen Materials wurden in 20 ml Wasser-Methanol (1:1) gelöst, zu welchem sodann wässeriges Ammoniumhydroxid zugesetzt wurde, gefolgt von der Einführung einer genügenden Menge von Schwefelwasserstoff. Das Reaktionsgemisch, welches den ge-40 bildeten Zinksulfidniederschlag enthielt, wurde auf einem Glasfilter, welcher mit «Celite»-Filterhilfsmittel gefüllt war, filtriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein sirupartiges Material zurückblieb, welches mit Äthyläther gut gewaschen wurde, und einen festen 45 Rückstand ergab. Dieser Rückstand wurde in einem Volumen Wasser-Dioxan (1:1) aufgenommen und die Lösung wurde über eine Säule aus 30 ml «Amberlite» IRA 900 (OH-Form , stark basisches Harz, ein Produkt von Rohm & Haas Co.) chromatographiert unter Verwendung von Wasser-Di-50 oxan (1:1) als Entwicklungslösungsmittel. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, welche 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A enthielten, wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 235 mg (64%) eines farblosen Feststoffes erhalten wurden, welcher identisch war 55 mit demjenigen aus Beispiel 1 (3) (B).

Beispiel 2

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A so 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, worauf420 mg (3,09 mMol) Zinkchlorid und 840 mg (6,18 mMol) Natri-umacetat-trihydrat zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde während 10 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, worauf 65 dem erhaltenen Gemisch, welches den gebildeten Kanamycin-A-Zinkkomplex enthielt, langsam im Laufe von 1 Stunde eine Lösung von 675 mg (2,27 mMol) N-Benzyloxy- carbonyl-oxyphthalimid

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halten wurden, der identisch mit demjenigen aus Beispiel 1 (3) (B) war.

Beispiel 5

5 Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurde in

20 ml eines Gemisches aus Wasser und Tetrahydrofuran (1:3) gelöst und anschliessend mit 1 g (4,5 mMol) Zinkacetatdihy-drat versetzt, gefolgt von dem Zusatz von 590 mg (2,4 mMol) io N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und die erhaltene Reaktionslösung anschliessend unter vermindertem Druck reduziert. Der Rückstand wurde über eine Säule aus 200 ml Chitosan geleitet, und die aus der Säule ausfliessende i5 Flüssigkeit anschliessend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (2) behandelt, wobei 414 mg (51%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff gewonnen wurden.

Beispiel 6

20 Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 15 ml eines Gemisches von Wasser und Methanol (1:7) gelöst und diese Lösung sodann mit 1,5 g (6,8 mMol) Zinkacetatdi-hydrat zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 590 mg 25 (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 7 ml Tetrahydrofuran. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen, und die derart erhaltene Reaktionslösung wurde sodann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde über eine Säule aus 200 ml Chito-schliessend das Gemisch während weiteren 5 Stunden gerührt 30 san geleitet, und die aus der Säule austretende Flüssigkeit anwurde. Zu dem erhaltenen Gemisch, welches den gebildeten schliessend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 (2) behandelt, Kanamycin-A-Zinkkomplex enthielt, wurde im Laufe von 30 wobei 442 mg (55%) der Titelverbindung als farbloser Fest-Minuten eine Lösung von 545 mg (2,2 mMol) N-Benzyloxy- stoff erhalten wurden.

carbonyloxysuccinimid gelöst in 5 ml Dimethylsulfoxid-Te-

trahydrofuran (1:1) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 35 Beispiel 7

über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, worauf Äthyl- Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A äther zugesetzt wurde, um den N-acylierten Zinkkomplex als 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in Niederschlag auszufällen. Der Niederschlag wurde sodann 20 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 272 mg (1,24 mMol) nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 (3) (H) beschrie- Zinkacetatdihydrat dieser Suspension zugesetzt. Das Geben behandelt, wobei 581 mg (78%) der Titelverbindung als 40 misch wurde bei Zimmertemperatur während 10 Stunden gefarbloser Feststoff erhalten wurden. rührt, wobei eine praktisch durchsichtige Lösung entstand, zu welcher sodann in kleinen Portionen im Laufe von etwa 2 Beispiel 4 Stunden 540 mg (2,17 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuc-

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A cinimid zugesetzt wurden. Nachdem das erhaltene Gemisch

(1) 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wur- 45 bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen worden den in 20 ml eines Gemisches von Wasser und Dimethylsulf- war, wurde eine grosse Menge Äthyläther zugesetzt, und das oxid (1:9) gelöst, worauf 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat abgeschiedene ölige Material abgezogen und mehrmals mit und anschliessend 590 mg (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbon- Äthyläther gewaschen, wobei ein dickes sirupartiges Material yloxysuccinimid zugesetzt wurden. Nachdem das Gemisch erhalten wurde.

bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen worden so Die Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit einer war, wurde eine grosse Menge Äthyläther zum Gemisch zuge- Probe dieses sirupartigen Materials unter Verwendung von setzt, was zur Abtrennung einer wässerigen sirupartigen Chloroform-Methanol- 28 % iges wässeriges Ammonium-

Schicht führte, welche mehrmals mit Äthyläther gewaschen hydroxid (Volumenverhältnis 1:1:1, untere Phase) als Entwurde, um eine dicke sirupartige Schicht zu ergeben. Wicklungslösungsmittel ergab folgende Flecken:

(2) Das derart erhaltene sirupartige Material wurde in 55 - Kleiner Fleck bei Rf 0,4 von 1,3,6',3"-Tetra-N-benzyl-Wasser-Methanol (3:1) gelöst und die Lösung durch eine oxycarbonyl-Kanamycin-A (welches beim Besprühen mit Säule von 200 ml Chitosan geleitet. Die Säule wurde mit Schwefelsäure und anschliessendem Erwärmen eine Farb-Wasser-Methanol (3:1) eluiert, und das Eluat wurde in Frak- reaktion entwickelte);

tionen gesammelt. Die auf Ninhydrin positiv reagierenden - schwacher Fleck bei Rf 0,28;

Fraktionen wurden vereint und auf ein schmales Volumen eo - Hauptfleck bei Rf 0,23 des gewünschten Produktes,

eingeengt. Das Konzentrat wurde auf eine Säule aus «Amber- 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A;

lite» CG 50-Harz (NH4+-Form) gegeben und die Säule gut - kleiner Fleck bei Rf 0,12 von 6'-N-Benzyloxycarbonyl-

mit einem Gemisch von Wasser und Dioxan (1:1) gewaschen Kanamycin-A; und und anschliessend der Gradienten-Eluierung mit Wasser-Di- - äusserst schwacher Fleck bei Rf 0 von nicht-umgesetz-oxan (1:1), welches 0 bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthielt, es tem Kanamycin-A.

unterworfen. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Es wurde kein Fleck entsprechend Tri-N-benzyloxycarbo-

Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene einge- nyl-Kanamycin-A beobachtet, welcher bei Rf 0,28 bis 0,4 dampft, wobei 494 mg (61 %) eines farblosen Feststoffes er- hätte auftreten können.

c6h5-ch2ocoon gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 4 Stunden stehen gelassen.

Anschliessend wurde das Reaktionsgemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (I) behandelt, wobei 598 mg (74%) 3,5'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A in Form eines farblosen Feststoffes erhalten wurden.

Beispiel 3

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl- Kanamycin-A 600 mg (0,95 mMol) Kanamycin-A-Tetrahydrochlorid und 150 mg (3,8 mMol) Natriumhydroxid in 15 ml Dimethylsulfoxid wurden während 1 Stunde gerührt, worauf 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat zugesetzt wurde und an-

650 004 18

Das obige dicke sirupartige Material wurde in Wasser-Dioxan (1:1) gelöst und die Lösung wurde über eine Säule aus 100 ml «CM-Sephadex» C-25-Harz (NH4+-Form) geleitet, welches zuvor mit Wasser-Dioxan (1:1) benetzt worden war. Anschliessend wurde die Säule der Eluierung wie in Beispiel 1 (3) (I) beschrieben unterworfen, wodurch die Zinkkationen entfernt wurden, und das gewünschte Produkt von den anderen Produkten getrennt wurde, um 412 mg (51 %) der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben.

Zum Vergleich wurde das soeben beschriebene Verfahren wiederholt, jedoch das Zinkacetatdihydrat durch 308 mg (1,24 mMol) Nickel-(II)-Acetattetrahydrat ersetzt, mit dem Resultat, dass das gewünschte 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A als farbloser Feststoff nur in der schwachen Ausbeute von 59 mg (7,3%) erhalten wurde.

Beispiel 8

Herstellung von 3,6'-Di-N- (p-methoxybenzyloxycarbonyl)-Kanamycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung entstanden war, zu welcher sodann im Laufe von etwa 30 Minuten eine Lösung von 789 mg (2,6 mMol) p-Methoxycarbobenzoxy-p-nitrophenylester(p-CH3OC6H4-CH20C00C6H4p-N02) gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend auf dieselbe Weise behandelt, wie in Beispiel 1 (2) und (3) (B) beschrieben, wobei 722 mg (83%) der Titelverbindung als farfe-

25

loser Feststoff erhalten wurden, [aj^ + 87° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: C36H52N4Oi7-1/2 H2C03:

C 51,95 H 6,33, N 6,64%

gefunden: C 51,56, H 6,41, N 6,53%.

Beispiel 9

Herstellung von 6'-N-(t-Butoxycarbonyl) -Kanamycin-A

Nach demselben Verfahren wie in Beispiel 8 beschrieben, mit dem einzigen Unterschied, dass der p-Methoxycarbo-benzoxy-p-nitrophenylester durch 220 mg (1,54 mMol) t-Butoxycarbonylazid ersetzt wurde, wurde die Titelverbindung in Form emes farblosen Feststoffes erhalten. Ausbeute: 627 mg.

[ct]p = + 96° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

farblosen Feststoffes zu ergeben, [a]^ = +81° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: C22H34N4013F6-2CH3C02HH20:

C 38,33, H 5,44, N 6,88, F 13,99% gefunden: C 38,03, H 5,48, N 6,54%.

