DE2423591A1

DE2423591A1 - 1-n-isoserylkanamycine

Info

Publication number: DE2423591A1
Application number: DE2423591A
Authority: DE
Inventors: Shinichi Kondo; Kenji Maeda; Hamao Umezawa; Sumio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1973-05-15
Filing date: 1974-05-15
Publication date: 1974-12-05
Also published as: FR2229686B1; FR2229686A1; US3939143A; DE2423591C3; GB1441202A; DE2423591B2

Description

Die Erfindung betrifft 1-N-Isoserylkanamycin A₁ 1-N-Isoserylkanamycin 3 und l-N-Isoseryl-3',4'-dideoxy-kanamycin B sowie deren nichttoxische Salze.

Die genannten Verbindungen sind gegen gramnegative und grampositive Bakterien überraschend wirksame Substanzen. Sie zeigen sogar gegen resistente Stämme dieser Bakterien unverminderte Wirksamkeit.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der genannten 1-N-Isoserylderivate der Kanamycine.

Kanamycin A (im folgenden kurz "Kanamycin") und Kanamycin B sind bekannte aminoglykosidisehe Antibiotika, die verbreitet als Chemotherapeutika eingesetzt werden. In jüngerer Zeit

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sind jedoch eine Reihe von Stärken dieser Bakterien aufgetreten, die gegen die bekanntan aminoglykosidischen Antibiotika resistent sind. Der Resistenzmechanismus dieser otanme gegenüber den aminoqlykosidisehen Antibiotika isb untersucht worden. H. 'Jiiiezawa et al. haben gezeigt, dass einige grarnnegative Stäncae von Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa, die den R-Faktor tragen und von Patienten isoliert wurden, die auf Kanamycine nicht ansprechen, einen Resistenzraechanismus au .weisen, der darauf beruht, dass sie ein Enzym erzeugen, das die 3'-Hydroxylgruppe der Kanamycine phosphorylisiert. Durch Einwirkung der Phospliotransferase v,^rerden solche Kanamycine inaktiviert (Science 3d. 157, S. 1559 (1967)).

7»Is Ergebnis der Untersuchungen des Resistenzmechanismus wurden 3 ' -Deoxykanamycin und 3 ' , 4'-Dideoxykanamycin B beschrieben und hergestellt, die der Einwirkung der Phosphotransferase widerstehen (Journal of 2\ntibiotics, Serie A, Bd. 24, S. 274-275 (1971) und Bd. 24, S. 435-487 (1971)). 3 ' -Deoxykananiycin und 3 ' , 4' -Dideoxykanamycin ß sind zwar gegen die genannten kanamycinresistenten Stämme effektiv, sind jedoch inaktiv gegenüber anderen kanamycinresistenten Stämmen, beispielsweise -üscherichia cdi JR66/W677, auf die aus klinisch isolierten Klebsieila der R-Faktor übertragen wurde. PI. ümezawa et al. konnten den Resistenzmechanismus gegenüber den Kanamycinen für diese Stämme aufklären. Die Stämme erzeugen ein Enzym, das die 2'-Hydroxylgruppe des Kanamycins oder 3',4'-Dideoxykanamycin B mit Adenosintriphosphat aaenyliert. Durch diese Nukleotidyltransferase werden Kanamycin und 3',4'-Dideoxykanamycin B inaktiviert (Journal of Antibiotics, Bd. 24, S. 911-913 (1971) und Journal of Antibiotics, Bd. 25, S. 492 (1972)).

Andererseits ist bekannt, dass Butirosin B, ein von einer Bacillus-Art erzeugtes aminoglykosidisches Antibiotikum

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gegenüber einigen kanamycin- und ribostamycinresistenten Bakterien aktiv ist. Das Butirosin B ist als l-N-((s)-4-Amino-2—hydroxy-n-butyryl)-ribostamycin identifiert worden (Tetrahedron Letters, Bd. 28, S. 2125 und S. 2617-2630 (1971) sowie DT-OS 1 914 527).

Vergleichende Untersuchungen der antibakteriellen Aktivität des Ribostamycins mit der des Butirosin B haben gezeigt, dass der (S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Substituent an der 1-Aminogruppe des Butirosin B für die Aktivität des Ribostamycins sowohl gegenüber ribostamycinresistenten als auch gegenüber ribostamycinempfindlichen Stämmen eine wichtige Rolle spielt. Die Gegenwart des (S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Substituenten an der 1-Aminogruppe des Butirosin B inhibiert die Wirkung der von den kanamycinresistenten Stämmen erzeuciten ITükleotidyltransferase.

Für das Kanamycin konnten dagegen bisher noch keine auch gegen resistente Stämme wirksame Derivate gefunden werden.

Der Erfindung liegt dementsprechend die Aufgabe zugrunde, Kanamycinderivate zu schaffen, die auch gegenüber kanamycinresistenten Bakterienstättiraen aktiv sind. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufcfabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung solcher Derivate zu schaffen, das einfach, wirtschaftlich und in guter Ausbeute durchgeführt werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe werden 1-N-Isoserylkanamycin A, 1-N-Tsoserylkanamycin B und l-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B sowie deren nichttoxische Salze vorgeschlagen.

Das erfindungsgemäss zur Lösung dieser Aufgabe vorgeschlagene Verfahren ist weiter unten ausführlich beschrieben.

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Den Verbindungen der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, dass man in die 1-Aminogruppe der Kanamycine einen sperrigen Substituenten einführt und dadurch die 2'-Hydroxylgruppe des Kanamycinmoleküls sterisch behindert. Das Kanamycin wird dadurch dem Angriff der inaktivierenden Enzyme der

■ kanamycinresistenten Bakterien entzogen. Durch Einführung der Isoserylgruppe gemäss der Erfindung werden dabei überraschenderweise nicht nur gegen gramnegative und grampositive Bakterien aktive Substanzen, sondern auch Substanzen erhalten, die gegen die unterschiedlichsten Arzneimittel resistent sind.

Ein weiterer überraschender Vorteil der Verbindungen der Erfindung liegt darin, dass sie sowohl in racemischer Form als auch als reines L-Isomer oder als reines D-Isomer ausserordentlich aktiv sind.

Zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung werden Kanamycin, Kanamycin B bzw. 3',4'-Dideoxy-kanamycin B an der 1-Aminogruppe mit Isoserin acyliert. Für diese Reaktion werden alle übrigen Aminogruppen partiell oder vollständig durch bekannte Aminoschutzgruppen blockiert. Von den so erhaltenen Acylierungsprodukten werden dann die

Schutzgruppen abgenommen. Das freie Endprodukt wird chromatogräphisch getrennt und aufgearbeitet.

Weiterhin weisen die so hergestellten 1-N-Isoserylkanamycine, wie bereits angedeutet, eine ausserordentlich und unerwartet hohe antibakterielle Aktivität gegenüber kanamycinempfindlichen Bakterien auf, vor allem gegenüber Bakterien, die empfindlich sind gegen Kanamycin A, Kanamycin B und 3■,4'-Dideoxykanamycin B. Schliesslich ist die ausserordentlich hohe Aktivität gegenüber Kanamycinresistenten Bakterienstärnmen von Pseudomonas aeruginosa auffällig. Die Verbindungen der Erfindung, also das 1-N-Isoserylkanamycin A, 1-N-Isoseryl-

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kanamycin B und das l-N-Isoseryl-3',4·-dideoxykanamycin B können durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden:

•2

R 4«

(D ,

in der R Wasserstoff oder Hydroxyl und R¹ Amino oder Hydroxyl sind, und zwar mit der Massgabe, dass, wenn R Wasserstoff ist, R¹ eine Aminogruppe ist. Auch die nichttoxischen, durch Addition von Säuren gebildeten Salze dieser Verbindungen sind aufgrund ihrer hohen bakteriziden Aktivität wertvolle Pharmazeutika. Bezüglich der Isoserylgruppe des Moleküls der allgemeinen Formel (I) können die Verbindungen entweder in der DL-Form oder in der L-Form oder in der D-Form hergestellt und mit voller Wirksamkeit verwendet werden. Dementsprechend umfasst der im Rahmen dieser Beschreibung verwendete Ausdruck "1-N-Isoserylkanamycin" die folgenden drei Verbindungen: 1-N-DL-Isoserylkanamycin A, 1-N-L-Isoserylkanamycin A und 1-N-D-Isoserylkanamycin A. Entsprechend bedeutet der Ausdruck "1-N-Isoserylkanamycin B" das 1-N-DL-Isoserylkanamycin B, 1-N-L-Isoserylkanamycin B und 1-N-D-Isoseryl-

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kanamycin B. Gleicherweise schliesst der Terminus ¹¹I-N-Isoseryl-3¹ ,4'-dideoxykanamycin B" die Verbindungen 1—JSi-DL-Isoseryl-3' , 4'-dideoxykanamycin B, 1-N-L-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B und l-N-D-Isoseryl-3'^'-dideoxykanamycin B ein.

Das 1-N-Isoserylkanamycin erhält man, wenn in der vorstehenden allgemeinen Formel (I) R und R¹ je eine Hydroxylgruppe bedeuten. Das 1-N-Isoserylkanamycin B entspricht derjenigen Verbindung der allgemeinen Formel (i), die erhalten wird, wenn R Hydroxyl und R¹ die Aminogruppe ist. Die Verbindung l-N-Isoseryl-3¹,4'-dideoxykanamycin B wird erhalten, wenn in der allgemeinen Formel (I) jeder der Reste R eine Hydroxylgruppe und R¹ die Aminogruppe ist. Das l-N-Isoseryl-3¹,4'-dideoxykanamycin B entspricht einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der R Wasserstoff und R¹ die Aminogruppe ist.

Als bevorzugte nichttoxische pharmazeutisch wertvolle Additionssalze der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) seien folgende Salze genannt: Hydrochloride, Sulfate, Phosphate, Acetate, Maleinate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Methansulfοnate, Äthansulfonate u.a.

