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kanamycin A der allgemeinen Formel (I)
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worin n für 1 oder 2 steht, sowie deren Säureadditionssalze.
Es wurde gefunden, dass gegen Heilmittel resistente Stämme von gramnegativen Bakterien, die von Patienten isoliert wurden, nämlich der resistente Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa und einige andere Arten resistenter Bakterien, ein Enzym (Phosphotransferase) produziren, welches die 3'-Hydroxylgruppe von Kanamycin A, Kanamycin B und anderer analoger aminoglykosidischer Antibiotika phosphoryliert, und dass diese aminoglykosidischen Antibiotika ihre anti-
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Nachdem dies erkannt worden war, wurden ausgedehnte Untersuchungen über den Mechanismus der
Resistenz von Bakterien gegen aminoglykosidische Antibiotika angestellt.
Es wurde dabei gefunden, dass eine oder einige in den aminoglykosidischen Antibiotika vorhandenen Hydroxylgruppen, beispielsweise die Hydroxylgruppen an der 4'- und/oder 2"-Stelle der aminoglykosidischen Moleküle von einer grossen Anzahl resistenter Bakterienstämme phosphoryliert oder adenyliert werden können, so dass das aminoglykosidische Stammantibiotikum seine antibakterielle Wirksamkeit verlieren kann. Auf diesen Untersuchungsergebnissen fussend wurden viele halbsynthetische Derivate von aminoglykosidischen Antibiotika auf halbsynthetischem Wege hergestellt, die auch gegen resistente Stämme aktiv sind. Von diesen halbsynthetischen Derivaten aminoglykosidischer Antibiotika ist das 3', 4'-Dideoxykanamycin B (JP-Patentveröffentlichung 7595/75 und 46110/76, US-PS Nr. 3. 753, 973) unter dem Freinamen Dibekacin bekannt.
Es wird bei der Therapie bakterieller Infektionen in Kliniken weit verwendet, da Dibekacin bemerkenswert aktiv gegen eine grosse Anzahl resistenter Bakterien ist.
Die Erfindung, dass die Entfernung der 3'- und 4'-Hydroxylgruppen von Kanamycin B, also die 3', 4'-Di-deoxygenierung von Kanamycin B, eine halbsynthetische Substanz ergibt, die die antibakterielle Wirksamkeit der Stammsubstanz Kanamycin B nicht verliert, sondern sogar eine verbesserte oder modifizierte antibakterielle Wirksamkeit sogar gegen die resistenten Bakterien aufweist, war grundlegend.
Es ist ferner bekannt, dass Butirosine, das sind von Bakterien produzierte aminogly osidische Antibiotika, gegen einige kanamycin- und ribostamycinresistente Bakterien wirksam sind. Diese Butirosine wurden als l-N- [ (S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-5-0-ss-D-xylofuranosyl- oder ribofuranosyl- - neamine identifiziert (Tetrahedron Letters Vol. 28, Seiten 2617 bis 2620 [1971], DE-OS 1914527).
Bei einem Vergleich der antibakteriellen Wirksamkeit von Ribostamycin mit der von Butirosin B wurde gefunden, dass der (S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl-Substituent an der 1-Aminogruppe des Butirosins eine wichtige Rolle bei der hohen Wirksamkeit des Ribostamycins auch gegen resistente Bakterien spielt. Daraus wurde abgeleitet, dass einem aminoglykosidischen Antibiotikum eine anti-
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bakterielle Wirksamkeit gegen resistente Bakterien durch Einführen einer Aminoacylgruppe in die 1-Aminogruppe eines aminoglykosidischen Antibiotikums verliehen werden kann. Auf Grund dieser Überlegung wurde bei vielen aminoglykosidischen Antibiotika die 1-N-Aminoacylierung durchgeführt.
Eine erforderliche Anwendung der 1-N-Aminoacylierung ergab sich beim Amikacin, welches auch BB-K8 genannt wird, das ist l-N- [ (S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-kanamyoin A (Journal of Antibiotics Vol. 25, Seiten 695 bis 708 [1972], US-PS Nr. 3, 781, 268).
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der Einwirkung des l-N- [ (S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-Substituenten des Amikacin weder phosphoryliert noch adenyliert werden können. Da Amikacin in den Kliniken weit verbreitet und viel häufiger verwendet wird, sind neue Typen von resistenten Bakterien aufgetreten, die gegen
Amikacin resistent sind.
In jüngster Zeit wurden einige Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, dass die 4'-Hydroxylgruppe von Amikacin von bestimmten neuen Stämmen resistenter Bakterien adenyliert und dass die 3'-Hydroxylgruppe von Amikacin phosphoryliert wird, beispielsweise Anti- microbial Agents and Chemotherapy, Seiten 619 bis 624 [1977]).
Unter Berücksichtigung obiger Tatsachen und Beobachtungen ist zu erwarten, dass ein möglicherweise erhältliches 3', 4'-Dideoxykanamycin A, falls die 3'- und 4'-Hydroxylgruppen von
Kanamycin A entfernt werden können, gegen die neuen Typen resistenter Bakterien aktiv sein sollte.