10 Beispiel 11

Herstellung von 3,6'-Di-N-phenoxycarbonyl-Kanamycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in einem Gemisch von Dimethylsulfoxid (15 ml) und Tetrahy-drofuran (5 ml) suspendiert, und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetat-15dihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt, worauf das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt wurde, bis es eine homogene Lösung gebildet hatte. Die erhaltene Lösung wurde sodann auf 0 °C gekühlt und anschliessend langsam mit einer gekühlten Lösung (auf 0 °C) von 400 mg (2,55 mMol) Phen-20oxycarbonylchlorid (C6H5OCOCl) in 3 ml Tetrahydrofuran versetzt. Die Reaktionslösung wurde im Laufe 1 Stunde auf Zimmertemperatur gebracht und anschliessend bei dieser Temperatur während 3 Stunden stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde sodann mit Äthyläther behandelt, wie in 25 Beispiel 1 (2) beschrieben, und das in Äther unlösliche sirupartige Material wurde nach demselben Verfahren, wie in Beispiel 1 (3) (A) beschrieben weiterbehandelt, wobei 625 mg (70%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten 25

3o wurden, [a]^ = +73° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

35 berechnet für:

gefunden: C îi 6~60, N 641%.

C32H44N401 j-2CH3C02HH20: C 50,11, H 6,31, N 6,49%

Beispiel 10

Herstellung von 3,6'-Di-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung erhalten worden war, zu welcher eine Lösung von 1,2 g (5,1 mMol) p-Nitrophenolester der Trifluoressig-säure, gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid, zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschliessend mit Äthyläther behandelt, wie in Beispiel 1 (2) beschrieben. Das in Äther unlösliche sirupartige Material wurde weiter wie in Beispiel 1 (3) (A) behandelt, um 590 mg (70%) der Titelverbindung in Form eines

40

Beispiel 12

Herstellung von 3,6'-Di-N-acetyl-Kanamycin-A

Das Reaktionsgemisch, welches nach demselben Verfahren wie in Beispiel 8 erhalten worden war, mit Ausnahme, 4s dass 260 mg (2,6 mMol) Essigsäureanhydrid anstelle des p-Methoxycarbobenzoxy-p-nitrophenylesters verwendet wurden, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (3) (A) beschrieben behandelt. Auf diese Weise wurden 525 mg (72%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten.

50 Mq = + 93° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Analyse:

berechnet für:

ss gefunden:

C22H40N4Oi3-2CH3CO2H-H2O: C 44,19, H 7,13, N 7,93% C 44,20, H 7,07, N 7,85%.

Beispiel 13

Herstellung von 3,6'-Di-N-formyl-Kanamycin-A so 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag, zu welcher sodann 690 mg 65 (4,12 mMol) p-Nitrophenylformiat (0HC0C6H4-p-N02) zugesetzt wurden. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend auf dieselbe Weise behandelt, wie in Beispiel 1 (3) (H) beschrie-

ben. Die auf Ninhydrin positiv reagierenden Fraktionen wurden vereint, mit gasförmigem Kohlenstoffdioxid durchtaut und anschliessend zur Trockene eingedampft. Auf diese Weise wurden 430 mg (67%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten. [a]g = + 101° (c= 1, Wasser).

19 650 004

stoffes in einer Ausbeute von 765 mg (82%) erhalten durch Wiederholung des Verfahrens nach Beispiel 15, jedoch unter Verwendung von 500 mg (1,07 mMol) 3'-Deoxy-Kanamy-cin-A (freie Base) als Ausgangsmaterial und 610 mg (2,45 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid.

[a]p = +76° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Analyse; berechnet für:

gefunden:

C20H36N4O13-H2CO3-H2O:

C 40,64, H 6,50, N 9,03% C 40,43, H 6,47, N 8,83%.

Beispiel 14

Herstellung von 3,6'-Di-N-tosyl-Kanamycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis es eine homogene Lösung gebildet hatte, zu welcher sodann langsam eine Lösung von 400 mg (2,1 mMol) Tosylchlorid in 7 ml Tetrahydrofuran zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 1 Stunde stehen gelassen, worauf weitere 200 mg Tosylchlorid, gelöst in 3,5 ml Tetrahydrofuran, zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde während weiteren 2 Stunden stehen gelassen und anschliessend nach demselben Verfahren, wie in Beispiel 1 (2) und (3) (A) beschrieben, weiterbehandelt, wobei 270 mg (28%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten 25

wurden. [a]j-j = +68° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Analyse: berechnet für:

gefunden:

C32H48N4015S2-2CH3C02HH20: C 46,44, H 6,28, N 6,02, S 6,89% C 46,31, H 5,98, N 6,31, S 6,55%.

io

Analyse: berechnet für:

i gefunden:

C34H48N4014-2CH3C02HH20: C 52,16, H 6,68, N 6,40% C 51,99, H 6,75, N 6,20%.

Bei der Wiederholung des obigen Verfahrens unter Weglassen des Zinkacetates wurden keine wesentlichen Mengen an farblosem Feststoff gewonnen.

Beispiel 15

Herstellung, von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl- 6'-N-methyl-Kanamycin-A

500 mg (1,0 mMol) 6'-N-Methyl-Kanamycin-A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und mit 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat versetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag, zu welcher sodann im Laufe von 30 Minuten eine Lösung von 550 mg (2,2 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxy-succinimid, gelöst in 5 ml Dimethylsulfoxid-Tetrahydrofuran (1:1) zugesetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschliessend auf dieselbe Weise behandelt, wie in Beispiel 1 (2) und (3) (A) beschrieben, wobei 720 mg (79%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden, [a]^ = +74°(c=l,

Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 31 weiter unten beschrieben, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-Kanamycin-A.

Beispiel 16

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-Kana-mycin-A

Die Titelverbindung wurde in Form eines farblosen Fest-

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 31 weiter unten be-i5 schrieben, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxy-Kanamycin-A.

Beispiel 17

Herstellung von 3,6' -Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-6'-N-20 methyl-Kanamycin-A

Die Titelverbindung wurde in einer Ausbeute von 737 mg (80%) erhalten durch Wiederholen des Verfahrens nach Beispiel 15 mit 500 mg (1,04 mMol) 3'-Deoxy-6'-N-methyl-Ka-namycin-A (freie Base) als Ausgangsverbindung und 595 mg 25 (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid.

[a]p = +73° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 31 weiter unten be-30 schrieben, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxy-6'-N-methyl-Kanamycin-A.

Beispiel 18

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-4'-deoxy-Kana-35 mycin-A

Ausgehend von 500 mg (1,07 mMol) 4'-Deoxy-Kanamy-cin-A als freie Base [siehe «Journal of Antibiotics», Vol. 27, Seiten 838-847 (1974); «Bulletin of the Chemical Society of Japan», Vol. 50, Seiten 2362-1268 (1977)], wurde die Titelver-40 bindung in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 666 mg (71 %) nach demselben Verfahren wie in Beispiel 15 erhalten, mit Ausnahme, dass 580 mg (2,3 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid gelöst in 4 ml Dimethylsulfoxid langsam im Laufe von 1 Stunde zur homogenen Lö-

45 25

sung zugesetzt wurden, [a]^ = + 77° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

50 Analyse: berechnet für:

gefunden:

C34H48N4018-2CH3C02HH20: C 52,16, H 6,68, N 6,40% C 51,77, H 6,79, N 6,31%.

55

Beispiel 19

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Kana-mycin-B

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-B (freie Base) wurden in 60 einem Gemisch von 12 ml Dimethylsulfoxid und 4 ml Tetrahydrofuran suspendiert, und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat wurde der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung vorlag und anschliessend auf 0 °C gekühlt. Zu der gekühlten 65 Lösung wurde langsam im Laufe 1 Stunde eine kalte Lösung von 825 mg (3,3 mMol)N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran-Dimethylsulfoxid (1:1) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde bei 0 °C während 2 Stun

650 004

den stehen gelassen und anschliessend bei Zimmertemperatur über Nacht, worauf das Gemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (A) beschrieben behandelt wurde, um 740 mg (70%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu 25

ergeben. [a]j-j = +63° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Analyse:

berechnet für: C42H55N50i6-2CH3C02J-J2O:

C 53,95, H 6,40, N 6,84%

gefunden: C 53,66, H 6,67, N 6,63%.

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 31 beschrieben, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Kanamycin-B.

Beispiel 20

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Tobramycin 480 mg (1,03 mMol) Tobramycin (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 1 Stunde gerührt, um eine homogene Lösung zu bilden, zu welcher sodann im Laufe von etwa 1 Stunde eine Lösung von 850 mg (3,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran-Dimethylsulfoxid (1:1) zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen, worauf die erhaltene Reaktionslösung mit einem grossen Volumen Äthyläther, wie in Beispiel 1 (2) beschrieben behandelt wurde, um ein dickes sirupartiges Material zu ergeben.

Das sirupartige Material wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 (3) (A) weiter behandelt, jedoch unter Verwendung von Wasser-Dioxan (1:2 anstelle von 2:1), wobei 810 mg (78%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten 25

wurden. = +65° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

20

Analyse: berechnet für:

gefunden:

C42H55N5015-2CH3C02H-H20: C 54,81, H 6,50, N 6,95% C 54,77, H 6,71, N 6,88%.

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 31 beschrieben, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Tobramycin.