1-N-DL-Isoserylkanamycin hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften: Die Substanz liegt bei Zimmertemperatur als farbloses Kristallpulver vor. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174 - 177 ⁰C. Die spezifische Drehung beträgt CoO _D + 89° (c 0,65 in Wasser). Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (ART 5721 der Fa. Merck) wird ein einziger Wanderungsfleck erhalten, der eine positive Ninhydrinreaktion zeigt. Für ein Laufmittelsystem aus Methanol, Chloroform, 28 %igem wässrigen Ammoniak und Wasser im Verhältnis 4:1: 2:1 liegt

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der Rf-Faktor bei 0,27, während er für Kanamycin unter den gleichen Bedingungen bei 0,39 liegt. Das 1-N-DL-Isoserylkanamycin zeigt auf dem gleichen Silicagel in der Dünnschichtchromatographie bei Entwicklung mit einem System aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17 %igem .wässrigen Ammoniak im Verhältnis 4:5:2:5 einen Rf-Faktor von 0,08 und einen einzigen ausgeprägten Wanderungsfleck, während das Kanamycin unter den gleichen Bedingungen einen Rf-Faktor von 0,11 zeigt. Im UV-Absorptionsspektrum dieser Substanz in Wasser ist lediglich das jenseits der Absorptionskante liegende Kontinuum zu erkennen. Das IR-Absorptionsspektrum der Substanz zeigt in Kaliumbromidtabletten Hauptabsorptionsbanden bei 3400, 2950, 1650, 1560, 1490, 1390, 1340, 1150 und 1030 cm"¹. Das Absorptionsspektrum zeigt also deutlich das Vorliegen einer Amidgruppe, also der Gruppe -COMB-, im Molekül. Die Verbindung zeigt nicht nur eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten gramnegativen und grampositiven Bakterien, die auch gegenüber Kanamycin empfindlich sind, sondern zeigt auch eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber arzneimittelresistenten Stämmen von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa. Die Verbindung weist eine nur sehr geringe Tier- und Humantoxizität auf. Für Mäuse beträgt die LDc₀ kei intravenöser Injektion über 200 mg/kg.

Auch l-N-L-Isoserylkanamycin liegt als farbloses kristallines Pulver vor. Der Zersetsingspunkt beträgt 184 - 187 °C, [a]^⁴ + 74° (c 0,85 in Wasser).

1-N-D-Isoserylkanamycin ist ebenfalls ein farbloses kristallines Pulver. Die Zersetzungsternperatur beträgt 184 - 188 ⁰C. [et] ^⁴ + 82 ° (c 0,33 in Wasser). Die übrigen Eigenschaften einschliesslich der antibakteriellen Aktivität und der Toxizität entsprechen für l-N-L-Isoserylkanamycin und

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l-ii-ü-Isoserylkanamycin den für das l-N-DL-Isoserylkanamycin beooachteten Werten.

1-N-üL-Isoserylkanamycin 3 hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften: Die als farbloses kristallines Pulver vorliegende Substanz hat einen Zersetzungspunkt von 179 - 184 ⁰C. Γα]^⁶ + 86° (c 0,72 in Wasser). Bei der dünnschichtchromatographischen Entwicklung auf Silicagel (ART 5721) wird ein einziger Laufpunkt erhalten, der eine positive Ninhydrinreaktion liefert. Bei Entwicklung mit einem Laufmittelsystem aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17 Seigern wässrigen Ammoniak im Verhältnis 4:5:2:5 beträgt der Rf-Faktor 0,09. Unter gleichen Bedingungen beträgt der Rf-Paktor von Kanamycin B 0,16. Im UV-Absorptionsspektrum der Substanz in Wasser zeigt sich lediglich das jenseits der Absorptionskante liegende Kontinuum. Das IR-AbsorptionsSpektrum der Substanz in Kaliumbromidtabletten enthält Absorptionsbanden, die das Vorliegen von Amidbindungen im Molekül bestätigen. Das MMR-Spektrum lässt deutlich das molare Bindungsverhäitnis 1 : 1 von Kanamycin B und DL-Isoserin erkennen. Die Substanz weist nicht nur gegenüber gramnegativen und grampositiven Bakterien, die auch auf Kanamycin ansprechen, eine hohe Aktivität auf, sondern auch gegenüber ansonsten arzneimittelresistenten Stämmen von üscherichia coli und Pseudomonas aeruginosa. Die Verbindung weist eine nur sehr geringe Tier- und Humantoxizität auf. Bei intravenöser Injektion an Mäusen beträgt die LD^_n über 100 mg/kg.

l-isr-DL-Isoseryl-3 ' ,4' -dideoxykanamycin B weist folgende physikalische, chemische und biologische Eigenschaften auf: Die Substanz liegt ebenfalls in Form eines farblosen kristallinen Pulvers vor. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174 - 175 °C. [cc]^⁶ + 82° (c 0,32 in Wasser). Bei der

dünnschichtchromatographischen Entwicklung auf Silicagel

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(ART 5721) liefert die Substanz einen einzigen Lautfleck. Der entwickelte fleck zeigt eine positive Ninhydririreaktion. Bei der Entwicklung mit einem Laufmittelsystem aus Butanol, Äthanol, Chloroform und 17 yoigem wässrigen Ammoniak im Verhältnis 4:5:2:5 beträgt der Rf-Faktor 0,17. Unter den gleichen Bedingungen beträgt der Rf-Faktor von 3',4'-Dideoxykanamycin B 0,26. Das UV-Äbsorptionsspektrum dieser Substanz in Wasser zeigt lediglich die jenseits der Absorptionskante liegende kontinuierliche Absorption. Im IR-Absorptionsspektrum der substanz in Kaliumbroraidtabletten werden alle .Banden beobachtet, die die im .Molekül vorliegende Amidbindung bestätigen. Das MMR-Spektrum zeigt ein molares Bindungsverhältnis von 1:1 zv/ischen Kanamycin B und DL-Isoserin. Die Substanz zeigt eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber kanamycinempfindlxchen gramnegativen und grampositiven Bakterien. Ausserdein zeigt sie eine überraschend hohe Aktivität gegen arzneimittelresistente Stämme von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa. Die Substanz zeigt eine sehr geringe Tier- und Humantoxizität. Bei der intravenösen Injektion bei Mäusen liegt die LD- über-100 mg/kg.

Die für eine inhibitor!sehe Aktivität erforderliche Mindestkonzentration (in mcg/ml) von l-N-DL-Isoserylkanamycin, 1-N-DL-IsoserylkanaTTiycin B und l-N-DL-Isoseryl-3',4'-dideoxykanaraycin B gegenüber den verschiedensten Mikroorganismen wird nach dem Verfahren der seriellen Verdünnung unter Verwendung eines Nähragars bei 37 ⁰C bestimmt. Die Bewertung wird nach 18-stündiger Inkubation vorgenommen. Zum Vergleich v/erden die zur inhibitorischen Wirkung erforderlichen Mindestkonzentrationen von Kanamycin, Kanamycin B und 3¹,4'-Dideoxykanamycin B in gleicher Weise unter gleichen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

Die so erhaltenen antibakteriellen Spektren von 1-N-DL-

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Isoseryl-kanamycin (in der Taoelle 1-13-KM), 1-N-DL-Isoseryl-kanamycin B (in der Tabelle l-IS-K^B) und l-H-DL-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B (in der Tabelle 1-IS-DKB) sind in der Tabelle I zusammen mit den Spektren von Kanamycin (in der Tabelle KM), Kanamycin ß (in der Tabelle KMB) und 3',4'-DideoxyKanamycin B (in der Tabelle DKB) gezeigt.

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Tabelle I

inhibitorisehe Mindestkonzentration (mcg/ml)

TestOrganismus

KM

1-IS-KM

KMB

1-IS-KMB

DKB

1-IS-DKB

Staphylococcus aureus PDA 2Q9P Staphylococcus aureus Smith Staphylococcus aureus Terajima Sarcina lutea PCI 1001 Bacillus anthracis Bacillus subtilis PCI 219 Bacillus subtilis NRRL B-558 Bacillus cereus ATCC 10702 Corynebacterium bovis 1810 Mycobacterium smegmatis ATCC Shigella dysenteriae JS 11910 Shigella flexneri 4b JS Il8ll Shigella sonnei JS 11746■ Salmonella typhosa T-63 Salmonella enteritidis 189I Proteus vulgaris OX 19 Klebsiella pneumoniae PCI 602 Klebsiella pneumoniae 22 #3038 Escherichia coli NIHJ Escherichia coli K-12 Escherichia coli K-12 ML 1629 Escherichia coli K-12 ML I63O Escherichia coli K-12 ML l4lO

Escherichia coli K-12 ML Escherichia coli LA29O R55 Escherichia coli LA290 R56 Escherichia coli LA290 R64 Escherichia coli W677 Escherichia coli JR66/W677 Pseudomonas aeruginosa A3 Pseudomonas aeruginosa No.12 Pseudomonas aeruginosa TI-13 Pseudomonas aeruginosa GN315 Pseudomonas aeruginosa 99

0_f78 <0,20 <0,20

6 25- <0,20 <0.20 <0,20

1,56

3 13 0,78

6 25 6 25 3,13 0,39 o;78 0,78 0,78 >100
1,56 1,56 >100
>100

1,56 >100
100
12_r5 12,5^ 1,56 >100
50
25

>100
>100
>100

'0,78

0,20

-<0,20

3,12

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78

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3; 13

13

1,56

0 78

78
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0.39

56
56
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1,56

<0,20
<0,20
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o;78
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>100

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50

12,5
100
>100
>100

1.56
<0_r20
<0,20

6 25

<0,20

1,56

1 56

0 78

6 25

3,13

6 25

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0:78
0j78
0,78
6J25
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1 56
3,13
3,13
1,56
3.13
l_r56
0,78
0,78
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12,5
6,25
6,25
6_T25

