KR920007274B1 - 변형된 포스포라미디트를 이용하는 변형 핵산의 제조방법 - Google Patents

변형된 포스포라미디트를 이용하는 변형 핵산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

변형된 포스포라미디트를 이용하는 변형 핵산의 제조방법
본 발명은 변형된 포스포라미디트(phosphoramidite)를 이용하여 변형 핵산을 제조하는 방법 및 이 방법에 사용되는 신규 화합물에 관한 것이다.
핵산은 지구상에 살고있는 생물체에 있어서, 본질적으로 중요한 화합물의 그룹이며, 따라서 모든 생물체 내에 존재한다. 그리고 유전정보는 이들내에 저장되어 있다. 또한 핵산 서열은 각각의 생물체에 대해 특징적이므로, 다른 종 생물체와의 구별 및 분화의 기준이 된다. 따라서 핵산을 검출하고 합성하는데 많은 시도가 이루어져 왔다.
핵산은 화학적으로 또는 효소적으로 합성할 수 있다. 자연적으로 존재하는 β배위의 핵산을 화학적으로 합성하는 것은, 규정된 누클레오티드 서열을 갖는 핵산을 다량으로 생성할 수 있으므로, 최근 한층 더 중요하게 받아들여지고 있다. 화학적 합성은 β배위의 올리고누클레오티드를 합성하는데 특히 기초를 제공해 줄 수 있었다. 사용되는 누클레오티드 구조단위체(building block)의 종류와 사슬내 인접 누클레오티드에 부착하기 위한 반응단계에 따라 여러가지 방법은 구별될 수 있다 :
포스포디에스테르(phosphodiester) 방법에 있어서, 포스페이트 기를 제외한 모든 반응성 그룹을 보호한 누클레오시드 일인산은, 커플링제(예. 염화 트리알킬 아릴술폰산)와 함께, 반응이 일어나는 장소인 히드록시 그룹만 제외하고 모든 반응성 그룹을 보호한 다른 누클레오시드와 반응시킨다. 올리고누클레오티드사슬을 합성하기 위한 축합 단계동안, 바람직하지 않은 부반응이 누클레오티드간(포스페이트) 결합의 비-에스테르화된 OH-그룹에서 발생하며, 착반응 혼합물이 형성되기 때문에, 상기 방법에 의한 수득량은 근본적으로 낮다. 또한, 형성된 인산 디에스테르는 에스테르화 반응이 수행되는 몇몇 양성자성 용매에만 용해하는 중요한 단점을 가지고 있다. 피리딘, 디메틸포름아미드 또는 디메틸술폭시드와 같은 용매는, 잘 알려진 바와 같이 예컨대 높은 비점과 같은 단점을 가지고 있다. 포스포디에스테르 유도체의 극성 성질의 결과로, 단리 및 정제 과정은 이온-교환기로 수행해야 하며, 간단한 방법, 예컨대 낮은 비점을 갖는 용매(예. 디클로로메탄)를 사용한 실리카 겔 방법으로 수행할 수 없다.
생성물의 많은 유기용매중에서의 불용성에 관한 단점은 포스포트리에스테르 방법에 의해 극복된다.
포스포트리에스테르법은, 단지 한개의 반응성 그룹과 다른 보호기로 보호된 인 원자 인접 2개의 히드록시 그룹을 갖는 하나의 인산 유도체를 사용한다. 제1누클레오시드와 반응한 후 보호기중 하나는 분해되며 그 다음, 형성된 히드록시 그룹은 제2누클레오시드와의 반응을 위해 활성화시킬 수 있다. 상기 반응과정의 결과로서, 활성화된 누클레오시드 인산의 수득량을 감소시키는 누클레오시드 인산에 대한 두 부가반응의 수행이 필수적이다.
비교적 고가의 합성 구조단위체에 약간의 반응단계를 실행하는 특히 유리한 방법은, 포스포라미디트 방법(Gait, M.J. et al., Oligonucleotide synthesis : A Practical Approach, IRL Press Oxford)으로 공지되어 있다. 이 방법에서는, 인산 유도체 대신에 소위 포스포라미디트라고 불리는 아인산 유도체를 사용한다.
이 화합물에서는 하기의 잔기들이 3사 인 원자에 붙어 있다 :
-제1누클레오시드와 결합할 수 있는 반응성 그룹(예. 할로겐 원자).
-활성화 반응 후 제2누클레오시드와 결합을 실행할 수 있는 2차 아미노그룹 및
-보호기로 가려진 히드록시 그룹.
포스포라미디트 방법의 제1단계에서, 아인산 유도체는 제1누클레오시드와 반응시킨다; 이 과정에서, 반응성 그룹은 누클레오시드와 대체된다. 제2단계에서, 2차 아미노 그룹은 선택적으로 제2누클레오시드에 의해 대체시킨다. 제2단계에서 활성화제로 테트라졸을 통상적으로 사용한다. 다음 단계에서, 누클레오티드 서열은 예컨대 요오드로 산화시키고 보호기는 분해시킨다. 한 변형에 의하여, 포스포라미디트 방법은 고체상 방법으로 기술되어진다. 이 상기 방법의 변형에서는, 증가되는 누클레오티드를 고체상에 결합시킨다. 올리고누클레오티드의 정제와 여분의 합성시약 및 구조단위체의 분리과정은 이러한 방법에 의해 매우 간소화된다. 시판용 자동 핵산 합성장치는 상기 방법에 따라 작동된다. 이들의 구조는 예컨대, 포스포라미디트 방법의 특정 단계에 매치되어 있다.
공지된 누클레오티드 서열을 갖는 핵산은, 특히 생물학적인 샘플물질내 특정 DNA의 검출에 사용된다.