Beispiel 21

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-Tobramycin

Die Titelverbindung wurde in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 890 mg (84%) erhalten durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 20, jedoch ausgehend von 500 mg (1,04 mMol) 6'-N-Methyl-Tobramycin 25

(freie Base). = +63° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 22

Herstellung von 3,2' ,6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-4'-deoxy-Ka-namycin-B

Ausgehend von 480 mg (1,03 mMol) 4'-Deoxy-Kanamy-cin-B als freie Base [siehe «Bulletin of the Chemical Society of Japan», Vol. 50, Seiten 2362-2368 (1977)], wurde die Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 815 mg (79%) nach demselben Verfahren wie in

25

Beispiel 20 beschrieben erhalten, [a]p = + 65° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 23

Herstellung von 3,2', 6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Dibekacin

600 mg (1,33 mMol) Dibekacin (3',4'-Dideoxy-Kanamy-10 cin-B) (freie Base) wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, und die Suspension wurde gerührt zur Bildung einer Lösung, zu welcher 1,4 g (6,4 mMol) Zinkacetatdihydrat zugesetzt wurde, worauf das Gemisch weiter gerührt wurde. Zu der erhaltenen Lösung wurde langsam im Laufe von etwa 1 15 Stunde eine Lösung von 1,1g (4,4 mMol) N-Benzyloxycarbo-nyloxysuccinimid in 12 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Anschliessend wurde ein grosses Volumen Äthyläther mit der Reaktionslösung gemischt, um einen öligen Nieder-20 schlag auszuscheiden (welcher hauptsächlich den N-benzyl-oxycarbonylierten Dibekacin-Zinkkomplex als das gewünschte Produkt und einen gewissen Anteil Dimethylsulfoxid enthielt), welcher mit Äthyläther gewaschen wurde, wobei ein dickes sirupartiges Material erhalten wurde. 25 Dieses sirupartige Material wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, wodurch der N-acylierte Zinkkomplex mit Wasser zerstört wurde und die freien Zinkkationen zusammen mit dem ursprünglich bestehenden Überschuss an Zinkacetat entfernt wurde. Auf diese Weise wurden 1,1g eines in Wasser un-30 löslichen Feststoffes erhalten, welcher das N-acylierte Dibekacin enthielt. Der Feststoff wurde einer Dünnschichtchromatographie aus Silicagel unterworfen unter Verwendung von Chloroform-Äthanol-18 %igem wässerigem Ammoniumhydroxid (1:1:1, untere Phase) als Entwicklungslösungs-35 mittel, wobei ein einziger Fleck bei Rf 0,3 erhalten wurde, was anzeigte, dass der Feststoff im wesentlichen aus 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Dibekacin mit einer Spur von Zink bestand.

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach 40 einem ähnlichen Verfahren wie dem in Beispiel 31 beschriebenen, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Dibekacin.

Zur weiteren Reinigung wurde das rohe Produkt der Titelverbindung, wie es oben erhalten wurde, mit 3M - Ammoniumhydroxidlösung gewaschen,um ein Produkt ohne Ver-

45 unreinigung mit Zinkionen zu ergeben, [a]^ = +71°(c=l,

Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 24

Herstellung von 3,2' ,6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-50 Dibekacin

500 mg (1,07 mMol) 6'-N-Methyl-Dibekacin (freie Base) und 1,2 g (5,45 mMol) Zinkacetatdihydrat wurden in 20 ml Dimethylsulfoxid gelöst, wonach der Lösung langsam im Laufe von etwa 30 Minuten 910 mg (3,6 mMol) N-Benzyl-55 oxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt wurden. Die Reaktionslösung wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschliessend in derselben Weise, wie in Beispiel 23 beschrieben, behandelt, wobei 910 mg der Titelverbindung erhalten wurden, welche praktisch rein war. 60 Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Beispiel 31 beschriebenen, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-Meth-yl-Dibekacin.

65 Beispiel 25

Herstellung von 3,2'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-C

Die Titelverbindung wurde in Form eines gefärbten Feststoffes in einer Ausbeute von 730 mg (79%) nach demselben

Verfahren wie in Beispiel 1 (1), (2) und (3) (A) beschrieben, erhalten, wobei von 500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-C (freie •

25

Base) ausgegangen wurde, [aj^ = + 75° (c= 1, Wasser-Di-

methylformamid, 1:2).

Die anschliessende Behandlung der Titelverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Beispiel 31 beschriebenen, ergab l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Kana-mycin-C.

Beispiel 26

Herstellung von 6'-N-Benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 20 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 0,5 g (2,3 mMol) Zinkacetatdihydrat zu der Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung entstanden war, zu welcher sodann 283 mg (1,13 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt wurden. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (I) beschrieben, behandelt, um 556 mg der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu erhalten.^5 = +92° (c=l, Wasser).

Beispiel 27

Herstellung von 6'-N-Benzyloxycarbonyl-Dibekacin

Nach dem Verfahren von Beispiel 26 wurden 382 mg der Titelverbindung erhalten unter Verwendung von 500 mg Dibekacin (freie Base), 12 ml Dimethylsulfoxid, 0,7 g Zinkacetatdihydrat und 305 mg N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid.

[a]p = +105° (c=0,5, Wasser).

Beispiel 28

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-dide-

oxy-3'-eno-Kanamycin-B

500 mg (1,11 mMol) 3',4'-Dideoxy-3'-eno-Kanamycin-B als freie Base [siehe «Bulletin of the Chemical Society of Japan», Vol. 50, Seiten 1580 bis 1583 (1977)] wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid gelöst und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat zu der Lösung zugesetzt, worauf das Gemisch während 1 Stunde gerührt wurde. Zur erhaltenen Lösung wurden langsam im Laufe von 30 Minuten 870 mg (3,49 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt. Nachdem das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen worden war, wurde die erhaltene Reaktionslösung mit einem grossen Volumen Äthyläther behandelt, wie in Beispiel 1 (2) beschrieben, um ein dickes sirupartiges Material zu erhalten.

Das sirupartige Material wurde in derselben Weise, wie in Beispiel 1 (3) (B) weiterbehandelt, jedoch unter Verwendung von Wasser-Dioxan (1:2 anstelle von 2:1), wobei 784 mg der Titelverbindung als farbloser Feststoff erhalten wurden.

[a]g = +30° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2). Beispiel 29

Herstellung von 3,2' ,6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Sisomicin

Die Titelverbindung wurde in Form eines farblosen Feststoffes in einer Ausbeute von 780 mg erhalten nach demselben Verfahren wie in Beispiel 28 beschrieben, jedoch ausgehend von 500 mg (1,12 mMol) Sisomicin (freie Base).

[a]g = +110° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

2i 650 004

787 mg der Titelverbindung wurde in Form eines farblosen Feststoffes erhalten nach demselben Verfahren wie in Beispiel 28 beschrieben, jedoch ausgehend von 500 mg gemischten Gentamicinen (C, Cla, C2 etc).

5

Beispiel 31 (als Referenz)

Herstellung von l-N-((S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Kana-mycin-A (Amikacin)

55 mg (0,062 mMol) 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Ka-io namycin-A-Àcetat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 1,5 ml Wasser-Tetrahydrofuran (2:5) gelöst und die Lösung mit 13 mg (0,12 mMol) wasserfreiem Natriumcar-bonat und anschliessend mit 23 mg (0,066 mMol) N-Hydr-oxysuccinimidester von (S)-4-Benzyloxycarbonylamino-2-ls hydroxybuttersäure versetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 10 Stunden stehen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde auf ein kleines Volumen konzentriert, und das Konzentrat wurde in 4 ml Wasser-Dioxan (1:1) aufgenommen. Eine kleine Menge Essigsäure wurde zu 20 der Lösung zugesetzt, um sie schwach sauer zu gestalten und diese Lösung wurde sodann der Hydrogenolyse unterworfen, indem Wasserstoffgas unter atmosphärischem Druck während 1 Stunde in Gegenwart von Palladiumschwarz hindurchgeleitet wurde (zur Entfernung der Benzyloxycarbonyl-25 gruppe). Die erhaltene Reaktionslösung wurde filtriert und konzentriert, und das Konzentrat wurde durch eine Säule von «CM-Sephadex» C-25 (NH4+-Form) [ein Produkt der Pharmacia Fine Chemical Co., Schweden] geleitet. Die Säule wurde der Gradienten-Eluierung mit 0 bis 0,5 N wässerigem 3o Ammoniumhydroxid unterworfen. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 24 mg (Ausbeute: 60%) der Titelverbindung als ihr Monocarbonat erhalten wurden, deren physikalische Eigenschaften und antibakterielle Wirk-35 samkeit identisch waren mit denjenigen einer authentischen Probe.

Beispiel 32 (als Referenz)

40 Herstellung von l-N-(DL-Isoseryl)-Dibekacin

58 mg (0,06 mMol) 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Di-bekacin, hergestellt wie in Beispiel 23, wurden in 1,5 ml Wasser-Tetrahydrofuran (2:5) gelöst, und dieser Lösung wurden 13 mg (0,12 mMol) wasserfreies Natriumcarbonat und an-« schliessend21 mg (0,063 mMol) N-Hydroxysuccinimidester von N-Benzyloxycarbonyl-DL-Isoserin zugesetzt. Das Ge-misch wurde bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend nach dem Verfahren behandelt, wie in Beispiel 31 beschrieben, wobei 21 mg (Ausbeute: 59%) der Titelverbin-50 dung als Monocarbonat erhalten wurden, deren physikalische Eigenschaften und antibakterielle Wirksamkeit identisch waren mit denjenigen einer authentischen Probe.

Beispiel 30

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Genta-micinen

55

Beispiel 33

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 504 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-60 Kanamycin-A (siehe Beispiel 1) in 4 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 220 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das erhaltene Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dem Reaktionsgemisch wurde sodann eine kleine Menge Trifluoressigsäure zugesetzt und die Reaktionslösung 65 sodann in ein grosses Volumen Äthyläther gegossen und die erhaltene ölige Ausscheidung mit Äthyläther gut gewaschen, um ein verfestigtes Material zu ergeben. Dieses Material wurde gut getrocknet und ergab 640 mg der Titelverbindung

n25

650 004

als feste Substanz. Ausbeute: 99%. [a]^ = +98°(c=l, Pyridin).

Elementaranalyse:

berechnet für: C36H47N40i6F3-CF3C00H:

C 47,40, H 5,02, N 5,82%

gefunden: C 47,13, H 5,15, N 5,79%.

Beispiel 34

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 20 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A in 0,4 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 6 mg Phenyltrifluoracetat vermischt und das erhaltene Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 33 behandelt, wobei 24,8 mg der Titelverbindung erhalten wurden, welche sich als identisch mit derjenigen aus Beispiel 33 erwies. Ausbeute: 97%.

Beispiel 35

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 10 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A in 0,3 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid wurde mit 7 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das erhaltene Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde sodann mit einem kleinen Volumen Trifluoressigsäure versetzt und anschliessend in ein grosses Volumen Äthyläther gegossen. Das ausgeschiedene ölige Material wurde gut mit Äthyläther gewaschen und die erhaltene feste Substanz getrocknet, wobei 11,7 mg (Ausbeute: 91 %) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form eines Feststoffes erhalten wurde.

Beispiel 36

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Suspension von 10 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbo-nyl-Kanamycin-A in 0,3 ml Dimethylformamid wurde mit 7 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das erhaltene Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die derart erhaltene homogene Reaktionslösung wurde mit einem kleinen Volumen Trifluoressigsäure versetzt und anschliessend in ein grosses Volumen Äthyläther gegossen. Das ausgeschiedene ölige Material wurde gut mit Äthyläther gewaschen, um es zu verfestigen, und die erhaltene feste Substanz wurde getrocknet, wobei 11,5 mg (Ausbeute: 90%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form eines Feststoffes erhalten wurden.