50
6,25

<0,20

<0j20

<O..2O

6 25

<0,20

0,78

3,13

0,39

1,56

0,78

<0,20

1,56

<0,20

0,39

100

0₇39

0,78

1,56

12,5 6,25 0,20 50

1,56 0,78 l_r56 >100

3,13

0,78

<0,20 <0,20

1,56 <0,20 <0,20 <0,20

1/56

0 78 <0,20

3,13 3,13 3,13 0,78 0,39 0,20 0,39

1 56 1 56 1 56 1,56 1,56 1,56 1,56 1,56 0,39 0.39 0^;,78 3,13

3 13

1,56

3,13 12,5 3,13

Das l-N-DL(oder -L- oder -D-)-Isoserylkanamycin, 1-N-DL(oder -L- oder -D-)-Isoserylkanamycin B und l-N-DL(oder -L- oder -D-)-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B, also die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (i) der Erfindung sind alle nur ausserordentlich gering toxisch gegenüber Tieren und Menschen. Die LDqn beträgt bei intravenöser Injektion für Mäuse in jedem Fall über 100 mg/kg. Ausserdem weisen die Verbindungen der Erfindung gegenüber gramnegativen und grampositiven Bakterien der verschiedensten Art, auch gegen kanamycinresistente Stämme, eine hohe antibakteriellejAktivität auf, so dass diese Verbindungen als wirksames Arzneimittel für Behandlung von Infektionen durch grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt werden kann. Die Verbindungen der Erfindung können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intermuskulär verabreicht werden. Alle pharmazeutisch an sich bekannten und zur Verabreichung von Kanamycin verwendeten Darreichungsformen können auch für die Verbindungen der Erfindung eingesetzt werden. Bei oraler Verabreichung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) der Erfindung kann jede an sich zur oralen Verabreichung bekannte pharmazeutische Darreichungsform verwendet werden. Beispiele für orale Darreichungsformen sind Pulver, Kapseln, Tabletten oder Sirup. Bei oraler Verabreichung beträgt die geeignete Dosis zur Behandlung bakterieller Infektionen etwa 0,25 bis 2 g je Tag und Person. Diese Tagesdosis sollte auf 3 oder 4 gleiche Teile aufgeteilt werden, die über den Tag verteilt verabreicht werden.

Bei intramuskulärer Injektion beträgt die Dosis vorzugsweise 50 - 200 mg pro Person in 2 bis 4 Portionen je Tag.

Weiterhin können die Verbindungen der Erfindung als Salbe zur äusserlichen Anwendung formuliert werden. Die Wirkstoffkonzentration solcher Salben beträgt vorzugsweise 0,5-5

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Gew. -%. Als Salbenbasis kann jede an sich bekannte Basis, vorzugsweise Polyäthylenglykol, verwendet v/erden.

Die Verbindungen der Erfindung der allgemeinen :.^ilormel (I) können aus Kanamycin, Kanamycin B bzw. 3 ' , 4' -Dideoxykananiycin B hergestellt werden, die der allgemeinen Formel

6"
4" CH₂OH

(II)

CH₂NH₂

entsprechen, in der R Wasserstoff oder Hydroxyl und R¹ Amino oder Hydroxyl sind, und zwar mit der iiassgabe, dass, wenn R Wasserstoff ist, R' die Aininogruppe ist. Die unter die vorstehend genannte allgemeine Formel (II) fallende Ausgangsverbindung wird selektiv an der 1-Aminogruppe mit Isoserin der Formel

HOOC-GH (OH) -

(III)

acyliert, und zwar in einer Weise, die für die Acylierung von Aminogruppen an sich bekannt ist. Das als Ausgaxysmaterial benutzte Kanamycin enthält vier Aminogruppen je Molekül,

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während das Kanamycin ß und 3'^'-Didoxykanamycin B fünf Aminogruppen je Molekül enthalten. Bei der Acylierung zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) darf jedoch nur die 1-Aminogruppe der Ausgangsverbindung der allcjemeinen Formel (II) selektiv mit dem Isoserin umgesetzt werden. Zu diesem Zweck v/erden die 6¹-, 3- und 3"-Aminogruppen des Kanamycins bzw. die 6¹-, 2¹-, 3- und 3 "-Aminogruppen des Kanaraycins B und ctes 3 ' , 4'-.Jideoxykanamycins B in an sich bekannter -eise durch Schutsgruppen maskiert. Lediglich die 1-Aminogriippe bleibt uninaskiert. Die präparative Herstellung eines solchen selektiv an den Aminogruppen maskierten Derivats der allgemeinen iormel (II) ist prinzipiell zwar möglich, erfordert jedoch eine Ileihe aufwendiger Verfahrensschritte. Statt dessen ist es daher vorzuziehen, lediglich die primäre 6'-Äminogruppe der Ausgangs ver bindung der allgemeinen Formel (IE) mit einer Schutzgruppe zu maskieren. Diese i-Iaskierung wird so durchgeführt, dass die 1-Aminogruppe unxnaskiert bleibt, ßine solche Maskierung ist relativ einfach und unkompliziert durchzuführen, da die 6'-Äminogruppe die chemisch aktivste aller Aminogruppen der Verbindung der allgemeinen E'ormel (II) ist. Diese Gruppe wird daher auch bevorzugt mit der Schutzgruppe umgesetzt. Bei geeigneter Verfahrensführung bleiben die übrigen Aminogruppen frei, während lediglich die 6'-Äminogruppe mit der Schutzgruppe maskiert wird. In Kanamycin B und 3',4'-Dideoxykanamycin B wird auch die 2'-Äminogruppe des I-ioleküls bei dieser Reaktion mit einer Schutzgruppe maskiert. Die 2ⁱ-Aminogruppe des Kanamycin B und des 3¹, 4'-Dideoxykanaxnycin3 B ist zwar weniger reaktiv als die 6'-Äminogruppe, jedoch reaktiver als die anderen Aminogruppen, also auch reaktiver als die 1-Aminogruppe. Entsprechend empfiehlt es sich für diese Verbindungen statt aller Aminogruppen ausser der 1-Aminogruppe lediglich die 6'-Äminogruppe oder sowohl die 6'-Äminogruppe und die 2'-Äminogruppe durch Schutzgruppen für die Acylierung mit dem Isoserin ziimaskieren.

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Pur die Umsetzung der in der beschriebenen Weise an den Aminogruppen mit Schutzgruppen versehenen Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (II), insbesondere für die Umsetzung des an der 6'-Aminogruppe bzw. gegebenenfalls auch an der 2'-Aminogruppe substituierten Kanamycins B und 3', 4' Dideoxykanamycins B, wird vorzugsweise ein Isoserin der Formel (III) eingesetzt, dessen Aminogruppe ebenfalls mit einer Schutzgruppe versehen isi:. üei der Acylierung kann ein Gemisch verschiedener Acylierungsprodukte entstehen, das das gewünschte 1-N-Mono-isoseryl-Produkt enthält, bei dem ausschliesslich die 1-Aminogruppe mit dem Isoserin acyliert worden ist. Als Nebenprodukte können unerwünschte Mono- oder Multiisoserylprodukte anfallen, bei denen andere Aminogruppen als die 1-Aminogruppe bzw. als die blockierte 6'-Aminogruppe und gegebenenfalls die bevorzugte ebenfalls blockierte 2'-Aminogruppe mit Isoserin acyliert sind. Bei der Entfernung der Aminoschutzgruppen entsteht aus diesem Reaktionsgemisch ein Gemisch von Isoserylderivaten der Ausgangsverbindung (II), das neben dem gewünschten 1-N-Mono-isoseryl-Produkt der allgemeinen Formel (I) als unerwünschte Nebenprodukte i-tono- oder Multiisoserylprodukte mit bereits abgenommenen Aminoschutzgruppen enthält. Das gewünschte l-N-Mono-isoseryl-Produkt (I) kann aus dem Gemisch der Isoserylderivate chromatographisch getrennt und isoliert werden. Die als iSTebenprodukte anfallenden Isoserylderivate weisen eine deutlich geringere antibakterielle Aktivität sowohl gegenüber resistenten als auch gegenüber empfindlichen Bakterien auf als das Produkt der allgemeinen Formel (I) der Erfindung.

Zur Lösung der Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung der allgemeinen Formel (I) zu schaffen, wird erfindungsgemäss folgendes Verfahren vorgeschlagen: Man acyliert eine Verbindung der allgemeinen Formel

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(IV)

in der R eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom und R¹¹ eine Aminogruppe -NH„, eine mit einer an sich bekannten Aminoschutzgruppe maskierte Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe ist, und zwar mit der Massgabe, dass, wenn R ein Wasserstoffatom ist, R" eine Aminogruppe oder eine blockierte Aminogruppe ist. R-, ist eine an sich bekannte Aminoschutzgruppe und R„ ein Wasserstoffatom, oder R, und R₃ gemeinsam eine an sich bekannte Aminoschutzgruppe' bilden, mit einer Isoserxnverbxndung, und zwar sowohl mit dem Racemat als auch mit dem reinen L-Isomer und dem reinen D-Isomer, der allgemeinen Formel:

HOOG-CH(OH)-CH₂N:

.R-

in der Ro und R^ je ein Wasserstoffatom oder eine bekannte

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Aminoschutzgruppe, oder R., und R^, gemeinsam eine bekannte zweiwertige Aminoschutzgruppe darstellen. Bei dieser Acylierung wird ein gemischtes Acylxerungsprodukt erhalten, das das gewünschte Zwischenprodukt der allgemeinen Formel

enthält, in der R, R", R-. , R_, R-. und R. je die vorstehend genannte Bedeutung haben. Anschliessend werden von den Aminogruppen der Verbindungen des so erhaltenen Reaktionsgemisches die Ärninoschutzgruppen abgenommen. Aus dem die freien Aminogruppen enthaltenden Reaktionsgemisch wird die gewünschte Verbindung der allgemeinen Formel (I) isoliert.