Es wurde jedoch experimentell bestätigt, dass 3', 4'-Dideoxykanamycin A nicht wie erwartet erhalten werden konnte, wenn Kanamycin A durch eine 3', 4'-Di-O-sulfonylierung und anschliessende
Behandlung des 3', 4'-Di-O-sulfonsäureesters mit Natriumjodid und Zinkpulver deoxygeniert wurde, wie dies bei der Halbsynthese von 3', 4'-Dedeoxykanamycin B erfolgreich möglich war. Dies wohl deshalb, weil das Kanamycin A Molekül die 2'-Hydroxylgruppe benachbart zu der 3'-Hydroxyl- gruppe aufweist, so dass die 2'-Hydroxylgruppe gleichzeitig mit der Sulfonylisierung der 3'- und
4'-Hydroxylgruppen sulfonyliert wird.
Dies hat zur Folge, dass die einmal sulfonylierte 2'-Hydroxyl- gruppe zur gleichen Zeit entfernt werden kann, wenn durch Behandlung mit Natriumjodid und Zinkpulver die sulfonylierten 3'- und 4'-Hydroxylgruppen entfernt werden.
Es wurde also berücksichtigt, dass 3', 4'-Dideoxykanamycin A nicht nach derselben Deoxy- geniermethode, die bei der Synthese von 3', 4'-Dideoxykanamycin B aus Kanamycin B angewendet wurde, aus Kanamycin A synthetisiert werden kann, ausser es wäre möglich, ein derart geschütztes Kanamycin-A-Derivat herzustellen, welches wie oben beschrieben deoxygeniert werden kann und bei welchem die 3'- und 4'-Hydroxylgruppen des Kanamycin A in ungeschütztem Zustand bleiben, während die benachbarte 2'-Hydroxylgruppe ebenso wie alle andern Hydroxyl- und Aminogruppen im geschützten oder blockierten Zustand sind.
Hinsichtlich der Reaktivität wurde jedoch zwischen den 2'-, 3'- und 4'-Hydroxylgruppen kein grosser Unterschied beobachtet und es war daher ausserordentlich schwierig, ein Verfahren zu finden, durch welches die 2'-Hydroxylgruppe geschützt werden kann, während die 3'-und 4'-Hydroxylgruppen unblockiert bleiben.
Umfangreiche Forschungsarbeiten wurden durchgeführt, um ein geeignetes Derivat des Kanamycin A zu finden. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass ein derart geschütztes Derivat des Kanamycin A mit freien 3'- und 4'-Hydroxylgruppen, welches eine geschützte oder ungeschützte 2"-Hydroxylgruppe und alle andern Hydroxylgruppen (einschliesslich der 2'-Hydroxylgruppe) ebenso wie die Aminogruppen blockiert, d. h. geschützt hat, durch eine Kombination einer Auswahl von Hydroxyl- und Aminoschutzgruppen bei genauer Einhaltung eines Systems der Reihenfolge einzelner Verfahrensschritte des Schutzes einer jeden Amino- und jeder Hydroxylgruppe, hergestellt werden kann, dergestalt, dass die reaktivste Aminogruppe der 4 Aminogruppen von Kanamycin A, nämlich die 6'-Aminogruppe zuerst blockiert wird, u. zw.
mit einer Alkoxycarbonyl- oder Aralkyloxycarbonylgruppe, insbesondere einer Benzyloxycarbonyl- oder Aryloxycarbonylgruppe, die als übliche Aminoschutzgruppen bekannt sind ; dann werden die 1-, 3-und 3"-Aminogruppen mit einer Hydroxycarbonylsulfonylgruppe wie einer Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl- oder Aralkylsulfonylgruppe geschützt ; die freie 4'-Hydroxylgruppe und die bereits durch obengenannte Gruppen geschützte 6'-Aminogruppe werden anschliessend in Form eines cyclische Carbamates kondensiert, u. zw. beispielsweise durch Behandlung mit Natriumhydrid, was einen gleichzeitigen Schutz der 4'-Hydroxyl-
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und der 61-Aminogruppe bedeutet ;
die 5- und 2'-Hydroxylgruppe werden selektiv und gleichzeitig durch Überbrücken und Einführen einer bekannten, divalenten Hydroxylschutzgruppe blockiert, beispielsweise mit einer Alkyliden-, insbesondere einer Isopropylidengruppe, einer Cyclohexyliden-, Benzyliden- oder einer Tetrahydro-4-pyranylidengruppe ; der gebildete 4 6'-Carbamatring wird durch Behandlung mit einem Alkali aufgebrochen, um die freie 4'-Hydroxyl- und die freie 6'-Aminogruppe wieder herzustellen ; schliesslich wird die freie 61-Aminogruppe mit einer Alkoxycarbonyl-, Aralkyloxycarbonyl-oder einer Alkanoylgruppe, beispielsweise der Acetylgruppe, blockiert. Auf diesem Wege konnte erfolgreich das gewünschte, ausreichend geschützte Derivat von Kanamycin A hergestellt werden.
Als Folge davon kann nunmehr ein erfolgreicher Weg vorgeschlagen werden, wodurch eine Halbsynthese von 3', 4'-Dideoxykanamycin A durchgeführt werden kann.
3', 41-Dideoxyderivate und l-N- [ (S)-a-Hydroxy-m-aminoalkanoyl]-3', 4' -dideoxyderivate von Kanamycin A werden also synthetisch aus Kanamycin A hergestellt und zeigen einen weiteren Bereich und/oder eine höhere antibakterielle Wirksamkeit als die Stammverbindung, das Kanamycin A, so dass diese neuen Verbindungen für die therapeutische Behandlung von Infektionen durch gramnegative und grampositive Bakterien, einschliesslich deren gegen Heilmittel resistente Stämme verwendet werden können.