Beispiel 37

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Suspension von 10 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbo-nyl-Kanamycin-A in 0,35 ml Sulfolan wurde mit 7 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 12,0 mg (Ausbeute: 94%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurde.

Beispiel 38

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Suspension von 22 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbo-nyl-Kanamycin-A in 0,8 ml Tetrahydrofuran wurde mit

22

10 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Gemisch während 2 Tagen gerührt. Die erhaltene homogene Reaktionslösung wurde mit 15 mg Äthyltrifluoracetat und 8 mg wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt, über Nacht gerührt und anschlies-5 send während 2 Tagen stehen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und das Konzentrat mit Wasser gewaschen und anschliessend getrocknet, wobei ein festes Material erhalten wurde. Das feste Material wurde in einem kleinen Volumen Tetrahydrofuran 10 zusammen mit einer kleinen Menge Trifluoressigsäure suspendiert. Das derart erhaltene Gemisch wurde gerührt und anschliessend mit Äthyläther versetzt. Der ausgeschiedene Feststoff wurde abfiltriert,mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei 21 mg (Ausbeute: 74%) der Titelverbindung als 15 Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurden, [a]^ = +95° (c=l, Pyridin).

Beispiel 39

20

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 10 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A in Wasser-Tetrahydrofuran (1:1,0,3 ml) 2 wurde mit einer Lösung von 5 mg Äthyltrifluoracetat in 0,1 ml Tetrahydrofuran vermischt und das erhaltene Gemisch bei Zimmertemperatur während 1 Tag stehen gelassen. Anschliessend wurde ein Gemisch von Äthyltrifluoracetat (10 mg), wasserfreiem Natriumcarbonat (4,4 mg) und Tetra-30 hydrofuran (0,1 ml) zur erhaltenen Lösung in 5 stündigem Intervall (im ganzen viermal) zugesetzt, um die 3"-N-Trifluor-acetylierung zu bewirken. Die Reaktionslösung wurde konzentriert und anschliessend in derselben Weise behandelt, wie in Beispiel 38 beschrieben, wobei 5,5 mg (Ausbeute: 43%) der 35 Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

Beispiel 40

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-40 acetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 10 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A in Wasser-Äthanol (2:3,0,6 ml) wurde mit einer Lösung von 5 mg Äthyltrifluoracetat in 0,1 ml Tetrahydrofuran versetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur 4S während 1 Tag stehen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 38 beschrieben weiter verarbeitet, wobei 2,3 mg(Ausbeute: 18%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

50

Beispiel 41

Herstellung von 3,6'-Di-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-trißuor-acetyl-Kanamycin-A

(a) Herstellung von 3,6'-Di-N-t-butoxycarbonyl-Kana-55 mycin-A

500 mg (1,03 mMol) Kanamycin-A (freie Base) wurden in 12 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat zu der erhaltenen Suspension zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur gerührt, bis eine 60 homogene Lösung vorlag, zu welcher sodann 370 mg (2,59 mMol) t-Butoxycarbonylazid zugesetzt wurden. Das erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend in derselben Weise wie in Beispiel 1 (2) und (3) (B) beschrieben behandelt, wobei 65 590 mg (80%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff er-25

halten wurden. [a]j-j = + 89° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

(b) Herstellung von 3,6'-Di-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-tri-fluoracetyl-Kanamycin-A

3,6'-Di-N-t-butoxycarbonyl-Kanamycin-A (60 mg)

wurde in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst und die erhaltene Lösung wurde mit 25 mg Äthyltrifluoracetat versetzt, worauf das erhaltene Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde sodann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 beschrieben weiterverarbeitet, wobei 76,8 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als Trifluoracetat in Form eines Feststoffes erhalten wurden.

[a]^ = +72° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2). Elementaranalyse:

berechnet für: C30H51N4O16F3CF3COOH:

C 42,95, H 5,86, N 6,26%

gefunden: C 42,77, H 5,92, N 6,38%.

23 650 004

25

wurden, [a]^ = +70° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

5 Elementaranalyse:

berechnet für: C34H43N4016F3CF3C00H:

C 46,26, H 4,74, N 5,99% gefunden: C 45,88, H 4,96, N 5,77%.

Beispiel 42

Herstellung von 3,6'-Di-N-(p-methoxybenzyloxycarbonyl)-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 40 mg 3,6'-Di-N-(p-methoxybenzyloxy-carbonyl)-Kanamycin-A (siehe Beispiel 8) in 0,4 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 18 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde sodann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 beschrieben weiterverarbeitet, wobei 49,3 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als feste Sub-25

stanz erhalten wurden, [a]^ = + 78° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: C38H5iN4018F3-CF3C00H:

C 46,97, H 5,12, N 5,48% gefunden: C 47,18, H 5,03, N 5,31%.

Beispiel 43

Herstellung von 3,6',3"-Tri-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A

75 mg 3,6'-Di-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A (siehe Beispiel 10) und 12 mg Triäthylamin wurden mit 0,6 ml Dimethylsulfoxid vermischt und dann mit 35 mg Äthyltrifluoracetat, und das Gemisch gerührt, um die gewünschte 3"-N-Tri-fluoracetylierung zu bewirken. Die Reaktionslösung wurde sodann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 weiterverarbeitet, wobei 94,2 mg (Ausbeute: 96%) der Titelverbindung als feste

25

Substanz erhalten wurden. [<x]j-j = + 76° (c = 1, Wasser-Di-methylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: C24H33N4Oi4F9 CF3COOH:

C 35,22, H 3,87, N 6,32%

gefunden: C 35,09, H 3,99, N 6,07%.

10

Beispiel 45

Herstellung von 3,6',3"-Tri-N-formyl-Kanamycin-A

Ein Gemisch von 62 mg 3,6'-Di-N-formyl-Kanamycin-A (siehe Beispiel 13), 90 mg Äthylformiat und 1 ml Dimethyl-i5 sulfoxid wurde während 12 Stunden in einem versiegelten Rohr auf 100 °C erhitzt, um die gewünschte 3"-N-Formylie-rung zu bewirken. Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit einer kleinen Menge Ameisensäure versetzt, dann in ein grosses Volumen Äthyläther gegossen und in derselben Weise wie 2o in Beispiel 33 beschrieben weiterverarbeitet, wobei 69 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als festes Material erhalten wurden, welches auf Ninhydrin positiv reagierte.

[a]g = +109° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

25

Elementaranalyse:

berechnet für: C2iH36N4Oi4HCOOH:

C 43,00, H 6,23, N 9,12% gefunden: C 42,83, H 6,19, N 9,10%.

Beispiel 46

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A 35 Ein Gemisch von 68 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-Kanamycin-A (siehe Beispiel 15) und 11 mg Triäthylamin, 30 mg Äthyltrifluoracetat und 0,7 ml Methylsulfoxid wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 beschrieben behandelt, wobei 86 mg (Ausbeute: 99%) der Titelverbin-40 dung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz 25

erhalten wurden. [a]p = +65° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 47

45 Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 52 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-Kanamycin-A (siehe Beispiel 16) und 11 mglriäthyl-50 amin in 0,4 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 21 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschliessend wurde die Reaktionslösung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 64,8 mg (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung als

25

55 festes Material erhalten wurden. [a]j-j = +70°(c= ser-Dimethylformamid, 1:2).

= 1, Was-

Beispiel 44

Herstellung von 3,6'-Di-N-phenoxycarbonyl-3"-t-trifluor-acetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 53 mg 3,6'-Di-N-phenoxycarbonyl-Ka-namycin-A (siehe Beispiel 11) und 9 mg Trimethylamin in 0,5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 23 mg Methyltrifluorace- 65 tat versetzt und das Gemisch sodann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 beschrieben weiterverarbeitet, wobei 65 mg (Ausbeute: 95%) der Titelverbindung als festes Material erhalten

Elementaranalyse:

60 berechnet für: CseH^NjO^-CFjCOOH:

C 48,21, H 5,11, N 5,92% C 47,94, H 5,35, N 5,77%.

gefunden:

Beispiel 48

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-3"-N-formyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 78 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-

650004

deoxy-Kanamycin-A in 0,7 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 65 mg Phenylformiat versetzt und das Gemisch über Nacht bei 50 °C zur 3"-N-Formylierung erhitzt.

Die Reaktionslösung wurde mit einer kleinen Menge Ameisensäure versetzt und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 weiterverarbeitet, wobei 83 mg (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung als Monoformiatin Form einer festen Substanz 25

erhalten wurden, [a]^ = +84° (c = 1, Wasser-Dimethyl-formamid, 1:2).

Beispiel 49

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-dichlor-acetyl-3'-deoxy-Kanamycin-A

Eine Lösung von 35 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-Kanamycin-A in 0,5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 12 mg Methyldichloracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktions lösung wurde mit einem kleinen Volumen Dichloressigsäure versetzt und anschliessend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 behandelt, wobei 44,5 mg (Ausbeute: 96%) der Titelver-

25

bindung als feste Substanz erhalten wurden, [a]^ = + 65° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Eine Lösung von 71 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-4'-deoxy-Kanamycin-A (siehe Beispiel 18) 12 mg Triäthylamin und 30 mg Äthyltrifluoracetat in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 beschrieben, ver-5 arbeitet, wobei 90 mg (Ausbeute: 99%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhal-25

ten wurden. [a]p = + 72° (c=1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

io

Beispiel 53

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3' ,4'-dideoxy-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 75 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-15 3',4'-dideoxy-Kanamycin-A und 30 mg Äthyltrifluoracetat in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 beschrieben, behandelt, wobei 96 mg (Ausbeute: 99%) der Titelverbindung als feste Substanz erhalten wurden.

20Ea]j) = +72° (c=l, Wasser-Dimethylsulfoxid, 1:2). Elementaranalyse:

berechnet für: C36H47N4014F3CF3C00H:

C 49,03, H 5,20, N 6,02% 25 gefunden: C 48,83, H 5,46, N 5,87%.

Elementaranalyse:

berechnet für: C36H48N4015Cl2-CHCl2C00H:

C 46,73, H 5,16, N 5,74, Cl 14,52% gefunden: C 46,58, H 5,33, N 5,62, Cl 14,28%.