Zur Herstellung der im engeren Sinne als Ausgangsverbindung verwendeten Substanz der allgemeinen Formel (IV) mit den Aininoschutzgruppen werden Kanamycin, Kanamycin B bzw. 3',4'-Dideoxykanamycin B, also die Verbindungen der allgemeinen Formel (II), mit einem Reagenz umgesetzt, das zur Einführung von Äminoschutzgruppen beispielsweise aus der herkömmlichen Peptidsynthese bekannt ist. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Äminoschutzgruppen können

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also prinzipiell beliebige Schutζgruppen, vorzugsweise jene Schutzgruppen sein, die bei der herkömmlichen Peptidsynthese eingesetzt werden. Voraussetzung für die Brauchbarkeit der Schutzgruppe ist lediglich, dass sie aus den nach der Acylierung erhaltenen gemischten Acylierungsprodukten leicht wieder abgetrennt werden kann, insbesondere ohne dabei die Amidbindung der Acylierunjsprodukte zwischen dem 1-N-Isoseryirest und dem Kanamycinrest zu beeinträchtigen.

Als bevorzugte Beispiele für Aminoschutzgruppen seien für die Reste R, , R_, R.^ und R, folgende genannt: Alkyloxycarbonyl, wie beispielsweise k'thoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl oder t-Amyloxycarbonyl7 Cycloalkyloxycarbonyl, wie beispielsweise Cyclopentyloxycarbonyl oder Cyclohexyloxycarbonyl7 Äralkyloxycarbonyl, wie beispielsweise 3enzyloxycarbonyl oder p-Nitrobenzyloxycarbonyl; Aryloxycarbonyl, wie beispielsweise Phenoxycarbonyl7 sowie Furfuryloxycarbonyl und eine Acylgruppe, wie beispielsweise o-Siitrophenoxyacetyl und andere.

Wenn die Reste R-. und R~ bzw. die Reste R~ und R. gemeinsam eine zweiwertige Aminoschutzgruppe bilden, so kann diese beispielsweise eine der folgenden Gruppen sein: Sine Phthaloylgruppe, eine Salicylidengruppe und ganz allgemein eine AlJcylidengruppe oder eine Arylidengruppe der Formel Z=ClHi-, in der R- eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, ^thyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder Penty1 oder eine Arylgruppe, wie beispielsweise Phenyl, Tolyl, p-Methoxyphenyl oder ο-Hydroxyphenyl ist.

Aminoschutzgruppen vom Typ einer Alkyloxycarbonylgruppe, einer Ar alkyloxycarbonylgruppe oder einer Aryloxycarbonylgruppe können durch die allgemeine Formel -CO-OR^. wiedergegeben werden, in der R_fi eine Alkylgruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen ist, beispielsweise Methyl, Äthyl, t-Butyl oder

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t-Amyl, oder eine Cycloalkylgruppe mit 3-6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Cyclopentyl oder Cyclohexyl τ eine Aralkylgruppe, wie beispielsweise eine Phenylalkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, beispielsweise Benzyl oder p-Nitrobenzyl; eine Arylgruppe, wie beispielsweise Phenyl, oder eine heterocyclische Gruppe, wie beispielsweise Furfuryl,ist. Als Aminoschutzgruppen werden insbesondere tert-Butoxy und Benzyloxy bevorzugt. Diese Schutzgruppen können mit der 6'-Aminogruppe und gegebenenfalls auch mit der 2'-Aminogruppe der Verbindung der allgemeinen Formel (II) reagieren und lassen sich ausserordentlich leicht nach der Acylierung vom Acylierungsprodukt abnehmen.

Zur Herstellung einer Verbindung mit geschützten Aminogruppen der allgemeinen Formel (IV), in der die 6'-Aminogruppe allein oder zusammen mit der 2'-Aminogruppe durch eine Aminoschutzgruppe des Typs -CO-OR^ blockiert ist, wird die antibiotische Verbindung der allgemeinen Formel (II) mit im wesentlichen der äquimolaren Menge eines Säurechlorids der allgemeinen Formel

Cl-CO-OR₀ (VII)

oder mit einem p-Nitrophenylcarbonat der Formel

P-NO₂-C₆H₅-O-CO-OR₆ (VII')

oder mit einem N-Hydroxybernsteinsäureester der allgemeinen Formel

-0-CO-OR₆

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oder mit einem Azidoformiat der allgemeinen Formel

N₃-CO-OR₆ (VII"¹)

oder mit einem 4,6-Dimethylpyrimidyl-2-thiol-carbonat der allgemeinen Formel

S-CO-OR₆ (VII""

umgesetzt, wobei in den vorstehend genannten Formeln R^ die genannte Bedeutung hat. Die Umsetzung erfolgt in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise in Wasser, Äthanol, Aceton oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel unter neutralen oder basischen Bedingungen in der aus der Peptidsynthese bekannten Weise. Bei dieser Umsetzung wird ein Gemisch verschiedener Derivate der Verbindung der allgemeinen Formel (II) mit geschützten Aminogruppen erhalten. Der Hauptanteil dieses Gemischs ist eine Verbindung, bei der lediglich die 6' -Aminocjruppe mit der Gruppe -CO-OR,- blockiert ist. Ein wesentlich geringerer Anteil fällt auf eine Verbindung, die neben der b'-Aminogruppe mindestens noch eine der anderen Aminogruppen durch die Schutzgruppe blockiert enthält. Produkte, bei denen neben der 6'-Aminogruppe noch mindestens zwei weitere Aminogruppen mit der Schutzgruppe versehen sind, treten bereits kaum noch auf. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird chromatographisch getrennt. Dazu dient ein Ionenaustauscherharz mit CarboxyIfunktionen, beispielsweise ein Copolymerisat von Methacrylsäure mit Divinylbenzol (Amberlite IRC 50 oder Amberlite CG 50; Röhm & Haas). Die Austauscherharze liegen als Ammoniumsalze vor. Aus dem Gemisch kann auf diese Weise die ge-

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wünschte Verbindung (IV) isoliert werden, die lediglich die 6'-Aminogruppe allein oder gegebenenfalls auch die 2¹-Aminogruppe durch die Schutzgruppe vom Typ -CO-OR- blockiert enthält.

Zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (IV)₁ in der die 6'-Aminogruppe allein oder zusammen mit der 2'-Aminogruppe durch Schutzgruppen blockiert sind, und zwar durch zweiwertige Schutzgruppen vom Alkyliden-oder Arylidentyp =0101,-, wird die antibiotische Verbindung der allgemeinen Formel (II) durch Alkylidenierimg oder Ärylidenierung mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge eines Aldehyds der allgemeinen Formel

OHG-R₆ (VIII)

in der R_r die vorstehend genannte Bedeutung hat, in einer zur Herstellung von Schiffschen Basen an sich bekannten Weise modifiziert. Bevorzugte Beispiele für den Aldehyd der allgemeinen Formel (VIII) sind die folgenden: Acetaldehyd, Anisaldehyd, Tolylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd oder Salicylaldehyd. Bei dieser Umsetzung werden gemischte Alkylidenierungsprodukte oder Arylxdenierungsprodukte erhalten, die chromatographisch getrennt werden können. Dazu werden die zuvor genannten Kationenaustauscherharze verwendet. Bs wird so eine Ausgangsverbindung (IV) isoliert, in der die 6'-Aminogruppe allein oder zusammen mit der 2'-Aminogruppe durch eine Aminoschutzgruppe des Typs ³CHR₁- blockiert ist.

6'-W-tert-Butoxycarbonylkanamycin kann in hoher Ausbeute durch Umsetzen von Kanamycin in einem Losunysmittelgemisch aus Pyridin, Itfas'ser und Triäthylamin mit der ein- bis dreimolaren Menge tert-Butoxycarbonylazid hergestellt werden. Das Azid wird unter Rühren tropfenweise der Kanamycinlösung

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zugesetzt. Anschliessend wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird auf einer Kationenaustauschersäule chromatographiert. Als Austauscherharz dient vorzugsweise Amberlite CG 50 in der Ammoniumform. Bei dieser Reinigung wird das nicht umgesetzte Kanamycin zurückgewonnen. In gleicher Weise können 2',6'-Di-N-tertbutoxycarbonylkanamycin 3 oder -3',4'-dideoxykanamycin B in hoher Ausbeute hergestellt werden. Dazu, werden Kanamycin B bzw. 3', 4'-Dideoxykanamycin B in einem Lösungsmittelgemisch aus Pyridin, V/asser und Triethylamin mit der zwei- bis dreifachen molaren Menge von tert-Butoxycarbonylazid umgesetzt. Das Azid v/ird tropfenweise unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird anschliessend über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und anschliessend im Vakuum zur Trockne eingedanpft. Die Reinigung des festen Rückstandes erfolgt chromatographisch auf einer Kationenaustauschersäule, vorzugsweise auf einer Amberlite CG 50-Säule in der Ammoniumform. Wenn die beschriebene Umsetzung mit der zweifachen molaren Menge oder wenigert tert-Butoxycarbonylazid durchgeführt v/ird, können das 6¹—N—tert— Butoxycarbonyl-kanamycin B bzw. das entsprechende 3',4^- Dideoxykanamycin B in hoher Ausbeute erhalten werden. Die auf diese ?/eise isolierten Verbindungen können durch weitere Umsetzung mit 1 bis 2 mol tert-Butoxycarbonylazid in gleicher Weise in die entsprechenden 2',6'-Di-N-tertbutoxycarbonylderivate überführt werden. Die auf diese Weise hergestellten Verbindungen, die alle unter die allgemeinen Formel (IV) fallen, Können ohne weitere Reinigung als Aus'gangsverbindungen für das Verfahren der Erfindung verwendet werden.