Die Produktion dieser neuen Derivate kann durchgeführt werden durch Herstellung eines endgruppengeschützten Kanamycin-A-Derivates, dessen 3'- und 4'-Hydroxylgruppen ungeschützt und dessen alle übrigen oder im wesentlichen alle übrigen funktionellen Gruppen des Ausgangsmaterials, Kanamycin A, geschützt sind, wobei die 3'- und 4'-Hydroxylgruppen sulfonyliert, die 3'- und 41-Sulfonyloxygruppen von dem erhaltenen 3', 4' -Disulfonsäureester zur Bildung eines 3'-Enokanamycin-A-Derivates entfernt werden, das S'-Enokanamycin-A-Derivat zur Sättigung der 31, 4' ungesättigten Bindung hydriert wird, worauf ein geschütztes 3', 41-Dideoxykanamycin A erhalten wird.
Anschliessend werden die restlichen Schutzgruppen entfernt und gegebenenfalls die 1-Aminogruppe des erhaltenen 3', 4'Dideoxykanamycin A mit einer (S)-a-Hydroxy-w-aminoalkansäure oder einem ihrer reaktiven Äquivalente acyliert.
Es werden somit erstmals erfolgreich die neuen Verbindungen l-N- (2-Hydroxy-3-aminopropio- nyl)-3', 4'-dideoxykanamycin A oder l-N- (2-Hydroxy-4-aminobutyryl)-3', 4'-dideoxykanamycin A der allgemeinen Formel (I) synthetisch hergestellt, durch Kondensation der 1-Aminogruppe von 3', 4'- - Dideoxykanamycin A mit einer Isoserylgruppe, insbesondere der DL- oder L- oder D-2-Hydroxy-3- - aminopropionylgruppe oder mit der (S)-2-Hydroxy-4-aminobutylrylgruppe. Es wurde ferner gefunden, dass die neuen Derivate von Kanamycin A, die jetzt synthetisch hergestellt werden können, gegen eine grosse Anzahl resistenter Bakterien wirksam ist.
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Formel (I)
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worin n 1 oder 2 bedeutet, sowie deren Säureadditionssalzen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man
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(i) die 1-Aminogruppe von 3', 4'-Dideoxykanamycin A oder eines teilweise endgruppengeschützten Derivates der allgemeinen Formel (Ia)
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worin E für Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, vorzugsweise eine Alkoxyoxycarbonylgruppe mit 2 bis 5 C-Atomen, eine Aralkyloxycarbonylgruppe, vorzugsweise eine Benzyloxycarbonylgruppe, oder eine Aryloxycarbonylgruppe steht, mit einer a-Hydroxy-M-aminoalkansäure der Formel (II)
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worin n 1 oder 2 und E'Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, oder mit einem an der Aminogruppe geschützten Derivat oder einem funktionellen Derivat acyliert unter Bildung einer 1-N-acylierten Verbindung der allgemeinen Formel (Ib)
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worin E,
E'und n obige Bedeutung haben und erforderlichenfalls (ii) die Aminoschutzgruppe (n) (E und E') entfernt, und die so erhaltene Verbindung gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden im Detail beschrieben.
Bei diesem Verfahren ist es grundsätzlich möglich, 3', 4'-Dideoxykanamicin A als freie Base oder als Säureadditionssalz als Ausgangsmaterial zu verwenden, ohne vorher die Aminogruppen ausser der 1-Aminogruppe zu schützen. Es wird jedoch bevorzugt, ein teilweise geschütztes Derivat von 3', 4'-Dideoxykanamycin A zu verwenden, welches ausser der 1-Aminogruppe noch einige andere Aminogruppen geschützt hat und welches die allgemeine Formel (Ia) aufweist. Für den teilweisen
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Schutz der Aminogruppen des 3', 4'-Dideoxykanamycin A können übliche Aminoschutzgruppen ver- wendet werden. Typische Beispiele solcher Aminoschutzgruppen sind die folgenden Gruppen : Alkyl- oxycarbonyl-, wie tert. Butoxycarbonyl- und tert.
Amyloxycarbonyl- ; Cycloalkyloxyoarbonyl-, wie Cyclohexyloxycarbonyl- ; Aralkyloxycarbonyl-, wie Benzyloxycarbonyl- ; Acyl-, wie Trifluoracetyl- und o-Nitrophenoxyacetyl- ; Phosphinthioyl-, wie Diphenylphosphinthioyl- und Dimethylphosphin- thiol-un Phosphinyl-, wie Diphenylphosphinylgruppen. Es können auch divalente Aminoschutz- gruppen, beispielsweise die Phthaloylgruppe, verwendet werden. Ebenfalls ist der Schutz der Amino- gruppen in Form einer Schiff'schen Base möglich.
Die Einführung dieser Aminoschutzgruppen in die 3- und/oder 61-Aminogruppe von 3', 4'-Dideoxykanamycin A kann nach einem bei der Synthese von
Peptiden und andern organischen Verbindungen üblichen Verfahren durchgeführt werden, beispiels- weise nach solchen, bei denen ein Säurehalid, Säureazid oder Ester und Säureanhydride als
Reagenzien zur Einführung von Aminoschutzgruppen, verwendet werden, wie dies beispielsweise in der US-PS Nr. 4, 107, 424 beschrieben ist.