Beispiel 50

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trichlor-acetyl-3'-deoxy-Kanamycin-A

Eine Lösung von 58 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-Kanamycin-A in 0,7 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 25 mg Methyltrichloracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei 50°°C stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einem kleinen Volumen Trichloressigsäure versetzt und anschliessend auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 weiterverarbeitet, wobei 80,5 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung

25

als feste Substanz erhalten wurden, [ajp = +65°(c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: C36H47N40]5C13CC13C02H:

C 43,65, H 4,63, N 5,36, Cl 20,34% gefunden: C 43,44, H 4,77, N 5,30, Cl 20,19%.

Beispiel 51

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-3"-N-trifluoracetyl-6'-N-methyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 72 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-6'-N-methyl-Kanamycin-A in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde sodann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 weiterverarbeitet, wobei 89,5 mg (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer fe-

25

sten Substanz erhalten wurde. [a]p = + 70° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 52

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-4'-deoxy-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A

Beispiel 54

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3' ,4'-dideoxy-30 3"-N-formyl-Kanamycin-A

75 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-dideoxy-Kana-mycin-A und 65 mg Phenylformiat wurden in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst und die erhaltene Lösung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 48 beschrieben, verarbeitet, wobei 80 mg (Aus-35 beute: 97%) der Titelverbindung als Monoformiat in Form

25

einer festen Substanz erhalten wurden, [a]^ = + 80° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

40

Beispiel 55

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-dideoxy-3"-N-dichloracetyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 68 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-45 3',4'-dideoxy-Kanamycin-A in 0,9 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 25 mg Methyldichloracetat versetzt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer kleinen Menge Dichloressigsäure versetzt und anschliessend in derselben Weise wie in so Beispiel 33 weiter verarbeitet, wobei 88 mg (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung als Monodichloracetat in Form einer fe-

25

sten Substanz erhalten wurden, [a]^ = + 67° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

55

60

Beispiel 56

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-tri-fluoracetyl-Kanamycin-B

Eine Lösung von 78 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-B (siehe Beispiel 19) und 11 mg Triäthylamin in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 35 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das Gemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 weiter verarbeitet, wobei 92 mg (Ausbeute: 95%) der Titel-65 Verbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Sub-

25

stanz erhalten wurden. [a]p = + 60° (c= 1, Wasser-Dimeth-ylformamid, 1:2).

Beispiel 57 25

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N- form-yl-Tobramycin

Eine Lösung von 82 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Tobramycin (siehe Beispiel 20) und 12 mg Triäthylamin in 1,2 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 60 mg Phenylformiat versetzt und das Gemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 48 weiter verarbeitet, wobei 86 mg (Ausbeute: 97%) der Titelver-

25

bindung als feste Substanz erhalten wurden. [a]j-j = + 71° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

650 004

Beispiel 61

Herstellung von 3,2' ,6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-form-yl-Dibekacin

Ein Gemisch von 79 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-5 Dibekacin und 60 mg Phenylformiat in 1,1 ml Dimethylsulfoxid wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 48 verarbeitet, wobei 84 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als Mono-formiat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

n25

10

[a]j-j = +70° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: C43H55N5016 HC00H:

C 55,98, H 6,09, N 7,42% gefunden: C 55,50, H 6,22, N 7,28%.

15

Beispiel 58

Herstellung von 3,2' ,6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-3"-N-trifluoracetyl-Tobramycin

Eine Lösung von 80 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-Tobramycin (siehe Beispiel 21) und 12 mg Triäthylamin in 1,2 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das Gemisch sodann in dersel- 2s ben Weise wie in Beispiel 33 weiter verarbeitet, wobei 97 mg (Ausbeute: 98 %) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

Beispiel 62

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-di-chloracetyl-Dibekacin

Eine Lösung von 84 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbon-yl-Dibekacin in 1,2 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 25 mg Methyldichloracetat auf dieselbe Weise wie in Beispiel 49 umgesetzt, wobei 104 mg (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung als Monodichloracetat in Form einer festen Substanz erhalten

20 25

wurden, [a]^ = + 59° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid,

1:2).

,25

= +60° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

30

Beispiel 59

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-tri-ßuoracetyl-Dibekacin

Eine Lösung von 82 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl- 35 wurden, [aj^ Dibekacin (siehe Beispiel 23) in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde i :2). mit 30 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das Gemisch in derselben Weise wie in Beispiel 33 beschrieben verarbeitet,

wobei 100 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als feste

25

Substanz erhalten wurden. [a]p = +61° (c=l, Wasser-Di-methylformamid, 1:2).

Beispiel 63

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-3"-N-trißuoracetyl-Dibekacin

Eine Lösung von 85 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-6'-N-methyl-Dibekacin (siehe Beispiel 24) in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das Gemisch in derselben Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 103,5 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten

— +60° (c=l, Wasser-Dimethylformamid,

Elementaranalyse:

berechnet für: c44h54n5o15f3 cf3cooh:

C 51,93, H 5,21, N 6,58% gefunden: C 51,84, H 5,38, N 6,47%.

4o Beispiel 64

Herstellung von 3,2'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-formyl-Kanamycin-C

Eine Lösung von 81 mg 3,2'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-C (siehe Beispiel 25) und 14 mg Triäthylamin in 1,5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 90 mg Äthylformiat versetzt und das Gemisch in derselben Weise wie in Beispiel 48 behandelt, wobei 85,5 mg (Ausbeute: 96%) der Titelverbindung als Monoformiat in Form einer festen Substanz erhalten 25

wurden. [a]j-j = + 81° (e= 1, Wasser-Dimethylformamid,

50

1:2).

Beispiel 60

Herstellung von 3,2',6',3"-Tetra-N-trifluoracetyl-Dibekacin

Ein Gemisch von 71 mg 3,2',6'-Tri-N-trifluoracetyl-Dibe-kacin und 30 mg Äthyltrifluoracetat in 1 ml Dimethylsulfoxid wurde über Nacht bei 40 °C stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde anschliessend in derselben Weise wie in Beispiel 33 beschrieben weiter verarbeitet, wobei 90 mg (Ausbeute: 99%) der Titelverbindung als feste Substanz gewonnen wurden.

[cc]p = +70° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2). Elementaranalyse:

berechnet für: C26H33N5012Fi2-CF3C00H:

C 35,42, H 3,61, N 7,38%

gefunden: C 35,40, H 3,89, N 7,17%.

Beispiel 65

55 Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-tri-ßuoracetyl-Sisomicin

Eine Lösung von 82 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Sisomicin (siehe Beispiel 29) in 1,5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Ge-60 misch in derselben Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 99 mg (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

[a]g = +151° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

65

Beispiel 66

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-tri-ßuoracetyl-Netilmicin

650 004

Eine Lösung von 85 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Netilmicin in 1,3 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das Gemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 103 mg (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form ei-

25

ner festen Substanz erhalten wurden. [a]p = +145° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 67

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluor-acetyl-Gentamicin-B

Eine Lösung von 72 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Gentamicin-B in 1,2 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das Gemisch auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 91 mg (Ausbeute: 99%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form ei-

25

ner festen Substanz erhalten wurden, [a]^ = + 92° (c = 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Beispiel 68

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-Tri-fluoracetyl-Gentamicin-Ci -und-Cla-Gemisch

Eine Lösung von 84 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Gentamycin-C]- und -Cla-Gemisch in 1,5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 30 mg Äthyltrifluoracetat versetzt und das erhaltene Gemisch in derselben Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 101 mg der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

[(x]q = +87° (c=l, WasserDimethylformamid, 1:2). Beispiel 69

Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-dide-oxy-3'-eno-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-B

Ein Gemisch von 83 mg 3,2'6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-dideoxy-3'-eno-Kanamycin-B (siehe Beispiel 28) und 35 mg Äthyltrifluoracetat in 1,2 ml Dimethylsulfoxid wurde über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschliessend wurde die Reaktionslösung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 33 verarbeitet, wobei 99,5 mg (Ausbeute: 96%) der Titelverbindung als Monotrifluoracetat in Form einer festen

25

Substanz erhalten wurden. [a]j-j = +26 (c= 1, Wasser-Di-methylformamid, 1:2).

Beispiel 70

Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-3"-N-formyl-Kanamycin-A

Eine Lösung von 90 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-Kanamycin-A in 0,8 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 13 mg N-Formylimidazol vermischt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer kleinen Menge Ameisensäure vermischt und anschliessend mit Äthyläther, wie in Beispiel 33, verarbeitet, wobei 94 mg (Ausbeute: 95%) der Titelverbindung als Monoformiat in Form einer festen Substanz erhalten wurden.

26

(freie Base) in einem Lösungsmittelgemisch von Dimethylsulfoxid (50 ml) und Tetrahydrofuran (20 ml) wurde mit 4 g (18,1 mMol) Zink-(II)-acetatdihydrat versetzt und das erhaltene Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt bis zur Bildung 5 einer homogenen Lösung. Es erforderte etwa 4 bis 5 Stunden, bis das suspendierte Kanamycin-A gelöst war unter Bildung eines Kanamycin-A-Zinkkationen-Komplexes. Die erhaltene Lösung wurde sodann auf 0 °C gekühlt tropfenweise im Laufe von etwa 1 Stunde mit einer kalten Lösung (0 °C) von 2,37 g 10 (9,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 40 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid (Volumenverhältnis 1:1) versetzt. Die Reaktionslösung wurde sodann bei Zimmertemperatur während 4 Stunden stehen gelassen. Während dieser Zeit erfolgte die 15 Benzyloxycarbonylierung des Zinkkomplexes von Kanamycin-A. Die erhaltene Reaktionslösung wurde der Silicagel-Dünnschichtchromatographie unterzogen unter Verwendung einer unteren Schicht von Chloroform - Methanol -28 %igem wässerigem Ammoniumhydroxid (Volumenver-2o hältnis 1:1:1) als Entwicklungslösungsmittel, und es wurde dann beobachtet, dass die Silicagelplatte einen Hauptflecken bei Rf 0,23 und zwei oder drei kaum wahrnehmbare kleine Flecken, welche oberhalb des Hauptfleckens lagen und anderen Nebenprodukten zuzuschreiben waren, aufwies. 25 (2) Die Reaktionslösung, welche den N-benzyloxycarbon-ylierten Kanamycin-A-Zinkkationen-Komplex aus der Vorstufe (1) enthielt, wurde in 500 ml Äthyläther gegossen und das ausgeschiedene ölige Produkt sodann mehrmals mit Äthyläther gewaschen, wobei 8,8 g eines dicken sirupartigen Pro-3o duktes erhalten wurden, welches den N-benzyloxycarbon-ylierten Komplex enthielt.