Zur Acylierung der Ausgangsverbindung (IV) mit dem Isoserin der Formel (V) gemäss der Erfindung v/ird die Verbindung (IV) mit dem Isoserin (V) in an sich bekannter und für die Acylierung im Rahmen herkömmlicher Amidsynthesen

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•üblicherweise umgesetzt. So kann die Verbindung (IV) vorzugsweise mit dem Isoserin (V) in einer Lösung in Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran unter Eiskühluncfln Gegenwart eines Dehydratationsmxttels, wie beispielsweise Dxcyclohexylcarbodiimxd, kondensiert werden. Das eingesetzte Isoserin kann entweder racemisch oder in einer der optisch aktiven Formen vorliegen. Bei Verwendung einer der optisch aktiven Isoserine, also entweder des L-Isoserins oder des D-Isoserins, weist das Reaktionsprodukt die gleiche biologische Aktivität wie das raceraische Produkt auf. Das Isoserin (V) kann selbstverständlich auch in Form eines chemisch aktiven Derivats verwendet werden, beispielsweise in Form des Säurechlorids, des gemischten Anhydrids, in Form eines aktiven Esters oder eines Azids. So wird beispielsweise vorgezogen, das Isoserin (V) zunächst mit H-Hydroxybernsteinsäureimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarfoodiimid zum aktiven jJster der Formel

C=O * R

) N-OOC-CH(OH)-CH₂N (V)

—-4o ^vR₁

umzusetzen, der dann zur N-Acylierung der Verbindung (IV) mit dieser umgesetzt wird. Vorzugsweise wird die Verbindung (IV) mit der 0,5- bis 3-fachen molaren Menge des aktiven Esters des Isoserins (V) umgesetzt. Als Reaktionsmedium dienen Wasser und ein organisches Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethoxyäthan.

Vorzugsweise werden bei der Acylierung der Ausgangsverbindung (IV) Isoserinderivate (V) bzw. (V ) eingesetzt, deren Aminoschutzgruppen R„ und R den Aminoschutzgruppen R,, R und R" der Ausgangsverbindung (IV) entsprechen.

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Bei der Acylierung des Ausgangsproduktes (IV) mit dem Isoserin (V) bzw. (V) wird ein gemischtes Acylierungsprodukt erhalten, das in der Regel ein Gemisch des gewünschten 1-N-Mono-isoserylprodukts und anderer unerwünschter Mono-N-isoserylprodukte sowie ebenfalls unerwünschter Multi-N-isoserylprodukte ist.

Aus dem so erhaltenen Acylierungsreaktionsgemisch können dann die noch anhaftenden Aminoschutzgruppen entfernt werden. Die Airdnoschutzgruppen werden also wieder durch Wasserstoffatome ersetzt. Alternativ dazu können die gemischten Acylierungsprodukte jedoch vor dem Entfernen der Aminoschutzgruppen chromatographisch getrennt werden. Die
Trennung erfolgt vorzugsweise über Silicagel. Auf diese Weise wird auch die nicht umgesetzte Ausgangsverbindung (IV) bereits vor der Abnahme der Schutzgruppen entfernt.

Die Entfernung der restlichen Aminoschutzgruppen vom
gemischten Acylierungsprodukt kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Dazu stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Wenn als Schutzgruppe beispielsweise eine Alkyloxycarbonylgruppe dient, beispielsweise tert-Butoxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Alkyliden oder Aryliden, kann die Entfernung der Aminoschutsgruppe in der Weise erfolgen, dass man die Acylierungsprodukte einer Hydrolyse unter massig scharfen
Bedingungen in Säure, beispielsweise in wässriger Trifluoressigsäure, wässriger Essigsäure oder verdünnter Salzsäure, unterzieht. Wenn die Aminoschutzgruppe eine Aralkyloxycarbonylgruppe, beispielsweise eine Benzyloxycarbonylgruppe, ist, wird sie vorzugsweise in der Weise abgenommen, dass man die Acylierungsprodukte einer Hydrierung bzw.
Hydrogenolyse in Gegenwart eines Palladiumkohlenstoffkatalysators oder einer Behandlung mit Bromwasserstoff
in Essigsäure unterwirft. Bei Verwendung einer o-Nitrophenoxyacetylgruppe als Schutzgruppe kann diese reduktiv

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entfernt werden. Die Phthaloylgruppe als Aminoschutzgruppe kann vom Acylierungsprodukt durch Einwirken von Hydrazinhydrat in Äthanol unter Erwärmung entfernt werden. Wenn die Acylierungsprodukte unterschiedliche Schutzgruppen enthalten, so können die Acylierungsprodukte gleichzeitig oder aufeinanderfolgend den verschiedenen spezifischen oder bevorzugten Abspaltungsreaktionen unterzogen werden. Wenn die Acylierungsprodukte beispielsweise sowohl die tert-Butoxycarbonylgruppe als auch die Benzyloxycarbonylgruppe als Aruinoschutzgruppe enthalten, so können diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure katalytisch^ Hydrierung der Acylierungsprodukte mit 5 % Palladium auf Kohlenstoff in 90 %iger Trifluoressigsäure und Methanol abgespalten werden.

Nach Entfernung der Aminoschutzgruppe aus den Acylierungsprodukten werden die gemischten Acylierungsprodukte mit den freien Aminogruppen chromatographisch getrennt. Dabei werden nicht umgesetzte Ausgangsprodukte und Nebenprodukte vom Hauptreaktionsprodukt der allgemeinen Formel (I) abgetrennt. Diese Trennung und Reinigung wird vorzugsweise säulenchromatographisch mit Silicagel durchgeführt. Die Isolierung der gewünschten Verbindung der allgemeinen Formel (I) aus dem gemischten Acylierungsprodukt kann wirksam in der Weise durchgeführt v/erden, dass man die Acylierungsprodukte einer Ionenaustauschchromatographie unterzieht. Als Kationenaustauscherharz mit Carboxylgruppen wird dazu vorzugsweise Amberlite IRC 50 oder AmberIite CG 50 (Röhm & Haas) verwendet. Auch kann vorteilhaft erweise ein schwacher Kationenaustauscher vom Typ CM-Sephadex C-25 (Pharmacia Co., Schweden) oder kann CM-Cellulose verwendet werden. Das Eluat dieser chromatographischen Trennung wird in Fraktionen gesammelt. Die antibakterielle Aktivität der aufgefangenen Fraktionen wird unter Verwendng resistenter und empfindlicher Bakterien

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als Testmikroorganismen geprüft . Durch diese Prüfung der antibakteriellen Aktivität jeder aufgefangenen Fraktion

¹ ι ~ ι

können in einfacher Weise diejenigen !Traktionen bestimmt werden, die die gewünschte Verbindung der Formel (I) enthalten, aus den so bestimmten aktiven Fraktionen wird dann in an sich bekannter Weise in der für die Herstellung aminoglykosidischer Antibiotika üblichen Technik der Wirkstoff der Erfindung aufgearbeitet.

Als ausserordentlich wirksames Verfahren z,ur Isolierung und Reinigung der gewünschten Verbindung der Formel (I) aus dem gemischten Acylierungsprodukt hat sich die Ligandenaustauschchromatographie erwiesen. Dazu wird ein Anionenaustauscherharz verwendet, vorzugsweise Dowex 5OW χ (H-Cyclus). Dieses Harz ist zunächst mit einem Metallsalz beladen, beispielsweise mit Kupfer(II)-Chlorid, Kobalt(II)-chlorid, Nickelnitrat, Eisen(III)-chlorid, Zinkchlorid, Gadmiumchlorid oder ähnlichen Salzen, und wird anschliessend mit Ammoniak oder einem Amin, beispielsweise mit Methylamin, behandelt.

Die Erfindung ist nachstehend anhand von Ausführungsbei— spielen näher beschrieben.

Beispiel 1

Synthese von l-N-DL-lsoserylkanamycin:

(a) Herstellung von 6 '-IJ-1ert-Butoxycarbony!kanamycin:

20 g, entsprechend 41,3 m-mol Kanamycinbase werden in 1600 ml eines CJemischs aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin im Volumenverhältnis 10 : 10 : 1 gelöst. Zu der Lösung •werden dann 5,9 g, entsprechend 41,3 mmol, tert-Butoxy— carbonylazid gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur

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20 h lang gerührt. Dabei tritt die tert-Butoxycarbonyliaerung ein. Das Realct ions gemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der erhaltene feste Rückstand wird in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wM auf eine 1000 ml-Säule gegeben, die mit einem Kationenaustauscherharz beschickt ist. Das Austauscherharz besteht im wesentlichen aus einem Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol in der Ammoniumform (Amberlite GG 50). Dabei werden die Butoxycarfoonylisierungsprodukte ain. Harz adsorbiert. Die Säule wird dann mit 5000 ml Wasser und anschliesssend mit 5000 ml 0,05 η wässrigem Ammoniak ge\vaschen. Anschliessend wird mit ο,Ι η wässrigem Ammoniak eluiert. Diejenigen Eluatfraktionen, die eine positive Ninhydrinreaktion und eine positive Rydon-Smith-Reaktion zeigen, und ausserdem bei einer Hochspannung-Papierelektrophorese nur einen einzigen Wanderungsfleck zeigen, werden miteinander kombiniert und zur Trockne eingeengt. Es werden 10,9 g eines weissen Pulvers entsprechend einer Ausbeute von 451 3 % 6'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin erhalten. Zersetzungspunkt 202 - 203 ⁰C. Bei weiterem bluieren der Säule mit o,3 η wässrigem Ammoniak wird das nicht umgesetzte Kanamycin in einer Ausbeute von 7,3 g, entsprechend 36,6 %, zurückgewonnen.