In Abhängigkeit von der Menge des zum Schutze der Amino- gruppen verwendeten Reagens, welche im allgemeinen 0, 5 bis 6 Mol beträgt, ist es möglich, ein
Gemisch von verschiedenen, teilweise an der Aminogruppen geschützten Derivaten von 3', 4'-Di- deoxykanamycin A in jedem Verhältnis herzustellen, je nach dem Unterschied der Reaktivität zwischen den einzelnen Aminogruppen des Ausgangsmaterials. Mischungen solcher an den Amino- gruppen teilweise geschützter Derivate von 3 I, 41-Dideoxykanamycin A können auch in dem Ver- fahrensschritt (i) der Acylierung des vorliegenden Verfahrens verwendet werden.
Es ist deshalb für die Durchführung des Verfahrensschrittes der Acylierung (i) vorteilhaft, das Rohprodukt des
Verfahrens des Schutzes der Aminogruppen, welches im allgemeinen ein Gemisch von teilweise an den Aminogruppen geschützten Derivaten des 3', 41-Dideoxykanamycin ist, ohne weitere Reinigung zu verwenden. Beim Verfahren der Einführung der Aminoschutzgruppen können diese vorzugsweise in Mengen von 1 bis 5 Mol in einem wässerigen organischen Lösungsmittel verwendet werden.
Ein weiteres Verfahren für die Einführung von Aminoschutzgruppen ist in der JP-AS 138402/78, angemeldet am 11. November 1978, der US-AS Ser. No. angemeldet am 2. November 1979 oder der UK-PS 7938894 beschrieben, welche sich auf ein Zinkkomplexverfahren für die Herstellung von aminoglykosidischen Antibiotika bezieht, bei denen einige Aminogruppen selektiv geschützt sind. Entsprechend dieser Verfahrensvariante wird 3', 4'-Dideoxykanamycin A zuerst in einen Komplex mit einem Zinkkation überführt und dann zu einem teilweise an den Aminogruppen geschützten Derivat acyliert.
Das oben genannte Zinkkomplexverfahren betrifft im allgemeinen ein Verfahren zur Herstellung von selektiv acylierten, an N-geschützten Derivaten von aminoglykosidischen Antibiotika, die eine 3-Aminoglykosyl- oder eine 3-Alkylaminoglykosylgruppe verbunden mit der 6-Hydroxygruppe des Deoxystreptaminteiles aufweisen. Dieser Prozess umfasst folgende Verfahrensschritte.
Herstellung eines Zinkkationkomplexes eines aminoglykosidischen Antibiotikums, Umsetzung dieses Komplexes mit einem Acyliermittel zur Herstellung des N-acylierten Zinkkomplexes, also eines zweiten Komplexes von Zinkkationen mit dem aminoglykosidischen Antibiotikum. welcher keine komplexen, acylierten Aminogruppen aufweist, Umsetzung dieses zweiten Komplexes mit einer Verbindung zur Entfernung der Zinkkationen zur Herstellung des selektiv acylierten, N-geschützten Derivates des aminoglykosidischen Antibiotikums. Der Komplex des aminoglykosidischen Antibiotikums mit Zinkkationen kann durch Umsetzung des Antibiotikums mit einem Zinksalz in einem inerten organischen Lösungsmittel hergestellt werden.
Entsprechend diesem Zinkkomplexverfahren kann aus 3', 41-Dideoxykanamycin Aals Ausgangsmaterial nach dem Verfahren der Erfindung leicht und effizient ein teilweise geschütztes Derivat von 31, 41-Dideoxykanamycin A beispielsweise nach folgendem Verfahren hergestellt werden : Es wird eine Lösung oder Suspension von 31, 41-Dideoxykanamycin in einem organischen oder einem wässerigen organischen Lösungsmittel hergestellt und mindestens 1 Mol Zinksalz je Mol 3', 4'-Dideoxykanamycin A zugesetzt. Für diesen Zweck können alle üblichen organischen Lösungsmittel verwendet werden, soweit der gebildete Zinkkomplex zumindest teilweise in ihnen löslich ist.
Eine grosse Menge eines polaren organischen Lösungsmittels und insbesondere grössere Mengen von Wasser sollten jedoch vermieden werden, da die Gegenwart polarer organischer Lösungsmittel oder die von Wasser die Stabilität des gebildeten Aminoglykosid-Zinkkationkomplexes herabsetzt, so dass die anschliessende Acylierung zur Einführung der Aminoschutzgruppen unbefriedigende Ergebnisse liefert.
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Es ist daher wünschenswert, ein organisches Lösungsmittel mit hoher Lösungskraft zu ver- wenden, beispielsweise Dimethylsulfoxyd, für die Lösung, in welcher der Zinkkomplex gebildet wird. Es ist aber auch möglich, wässeriges Dimethylsulfoxyd, Dimethylformamid, wässeriges Di- methylformamid, ein Gemisch von Dimethylsulfoxyd und Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, wässeriges Tetrahydrofuran und auch niedrige Alkohole, wie Methanol, Äthanol und wässeriges
Methanol zu verwenden.
Das Zinkkation kann in Form eines Zinksalzes dem Reaktionssystem, in welchem der Zinkkomplex gebildet wird, zugeführt werden. Jedes Zinksalz, welches durch Reaktion eines Zinkkations mit einer üblichen anorganischen oder organischen Säure gebildet wird, kann für diesen Zweck verwendet werden. Es ist im allgemeinen jedoch wünschenswert, ein Zinksalz einer schwachen Säure, beispielsweise Zinkacetat, zu verwenden.