그러한 검출 방법의 경우는, 단일 가닥이 서로 상보적인 누클레오티드 서열을 가지며, 양 가닥이 리보오스의 C-1에서 동일한 배위(α 또는 β)를 가질 경우, 단일 핵산 가닥은 다른 단일 가닥의 핵산과 반응하여 이중가닥을 형성할 수 있다는 특성을 이용한 것이다. 자연적으로 존재하는 핵산은 염기와 당의 결합에 대하여 β배위를 가지므로, β핵산이 특히 상보적인 핵산으로서 간주될 수 있다. 이와 같은 이중 가닥 형성의 방법을 혼성화(hybridization)라고 부른다.
단일 가닥의 핵산과의 혼성화에, 변형된 상보적 단일 가닥 핵산을 사용한다면, 이중가닥의 형성은 검출될 수 있다. 그 후, 예컨대 방사성 표지를 할 수 있는 변형방법을 통해 혼성화된 핵산의 양을 측정한다.
변형된 핵산의 합성을 위해, 이미 이용가능한 천연핵산을 화학적 또는 효소적으로 변형시키거나, 이미 변형된 누클레오티드 구조단위체로 누클레오티드 서열을 합성할 수 있다.
그러나, 이미 완전히 합성된 핵산의 말단(예컨대, 5'-말단)을 WO 86/07363에 제시된 바와 같이 변형시킴으로써, 단일 가닥 당 한개의 변형 누클레오티드만을 포함하는 핵산을 제조할 수 있다. 그러므로, 탐침으로서 이런 종류의 변형 핵산을 사용하여 핵산의 양을 측정하는 방법은 그리 민감한 방법이 아니다.
화학적 반응에 의해 완전한 핵산의 염기를 변형하는 방법은 EP-A 제0173251호에 제시되어 있다. 그러나, 이를 위해서는 핵산에 대한 여러 반응단계가 필요하며 변형율은, 핵산이 유리 아미노기를 갖는 염기를 포함하는지의 여부에 좌우된다(핵산의 변형은 상보적 핵산과의 혼성화 능력을 감소시키지는 않는다).
인 원자에 변형을 한 디누클레오티드의 제조방법은 참고문헌(Ja"ger et al. Biochemistry Vol. 27, p. 7237(1988))에 기술되어 있다. 변형은, 연결자(linker)를 통해 결합된 일차 아미노기로 이루어지며, 통상의 포스포라미디트 방법과 유사한 방법으로 도입된다.
그러나, 이 방법은 포스포라미디트 방법을 사용하는 통상의 자동 합성장치로 수행할 수 없다. 그외의 단점은, 유리 아미노기가 이를 위해 사용되는 친전자성 시약과 반응하기 때문에 더이상 부가 누를레오티드를 연결시킬수 없다는 것이다.
그러므로 이용가능한 선행 기술상태 각각의 방법은 상당한 단점들을 가지고 있다.
본 발명의 목적은, 공지방법의 단점을 극복하고 특히, 포스페이트 잔기에 변형되었으며 간단한 출발물질을 가지고 약간의 반응단계를 거쳐 많은 생성물을 만들 수 있는 β배위 핵산을 고체상에서 합성하는 방법을 이용하는 것이다.
발명의 목적은, 누클레오시드 포스포라미디트(일반식 (Ⅰ)의 화합물을 누클레오시드 포스포라미디트로 사용함)를 유리 히드록실기를 갖는 다른 누클레오티드와 반응시키고, 형성된 누클레오티드 서열을 포스페이트로 산화시킴으로써, 하기 일반식 (Ⅸ)의 누클레오티드 서열을 제조하는 방법을 제공하는데 있다 :
Figure kpo00001
상기식에서, K는 누클레오티드 서열이나 다른 누클레오티드중 포스페이트기의 인 원자 또는 수소이고, J는 누클레오티드 서열이나 다른 누클레오티드의 5', 산소원자 또는 히드록시 그룹이고, B는 천연 또는 변형 누클레오 염기이고, T는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급 알킬옥시 또는 히드록시 그룹이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1) 원자가 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고, 및 n은 1 내지 200의 자연수이다;
Figure kpo00002
상기식에서, A는 산소보호기, 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드이고, B는 천연 또는 변형 누클레오 염기이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1)원자가 다리 연결부이고, T는 수소, 저급알킬, N3, 저급알콕시 또는 필요에 따라 보호된 히드록시 그룹이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고, V는 분해될 수 있는 보호기이고, n은 1 내지 200의 자연수이고, 및 D는 2차 아민기이며, 단, 저급알킬 및 저급알콕시 그룹은 1 내지 6 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소원자를 포함한다.
소위 포스포라미디트 방법에 의한 핵산의 제조방법은 원칙적으로, 예컨대 참고문헌(Biochimie 1985, 67, 673-684)에 공지되어 있다. 본 발명의 방법은, 출발물질로, 다른 누클레오시드 포스포라미디트(이른바 일반식 (Ⅰ)의 화합물)를 사용한다는 점에서 선행 기술 상태의 방법과 특히 다르다.
일반식 (Ⅰ)에 있어서 바람직한 잔기 A는 산소보호기이다. 누클레오티드 합성에 있어서 5'-히드록실기를 보호하기에 적합한 보호기는 공지되어 있다. 산성 조건하에 분해될 수 있는 트리페닐메틸기 또는 디메톡시 트리페닐메틸기와 같은 보호기를 특히 자주 사용한다.
잔기 A가 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드를 나타낸다면, 이는 천연 또는 변형된 누클레오티드나 올리고누클레오티드일 수 있다. 올리고누클레오티드를 이용한 합성이 보다 더 어렵기 때문에 누클레오티드가 올리고누클레오티드보다 더 바람직하다. 잔기 A의 누클레오티드나 올리고누클레오티드는 또한 본 발명에 따라 제조된 잔기일 수 있다. 잔기 A의 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드의 반응성 그룹은 적합한 보호기로 보호하는 것이 바람직하다. 특히, 잔기 A의 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드중 말단 5'- 히드록시그룹은 산소보호기로 보호한다. 이 산소보호기는 특히 잔기 A에 있어서 상기 언급한 의미와 동일하다.