(3) Die Entfernung der Zinkkationen aus dem sirupartigen Komplexprodukt erfolgte in der unten erwähnten Weise unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustau-35 scherharzes, welches Carbonsäurefunktionen (-COOH) enthielt [«Amberlite» CG-50-Harz (H+-Form), ein Produkt der Rohm & Haas Co., USA].

60 ml «Amberlite» CG-50 (H+-Form)-Harz wurde zuvor mit Wasser-Dioxan (Volumenverhältnis 2:1) gut gesättigt. Eine 40 Säule wurde sodann mit diesem Harz gepackt und die Lösung von 1 g des sirupartigen Komplexproduktes in Wasser-Dioxan (1:1) durch die Säule geleitet, welche anschliessend mit Wasser-Dioxan (2:1), welches 1 % Essigsäure enthielt, entwik-kelt wurde. Die Eluatfraktionen, welche das gewünschte Pro-45 dukt, nämlich 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kanamycin-A, welches auf Ninhydrin positiv reagiert, enthielten, liefen zuerst aus und dann erst die Fraktionen, welche das Zinkacetat enthielten und eine Farbreaktion mit Diphenylcarbazid ergaben. Die ersten Fraktionen, welche das gewünschte Produkt so enthielten, wurden vereint und zur Trockene eingedampft und das Konzentrat dann mit Äthyläther gewaschen, wobei 340 mg (Ausbeute: 81%) 3,6'-Di-N-benzyl-oxycarbonyl-Kanamycin-A in Form eines farblosen Feststof-25

s5 fes erhalten wurden, [a]^ = +76° (c= 1, Wasser-Dimeth-ylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: Ca^jH^NfO^^CT^CC^H-^O: 60 C 51,23, H 6,56, N 6,29%

gefunden: C 51,02, H 6,71, N 6,22%.

Beispiel 71

Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Kana-mycin-A (Amikacin)

(a) Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-Kana-mycin-A

(1) Eine Suspension von 2,0 g (4,13 mMol) Kanamycin-A

(b) Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-65 trifluoracetyl-Kanamycin-A- Trifluoracetat

Das in der obigen Stufe (a) erhaltene Produkt wurde in derselben Weise wie in Beispiel 33 beschrieben verarbeitet, jedoch unter Zusatz von 1,5 Moläquivalenten Triäthylamin, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.

27

650 004

(c) Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Ka-namycin-A

Eine Lösung von 60 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A-Trifluoracetat, hergestellt nach dem obigen Verfahren (b) in 1,5 ml WasserTetrahydro-furan (Volumenverhältnis 1:1) wurde mit 7 mg wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt, gefolgt von der Zugabe von 23 mg N-Hydroxysuccinimidester von L-4-Benzyloxycarbonylami-no-2-hydroxybuttersäure, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 10 Stunden stehen gelassen.

Die derart erhaltene Reaktionslösung wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Wasser vermischt, wobei ein fester Niederschlag entstand. Der Feststoff wurde in 3 ml 2N wässerigem Ammoniumhydroxid-Tetrahydrofuran (Volumenverhältnis 5:3) aufgenommen und die Lösung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um die Entfernung der 3"-N-Trifluoracetylgruppe zu bewirken. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft und ergab einen festen Rückstand. Dieser feste Rückstand wurde in 4 ml Was-ser-Dioxan (1:1) gelöst und die Lösung durch Zusatz einer sehr kleinen Menge Essigsäure schwach sauer gemacht und der katalytischen Hydrogenolyse mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck während 1 Stunde in Gegenwart von Palladiumschwarz-Katalysator unterworfen, um die Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe zu bewirken. Die erhaltene Reaktionslösung wurde filtriert und konzentriert, und das Konzentrat wurde durch eine Säule aus «CM-Sephadex» C-25 (NH4+-Form) (ein Produkt von Pharmacia Fine Chemicals Co., Schweden) geleitet, welches sodann der Gradienten-Ent-wicklung mit 0 bis 0,5N wässeriger Ammoniumhydroxidlösung unterworfen wurde. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten wurden vereint und zur Trok-kene eingedampft, wobei 36 mg (Ausbeute: 89%) des Mono-carbonates der Titelverbindung erhalten wurden. Die physi-cochemischen Eigenschaften und die antibakterielle Wirksamkeit dieses Produktes erwiesen sich als vollständig identisch mit jenen einer authentischen Probe.

(c) Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3' -deoxy-Kanamycin-A

Eine Lösung von 50 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A-Trif]uoracetat, er-5 halten nach der obigen Stufe (b) in 1,5 ml Wasser-Tetrahy-drofuran (Volumenverhältnis 1:2) wurde mit 6 mg wasserfreiem Natriumcarbonat und anschliessend mit 20 mgK-Hydroxysuccinimidester von L-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure versetzt. Das Gemisch wurde bei Zim-10 mertemperatur während 8 Stunden stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde sodann auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Wasser vermischt, wobei ein fester Niederschlag erhalten wurde.

Der Feststoff wurde mit 3 ml 2N - wässerigem Ammoni-umhydroxid-Tetrahydrofuran (Volumenverhältnis 1:1) vermischt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen, um die Entfernung der 3"-N-Trifluoracetyl-gruppe zu bewirken. Die Reaktionslösung wurde sodann zur Trockene eingedampft, wobei ein fester Rückstand erhalten m wurde, und dieser Rückstand wurde mit 4 ml Wasser-Dioxan (Volumenverhältnis 1:1) vermischt. Die Lösung wurde durch Zusatz einer sehr kleinen Menge Essigsäure schwach sauer gemacht und anschliessend der Hydrogenolyse mit Wasserstoff unter atmosphärischem Druck während 1 Stunde über Palla-25 diumschwarz-Katalysator unterworfen, um die Benzyloxy-carbonylgruppen zu entfernen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 72(c) verarbeitet, wobei 30 mg (Ausbeute: 87%) der Titelverbindung als Monocarbonatmonohydrat erhalten wurden.

3°[a]p = +89° (c=l, Wasser).

Beispiel 72

Herstellung von l-N-[(L)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-3'-deoxy-Kanamycin-A

(a) Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-Kanamycin-A

Eine Suspension von 500 mg (1,07 mMol) 3'-Deoxy-Ka-namycin-A (freie Base) in 12 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat vermischt und das erhaltene Gemisch bis zur Bildung einer homogenen Lösung gerührt. Zu dieser Lösung wurde sodann eine Lösung von 610 mg (2,45 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 5 ml Dimethylsulfoxid-Tetrahydrofuran (Volumenverhältnis 1:1) zugesetzt und die Reaktionslöung sodann bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 72 (a) (3) verarbeitet, wobei 765 mg (Ausbeute: 82%) der Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes erhalten wurden.

[a]p = +76° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2). Elementaranalyse:

berechnet für: C34H48N40i4-2CH3C02H-H20: C 52,16, H 6,68, N 6,40%

gefunden: C 51,99, H 6,75, N 6,20%.

(b) Herstellung von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3'-deoxy-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A-Trifluoracetat

Das in der obigen Stufe (a) erhaltene Produkt wurde wie in Beispiel 47 behandelt, um die Titelverbindung zu ergeben.

Beispiel 73

35 Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-di-deoxy-Kanamycin-A

Eine Lösung von 70 mg 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-dideoxy-3"-N-trifluoracetyl-Kanamycin-A-Trifluorace-tat, hergestellt nach Beispiel 52, in 2 ml Wasser-Tetrahydro-40 furan (1:2) wurde mit 9 mg wasserfreiem Natriumcarbonat vermischt, gefolgt vom Zusatz von 28 mg N-Hydroxysuccini-midester von L-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybut-tersäure. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 10 Stunden stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch 45 wurde sodann auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Wasser vermischt, um einen festen Niederschlag zu erhalten.

Der Feststoff wurde mit 4 ml eines Lösungsmittelgemisches von 3N wässerigem Ammoniumhydroxid und Tetrahydrofuran (1:2) vermischt und das Gemisch sodann bei Zim-50 mertemperatur über Nacht stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zur Trockene eingedampft und ergab einen festen Rückstand. Dieser Rückstand wurde mit 6 ml Wasser-Di-oxan (1:3) vermischt und die Lösung durch Zusatz einer sehr kleinen Menge Essigsäure schwach sauer gemacht und an-55 schliessend der Hydrogenolyse mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck während 1,5 Stunden über Palladiumschwarz-Katalysator unterworfen. Die Reaktionslösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 72(c) verarbeitet, wobei 42 mg (Ausbeute: 91%) der Titelverbindung als Monocar-25

60 bonat erhalten wurden, [aj^ = +91° (c= 1, Wasser).

Beispiel 74

Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-To-65 bramycin

(a) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-To-bramycin

Eine Suspension von 480 mg (1,03 mMol) Tobramycin

650 004

(freie Base) in 12 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 1 g (4,55 mMol) Zinkacetatdihydrat versetzt und das Gemisch während 1 Stunde gerührt. Zur erhaltenen Reaktionslösung, welche den Tobramycin-Zinkkationen-Komplex enthielt, wurde tropfenweise im Laufe von etwa 1 Stunde eine Lösung von 850 mg (3,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 10/ml Tetrahydrofuran-Dimethylsulfoxid (Volumenverhältnis 1:1) zugesetzt, und das derart gebildete Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit einem grossen Volumen Äthyläther in derselben Weise wie in Beispiel 72 (a)(2) behandelt, wobei ein sirupartiges Produkt erhalten wurde, welches den N-benzyloxycarbonylierten Tobramycin-Zink-Komplex enthielt. Anschliessend wurde das sirupartige Komplexprodukt in'derselben Weise wie in Beispiel 72(a)(3) verarbeitet, wobei jedoch das Verhältnis von Wasser zu Dioxan (2:1) geändert wurde in ein Volumenverhältnis von 1:2. 810 mg (Ausbeute: 78%) der Titelverbindung in Form eines farblosen Feststoffes wurden auf diese Weise erhalten.