Solange die gesamte molare Menge des verwendeten Zinksalzes mindestens gleich der molaren Menge des aminoglykosidischen Antibiotikums ist, schreibt die Komplexbildung voran. Es ist jedoch zweckmässig, das Zinksalz in einer Menge von im wesentlichen mehr als 1 Mol je Mol des Antibiotikums zu verwenden, so dass das Gleichgewicht der Komplexbildungsreaktion in Richtung der Bildung des Zinkkomplexes verschoben wird. Günstige Ausbeuten am Zinkkomplex können erhalten werden, wenn das Zinksalz in Mengen von 2, 3 bis 6 Mol je Mol Aminoglykosid verwendet wird. In der Praxis ist es jedoch vorteilhaft, das Zinksalz in Mengen von 4 bis 5 Mol je Mol Aminoglykosid zu verwenden.
Die Zeitdauer für den vollständigen Ablauf der Komplexbildung nach der Zugabe des Zinksalzes hängt von der Art des organischen Lösungsmittels ab und kann von einer fast sofortigen Reaktion (wenn wässerige organische Lösungsmittel verwendet werden) bis zu 20 h dauern. Die Komplexbildung wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt, es kann aber auch erhitzt oder gekühlt werden.
Auf diese Weise wird eine Lösung oder Suspension des Zinkkomplexes des Aminoglykosides hergestellt, zu welcher dann ein Acyliermittel, dessen Acylgruppe als Aminoschutzgruppe eingeführt werden kann, zugesetzt wird.
Das zum Zwecke der Einführung der Aminoschutzgruppe verwendete Acyliermittel soll die nicht im Komplex gebundenen 3- und 6'-Aminogruppen in dem erhaltenen 3', 4'-Dideoxykanamycin A-Zinkkation-Komplex acylieren und mit der Acylgruppe des Acyliermittels blockieren. Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Acylgruppen können Alkoxycarbonyl-, Aralkyloxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- oder Arylsulfonylgruppen sein. Das verwendete Acyliermittel ist entweder ein Ameisensäurederivat der allgemeinen Formel (lila)
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eine Arylgruppe, vorzugsweise Phenyl oder eine Aralkylgruppe, vorzugsweise Benzyl steht, wobei diese Gruppen gegebenenfalls substituiert sein können, oder ein p-Nitrophenylcarbonat der allgemeinen Formel (IIIb) R'-O-CO-O-C.
H -p-NO : (IIIb) oder aktive N-Hydroxysuccinimidester der allgemeinen Formel (IIIc)
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oder Azidoformate der allgemeinen Formel (IIId)
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R3O-CO-N3 (IIId), worin R3 obige Bedeutung hat, oder Sulfonsäureester der allgemeinen Formel (IIIe) R'S03H (Irre), worin R4 eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, wie Phenyl, ist oder ein Halid, An- hydrid oder ein Ester obiger Sulfonsäure.
Beispiele verwendbarer Acyliermittel sind : p-Nitrophenylformiat, p-Nitrophenolester oder Tri- fluoressigsäure, Trifluoressigsäureester, N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid, ein repräsentativer aktiver Ester, N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid, Benzyloxycarbonylchlorid, p-Methoxybenzyloxy- carbonyloxy-p-nitrophenyl, tert. Butoxycarbonylazid, Phenoxycarbonylchlorid, Tosylchlorid, Mesyl- chlorid u. a.
Das Acyliermittel kann als solches oder als Lösung in einem Lösungsmittel wie Tetrahydro- furan und Dimethylsulfoxyd oder in einem Gemisch beider Lösungsmittel zu der Lösung oder Suspen- sion des Aminoglykosid-Zinkkomplexes zugesetzt werden. Die molare Menge des zugesetzten Acylier- mittels ist üblicherweise gleich oder etwas höher als die Zahl der nicht komplex gebundenen Amino- gruppen, mit welchen das Acyliermittel reagieren soll. In manchen Fällen kann die molare Menge des Acyliermittels jedoch bis zum 3fachen der Zahl der nicht komplex gebundenen Aminogruppen ansteigen. Das Acyliermittel kann entweder auf einmal oder in Anteilen langsam über eine Zeit- dauer von 2 bis 3 h zugesetzt werden, obzwar es im allgemeinen in einem Zeitraum von 30 min bis zu 1 h zugesetzt werden kann.
Die Acylierung wird bei Temperaturen von-20 bis 1000C, üblicherweise aber bei Temperaturen von 0 C bis Raumtemperatur durchgeführt. In einigen Fällen wird die Reaktionstemperatur während der Zugabe des Acyliermittels niedrig gehalten und wird dann stufenweise mit Fortschritt der Acylierung erhöht. Überlicherweise wird die Acylierung in situ im organischen Lösungsmittel, in dem der Komplex des aminoglykosidischen Antibiotikums mit Zink gebildet wurde, durchgeführt. Die Acylierung des Zinkkomplexes liefert den N-acylierten Zink- komplex, nämlich den vorher erwähnten zweiten Komplex, d. h. einen Komplex von Zinkkationen mit dem selektiv N-acylierten aminoglykosidischen Antibiotikumderivat.
Entsprechend dem Zinkkomplexverfahren, das vorstehend beschrieben wurde, folgt auf den
Schritt der Acylierung des Komplexes Aminoglykosid-Zinkkation die Entfernung des Zinkkations von dem zweiten Komplex, d. h. dem N-acylierten Zinkkomplex, nämlich die Zerstörung des Komplexes, um das selektiv geschützte N-acylierte Derivat des Aminoglykosides zu erhalten, welches frei von
Zinkkationen ist.