잔기 B의 천연 누클레오 염기로는 아데닌, 티민, 시토신, 우라실 또는 구아닌이 바람직하다. 변형 염기는 예컨대 이들의 구조 내 고리 또는 치환기중에서 변화시킬 수 있다. 그러한 예로는 7-데아자구아닌 또는 5-아미노알킬 우라실 또는 8-아미노헥실-아미노-아데닌이 있다. 상보적 핵산과의 왓슨-크릭 염기 짝지음에 영향을 미치지 않거나 매우 약간 정도만 영향을 미치는 염기가 바람직하다.
잔기 T는 리보 또는 아라비노 배위를 가질 수 있다. 그중 리보 배위가 바람직하다. 염기성, 산성, 또는 친핵성 조건하에서 분해될 수 있는 그룹, 바람직하게는 t-부틸디메틸실릴 또는 트리이소프로필실릴 그룹이 히드록시 잔기에 대한 보호기로 가능하다.
보호기 V는, 선택적으로 분해될 수 있는 보호기가 바람직하다. 완성된 누클레오티드 사슬이 고형 지지체(carrier)로부터 분해되는 조건하에서 동시에 분해될 수 있는 보호기가 바람직하다. 그러므로 산성 조건하에서 분해될 수 있는 예컨대 A로 표시된 바와 같은 보호기는 바람직하지 않다. 따라서 알칼리성 또는 암모니아성 조건하에서 분해될 수 있는 보호기가 특히 바람직하다; 플루오레닐 메톡시카르보닐기 또는 트리플루오로아세틸기가 특히 바람직한 것으로 밝혀졌다.
일반식 (Ⅰ)의 화합물은, 일반식 (Ⅱ)의 화합물을 일반식 (Ⅲ)의 포스판과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
Figure kpo00003
상기식에서, A는 산소보호기, 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드이고, B는 천연 또는 변형 누클레오 염기이고, T는 수소, (필요하다면, 보호된)히드록시기, 저급알킬, N3또는 저급알킬옥시이고, Z는 우수한 이탈기이고, X는 산소 또는 황이고, L은 적어도 2가의 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고, V는 분해될 수 있는 보호기이고, n은 1 내지 200의 자연수이고, D는 이차 아민잔기이다.
반응조건은 선행 기술상태의 누클레오시드 포스포라미디트에 대해 이미 기술한 바와 유사한 조건으로 전문가에 의해 선택될 수 있다. 그러나, 이 방법에서는, 보호기 V를 분해할 수 있는 시약을 사용하지 않는다는 사실에 주의해야 한다. 각각의 보호기에 대한 반응조건은 전문가에게 공지되어 있다.
일반식 (Ⅲ)의 포스판은 시판용 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성할 수 있다. 합성반응의 바람직한 순서로서, 이차 아민은 저가의 원료이므로 이 물질과의 반응을 제일 먼저 실시한다. 따라서, 이 반응단계에서, 비특정반응에 의한 수득량중 손실량을 필요하다면 얻을수 있다. 일반식 (Ⅲ)의 포스판은, 하기 일반식 (Ⅵ)의 화합물을 일반식 (Ⅶ)의 이차 아민과 반응시키고 생성물을 일반식 (Ⅷ)의 화합물과 반응시켜 형성된 생성물을 단리시키는 방법으로 바람직하게 제조된다.
P(-Z)3(Ⅵ)
H-D (Ⅶ)
G-X-L(-U-V)n(Ⅷ)
상기식에서, Z은 우수한 이탈기이고, D는 2차 아민기이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1)원자가 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소, 또는 N-H이고, V는 분해될 수 있는 보호기이고, n은 1 내지 200의 자연수이다. 잔기 Z는 할로겐이 바람직하며 염소가 특히 바람직하다.
일반식 (Ⅶ)의 화합물은 특히 일반식 H-NR1R2전문가에게 알려진 2차 아민인데, 식중에서 R1및 R2는 동일 또는 상이하며, 1-10탄소원자를 갖는 일차, 이차 또는 삼차 알킬 잔기이거나, 원한다면, 헤테로원자로서 하나 또는 두개의 질소, 산소 및/또는 황원자를 포함할 수 있는 5-7 탄소원자를 함께 갖는 알킬-가지난 시킬로알킬잔기이고 또는 NR1R2는 이미다졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 3-니트로-1,2,4-트리아졸릴, 티아졸릴, 피롤릴, 벤조트리아졸릴 또는 벤조히드록시트리아졸릴기를 나타낸다. 디이소프로필아민 및 모르폴린이 특히 바람직한 아민으로 밝혀졌다.
1-10, 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄, 포화 또는 불포화 탄화수소는 다리 연결부로서 언급할 가치가 있다. 탄화수소 사슬은 헤테로원자, 예컨대 산소 또는 황에 의해 차단될 수 있다. 다리 연결부는 또한 지방족 또는 방향족 고리 시스템을 포함할 수 있다. 다리 연결부는 또한 그외의 헤테로 원자를 포함할 수도 있다. 그러나, 본 발명에 따른 방법으로 수행되는, 상기 다리 연결부를 포함하는 화합물과의 반응에 있어서, 그러나 유리 비치환된 또는 치환기로서 1차 아미노기나 히드록실기를 갖는 다리 연결부는 제외되어야 한다. 다리 연결부는, n 공유 결합을 통해 n개의 U그룹과 연결되어 있다. 바람직한 n 숫자는 1 내지 200이다.