(b) Herstellung von 1-N-DL-Isoserylkanamycin:

Das in der Verfahrensstufe (a) erhaltene 6'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin wird in einer Menge von 633 mg entsprechend 1,0 mmol in einem Gemisch von 10 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelost. Die Lösung wird anschliessend mit 303 mg, entsprechend 1,0 mmol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester des tert-Butoxycarbonyl-DL-isoserins in 5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur zur Durchführung der Acylierung 21 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne

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einqjeengt. Die dabei erhaltenen festen Acylierungsprodukte werden ohne weitere Reinigung in 5 ml 90 %iger wässriger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung bleibt 45 min lang bei Zimmertemperatur stehen. Dabei tritt eine Entfernung der tert-Butoxycarbonylschutzgruppen ein. Anschliessend wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dabei wird ein Peststoff erhalten, der mit 40 ml Athyläther gev/aschen wird. Nach dem Waschen werden 1367 mg Feststoff erhalten. Das erhaltene Material wird in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird auf eine 25 rnl-Kationenaustauschersäule gegeben. Das Austauscherharz besteht im wesentlichen aus einem Copolymerisat aus Methacrylsäure und Divinylbenzol in Amraoniumform (Amberlite CG 50). Die Acylierungsprodukte werden am Harz adsorbiert. Die Säule wird anschliessend mit 125 ml Wasser gewaschen. Dann wird mit ο,25 η wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird in 5 ml-Fraktionen gesammelt. Jede der Fraktionen wird in üblicher Weise auf der Tiipfelplatte auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Dazu dient ein kanamycinempfindlicher Stamm von

Bacillus subtilis PCI 219 und kanamycinresistenter Stamm von Escherichia coli JR66/w677 als Testorganismus. Diejenigen Fraktionen, die gegenüber beiden Stämmen eine hohe antibakterielle Aktivität zeigen, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dabei werden 190 mg eines weissen Pulvers erhalten. Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (ART 5721) zeigt dieses Produkt noch immer Verunreinigungen. Als Laufmittelsystem für die Dünnschichtchromatographie dient ein Gemisch aus Methanol, Chloroform, 28 %igem wässrigen Ammoniak und Wasser im Verhältnis 4 : 1 : 2 : 1. Das erhaltene weisse Pulver wird daher erneut in einem Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17 tigern wässrigen Ammoniak im Volumenverhältnis 4:1:2 gelöst. Die Lösung wird säulenchromatographisch über 12 g Kieselsäure gereinigt. Die r.ieselsäuresäule wird mit dein gleichen

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Lösungsmittelgemisch eluiert, in dein das Pulver aufgenommen wurde. Das Eluat v/ird in 4 ml Fraktionen aufgefangen. Jede der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch auf Silicagel getestet. Fraktionen, die dabei nur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden vereinigt und zur Trockne unter verhinderten Druck eingeengt, ßs werden 97 ng 1-H-DL-Isoserylkanamycin Λ in Form eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten. Die Ausbeute ist 17,0 %. Der 3er-

setzungspun

in Viasser).

setzungspunkt liegt bei 174 - 177 °C. |>7^⁵ + 89° (c 0,65

Elementaranalyse:

Gefunden: G 43,90 %', H 7,56 %; N 11,89 %

Berechnet für C-,Η.,Ι,Ο,,: G 44,13 %; H 7,23 %; N 12,25 %

2.1. 4X O Xj

Beispiel 2

Synthese von l-N-DL-Isoseryl-3 ' , 4'-dideoxykanamycin 13

(a ) Herstellung von 6 ' -ii-tert-Butoxycarbonyl-3 ' , 4 ' -dideoxylcänaraycin B:

5 g, entsprechend 11 mmol, 3',4'-Dideoxykanamycin B-Base werden in 555 ml eines Geraisches von Pyridin, Wasser und Triethylamin im Voluraenverhältnis 10 : 10 : 1 gelöst. Zur Lösung werden 1,58 g, entsprechend 11 mmol, tert-ßuto::y carbonyla^id gegeben. Zur Durchführung der tert-3utoxycarbonylisierung v.drd das Geraisch bei Zimmertemperatur 14 h. lang gerührt. Das iieaktionsgemisch vd.rd unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird auf eine 300 ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Das Harz besteht i wesentlichen aus ein^m Copolymer!sat von Methacrylsäure und Divinylbenzol in der Ammoniunform (Amberlite ZG 50)

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Dabei werden die Butoxycarbonylisierungsprodukte am Harz adsorbiert. Die oäule wird mit 1500 ml V/asser gewaschen und anschliessend mit 0,2 %igem wässrigen Ammoniak eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Diejenigen !Traktionen, die eine positive Ninhydrinreaktion und eine positive Ilydon-Smith-Reaktion zeigen und bei der Hochspannungspapierelektrophorese nur einen einzigen Wanderungspunkt zeigen, v/erden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt. Dabei wer-den 2,8 g 6'-N-tert-Butoxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamycin B in Form eines weissen Pulvers erhalten. Der Zersetzungpunkt des Produktes lieqt bei 136 140 °C. Die Ausbeute beträgt 49 %. Beim weiteren Eluieren der Harzsäule mit 1 /oigem wässrigen Ammoniak wird das nicht umgesetzte 3',4'-Üideoxykanamycin B in einer Ausbeute von 1,3 g, entsprechend 36 νό, zurückgewonnen.

(b) Herstellung von l-N-DL-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B:

553 mg, entsprechend 1,0 imnol, des in der Verfahrensstufe (a) erhaltenen 6'-N-tert-Butoxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamycins B werden in 21 ml eines Gemischs aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin im Volumenverhältnis 10 : 10 : 1 gelöst. Die Lösung wird mit 160 mg, entsprechend 1,1 mmol, tert-Butoxycarbonylazid versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 23 h lang gerührt. Das dabei erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Es werden 757 mg eines blassgelben Pulvers erhalten, das ein Gemisch aus ö'-IT-tert-Dutoxycarbony1-3',4'-dideoxykanamycin B und 2 ' ,6'-Di-N-tertbutoxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamycin B sowie von Spuren der entsprechenden Stellungsisomeren ist. Das erhaltene Pulver wird ohne weitere Reinigung in einem Gemisch aus 10 ϊϊιΙ Wasser und 10 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird dann mit einer Lösung von 330 mg, entsprechend 1,1 mmol, -T-Hydroxybemsteinsäureimidester von tert-Butoxycarbonyl-DL-isoserin in 5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch v/ird

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bei Zimmertemperatur 24 h lang zur Durchführung der Acylierung gerührt. Das .erhaltene Reaktionsgemisch wird dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Die Acylierungsprodukte werden als Feststoff erhalten. Das feste Reaktionsprodukt wird in 5 ml 90 %iger wässriger Trifluoressigsäure aufgenommen. Die dabei erhaltene Lösung wird bei Zimmertemperatur 30 min lang stehengelassen. Dabei werden die tert-Butoxycarbonylschutζgruppen abgetrennt. Die Reaktions-Jbsung wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Das dabei erhaltene feste Produkt wird mit einem geringen Volumen Äthyläther gewaschen. Es werden 1,66 g eines schwach gelblichen Pulvers erhalten. Das erhaltene Pulver wird in Wasser gelöst. Die Lösung wird auf eine 25 ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Das Harz besteht im wesentlichen aus einem Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylberizol in der Ammoniumform (Arnberlite CG 50). Die Äcylierungsprodukte werden am Harz adsorbiert. Die Harzsäule wird dann mit 125 ml Wasser gewaschen und mit 0,5 η wässrigem Ammoniak eluiert. Das äluat wird in 5 ml-Fraktionen gesammelt. Jede der Fraktionen wird nach dem üblichen Verfahren auf der Platte auf ihre antibakterielle Aktivität geprüft. Dazu dient ein kanamycinempfindlicher Stamm von Bacillus subtilis PCX 219 und ein kanamycinresistenter Stamm von Escherichia coli JR66/W677 als Testmikroorganismus. Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber beiden Stämmen aufweisen, werden miteinander vereinigt undjunter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 322 mg eines weissen Pulvers erhalten. Die Dünnschichtchromatographie auf Gilicagel zeigt, dass dieses Pulver noch immer Verunreinigungen enthält. Die Reinigung v/ird auf einer Chromatographiesäule über 12 g Kieselsäure durchgeführt. Die das adsorbierte Acylierungsprodukt enthaltende Silicagelsäule wird mit einem Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17 %igem wässrigen A^.iinoniak im Volumenverhältnis 4:1:2

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eluiert. Die Eluate werden in 4 ml-Fraktionen gesammelt. iTede der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch auf Silicagel geprüft, üluatfraktionen, die bei dieser Prüfung rur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden miteinander vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 91 mg l-N-DL-Isoseryl-3',4'-didcoxykanamycin B in Form eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten. Die Ausbeute beträgt

17 %. Der Zersetzungspunkt liegt bei 174 - 175 °C. [a]^⁶ + 02° (c 0,32 in Wasser).

^lementaranalyse

Gefunden: C 46,00 %; H 7,97 %; N 15,70 %

Berechnet für C₀₁H₁₀]SL-O_1n: C 46,83 %r H 7,86 %; N 15,61 %

ZX 4i D XU

Beispiel 3

Synthese von 1-N-DL-Isoserylkanamycin B:

(a) Herstellung von 6'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin B!

4,83 g, entsprechend 10 mmol, Kanamycin B-Base werden in 100 ml Wasser gelöst. Zur Lösung werden 2,40 g, entsprechend 10 mmol, tert-Butyl-4,6-dimethyl-pyrimidyl-2-thiol-carbonat in 100 ml Dioxan gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur zur Durchführung der tert-Butoxycarbonylisierung

18 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Feststoff wird in TTasser gelöst. Die erhaltene wässrige Lösung wird auf eine 35o ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Das Harz besteht im wesentlichen aus einem Copolymerisat aus Methacrylsäure und Divinylbenzol in Ammoniumform (Amberlite CG 50). Das Harz wird mit den Produkten der Rutoxycarbonylisierung beladen. Anschliessend"wird mit

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1400 ml Wasser gewaschen und mit 0,2 zeigern wässricjen Ammoniak eluiert. Diejenigen Fraktionen des Eluats, die eine positive ISFinhydrinreaktion und eine positive Rydon-Smith-Reaktion zeigen und ausserdem bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese nur einen einzigen Lauffleck zeigen, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eincfedarnpf t. Dabei werden 2,35 σ 5 '-li-tert-Butoxycar.oonylkanainycin E in Form eines weissen Pulvers mit dem Zersetzungspunkt 160 - 172 G erhalten. Die Ausbeute entspricht 40 %. Bei weiterem kluieren der Austauschersäule mit o, 6 /oigem wässrigen Ammoniak wird das nicht umgesetzte Kanamycin B in einer Ausbeute von 1,0 :j, entsprechend 21 \i>, ξ urü ckgewo nnen.