Für die Entfernung des Zinkkations aus dem zweiten Komplex, das ist dem N-acylierten Zink- komplex, ist es notwendig, diesen Komplex mit einem Mittel zur Entfernung von Zinkkationen zu behandeln. Für diesen Zweck stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Nach der ersten Methode wird ein zinkfällendes Reagens verwendet, welches das Zinkkation in eine wasserunlösliche Zinkverbindung, wie beispielsweise Zinksulfid, Zinkhydroxyd oder Zinkcarbonat umwandelt, während der N-acylierte Zinkkomplex in dem Acylierreaktionsgemisch gelöst verbleibt, in welchem der Komplex aus aminoglykosidischem Antibiotikum und Zinkkation acyliert wurde, oder nachdem dieser in eine neue Lösung eines organischen Lösungsmittels aus dem Acylierreaktionsgemisch überführt wurde.
Das nach der ersten Methode verwendete zinkfällende Mittel kann beispielsweise Schwefelwasserstoff, ein Alkalisulfid, wie Natriumsulfid, Ammoniumsulfid, ein Erdalkalisulfid, wie Calciumsulfid, und ein Alkalicarbonat, wie Natriumcarbonat, oder Ammoniumhydroxyd sein. Die zweite Methode besteht darin, dass (i) durch Verdampfen des Lösungsmittels konzentriert oder zur Trockne eingedampft wird oder dass (ii) mit einem flüssigen Verdünnungsmittel das Acyliergemisch oder die neue Lösung des N-acylierten Zinkkomplexes verdünnt wird, so dass sich ein öliger oder fester Niederschlag bildet, der konzentriert wird, worauf aus dem Niederschlag, dem Konzentrat oder dem Rückstand das gewünschte Derivat des N-acylierten aminoglykosidischen Antibiotikums gewonnen wird.
Das bei dieser zweiten Methode verwendete flüssige Verdünnungsmittel ist Wasser oder eine organische Flüssigkeit, in welcher sich der N-acylierte Zinkkomplex als Ganzes oder der Teil des
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Wasser und Dioxan (1 : 3 Volums-Teile) gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurden 2, 0 g p-Toluolsulfonylchlorid unter Rühren zugesetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht weiter gerührt (für die Tri-N-toxylumsetzung) und dann auf ein kleineres Volumen eingeengt.
Der konzentrierten Lösung wurde Wasser zugesetzt und der abgeschiedene Niederschlag durch Filtrieren entfernt, mit Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei man das oben genannte Produkt als Feststoff erhielt.
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Elementaranalyse für C, H NOS
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<tb>
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> S
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 52, <SEP> 21% <SEP> 5, <SEP> 59% <SEP> 5, <SEP> 18% <SEP> 8, <SEP> 9% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> 52, <SEP> 10% <SEP> 5, <SEP> 56% <SEP> 5, <SEP> 12% <SEP> 8, <SEP> 68% <SEP>
<tb>
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Von der in dem vorstehenden Verfahrensschritt (1) erhaltenen Substanz wurden 1, 29 g in 4 ml Dimethylformamid aufgenommen und der erhaltenen Lösung wurden 45 mg Toluolsulfonsäure und 0, 86 ml 1, 1-Dimethoxycyclohexan zugesetzt.
Die erhaltene Mischung wurde 6 h bei Raumtemperatur (für die 411, 611-0-cyclohexyliden-Umsetzung) stehengelassen. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann in ein grosses Volumen einer Lösung von Natriumhydrogencarbonat in Wasser gegossen. Der abgeschiedene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, gut mit Wasser gewaschen und getrocknet.
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<tb>
<tb> 35C <SEP> H <SEP> N <SEP> S
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 54, <SEP> 81% <SEP> 5, <SEP> 90% <SEP> 4, <SEP> 82% <SEP> 8, <SEP> 28% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> 54, <SEP> 89% <SEP> 6, <SEP> 10% <SEP> 4, <SEP> 63% <SEP> 8, <SEP> 52% <SEP>
<tb>
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Von der in dem vorhergehenden Verfahrensschritt (2) erhaltenen Substanz wurden 911 mg in 18 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurden 337 mg von 50% Natriumhydrid in Öl zugesetzt.
Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 3, 5 ml von 4N Essigsäure und weiter mit 50 ml Toluol versetzt. Das ganze Gemisch wurde zur Entfernung der Lösungsmittel destilliert und der so erhaltene dicke Sirup wurde mit einem grossen Volumen Wasser versetzt. Der abgeschiedene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Äthyläther gewaschen und zu einem farblosen Feststoff getrocknet, der der oben genannten Verbindung entsprach.
Ausbeute 685 mg (85%).
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<tb>
<tb> : <SEP> 6'-N-carboxyl-5, <SEP> 2'-O-isopropyliden-l, <SEP> 3, <SEP> 3"-tri-N-tosylkanamycinC <SEP> H <SEP> N <SEP> S
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 53, <SEP> 83% <SEP> 5, <SEP> 90% <SEP> 5, <SEP> 13% <SEP> 8, <SEP> 80% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> :
<SEP> 53, <SEP> 61% <SEP> 5, <SEP> 81% <SEP> 4, <SEP> 88% <SEP> 8, <SEP> 57% <SEP>
<tb>
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(5) Herstellung des 6'-N-Benzyloxycarbonyl-1,3,3"-tri-N-tosyl-5,2'-O-isopropyliden-4",6"-O-cyclo- hexyliden-kanamycin A
Von der in dem Verfahrensschritt (4) erhaltenen Substanz wurden 48 mg in 2 ml eines Wasser- - Dioxan gemisches (1 : 3 Volums-Teile) gelöst, der Lösung 30 mg wasserfreies Natriumcarbonat zugesetzt und anschliessend 1 h bei 50 C erhitzt, um die Hydrolyse der genannten Verbindung zu bewirken, welche die Aufsprengung des 4', 6'-cyclischen Carbamates und die Entfernung der 4', -0 : 6'-N-Carbonylgruppe zur Folge hat.