일반식 (Ⅲ)의 화합물은 선행기술 상태의 포스판과 비교하여, 보호된 형태의 반응성 그룹을 가질뿐 아니라 핵산의 포스포라미디트 합성을 위한 누클레오시드 포스포라미디트의 합성에 사용할 수 있다는 장점을 가지고 있다; 이는 검출잔기를 위한 결합 자리로 제공될 수 있다.
누클레오티드 사슬 제조를 위한 본 발명에 따른 방법은 특히 하기의 단계를 포함한다 :
-일반식 (Ⅰ)의 누클레오시드 포스포라미디트를 유리 히드록시 그룹을 갖는 누클레오시드와 커플링 반응시킨다. 바람직하게는 유리 히드록실기를 갖는 누클레오시드를 고형지지체에 공유 결합시킨다. 아미노기, 카르보닐기 또는 그외의 히드록시기와 같은 누클레오시드의 다른 반응성 그룹은 커플링 반응 조건하에서 안정한 보호기로 보호시키는 것이 바람직하다. 당 잔기상에 존재할 수 있는 2'-히드록시기는 t-부틸디메틸실릴기로 보호하는 것이 바람직하다. 바람직한 유리 히드록시기는 당 잔기의 5'-히드록시기이다.
누클레오시드는 모노누클레오시드, 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드일 수 있다. 그러나 모노누클레오시드, 2 내지 200 바람직하게는 20 내지 60개의 누클레오티드 구조단위체로 이루어진 올리고 누클레오티드 또는 폴리누클레오티드가 바람직하다. 누클레오티드 구조단위체는 천연 또는 변형 누클레오티드일 수 있다.
누클레오시드는 또한 본 발명에 따른 방법으로 변형된 누클레오시드일 수 있다.
-그 다음, 고체상에 결합된 누클레오티드 사슬을 산화시킨다. 요오드가 바람직한 산화제로 밝혀졌다.
-이어서 바람직하게는 캐핑 단계를 수행한다. 이 과정은 공지의 방법에 따라 수행한다.
-잔기 A의 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드의 말단 5'-히드록시 그룹에 대한 산소보호기 또는 보호기 A를 선택적으로 분해시킨다. 바람직한 경우에 있어서, 잔기 A의 산소보호기가 산성 조건하에서 분해될 수 있는 디메톡시 트리페닐메틸기와 같은 보호기라면, 이는 예컨대 디클로로아세트산에 의해 분해시킬 수 있다.
-이제 원한다면, 상기의 제1단계를 반복 실시한다. 이를 위해, 통상의 모노누클레오시드 포스포라미디트 또는 일반식 (Ⅰ)을 갖는 모노누클레오시드 포스포라미디트를 누클레오시드 포스포라미디트로 사용할 수 있다.
-누클레오티드 사슬이 목적 길이까지 합성된 직후, 보호기 V를 분해시킨다. 아미노 보호기의 경우에 있어서, 트리플루오로아세틸 또는 플루오레닐메톡시 카르보닐 잔기(Fmoc)가 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.
-이후, 누클레오티드 사슬을 공지의 방법으로 고형지지체로부터 분해시킨다. 반응조건은 공유 결합의 종류에 따라 선택되며 본 발명에 따른 변형에 의해 영향받지 않는다.
그러나, 지지체로부터 누클레오티드 사슬의 분해와 보호기 V의 분해반응이 동시에 일어날 수 있는 조건이 특히 바람직하다. 이는, 예컨대, 3'-0-숙신일을 통해 CPG(controlled pore glass)에 결합된 지지체와 잔기 V로서 Fmoc 보호기를, 분해용 시약으로 사용하는 알칼리성, 바람직하게는 진한 암모니아 수용액이나 아민용액중에서 사용함으로써 실행할 수 있다.
-일반적으로 정제 단계 예컨대 HPLC 크로마토그래피 또는/및 투석에 의한 정제 단계를 다음 과정으로 실시한다. 올리고누클레오티드 합성에 일반적으로 사용되는 조건과 동일한 조건을 이 과정에서도 사용한다.
이러한 모든 단계는, 다른 누클레오시드 포스포라미디트를 사용한다는 점과 포스페이트 잔기의 산소보호기를 분해하기 위한 시약대신에 보호기 V의 분해를 위한 선행기술의 시약을 사용한다는 점과는 달리, 반응을 수행하는데 통상적인 방법과 정의 변화가 필요하지 않다는 공통점을 가지고 있다. 특히 단계의 수는 통상의 포스포라미디트 방법과 동일하거나 보다 작다. 그러므로 본 발명에 따른 방법은, 장치상의 변화없이, 포스포라미디트 합성을 위해 이용할 수 있는 핵산 합성장치로 수행할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 일반식(Ⅸ)의 누클레오티드 서열은 바람직하게는 2 내지 200, 특히 바람직하게는 20 내지 60개의 누클레오티드 구조단위체를 갖는다. 이중 10 내지 80% 특히 바람직하게는 20 내지 50%의 누클레오티드 구조단위체는, 인 원자에서 변형된 일반식 (Ⅰ)의 누클레오시드 일인산으로부터 형성된 누클레오티드 구조단위체이다. 이러한 변형 누클레오티드 구조단위체는 서열내에서 다른 누클레오티드에 2-5 누클레오티드 간격으로 위치하는 것이 바람직하다. 일반식 (Ⅸ)의 화합물은 많은 용도를 갖는다.
예컨대, 본 발명에 따라 제조된 일반식 (Ⅸ)의 누클레오티드 사슬로부터, 간단한 방법으로 검출잔기 또는 검출잔기로 전환될 수 있는 잔기를 포함하는 누클레오티드 사슬을 제조할 수 있다. 누클레오티드 사슬이 여러개의 변형된 누클레오티드 구조단위체를 갖는다면, 여러개의 그러한 변형잔기를 포함하는 누클레오티드 사슬을 제조할 수 있다. 결과적으로, 핵산의 측정은 더 민감하게 됨이 밝혀졌으므로, 이와 같은 경우가 바람직하다.