[a]p = +65° (c=l, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

Elementaranalyse:

berechnet für: Gdf^NsO^^QH^CC^HHjO: C 54,81, H 6,50, N 6,95% gefunden: C 54,77, H 6,71, N 6,88%.

(b) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-formyl-Tobramycin-Monoformiat

Das in Stufe (a) erhaltene Produkt wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 57 verarbeitet, um die Titelverbindung zu ergeben.

(c) Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-To-bramycin

Eine Lösung von 100 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbo-nyl-3"-N-formyl-Tobramycin-Monoformiat, erhalten in der obigen Stufe (b), in 3 ml Wasser-Tetrahydrofuran (1:3) wurde mit 12 mg wasserfreiem Natriumcarbonat vermischt, gefolgt vom Zusatz von 40 mg N-Hydroxysuccinimidester von (L)-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 10 Stunden stehen gelassen. Die derart gebildete Reaktionslösung wurde auf ein Ideines Volumen eingeengt und mit Wasser vermischt, um einen festen Niederschlag auszuscheiden.

Der Feststoff wurde in 2 ml 10%igem wässerigem Wasserstoffperoxid suspendiert und die Suspension wurde während 3 Stunden bei 60 °C kräftig gerührt und anschliessend filtriert, wobei ein fester Rückstand, welcher das De-N-Formyl-derivat enthielt, erhalten wurde. Der feste Rückstand wurde in 8 ml Wasser-Dioxan (1:3) aufgenommen und die Lösung wurde durch Zusatz eines sehr kleinen Volumens Essigsäure schwach sauer gemacht und der Hydrogenolyse bei atmosphärischem Druck während 1,5 Stunden über Palladiumschwarz-Katalysator unterworfen. Die Reaktionslösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 72(c) verarbeitet und über eine «CM-Sephadex» C-25-Säule geführt, welche sodann der Gradienten Entwicklung mit 0 bis IN wässeriger Ammoniumhydroxidlösung unterworfen wurde. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 67 mg (Ausbeute: 87%) der Titelverbindung in Form ihres Dicarbo-

25

natdihydrates erhalten wurden, [aj^ = +78° (c= 1, Wasser). Dieses Produkt stimmte mit einer authentischen Probe überein.

28

Beispiel 75

Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Di-bekacin

(a) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Di-s bekacin

600 mg (1,33 mMol) Dibekacin (freie Base) wurden mit 15 ml Dimethylsulfoxid unter Rühren vermischt. Die Lösung wurde mit 1,4 g (6,4 mMol) Zinkacetatdihydrat unter Rühren versetzt. Zu der Lösung wurde im Laufe von etwa 1 10 Stunde tropfenweise eine Lösung von 1,1g (4,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 12 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt und das Gemisch sodann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde weiter mit einem grossen Volumen Äthyläther ver-15 mischt, wobei eine ölige Ausscheidung erhalten wurde, welche hauptsächlich das gewünschte Produkt und einen Anteil an Dimethylsulfoxid enthielt. Die erhaltene ölige Abscheidung wurde von der oberen flüssigen Phase getrennt und weiter mit Äthyläther gewaschen, wobei ein dickes sirupartiges 20 Produkt erhalten wurde.

Dieses sirupartige Produkt wurde wiederholt mit Wasser gewaschen. Durch diese Wasserbehandlung wurde der ursprünglich vorhandene Überschuss an Zinkacetat entfernt und ferner der N-benzyloxycarbonylierte Zinkkomplex zer-2s stört, wobei 1,1 g eines in Wasser unlöslichen festen Rückstandes erhalten wurden. Dieser Feststoff ergab in einer Sili-cagel-Dünnschichtchromatographie, welche mit der unteren Phase von Chloroform-Methanol-18 %iger wässeriger Am-moniumhydroxidlösung (Volumenverhältnis 1:1:1) als Ent-30 wicklerlösungsmittel entwickelt wurde, einen einzigen Fleck bei Rf 0,13, und bestand aus praktisch reinem 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-Dibekacin zusammen mit einer Spur

25

dann emverleibtem Zink, [a]^ + 71° (c = 1, Wasser-Dimeth-

35 ylformamid, 1:2). Wenn jedoch der Feststoff mit 3M wässeriger Ammoniumhydroxidlösung gewaschen wurde, wurde das reine Produkt ohne Verunreinigung mit Zinkkationen erhalten.

(b) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3"-N-4o trifluoracetyl-Dibekacin-Trifluoracetat

Das Produkt der obigen Stufe (a) wurde wie in Beispiel 59 verarbeitet, um die Titelverbindung zu ergeben.

(c) Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-Dibekacin

45 Eine Lösung von 170 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbo-nyl-3"-N-trifluoracetyl-Dibekacin-T rifluoracetat, erhalten nach Stufe (b), in 5 ml Wasser - Tetrahydrofuran (1:3) wurde mit 18 mg wasserfreiem Natriumcarbonat vermischt, gefolgt vom Zusatz von 60 mg N-Hydroxysuccinimidester von (S)-4-50 Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure und das Gemisch während 9 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Wasser vermischt, wobei ein fester Niederschlag ausfiel.

55 Der Feststoff wurde mit 12 ml 4N wässrigem Ammoni-umhydroxid-Tetrahydrofuran (1:3) vermischt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde sodann zur Trockene eingedampft, 60 wobei ein fester Rückstand erhalten wurde. Der erhaltene feste Rückstand wurde in 12 ml Wasser-Dioxan (1:3) gelöst und die Lösung durch Zusatz einer sehr kleinen Menge Essigsäure schwach sauer gemacht und anschliessend der Hydrogenolyse bei atmosphärischem Druck während 1,5 Stunden über Paila-65 diumschwarz unterworfen. Die Reaktionslösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 75 (c) verarbeitet, wobei 96 mg (Ausbeute: 89%) der Titelverbindung als Dicarbo-25

nat erhalten wurde. [a]p = +86° (c= 1, Wasser). Die physi-

20

cochemischen Eigenschaften sowie die antibakterielle Wirksamkeit des erhaltenen Produktes erwiesen sich als übereinstimmend mit denjenigen einer authentischen Probe [Journal of Antibiotics, Vol. 26, Seite 412 (1973)].

5

Beispiel 76

Herstellung von l-N-(DL-3-Amino-2-hydroxypropionyl)-Di-bekacin, d.h. 1-N-DL-Isoseryl-Dibekacin

Eine Lösung von 150 mg 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbo-nyl-3"-N-trifluoracetyl-Dibekacin-Trifluoracetat aus Beispiel 10 59 in 5 ml Wasser-Tetrahydrofuran (1:3) wurde mit 16 mg wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt, gefolgt unter Zugabe von 51 mg N-Hydroxysuccinimidester von DL-3-Benzyloxy-carbonylamino-2-hydroxypropionsäure (d.h. DL-3-Benzyl-oxycarbonylisoserin). Das Gemisch wurde bei Zimmertempe- 15 ratur während 10 Stunden stehen gelassen. Anschliessend wurde die Reaktionslösung in derselben Weise wie in Beispiel 76 (c) verarbeitet, wobei 82 mg (Ausbeute: 88%) der Titelver-

25

bindung als Dicarbonat erhalten wurden, [a]^ = + 82°

(c = 0,32, Wasser).

Die physicochemischen Eigenschaften und die antibakterielle Wirksamkeit dieses Produktes erwiesen sich als identisch mit demjenigen einer authentischen Probe.

25

Beispiel 77

Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxy butyryl)-Dibekacin

(a) Herstellung von 3,2',6'-Tri-N-p-methoxybenzyloxycar-bonyl-Dibekacin 30

500 mg (1, H mMol) Dibekacin (freie Base) wurden in 15 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und die Suspension gerührt bis zur Bildung einer Lösung, zu welcher 1,2 g (5,5 mMol) Zinkacetatdihydrat unter Rühren zugesetzt wurden. Zu der erhaltenen Lösung wurde sodann im Laufe von 30 Mi- 35' nuten tropfenweise eine Lösung von 1,17 g (3,86 mMol) p-Methoxycarbobenzoxy-p-nitrophenylester, gelöst in 10 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Die erhaltene Lösung wurde sodann in derselben Weise wie in Beispiel 76 (a) 40 verarbeitet, wobei 893 mg (Ausbeute: 85%) der Titelverbin-25

dung erhalten wurden. [a]j-j = + 69° (c=l, Wasser-Dimeth-

29 650 004

ylformamid, 1:2).

(b) Herstellung von 3,2'ß'-Tri-N-p-methoxybenzyloxycarbo-nyl-y'-N-trifluoracetyl-Dibekacin-Trifluoracetat

Eine Lösung von 160 mg3,2',6'-Tri-N-p-methoxybenzyl-oxycarbonyl-Dibekacin in 2 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 48 mg Äthyltrifluoracetat vermischt und das Gemisch sodann in derselben Weise wie in Beispiel 33 beschrieben verarbeitet, wobei 188 mg (Ausbeute: 96%) der Titelverbindung als feste

25

Substanz erhalten wurden, [aj^ = + 58° (c= 1, Wasser-Dimethylformamid, 1:2).

(c) Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl) -Dibekacin

Eine Lösung von 150 mg 3,2',6'-Tri-N-p-methoxybenzyl-oxycarbonyl-3"-N-trifluoracetyl-Dibakacin-Trifluoracetat, erhalten nach der obigen Stufe (b), gelöst in 5 ml Wasser-Te-trahydrofuran (1:3) wurde mit 14 mg wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt, gefolgt von der Zugabe von 54 mg N-Hydroxysuccinimidester von (S)-4-(p-Methoxybenzyloxy-carbonyl)-amino-2-hydroxybuttersäure, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während 8 Stunden stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und anschliessend mit Wasser vermischt, um einen festen Niederschlag auszufällen.

Zu dem festen Niederschlag wurde eine Lösung von 1N-HC1 in wässerigem Methanol (1:3,6 ml) zugesetzt und das Gemisch während 4 Stunden bei 60 °C erhitzt, um die p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe zu entfernen. Die erhaltene Lösung wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und anschliessend mit 5N wässerigem Ammoniumhydroxid versetzt, bis die Lösung ein pH von 10 aufwies. Die Lösung wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und anschliessend konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wurde. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und die Lösung wurde über eine Säule von «CM-Sephadex» C-25 (NH4+-Form) geleitet, welche anschliessend mit Wasser gut gewaschen wurde und dann der Gradienten-Entwicklung mit 0 bis IN wässeriger Ammoniumhydroxidlösung unterworfen wurde. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereint und zur Trockene eingedampft, wobei 77 mg (Ausbeute: 87%) der Titelverbindung als Dicarbonat erhalten wurde. [a]g = +85° (c = 1, Wasser).