Die erhaltene Reaktionslösung wurde sofort mit 80 mg Benzyloxycarbonylchlorid versetzt und 2 h bei Raumtemperatur (für die Bildung der 6'-N-Benzyloxycarbonylgruppe) stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von Essigsäure bis zu schwach alkalischer Reaktion neutralisiert und anschliessend im Vakuum auf ein geringeres Volumen konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wurde mit einem grossen Volumen Wasser vermischt und der abgeschiedene Feststoff durch Filtrieren entfernt, mit Wasser und dann mit Äthyläther ge-
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<tb>
<tb> [a]ÓS <SEP> +90 <SEP> (c=l,C <SEP> H <SEP> N <SEP> S
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 55, <SEP> 99% <SEP> 6, <SEP> 04% <SEP> 4, <SEP> 66% <SEP> 8, <SEP> 01% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> 55, <SEP> 75% <SEP> 6, <SEP> 07% <SEP> 4, <SEP> 48% <SEP> 7, <SEP> 82% <SEP>
<tb>
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gelöst und der erhaltenen Lösung nach Kühlung mit Eis 320 mg Benzylsulfonylchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde unter Eiskühlung (für die Bildung der 3', 4'-Di-0-benzylsulfonyl- und der 2"-0-Benzylsulfonylgruppe) 2 h stehengelassen.
Dem flüssigen Reaktionsgemisch wurde 0, 2 ml Wasser zugesetzt und dann im Vakuum auf ein kleineres Volumen eingeengt. Der verbliebene Feststoff wurde mit Wasser gemischt und der unlösliche Anteil durch Filtrieren entfernt, gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und ergab die oben genannte Erfindung als Feststoff.
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<tb>
<tb> +700 <SEP> (c=l,C <SEP> H <SEP> N
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 55, <SEP> 58% <SEP> 5, <SEP> 45% <SEP> 3, <SEP> 37% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> 55, <SEP> 23% <SEP> 5, <SEP> 40% <SEP> 3, <SEP> 19% <SEP>
<tb>
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Von dem im obigen Verfahren (6) erhaltenen 3', 4', 2"-Tri-0-benzylsulfonyl-kanamycin A-Derivat wurden 560 mg in 12 ml Dimethylformamid gelöst und der erhaltenen Lösung 6 g Natriumjodid zugesetzt.
Anschliessend wurde 5, 5 h (für die Bildung der 3', 4'-ungesättigten Bindung) bei 100 C erhitzt. Dem Reaktionsgemisch wurde ein grosses Volumen Chloroform zugesetzt und anschliessend zentrifugiert. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde zu einem kleineren Volumen konzentriert, mit Wasser verdünnt und der ausgefallene Feststoff gut mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Der erhaltene Feststoff wurde in 10 ml Chloroform aufgenommen, durch Chromatographieren an einer Silikagelsäure gereinigt und mit einem Chloroform-Methanol gemisch (20 : 1) als Eluiermittel behandelt.
Die aus der Silikagelsäure kommende Flüssigkeit wurde zur Trockne
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<tb>
<tb> [a]Ö <SEP> +110 <SEP> (c=l,C <SEP> H <SEP> N <SEP> S
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 57, <SEP> 25% <SEP> 5, <SEP> 80% <SEP> 4, <SEP> 24% <SEP> 9, <SEP> 70% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> 57, <SEP> 11% <SEP> 5, <SEP> 66% <SEP> 4, <SEP> 09% <SEP> 9, <SEP> 43% <SEP>
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(8) Herstellung des 3l, 41-Dideoxykanamycin A
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wurden 453 mg in 7 ml 80%iger wässeriger Essigsäure gelöst. Anschliessend wurde 1 h (zur Entfernung der 5, 2'-0-Isopropyliden und der 4", 6"-0-Cyclohexylidengruppen) bei 80 C erhitzt.
Die Reaktionslösung wurde auf ein kleineres Volumen konzentriert und dann mit Wasser versetzt, um einen Feststoff abzuscheiden, der anschliessend mit Wasser gewaschen und dann getrocknet wurde.
Der so erhaltene Feststoff enthielt das von den Isopropyliden- und Cyclohexylidengruppen befreite
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erhaltene Lösung unter Wasserstoff bei 3 atm. 2, 5 h bei Raumtemperatur in Gegenwart von 40 mg Platinoxyd geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt 412 mg des Feststoffes.
Durch diese Behandlung mit Wasserstoff wurde die 3', 4'-ungesättigte Bindung mit Wasserstoff gesättigt und gleichzeitig die 61-N-Benzyloxycarbonylgruppe entfernt. Es wurde festgestellt, dass der erhaltene Feststoff das l, 3, 3"-Tri-N-tosyl-2"-0-benzylsulfonyl-31, 41-dideoxykanamycin A enthält. Der erhaltene Feststoff wurde in etwa 150 ml flüssigem Ammoniak bei -500 gelöst, worauf 400 mg metallisches Natrium in Stücken zugesetzt wurden und bei obiger Temperatur 1, 5 h (zur Entfernung der N-Tosylgruppen und der 2"-Q-Benzylsulfonylgruppe) gerührt wurde.