그러므로 본 발명의 또다른 목적은, 상기 언급한 단계에 이어, 형성된 일반식 (Ⅸ)의 누클레오티드 사슬을 일반식 (Ⅳ)의 화합물과 반응시켜 하기 일반식 (Ⅴ)의 누클레오티드 사슬을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
Figure kpo00004
상기식에서, K는 다른 누클레오티드 또는 누클레오티드 서열의 포스페이트잔기의 인 원자나 수소이고, J는 다른 누클레오티드 또는 누클레오티드 서열의 5' 산소원자나 히드록시 그룹이고, B는 천연 또는 변형 누클레오 염기이고, T는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급알킬옥시 또는 히드록시 그룹이고, W는 검출잔기 또는 검출잔기로 전환될 수 있는 잔기이고, X, L, U 및 n은 상기 언급한 의미와 동일하고, 및 Y는 반응성 그룹이다.
쉽게 치환될 수 있는 친핵성 그룹이나 친전자성 그룹은 예컨대 반응성 그룹 Y로 가능하다. 일반식 (Ⅳ)의 화합물은 예를들면 할로겐화 카르복실산이다.
친전자성 그룹은 예를들면 활성화된 에스테르나 무수물내의 그룹이다. 바람직한 에스테르는, 예를들면 이들이 카르복실기를 가질 경우, 합텐의 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.
잔기 K 또는 J의 의미중에 포함된 다른 누클레오티드는 천연 또는 변형 누클레오티드일 수 있다. 잔기 K 또는 J의 의미중에 포함된 누클레오티드 사슬은 변형된 누클레오티드 구조단위체뿐 아니라 천연 누클레오티드 구조단위체를 포함할 수 있다. 일반식 (Ⅴ)의 누클레오티드 사슬은 바람직하게는 2 내지 200, 특히 바람직하게는 20 내지 60개의 누클레오티드 구조단위체를 갖는다. 이들중 10 내지 80%, 특히 바람직하게는 20 내지 50%의 누클레오티드 구조단위체는 일반식 (Ⅰ)의 누클레오시드 일인산으로부타 형성된 누클레오티드 구조단위체이다.
잔기 W는 고분자 구조뿐 아니라 저분자 구조일 수 있다. 바람직한 저분자 리포터 분자는 염료 및 합텐이다; 바람직한 고분자 그룹은 예컨대 효소 또는 항원이나 항체와 같은 면역 활성물질이다. 합텐이 특히 바람직하다. 이중에서, 정상 상태하 체액중에서 발견되지 않는 예컨대 디곡시게닌(digoxigenin)과 같은 것들이 특히 바람직하다. 합텐과 특히 디곡시게닌은, 이들을 포함하는 누클레오티드 사슬의 분자량이 변형에 의해 많이 변화하지 않으므로 면연적 활성물질로 특히 유리하다고 밝혀졌으며, 따라서 예를들어 겔 크로마토그래피 방법의 표준길이로 이용할 수 있다.
누클레오티드 사슬의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법은 선행기술상태와 비교하여 하기의 장점을 가짐이 밝혀졌다 :
-변형은 인 원자에서 이루어지므로 상보적인 누클레오티드 사슬과 함께 형성된 누클레오티드 사슬의 염기-짝지음은 손상되지 않는다.
-형성된 누클레오티드 사슬은 중합효소에 의한 프라이머(primer)로서 이용된다.
-변형은, 예컨대 당 잔기나 염기의 다른 변형에 추가로 또는 3'-이나 5'-말단 표지에 더하여 도입될 수 있다.
-본 방법은 필요한 구조단위체의 유사합성을 포함한다. 그러한 방법은, 특히 고가의 누클레오티드 구조 단위체를 많이 생성할 수 있기 때문에, 특히 유리하다.
-누클레오시드 포스포라미디트의 합성을 위해, 쉽게 -이용가능한, 자연적으로- 존재하는 β 누클레오시드를 이용할 수 있다.
-동일 수 또는 감소된 수의 반응단계로, 포스페이트 잔기에 변형된 누클레오티드 사슬을 합성하기 위해 누클레오티드 합성을 위한 고체상 포스포라미디트 방법의 잘-알려진 장점을 이용하는 것이 가능하다.
-본 발명에 따른 방법을 이용하여, 사슬내 특정자리에 매우 특별한 수의 변형을 도입하는 것이 가능하다.
-형성된 변형 누클레오티드 사슬을 일반적으로 사용할 수 있다. 예를들어 다른 검출잔기를 선택할 수 있다.
-검출잔기는 누클레오시드 포스포라미디트내에 처음부터 존재하지 않기 때문에, 효소표지나 다른 민감한 리포터 그룹을 사용할 경우 예상되는 복잡성을 누클레오티드의 화학 합성동안 피할 수 있다.
-리포터 분자에 의한 입체 장애는 올리고누클레오티드 합성의 수득량과 효율을 저하시킬 수 있다. 이러한 단점은 본 발명에 따른 방법으로 극복된다.
샘플을 그것에 본질적으로 상보적인 핵산과 접촉시키고, 다른 핵산에 상보적인 핵산을 혼성화 및 검출잔기를 검출하는 조건하에서 혼합물을 처리함으로써, 샘플내 핵산의 검출을 위한 방법중의 샘플 DNA에 상보적인 누클레오티드 서열로서 일반식 (Ⅴ)의 누클레오티드 서열을 사용함이 유리할 수 있다. 검출잔기의 검출은 공지의 방법에 의해 실행될 수 있다. 검출잔기가 면역적 활성물질이라면, 잔기는 표지된 면역 상대자와 반응할 수 있다. 그 후에 표지물질을 측정한다. 본 발명에 따른 핵산을 사용할 경우, 합텐 특히 디곡시게닌이 잔기 W로 바람직하다.