(b) Herstellung von 1-W-DL-Isoserylkanarnycin B:

584 mg, entsprechend 1,0 inraol, des in der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe (a) erhaltenen 6 '-l-T-tert-Butoxycarbonylkanamycins 3 werden in 21 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triethylamin im Volumenverhältnis 10 : 10 : 1 gelöst. Zu der Lösung werden 150 mg, entsprechend 1,1 mmol, tert-Butoxycarbonylazid gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 23 h lancj gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es v/erden 715 rag eines biassgelben Pulvers erhalten. Dieses Pulver ist ein Gemisch aus β'-lv-tert-Butoxycarbonylkanamycin B und 2',6'-Di-N-tert-butoxycarbonalkanamycin B sov/ie von Spuren von Stellungsisomercn dieser Substanzen. Das erhaltene Pulver wird ohne weitere Reinigung in einem Gemisch aus 10 ml Wasser und 5 r.il Diraethoxyäthan jelöst. Die Lösung wird dann mit einer Lösung von 330 rag, entsprechend 1,1 mmol, des N-lIydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-DL-isoserin in 6 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur zur Durchführung der Acylierung 24 h lang gerührt.

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Das Reactionsgemisch wird unter vermindertem uruck zur Trockne eingeengt. Die dabei erhaltenen festen Acylierungsprodukte v/erden in 5 ml 90 "joiyer wässriger Trifluoressigsäure aufgenommen. Die Lösung wird bei .dimmertemperatur 30 min lang stehengelassen. Dabei werden die tert-Butoxycarbonylgruppen vollständig entfernt. Die Reactionslösung wird unter vermindertem Druck zur j-'rockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird mit einem gerinaen Volumen Mthyl-Hther rjevaschcn. Nach den Waschen werden 1,75 g eines blassgelben PuIver.3 erhalten. Das Pulver v/ird in Wasser crelöst. Die wässrice Lösung wird auf eine 30 ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Das Harz besteht im wesentlichen aus einem Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol (Amberlite CG 50) in der Ammoniumform. Dabei werden die Äcylierungsprodukte am Harz adsorbiert. Die Harz- säule wird mit 150 Tal Wasser cjewaschen und mit o,25 η wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird in β ml-Fraktionen aufgefangen. Jede der Fraktionen wird in üblicher Ueise auf der Platte auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Als Prüfmikroorganismen dienen dabei ein kanamycinempfindlicher 3 tarm ι von Bacillus subtilis PCI und ein kanamycinresistenter Stann von Escherichia coli JR66/W677. Diejenigen Fraktionen, die eine hohe antibakterielle Aktivität sowohl gegenüber dem empfindlichen als auch gegenüber dem resistenten Stamm zeigen, v/erden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 240 mg eines weissen Pulvers erhalten. Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel zeigt sich, dass dieses Pulver noch Verunreinigungen enthält. 7.ur Reinigung wird es auf eine mit 11 g Kieselsäure beschickte Chromatographiesäule gegeben. Die die adsorbierten Acylierungsprodukte enthaltende Kieselcjelsäure wird mit einem Gemisch aus Methanol, Chloroform und 17 /'oigein wässrigen Ammoniak im Volumenverhältnis 4:1:2 eluiert. Das Eluat wird in 4 ml-Fraktionen aufgefangen. Jede der Fraktionen wird dünnschichtchromato-

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graphisch auf Silicagel geprüft. Diejenigen Fraktionen, die dabei nur einen einsigen Lauffleck zeigen, v/erden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dabei werden 69 mg l-N-DL-Isoserylkanamycin B in Form eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten. Jie Ausbeute entspricht 12 %. Der Zersetsungspunkt de3 Produktes liegt bei 179 - 184 "⁰C. f^i·,², + '^ö° (c 0,72 in Wasser).

Elementaranalyse;

Gefunden: G 44,52 tf; H 7,13 yoj -<r 14,92 ·,«

Berechnet für ^G ₂l^H42^i:i6⁰12^{: C 44}'²⁰ ^:"^a' ^{n 7}'⁴¹ ^%' ^{W 14}'⁷³ '^&

Beispiel 4

Synthese von l-N-DL-Isoseryl-3' ,4'<-dideoxykanamycin B:

(a) Herstellung von 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3' ,4'-dideoxykanamycin B:

13,53 g, entsprechend 30 mmol, 3',4'-Dideoxykanamycin (im folgenden DKB) v/erden in Form der Base in 135 rnl Wasser gelöst. Zur Lösiang werden tropfenweise 5,61 g, entsprechend 33 mmol, Benzyloxycarbonylchlorid im Verlauf 1 h unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt. Die Lösung wird dabei auf einer Temperatur im Bereich von vorzugsweise 0 - 5 C gehalten. Nach Abschluss der Zugabe wird das Gemisch noch 1 h lang bei Zimmertemperatur gerührt. Anschliessend wird zur /abtrennung des Niederschlages filtriert. Das Filtrat wird mit 135 rai Kthyläther gewaschen. Die wässrige Phase wird durch Zusatz von wässrigem 7\n;ioniak neutralisiert und anschliessend unter vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte Lösung wird auf eine 480 ml-Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Das Austauscherharz besteht im wesentlichen aus einera CopoK^aerisat von Methacrylsäure und

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Divinylberizol (/.iaberlite C-J 50) in der ^mmoniuinform. Dabei v.drd das benzylorcycarbcnylisiertG DK" ara Harz adsorbiert. Die Siule wird mit 1920 ml wasser gewaschen und dann mit 0,1 η wässrigem Ammoniak eluiert. Die ersten 960 ml dec hlluats werden verworfen. Die folgende 780 ml-Fraktion wird aufaeiangen, eingeengt und gefriergetrocknet. Dabei v/erden 5,43 g 6 ' -N-Benzyloxycarbonyl-DKB in Form eines farblosen Pulvers erhalten. Der Schmelzpunkt dieser Substanz liegt bei 113 - 115 " J, wobei beim Schmelzen eine Zersetzung unter Aufschäumen einhergeht. Die Aus3:>eute beträgt 31 Vo.

(b) Herstellung von l-.'\-DL-Isoseryl-3 ' , 4'-dideoxykanamycin B:

1 g, entsprechend 1,62 mnol, 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamycin B werden in 85 ml eines Gemisches aus Pyridin, Wasser und Triathylamin im Volumenverhältnis 10 : 10 : 1 gelöst. Die Lösung wird mit 256 mg, entsprechend 1,7c; rraol, tert-Butoxycarbonylazid versetzt. Das Gemisch wird 21 h lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das dabei erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Es werden 1,27 σ eines gelblichen Pulvers erhalten. Dieses Pulver ist ein Gemisch von 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamycin B und 2'-N-tert-Butoxycarbonyl-6 ' -lsJ-benzyloxycarbonyl-3 ' , 4' -dideoxykanamycin B und enthält Spuren von Stellungsisomercn. Ohne weitere Reinigung wird das erhaltene Pulver in einem Gemisch von 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Su der so hergestellten Lösung wird eine Lösuncf von 623 mg, entsprechend 1,78 mmol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester von Benzyloxycarbonyl-DL-isoserin in 20 ml Dimethoxyäthan gegeben. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur 24 h lang gerührt. Das -leakti ons geraisch wird unter vermindertem Druck zur x'rocicne eingeengt. Die dabei erhaltenen festen Acylierungsprodukte v/erden in einem Gemisch von 13 ml

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90 '/edger wässriger Trifluoressigsiiure, 9 ml Methanol und 1 raol Wasser gelöst und in Gegenwart von 640 ^racf 5 '/■> Palladium auf Kohlenstoff als Katalysator oei Atmosphärendruck 5 h lang· hydriert. Dabei v/erden gleichzeitig beide Arten der Aminoschutzgruppen enüfernt. Wach Abtrennen des Katalysators durch Filtrieren und /abziehen der flüchtigen Bestandteile wird ein farbloses Pulver erhalten. Dieses Pulver wird der im Beispiel 2 (b) beschriebenen ./eise gereinigt. Dabei wird das l-H-DL-Isoseryl-3 ' , 4¹ -dideoxykanamyein B in 13 Voiger Ausbeute erhalten.

Beispiel 5

Synthese von 1-N-DL-1 sos eryl kanamycin .3:

(a) Herstellung von 6 ' -Ii-Benzyloxycarbonylkanamycin Ii:

5,d ei, entsprechend 12 uiinol, Kanamycin IM-Base v/erden in 116 Pil Nasser gelöst. Die Lösung wird tropfenv/eise mit 2,04 g, entsprechend 12 mmol, Den.'syloxycarbonylchlorid im Verlauf von 1 h unter Eiskühlung und Rühren versetzt. Nach Abschluss der Zugabe wird das Gemisch noch 2 h lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das ^eaictionsg^emisch wird zur Abtrennung des Niederschlages filtriert. Das IPiltrat wird mit 116 ml «thyläther gewaschen. Die wässrige Phase wird mit wässrigem Ammoniak neutralisiert und anschlies3end unter vermindertem Druck konzentriert. Die so konzentrierte wässrige Lösung wird auf eine 240 ml-ICationenaustauscherharzsäule gegeben. Das Harz besteht im wesentlichen aus einem Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol (Amberlite CG 50) in der Aramoniumform. Das 6'-N-benzyloxycarbonylisierte Kanamycin B wird dabei am Harz adsorbiert. Die Säule wird mit 960 ml Viasser gewaschen und anschliessend mit 0,1 η wässrigem Ammoniak eluiert. Diejenigen Fraktionen des Eluats, die eine positive

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Rydon-Smith-Reaktion zeigen und bei der Hochspannungs-Papierelektro-ohorese nur einen einzicjen Lauffleck zeigen, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt. Dabei werden 2,7 q 6'-.u-Benzyloxycarbonyl-kananycin B in ,.-'oral eines weissen lulvers erhalten. Die Ausbeute entspricht 37 ,·:>.