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Zu der Reaktionslösung im flüssigen Ammoniak wurde dann Methanol zugesetzt und das Gemisch langsam bei Verdampfung des Ammoniaks auf Raumtemperatur gebracht und einem verminderten Druck unterworfen, um die noch verbliebenen Spuren von Ammoniak zu entfernen. Der so erhaltene feste Rückstand wurde in Wasser gelöst und die wässerige Lösung durch Zusatz eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (Dowex 50 W x 2) in der H+ Form (ein Produkt der Dow Chemical Co., U. S. A.) neutralisiert. Das Harz wurde aus der wässerigen Lösung durch Filtrieren entfernt, in eine Kolonne überführt und mit 1 N wässerigem Ammoniak behandelt. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die die Substanz enthielten, welche positiv auf eine Reaktion mit Ninhydrin reagierte, wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft und ergaben das Rohprodukt des 3', 4'-Dideoxykanamycin A.
Zur Reinigung wurde das Rohprodukt in Wasser gelöst und die wässerige Lösung in eine Kolonne eines Carboxymethylgruppen enthaltenden Kationenaustauscherharzes der Handelsbezeichnung CM-Sephadex C-25 (ein Produkt der Pharmacia Fine Co., Schweden) eingebracht. Anschliessend wurde mit einem wässerigen Ammoniak von 0 N---0, 12 N graduell entwickelt. Das Eluat, welches das gewünschte Produkt enthielt, wurde gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt das reine 3', 4'-Dideoxykanamycin A-Carbonat als farblosen Feststoff.
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+1160 <SEP> (c=l,C <SEP> H <SEP> N
<tb> Berechnet <SEP> : <SEP> 43, <SEP> 90% <SEP> 7, <SEP> 41% <SEP> 10, <SEP> 72% <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> 44, <SEP> 22% <SEP> 7, <SEP> 34% <SEP> 10, <SEP> 45% <SEP>
<tb>
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Das nach den Stufen Al bis 8 erhaltene 3', 4'-Dideoxykanamycin A-Carbonat wurde in 8 N wässerigem Ammoniak gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zur Trockne im Vakuum eingedampft, wobei die Lösung von einem Kontakt mit der Kohlendioxydkomponente der Luft geschützt wurde. Auf diese Weise wurde die freie Base des 3', 4'-Dideoxykanamycin A hergestellt. Diese Verbindung (freie Base) (85, 4 mg) wurde in 1, 3 ml Dimethylsulfoxyd suspendiert. Anschliessend wurden 187 mg Zinkacetatdihydrat [ZntCHgCO) :. ZH O] zu der erhaltenen Suspension zugesetzt.
In dem die Suspension enthaltenden Reaktionsgefäss wurde die Luft durch Stickstoff verdrängt. Das Reaktionsgefäss wurde dann abgedichtet und die Suspension bei Raumtemperatur 3 h gerührt, bis aus der Suspension eine homogene Lösung geworden war, die den gebildeten Komplex von Zinkacetat mit 3', 4'-Dideoxy- kanamycin A enthielt. Zu dieser homogenen Lösung wurden langsam und in kleinen Anteilen im Laufe von 2 h 90 mg N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugesetzt. Dann wurde Äthyläther (5 ml) dem Gemisch zugegeben, welches dann kräftig geschüttelt und eine Zeit stehengelassen wurde. Dann wurde die überstehende Lösung durch Dekantieren von der unteren, sirupartigen Phase, welche den Komplex von Zinkacetat mit N-benzyloxycarbonylisiertem 3', 4'-Dideoxykanamycin A enthielt, abgetrennt.
Dieser sirupartigen Phase wurden abermals 5 ml Äthyläther zugesetzt, kräftig geschüttelt, stehengelassen und dann von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Die neuerlich gebildete sirupartige Phase wurde weitere 4mal in gleicher Weise mit Äthyläther behandelt. Es wurde ein dicker, sirupartiger Feststoff (etwa 450 mg) erhalten, von welchem angenommen wurde, dass es sich um ein Gemisch von 3, 6'-Di-N-Benzyloxycarbonyl-3', 4'-dideoxykanamycin A, dessen Zinkacetatkomplex, Zinkacetat und dem verwendeten Lösungsmittel handelt.
Dieser Sirup wurde in 30 ml eines Wasser- - Dioxangemisches (l : 1) gelöst, anschliessend in einer Kolonne des Ionenaustauscherharzes CM-Sephadex C-25 (ein Produkt der Pharmacia Fine Chemical Co., Schweden) chromatographisch getrennt, mit einem Wasser-Dioxangemisch (1 : 1), welches 0, 1 N Ammoniak enthielt, behandelt, wodurch der Zinkacetatkomplex von 3', 4'-Dideoxykanamycin A zersetzt wurde. Es wurde das 3, 6'-Di- - N-benzyloxycarbonyl-3', 4'-Dideoxykanamycin A isoliert. Die Eluate aus der genannten CM-Sephadex Kolonne, die eine Substanz enthielten, die positiv auf Ninhydrin reagierte, wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Es wurde die oben genannte Verbindung als farbloser Feststoff in einer Ausbeute von 113 mg (83%) erhalten.
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(2) und weiter der katalytischen Hydrogenolyse wie im Beispiel 1 (B) (3) unterzogen. Die oben genannte Verbindung wurde in Form ihres Monocarbonates als farbloser Feststoff in einer Ausbeute von 42 mg (42%, berechnet als Monocarbonat) gewonnen.
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