그것들은 단일 가닥의 핵산으로부터 이중가닥의 핵산을 효소적으로 합성하는데 있어서 프라이머로서도 동등하게 적합하다. 형성된 이중-가닥 핵산은 두 가닥중 적어도 한 가닥에 누클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 설명된다.
[실시예 1]
[2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐-)아미노에탄올]
68.0g(약 200mMol)의 9-플루오레닐메톡시카르보닐-N-히드록시숙신이미드에스테르(Fmoc-O-Su)를 1 1 둥근-바닥 플라스크내에서 300㎖ 디옥산중에 교반하면서 용해시킨다. 14.4㎖(238mMo1)의 에탄올아민과 200㎖ 물에 용해된 40g의 Na2CO3를 투명용액에 연속적으로 부가한다. 일단 형성된 과육질(pulpy)의 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반한 후 다음날 흡인여과시킨다. 목적 생성물외에 반응되지 않은 Fmoc-O-Su, N-히드록시숙신이미드를 포함하는 여과 잔류물을 초산 에스테르로 재결정시킨다. 진공하에서 건조시킨 후 이론상 수득량의 76%인 47.4g의 순수 생성물을 수득한다.
1H-NMR(ppm) (DMSO) : 3.4(m, CH2O, 2H); 3.6(t, CH2N, 2H); 4.2-4.5(m, CH2OCO+H[C9], 3H); 5.2(s[b], NH, 1H); 7.2-7.9(m, 방향족, 8H);
[실시예 2]
[디클로로-N,N-디이소프로필아미노-포스판]
300㎖의 무수에테르, 81㎖의 무수 피리딘 및 87.5㎖의 PCl3(1Mol)을, 500㎖ 적하 깔때기, KPG 교반기, 온도계 및/드라이아이스 배드를 갖춘 21 삼구, 둥근-바닥 플라스크내에서 교반하면서 -70℃로 예비 냉각시킨다. 250㎖의 무수 에테르에 용해시킨 142㎖의 디이소프로필아민(1Mol)을 상기 혼합물에 2시간내에 한 방울씩 부가하고 약 -60 내지 -65℃에서 유지시킨다. 부가를 완결한 후, 농축된 과육질의 반응 혼합물을 실온으로 올리고 약 600㎖의 무수에테르로 희석시켜 더 쉽게 교반되도록 만든다. 실온에서 이후 3시간 교반한 후, 형성된 침전물을 유리 여과기로 흡인 여과하고 에테르로 여러차례 세척한다.
표준압력에서 에테르를 배수한 후, 수류 진공하에서 반응되지 않은 PCl3, 디이소프로필아민 및 피리딘을 제거하고 그 다음 오일-펌프 진공하에서(KP46℃/0.35토르) 잔류하는 오일을 분별 증류한다. 이론적 생성량의 36%에 해당하는 포스판 7.34g이 수득된다.
31P-NMR (ppm) (CHCl3) : 167.5
[실시예 3]
[2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐-)아미노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포클로리디트]
0.9㎖의 디클로로-N,N-디이소프로필아미노-포스판(5mmol)을 100㎖ 둥근-바닥 플라스크중에서 30㎖의 무수 테트라히드로푸란에 용해시키고 0.4㎖ 무수피리딘을 부가한다. 20㎖ 무수 테트라히드로푸란에 용해시킨 1.4g의 2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)아미노 에탄올(5mmol)용액을 자석 교반하면서 약 5시간동안 상기 혼합물에 천천히 한방울씩 부가한다. 분리하여 테트라히드로푸란을 제거한 피리딘 히드로클로라이드를 흡인한 후, 누클레오시드 포스포라미디트와 제조를 위해 잔류하는 오일(2.2g=이론적 수득량의 98%)을 직접 사용한다(실시예(4) 참조).
[실시예 4]
[5'-0-디메톡시트리틸-2'-데옥시티미닌-3'-O-[2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)아미노에틸]-N-N-디이소프로필아미노-포스판]
a) 2.5g의 5'-0-디메톡시트리틸-2'-데옥시티미딘(4.6mMol)을 100㎖ 둥근-바닥 플라스크내에서, 50㎖의 디클로로메탄(Na2CO3로 증류됨)과 2.5㎖의 N-에틸-N,N-디이소프로필아민에 용해시킨다. 1회용 주사기를 사용하여 상기 용액에 2㎖의 2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐-)아미노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포클로리디트(약 5mmol)을 부가한다. 이를 실온에서 48시간 교반하고 진공하에서 증발시켜 점성 잔류물을 수득한다.
조생성물은 실리카 겔 60(컬럼 30×2㎝, 이동용매 석유 에테르 50-75℃/아세트산 에틸/디클로로매탄/피리딘=4 : 8 : 8 : 2)로 크로마토그래피하여 정제한다. 생성물을 포함하는 분획은 회수하고 용매는 진공하에서 완전히 제거한다.