(b) Synthese von i-iM-DL-Isoserylkanamycin 3:

In der im Beispiel 4 (b) beschriebenen Weise wird das ö'-iT-Bensyloxycarbonyl-Kanamycin B mit tert-Butoxycarhonyl— azid butoxycarbonylisiert, mit dem iNf-Hydroxybernsteinsäureiraidester von tert-Eensyloxycarbonyl-DK-isoserin acyliert, v/erden die 'T—SchutzgruDpen durch ka ta Iy ti seile Hydrierung in saurer Lösunq entfernt und wird durch Säiulenchromatographie gereinigt. Dabei wird das 1-iM-DL-Isoserylkanamycin B in einer Ausbeute von 17 ',° erhalten.

Beispiel 5

ovnthese von 1-^r-L-Isoserylkanamycin:

316 mg, entsprechend 0,5 mrnol, 6 '-Jsf-tert-Butoxycarbonyllcanamycin werden in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 2,5 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 225 mg, entsprechend 0,7 :nmol, N-Hydroxybernsteinsäureimidester von tert-Butoxycarbonyl-L-isoserin in 2,5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird dann in der im Beispiel 1 (b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei werden 48 mg 1-H-L-lsoserylkanamycin in einer Ausbeute von 17 % erhalten.

Beispiel 7

Synthese von 1-N-D-Isoserylkanamycin:

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10,5 mg, entsprechend 0,18 rnmol, 6 '-ϊ-7-tert-Butoxycar bom/1 kanamycin werden in einem Gemisch von 2,5 ml vvasser und 1,25 ml Diinethoxyäthan gelöst. Die Lösung· wird mit einer Lösung von 55 rag, entsprechend 0,Ii; rnrnol, N-HydroxybernsteiiB äureiüiidester von tert-^utoxycarbonyl-D-isoserin in 1,25 ml DinietTioicytithan versetzt. Das Gemisch vdrdin der im Beismel· l(b) beschriebenen Tveiße weiterverarbeitet. Dabei werden 12 mg l-N-D-Iraoserylxananycin, entsprechend einer Ausbeute von In ■;£,, erhalten.

Beispiel G

Synthese von 1-IT-L-Isoserylkanamycin Il

117 mg, entsprechend 0,2 ncnol, β'-JO-tert-r.utoxycarmnyl-Jcanaraycin B werden in 4 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triethylamin im Volunenverhältnis 10 : 10 : 1 gelöst. Die Lösuncr wird init 32 mg, entsprechend 0,22 τητποί, tert-Butoxycarbonylariid versetzt. Das Gemisch wird 23 h bei Zimmertemperatur gerührt. Das dabei erhaltene Rea'ktionsgemisch wird unter verminderten Druck zur Trockne eingeengt. Ohne weitere Reinigung v/ird der Rückstand in einem Gemisch von 2 nl vvasser und 2 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 66 mg, entsprechend 0,22 mmol, des N-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-L-isoserin in 1 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird in dex~ im Beispiel 3 (h) beschriebenen vveise weit erverarbeitet. Dabei wird das l-'iT-L-Isoserylkanamycin B in einex- Ausbeute von 16 % erhalten. Der Zersetzungspunkt liecft bei 1(39 - 194 G.

Beispiel 9

Synthese von l-N-D-Isoserylkanamycin B

56 ιϊκτ, entsprechend 0,1 üe:lo1, ö'-N-tert-Butoxycarbonyl-

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kanamycin werden in 2 ml eines Gemisches von Pyridin, Wasser und Triäfehylamin im Volumenverhältnis 10 : 10 : gelöst. Dem Lösungsmittelgemisch sind 16 mg, entsprechend 0,11 mmol, tert-Butoxycarbonylasid zugesetzt. Es wird 23 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Ohne Reinigung wird der Rückstand in einem Gemisch aus 1 ml Wasser und 1 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 33 mcj, entsprechend o,11 mmol, des N-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-D-isoserin in 0,5 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird anschliessend in der im Beispiel 3 (b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei wird das 1-N-D-Isoserylkanamycin B in einer Ausbeute von 15 % erhalten. Der Zersetzungspunkt liegt bei 133 - 194 ⁰C.

Beispiel 10

Synthese von l-N-L-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B:

111 mg, entsprechend 0,2 mmol, 6'-N-tert-3utoxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamycin B werden in 4 ml eines Gemische von Pyridin, Wasser und Triethylamin im Volumenverhältnis 10 : 10 : .1 gelöst. Zur Lösung werden 32 mg, entsprechend 0,22 mraol, tert-Butoxycarbonylazid gegeben. Es wird 23 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Ohne Reinigung wird der Rückstand in einem Gemisch aus 2 ml Wasser und 2 ml Dimethoxyäthan gelöst. Die Lösung wird mit 66 mg, entsprechend o,22 mmol, des N-Hydroxybernsteinsäureimidesters von tert-Butoxycarbonyl-L-isoserin in 1 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird anschliessend in der im Beispiel 2 (b) beschriebenen Weise weiterverarbeitet. Dabei wird das l-N-L-Isoseryl-3',4*-dideoxykanamycin B in 19 %iger Ausbeute erhalten. Der Zersetzungspunkt des

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Produkts liegt bei 184 - 136 °C.

3eispiel 11

Synthese von l-N-D-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin 3:

In der im Beispiel 2 (b) beschriebenen Weise wird 6'-N-tert-Butoxycarbonyl-3¹,4'-dideoxykanamycin E mit tert-ßutoxycarbonylazid butoxycarbonylisiert. Anschlies-. send wird mit dem IT-Hydroxybernsteinsäureimidester des tert-Butoxycarbonyl-D-isoserins acyliert und werden die tert-Butoxycarbonylschutsgruppen entfernt. Dann wird in der ebenfalls im Beispiel 2 (b) beschriebenen Weise säulenchromatogräphiert. Dabei wird das 1-N-D-Isoseryl-3',4·-dideoxykanamycin B in einer Ausbeute von 18 % erhalten. Der Zersetzungspunkt des Produktes liegt bei 134 - 187 °C.

Die vorstehend beschriebenen Beispiele können in gleicher Weise und mit gleichem Erfolg mit der Abänderung wiederholt werden, dass die allgemein oder spezifisch beschriebenen Reaktionsteilnehmer und bzw. oder Reaktionsbedingungen in der aus dem allgemeinen Teil der Beschreibung ersichtlichen Weise modifiziert werden. Der Fachmann kann nach Kenntnisnahme der Beschreibung ohne erfinderisches Sutun eine Reihe von weiteren Modifikationen vornehmen.

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Claims

Patentansprüche

1. 1-N-Isoserylkanamycin A₁ l-N-Isoserylkanamycin B und l-N-Isoseryl-3·,4'-dideoxy-kanamycin B sowie deren nichttoxische Salze.

2. 1-N-DL-Isoserylkanamycin A.

3. l-l-SF-L-Isoserylkanainycin A.

4. l-n-D-lsoserylkanamycin A.

5. 1-fi-DL-Isoserylkanamycin B.

6. l-H-L-Isoserylkanainycin B.

7. l-U-D-Isoserylkanamycin B.

8. l-M-DL-Isoseryl-3·,4'-dideoxykanamycin B.

9. l-N-L-Isoseryl-3',4'-dideoxykanamycin B.

10. l-J-?-D-lsoseryl-3 ' , 4' -dideoxykananycin B.

11. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel

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6" 4» CH₂OH

in der R eine Hydroxylgruppe oder ein Viasserstoffatom und R" eine Aminogruppe -NII₂, eine mit einer an sich bekannten Aminoschutzgruppe blockierte Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe ist, und zwar mit der Massgabe, dass, wenn R Wasserstoff ist, R" eine Aminogruppe oder eine blockierte Aminogruppe ist, und R, eine an sich bekannte Aminoschutzgruppe und R„ ein Wasserstoffatom oder R-J und R„ zusammen eine zweiwertige x^minoschutzgruppe bedeuten, mit einer Isoserinverbindung der allgemeinen Formel

HOOC-CH(OH)-CH_?N

in der R- und R^ je ein Wasserstoffatom oder eine an sich belcannte Aminoschutzgruppe bedeuten oder R., und R. zusammen eine an sich bekannte zweiwertige Aminoschutzgruppe darstellen, acyliert und dabei im Gemisch Äcylierungsprodukte erhält, die als Zwischen-

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produkt eine Verbindung der allgemeinen Formel

in der R, R", R-, , R^, K._ und R. die vorstehend genannte Bedeutung haben, erhält, dass man von den so erhaltenen gemischten Acylierungsprodukten die Aminoschutzgruppen abnimmt und dass man dann das gewünschte Endprodukt aus dem Acylierungsproduktgemisch mit den freien /iminogruppen isoliert.

12. verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,

dass man als Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel Ov) 6'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin oder 6'-N-Benzyl oxycarbonylkanamyciη verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,

dass man als Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (IV) 2',6'-Di-N-tert-butoxycarbony!kanamycin B oder 2',6'-Di-N-tert-butoxycarbonyl-3',4'-dideoxykanamvcin B verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,

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dass man als Ausgangsverbindung der allganeinen Formel (IV) 2■-N-tert-Butoxycarbonyl-6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin B verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (IV) 2'-N-tert-Butoxycarbonyl-6'-N-benzyloxycarbonyl-3 ' , 4'-dideoxykanamycin B verwendet.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als Isoserinverbindung der allgemeinen Formel (V) als Acylierungsmittel den N-Hydroxybernsteinsäureimidester einsetzt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man die Isolierung der gewünschten Produktverbindung aus dem Gemisch der von den Aminoschutzgruppen befreiten .Reaktionsprodukte chromatographisch mittels eines funktionelle Carboxylgruppen enthaltenden Kationenaustauscherharzes durchführt.

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