C

Claims (15)

650 004 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines selektiv N-acylierten Aminoglycosid-Antibiotikums, welches Aminoglycosid-An-tibiotikum einen Deoxystreptaminteil enthält, der eine 3-Aminoglycosyl- oder eine 3-Alkylaminoglycosylgruppe gebunden an die 6-Hydroxylgruppe des Deoxystreptaminteiles aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) Zinkkationen mit einem entsprechenden aminoglycosidischen Antibiotikum in einem inerten organischen Lösungsmittel umsetzt, um den Komplex von Zinkkationen mit dem aminoglycosidischen Antibiotikum zu bilden;

(b) ein Acylierungsmittel, welches eine als Aminoschutz-gruppe einzuführende Acylgruppe enthält, mit dem aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationen-Komplex umsetzt, um einen Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum zu erzeugen, dessen ursprünglich nicht-komplexierte Aminogruppen acy-liert sind, und

(c) den Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglysidischen Antibiotikum mit einem Reagens umsetzt, welches die Zinkkationen aus dem Komplex entfernt, um das gewünschte selektiv N-acylierte aminoglyco-sidische Antibiotikum zu bilden.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mit den Zinkkationen komplexierte amino-glycosidische Antibiotikum ein 6-0-(3"-Amino- oder 3"-Alk-ylamino-3"-deoxyglycosyl)-2-deoxystreptamin ist, welches gegebenenfalls eine 4-0-(Aminoglycosyl)Gruppe aufweist.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aminoglycosidische Antibiotikum Kanamycin-A, 6'-N-Alkylkanamycin-A, 3'-Deoxykanamy-cin-A, 6'-N-Methyl-3'-deoxykanamycin-A, 4'-Deoxykana-mycin-A, 6'-N-Methyl-4'-deoxykanamycin-A, 3',4'-Dideoxy-kanamycin-A, 6"-Deoxykanamycin-A, 4",6"-Dideoxykana-mycin-A, Kanamycin-B, 3'-Deoxykanamycin-B, 4'-Deoxy-kanamycin-B, 3',4'-Dideoxykanamycin-B, 3',4',Dideoxy-3'-eno-kanamycin-B, 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin-B, Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamycin-C, 3',4'-Dideoxykana-mycin-C, Gentamicin-A, Gentamicin-B, Gentamicin-C, Ver-damicin, Sisomicin oder Netilmicin ist.

4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung des aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationenkomplexes durch Umsetzung von Zinkacetat oder Zinkchlorid in einer Menge von 2,3 bis 6 Mol pro Mol des aminoglycosidischen Antibiotikums in einem inerten organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus Di-methylsulfoxid, wässerigem Dimethylsulfoxid, Dimethyl-formamid, wässerigem Dimethylformamid, oder einem Gemisch von Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid, Tetra-hydrofuran, wässerigem Tetrahydrofuran, Methanol, wässerigem Methanol, Äthanol oder wässerigem Äthanol gegebenenfalls in Gegenwart von Natriumacetat erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Acylgruppe des verwendeten Acylierungsmittels eine Alkanoylgruppe, eine Aroylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Aralkyloxycarbonyl-gruppe, eine Aryloxycarbonylgruppe, eine Alkylsulfonyl-gruppe, eine Aralkylsulfonylgruppe oder eine Arylsulfonyl-gruppe ist.

6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Acylierungsmittel in gleicher molarer Menge oder in geringem Überschuss über die Anzahl der zu acylierenden Aminogruppen im aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationenkomplex verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex der Zinkkationen -mit dem selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum aus dem Acylierungsreaktionsgemisch getrennt wird, bevor es mit einem Reagens zur Entfernung der Zinkkationen aus dem Komplex umgesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, da-5 durch gekennzeichnet, dass der Komplex der Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum aus dem Acylierungsreaktionsgemisch abgetrennt wird durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, durch Verdampfen des organischen Lösungsmittelmediums io aus dem Acylierungs-Reaktionsgemisch oder durch Verdünnen des Acylierungs-Reaktionsgemisches mit einem verdünnenden organischen Lösungsmittel, bevor es mit einem Reagens zur Entfernung der Zinkkationen umgesetzt wird.

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9. Verfahren nach Patentanspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der abgetrennte Komplex mit Wasser oder einem polaren organischen Lösungsmittel, welches wasserhaltig sein kann, vermischt wird, welches als Zinkkationen entfernendes Reagens dient.

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10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das polare organische Lösungsmittel entweder ein solches ist, in welchem das Zinksalz löslich ist, aber in welchem das N-acylierte aminoglycosidische Antibiotikum unlöslich ist, oder ein solches, in welchem das Zinksalz unlöslich 25 ist, aber das N-acylierte aminoglycosidische Antibiotikum löslich ist.

11. Verfahren nach Patentanspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der abgetrennte Komplex der Zinkkationen mit dem N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum

30 wiederum vollständig in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird, welches einen Anteil Wasser enthält, und die erhaltene Lösung der Chromatographie unterzogen wird, unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, eines Anio-nenaustauscherharzes, eines Chelataustauscherharzes oder 35 eines in Wasser unlöslichen Polymers, welches funktionelle Gruppen enthält, die sich mit einem Metall zu verbinden vermögen, welche als Zinkkationen entfernendes Reagens dienen.

12. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, da-40 durch gekennzeichnet, dass das Acylierungsreaktionsgemisch direkt über eine Säule aus einem Kationenaustauscherharz, einem Anionenaustauscherharz, einem Chelataustauscher-harz oder einem in Wasser unlöslichen Polymer, welches Funktionen enthält, welche sich mit Metall zu verbinden ver-45 mögen, geleitet wird, um den Komplex der Zinkkationen mit dem N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum zu adsorbieren, und die Säule sodann mit einem wässerigen organischen Lösungsmittel, welches gegebenenfalls eine Säure oder Base enthält, entwickelt wird, und das Eluat in Fraktionen so gesammelt wird, worauf die Fraktionen, welche das gewünschte, selektiv N-acyüerte aminoglycosidische Antibiotikum enthalten, jedoch keine Zinkkationen enthalten, gewonnen werden.

13. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, dass durch gekennzeichnet, dass das Acylierungsreaktionsgemisch, sofern das gewünschte N-acylierte aminoglycosidische Antibiotikum in Wasser unlöslich oder annähernd unlöslich ist, unmittelbar mit Wasser vermischt wird, so dass das Derivat getrennt von dem Zinksalz, welches in Wasser gelöst ver-

60 bleibt, ausgefällt wird.

14. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Acylierungsreaktionsgemisch mit Schwefelwasserstoff, einen Alkalimetallsulfid oder einem Erdalkalimetallsulfid behandelt wird, welches die Zinkkatio-

65 nen als Zinksulfide ausfallt, oder mit Ammoniumhydroxid, welches die Zinkkationen als Zinkhydroxid ausfällt.

15. Verfahren zur Herstellung eines l-N-(a-Hydroxy-ra-amino-alkanoyl)-aminoglycosid-Antibiotikums, welches ei-

nen 6-0-(3"-Amino- oder 3"-Alkylamino-3"-deoxyglycosyl)-2-deoxystreptaminteil enthält, der gegebenenfalls eine 4-0-(Aminoglycosyl)-Gruppe aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) Zinkkationen mit einem entsprechenden aminoglycosidischen Antibiotikum in einem inerten organischen Lösungsmittel umsetzt, um den Komplex von Zinkkationen mit dem aminoglycosidischen Antibiotikum zu bilden;

(b) ein Acylierungsmittel, welches eine als Aminoschutz-gruppe einzuführende Acylgruppe enthält, mit dem aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationenkomplex, der in Stufe (a) in situ in dem inerten organischen Lösungsmittel gebildet wurde, umsetzt, um einen Komplex von Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum zu erzeugen, welches die ursprünglich nicht-komplexier-ten Aminogruppen acyliert enthält;

(c) den in Stufe (b) erhaltenen selektiv N-acylierten aminoglycosidischen Antibiotikum-Zinkkationenkomplex mit einem Reagens umsetzt, welches Zinkkationen aus dem N-acylierten Zinkkomplex entfernt, um ein partiell und selektiv geschütztes N-acyliertes aminoglycosidisches Antibiotikum zu ergeben, welches frei von Zinkkationen ist, und in welchem die 1-Amino- und 3"-Amino- oder 3"-Alkylaminogruppe ungeschützt sind, während alle anderen Aminogruppen im Ami-noglycosidmolekül durch die Acylgruppen geschützt sind;

(d) das in der Stufe (c) erhaltene partiell und selektiv geschützte N-acylierte Antibiotikum mit einem Fettsäureester der Formel VIII

RaC-Rb O

[VIII]

in welcher Ra Wasserstoff oder eine Dihalogenalkyl- oder Tri-halogenalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Rb eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aral-kyloxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkylrest oder eine Aryloxygruppe ist, oder mit N-Formylimidazol als Acylierungsmittel in einem inerten organischen Lösungsmittel umsetzt, um die 3"-Amino- oder 3"-Alkylaminogruppe zu acylieren und dadurch das 1-N-ungeschützte und in allen anderen Aminogruppen voll durch Acylgruppen geschützte aminoglycosidische Antibiotikum zu ergeben, in welchem alle Aminogruppen mit Ausnahme der 1-Aminogruppe mit Acylgruppen geschützt sind;

(e) das in der Stufe (d) erhaltene Antibiotikum mit einer a-Hydroxy-oo-aminofettsäure der Formel IX

HOOC-C H(CH2)mNH2 I

OH

[IX]

in welcher m 1 oder 2 bedeutet, oder mit einem äquivalenten funktionellen Derivat davon, wobei die Aminogruppe entweder ungeschützt oder geschützt ist, umsetzt, um die 1-Ami-nogruppe des 1-N-ungeschützten Antibiotikums zu acylieren, und

(f) die restlichen Aminoschutzgruppen aus dem erhaltenen 1-N-Acylierungsprodukt abspaltet.