이론적 수득량의 20%에 해당하는 흰색 거품성 잔류물 0.9g을 수득한다.
b) 다른 방법에 의하면, 5.45g의 5'-0-디메톡시트리틸-2'-데옥시티미딘(10mmol)을 100㎖ 무수 디옥산에 교반하면서 용해시킨다. 참고문헌 S. Hammoto, H. Takaku, Chemistry Lett. 1986, 1401-1404에 따라 제조된 비스-(디이소프로필아미노)-클로로포스판 2.7g(10mmo1)과 2.1㎖의 트리에틸아민(15mmo1)을 100㎖의 디옥산에 용해시킨 용액을 30분내에 상기 용액에 한 방울씩 부가한다. 그 다음, 이동용매로 염화 메틸렌/아세트산 에틸=1 : 1을 사용하여 얇은 막 크로마토그래피로 반응시킨다. 두시간 후, 트리에틸암모늄 클로라이드의 침전물을 보호용 기체인 아르곤하에서 여과시키고 여과액(무색거품)을 농축시킨다. 형성된 5'-0-디메톡시트리틸-2'-데옥시티미딘-3'-0-비스-(N,N-디이소프로필아미노)포스판은 더 이상의 분리과정없이 목적 생성물로 전환된다. 이를 위하여, 무색 거품은 100㎖ 무수 아세토니트릴로 회수하고 3g의 2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-아미노-에탄올(실시예 1)과 35㎎(5mmol)의 테트라졸(승화된 형태)을 부가한다. 실온에서 하룻밤 교반시키고 100㎖의 아세트산 에틸을 부가하여 반응을 종결한다. 포화염화나트륨 용액으로 세번 추출한 후 혼합된 유기층은 황산나트륨으로 건조시킨다. 황산 나트륨을 여과시킨 후 여과액을 농축시킨다. 조생성물은실리카겔 60H로 크로마토그래피(ℓ=24㎝, d=4㎝; 이동용매 : 염화 메틸렌/아세트산에틸=5 : 1)하여 정제한다. 용매를 제거한 후 무색거품이 다시 수득된다. 이는 10㎖의 염화 메틸렌으로 회수하여 400㎖의 얼음-냉각한 n-헥산으로 침전시킨다. 이론적 수득량의 20%에 해당하는 양인 1.8g의 목적 생성물을 무색 분말형태로 수득한다.
두 부분입체 이성질체는 TLC와 31P-NMR에 의해 구분할 수 있다 :
Rf값 (CH2Cl3/EA=1 : 1) : 0.04, 0.15
31P-NMR(ppm) (CD3CN) : 146.7, 145.8
[실시예 5]
[d(Tp AE TpTpTpTpTpTpTp AE T)의 합성]
올리고누클레오티드의 합성은 BioSearch Company사 제품인 완전자동 DNA합성장치 8600을 사용하여 표준 프로토콜(protocol)에 따른 1μmol 스케일로 수행된다. 합성기구에는 이를 위하여 Iμmol 티미딘 지지체로 피박된 반응 컬럼이 설치되어 있으며, 제1반응 단계에서, 5'-OH 보호기(디메톡시트리틸-)는 디클로로 메탄에 용해시킨 디클로로아세트산 2% 용액으로 처리하여 분해시킨다. 컬럼을 아세토니트릴로 세척한 후, 본 발명에 따라 P에 변형을 시킨 실시예(4)의 5'-0-디메톡시-트리페닐메틸-2'-데옥시티미딘-3'-0-[2-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)아미노에틸]-N,N-디이소프로필아미노-포스판을 출발 누클레오시드의 유리 5'-OH기에 커플링시키고 동시에 아세토니트릴중의 테트라졸로 활성화시킨다. 아직도 3가의 형태로 존재하는 P원자는 세척후 THF/루티딘/H2O에 용해시킨 요오드 용액으로 산화시킴으로써 천연의 5가 포스페이트로 전환된다. 아세트산 무수물/디메틸아미노피리딘과의 계속되는 캡핑단계는 아세틸화 반응에 의해 비-커플링된 5'-OH-누클레오시드를 보호한다. 이 단계에 의해 다른 서열의 형성이 억제된다. 세척 후, 합성순환은 5'-0-디메톡시트리틸 보호기의 새로운 분해와 함께 출발단계로부터 다시 시작된다. 이 방법에 있어서, 마지막 순환 과정에서 아미노에틸화된 티미딘-포스포라미디트(TpAE)와의 또다른 커플링을 수행하기전에, 변형되지 않은 포스포라미디트부를 포함하는 6개의 티미딘 구조 단위체를 반응 서열내로 도입시킨다. 합성을 완결한 후, 지지체에 결합된 올리고누클레오티드는 진한 암모니아 수용액으로 처리하여 제거하고 동시에 아미노에틸화된 포스페이트의 Fmoc보호기도 제거한다. 결과는 86ODU/A260이다. 이 조생성물은 하기 조건하에서 HPLC하여 정제한다.
컬럼 : 모노 Q HR 10/10(Pharmacia)
용리액 A(물), 용리액 B(0.5n-LiCl)
구배 : 60분동안 A에서 50% B로 용리액은 H2O에 대해 하룻밤 투석시킨다.
(Spektrapor, MWCO 1000)
수득량 : 55 ODU
[실시예 6]
[실시예(5)로부터 얻은 올리고누클레오티드를 디곡시게닌으로 표지]
실시예(5)로부터 얻은 올리고머 55 ODU/A260을 1㎖의 0.1m 붕소산 나트륨 완충액(pH 8.5)에 용해시키고 1㎖ 디메틸포름아미드에 용해시킨 10㎎의 디곡시게닌-0-숙신일-아미도카프로 산-N-히드록시숙신이미드 에스테르와 혼합한다. 혼합물은 실온에서 18시간동안 교반하고 진공하에서 건조시켜 증발시킨 후 H2O에 용해시키며, 생성물의 혼합물은 HPLC로 분리한다.
컬럼 : Shandon Hypersil ODS, 25㎝×0.4㎝
용리액 A : 0.1m 아세트산 트리에틸암모늄 용액
용리액 B : 0.1m 아세트산 트리에틸암모늄 용액/이소프로판올
구배 : 30분동안 A에서 50% B로
생성물 분획은 진공하에서 증발시켜 농축시키고 물로 회수하여 증류수에 의해 하룻밤 투석시킨다(Sprectrapor, MWCO 1000)
수득량 : 11 ODU/A
[실시예 7]
[DNA 시험에서 검출한계의 비교]
3개의 동일한 올리고누클레오티드(38mers)와 HIV에 특이한 서열과의 혼성화 성질을 클론된 HIV-DNA 조각(954bp PvuⅡ/Bgl Ⅱ fragment from the gag region of the HIV-Wfl.13-isolate)에 대해 시험해 보았다. 올리고누클레오티드는 하기 위치에서 디곡시게닌으로 표지시킨다 :
1. 5'-말단 우라실과 중간에 위치한 우라실 각각의 위치(즉, 두 딕(dig) 라벨, 우라실의 C-5에 염기 표지).
2. 5'-말단, 3'-말단 및 중간에 위치한 우라실 각각의 위치(세번 딕 라벨, 우라실의 C-5에 염기 표지).
3. 5'-말단 포스페이트 그룹과 중간에 위치한 포스페이트그룹 각각의 위치(2 딕 라벨/분자, 본 발명에 따라 표지).
a) 딕 라벨링한 올리고누클레오티드를 위한 혼성화 준비
샘플 DNA를 1㎕부피의 희석 계열중에 있는 여과지 위에 각각 직접 점적하거나 아가로스 겔에서 분리한 후 20×SSC 완충액을 이용하여 서어던블롯(Southern blot)에 의해 여과지에 전이시킨다. 3분간 UV를 조사하여 정착시킨다. 여과지를 하기 조건하에서 예비-혼성화시킨다. 5×SSC, 0.5% 보호 시약중에서 40℃, 1시간. 딕 라벨링된 올리고누클레오티드와의 다음 혼성화 반응은 하기 조건하에서 수행한다 : 5×SSC, 0.5% 보호시약, ㎖당 200㎎의 올리고누클레오티드 혼성화 용액중에서 4℃로 하룻밤.
반응후 여과지에 2×SSC, 0.1% SDS 중에서 40℃로 4×10분간 세척한다.
검출은 디곡시게닌에 대한 POD-표지된 항체를 이용하여 비-방사성 라벨링과 유사하게 검출용 키트(Boehringer Mannheim GmbH)로 수행한다.
b) 결과 :
점적된/블롯된 샘플 DNA의 검출 한계
두번 염기표지한 올리고누클레오티드 사용(1) : 10ng
세번 염기표지한 올리고누클레오티드 사용(2) : 10ng
포스페이트를 통해 두번 표지한 올리고누클레오티드 사용(3) : 1-10ng

Claims (6)

  1. 하기 일반식 (Ⅸ)의 누클레오티드 서열을 하기 일반식 (Ⅳ)의 화합물과 반응시켜 하기 일반식(Ⅴ)의 누클레오티드 서열을 제조하는 방법 :
    Figure kpo00005
    상기식에서, K는 수소 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, J는 히드록시 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열의 5' 산소원자이고, B는 천연 또는 변형된 누클레오 염기이고, T는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급 알킬옥시 또는 히드록시 그룹이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1)원자가 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고, W는 검출가능한 잔기 또는 검출가능한 잔기로 전환될 수 있는 잔기이고, n은 1 내지 200의 자연수이고, 및 Y는 반응기이다.
  2. 하기일반식 (Ⅴ)의 누클레오티드 서열 :
    Figure kpo00006
    상기식에서, K는 수소 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, J는 히드록시 그룹 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열의 5' 산소원자이고, B는 천연 또는 변형된 누클레오 염기이고, T는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급 알킬옥시 또는 히드록시기이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1)원자가 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고, W는 검출가능한 잔기 또는 검출가능한 잔기로 전환될 수 있는 잔기이고, n은 1 내지 200의 자연수이다.
  3. 하기 일반식 (Ⅰ)의 화합물을 유리 5'-히드록시기를 갖는 다른 누클레오시드와 반응시키고 형성된 누클레오티드 사슬을 산화시켜 하기 일반식 (Ⅸ)의 누클레오티드 사슬을 제조하는 방법 ;
    Figure kpo00007
    상기식에서, K는 수소 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, J는 히드록시기 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열의 5' 산소원자이고, B는 천연 또는 변형된 누클레오 염기이고, T는 일반식 (Ⅸ)에서는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급알킬옥시 또는 히드록시기이고, 일반식 (Ⅰ)에서는 수소 또는 원한다면 보호된 히드록시기이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1)원자가 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고, n은 1 내지 200의 자연수이고, A는 산소보호기, 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드이고, V는 분해될 수 있는 보호기이고, 및 D는 2차 아민잔기이다.
  4. 하기 일반식 (Ⅸ)의 누클레오티드 서열 :
    Figure kpo00008
    상기식에서, K는 수소 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, J는 히드록시기 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열의 5' 산소원자이고, B는 천연 또는 변형된 누클레오 염기이고, T는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급 알킬옥시 또는 히드록시기이고, X는 산소 또는 황이고, L은 (n+1)원자가 다리 연결부이고, U는 산소, 황, 질소 또는 N-H이고 및 n은 1 내지 200의 자연수이다.
  5. 샘플중의 핵산에 상보적인 핵산으로서 하기 일반식 (Ⅴ)의 화합물을 사용하여 샘플중의 핵산을 검출하기 위한 하기 일반식 (Ⅴ)의 누클레오티드 서열의 용도 :
    Figure kpo00009
    상기식에서, K는 수소 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, J는 히드록시기 또는 다른 누클레오티드나 누클레오티드 서열의 5' 산소원자이고, B는 천연 또는 변형된 누클레오 염기이고, T는 수소, 저급알킬, 아지드, 저급 알킬옥시 또는 히드록시기이고, 및 X, L, U, W 및 n은 상기-언급한 의미와 동일하다.
  6. 이중가닥의 핵산을 효소적으로 합성하는데 사용되는 프라이머로서의 하기 일반식 (Ⅴ)의 누클레오티드 서열의 용도.
    Figure kpo00010
    상기식에서, K, B, T, J, X, L, U, W 및 n은 상기 언급한 의미와 동일하다.
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