JP4579350B2 - 共有結合的に架橋されたオリゴヌクレオチド、その製造法、およびその製造法に用いられるシントン - Google Patents

Description

本発明は、共有結合的に架橋した二本鎖オリゴヌクレオチド、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、または混合ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体であって、その２本の相補性鎖が共有結合的に架橋しているものに関する。
更に詳細には、本発明は、（複数の）内部オリゴヌクレオチド共有結合を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチドの２つの部位の間に共有結合を、またはオリゴヌクレオチドの部位の多数、すなわち２つの多くの間に数個の共有結合を有する一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。特に、オリゴヌクレオチドは、「ヘアピン」型、すなわち分子内で対を形成しないループ構造によって分離された同一鎖の２個の対になった断片を含むものであることができ、共有結合は上記の対になった断片に位置している。
本発明は、（複数の）オリゴヌクレオチド間共有結合を有する二本鎖オリゴヌクレオチド、すなわち２個の対になった鎖が、この２本の鎖のそれぞれの１個以上の部位の間の共有結合によって互いに結合している二本鎖オリゴヌクレオチドにも関する。
この種類のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ ＷＯ９３／１８０５２号明細書に記載されている。それらは、治療用途、特に病理学に関与する遺伝子の転写に関わる因子とハイブリッドする特性を得るのに用いられるいわゆる「センス」法に有用である。この種のセンス薬剤もＰＣＴ ＷＯ９２／１９７３２号明細書に記載されている。
架橋したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の機構を解明するための研究試薬としても用いられる。特に、この相互作用が二重らせん（ＲＮＡポリメラーゼ、メチラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、および他の修復酵素）の構造の乱れに関係しているときには、有用である。
架橋した二本鎖を実際に使用することによって、様々な組織における遺伝子発現の水準を（特定の因子がこの機構に参加するとき）イン・ビトロ系で検討を行うことができ、転写を阻害しかつこれを調節するための有効な手段を構成する。
これらの二本鎖は、共有結合を持たない二本鎖オリゴヌクレオチドと比較してエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに対する耐性が大きいという特に有利な特性を有する。
本発明の目的は、改良された共有結合的架橋を有するオリゴヌクレオチドを提供することであり、すなわち共有結合が二本鎖のまたはＤＮＡの他の二次および三次構造のらせん構造満足するのに十分な柔軟性を有するものでなければならない。
本発明のもう一つの目的は、これらの共有結合的に架橋したオリゴヌクレオチドの簡略化した製造法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、共有結合したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分のハイブリダイゼーションを混乱させることなく切断することができる共有結合を得ることである。
ＷＯ９３／１８０５２号明細書では、共有結合した二本鎖であって、共有結合がアルデヒド基、更に具体的にはジアルデヒド基とアミン基との反応から生じるものが記載されている。この反応によりシッフ塩基を生じ、続いて水素化ホウ素化合物で還元して、ヒドラジド共有結合を生じるのである。アルデヒドとヒドロキシル基との反応も記載されており、これはアセタール結合を生じる。
本発明は、第一アミン基とカルボキシル基との間にアミド型

の共有結合を使用することにある。この種の結合により、本発明によって設定された目的を達成することができる。
この種のアミド結合は、その化学が極めて単純であるため、有利であるが、カルボジイミド型の縮合試薬の存在下で一段縮合反応が必要であり、下記の理由によりＷＯ９３／１８０５２号明細書には記載されなかった。この種のアミド結合は、これが２個の核酸、更に具体的には２個のオリゴヌクレオチドを伴うときには、ｐＨが約６．５の酸性媒質中で生成されなければならない。ところが、脂肪族第一アミン基のｐＫａは、１１程度である。従って、６．５程度の反応ｐＨ条件下では、脂肪族第一アミン基はほとんどがプロトン化した形態であり、アミンの親核性形態は事実上存在しないので、反応は起こらないか、またはいずれにしても収率は極めて低くなる。
しかしながら、本発明によれば、２′−デオキシヌクレオチドの２′位に位置したアミン基は著しく低いｐＫａを有し、すなわち７．４程度であり、２個のオリゴヌクレオチドのカップリングと適合するｐＨ条件下でこのアミンをカルボキシル基とカップリングすることができる。反応ｐＨ水準の結果として、これはかなりの程度まで遊離のプロトン化されていない形態に保持され、親核性のままである。
従って、本発明の本質的特徴は、２′−デオキシヌクレオチドの２′位にＮＨ_２基を有する改変ヌクレオチドであって、末端にカルボキシル基を有する脂肪族基を有するもう一つの改変ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチド類似体とカップリングしたものを用いることである。
更に具体的には、本発明の主題は、１個以上のオリゴヌクレオチド間または内の共有結合的架橋を有するそれぞれ二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのまたはそれぞれの共有結合が一方の鎖の第一アミン基と、それぞれ他方の鎖または同一鎖のカルボキシル基との間のアミド結合からなり、上記の第一アミン基が一方のヌクレオチドの糖の環の２′位で直接置換されており、上記カルボキシル基がそれぞれ他方の鎖または同一鎖のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体で置換された脂肪族スペーサー基によって支持されていることを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
「ヌクレオチド類似体」は、天然ヌクレオチドと同様に、２個のヌクレオチド間結合の間に３個の炭素原子からなる線状主鎖を含み、この主鎖がその骨格として

を有する非ヌクレオチドインサートを意味する。この非ヌクレオチドインサートにより、天然のヌクレオチド間距離に付着することができる。上記の「ヌクレオチド類似体」は、オリゴヌクレオチドにおいてそれぞれ末端ヌクレオチドまたは非末端ヌクレオチドと置換する場合には、１価残基または２価残基の形態となっている。
共有結合に含まれる脂肪族基は、その大きさが、問題となっている２個のオリゴヌクレオチド間の共有結合が５〜２５個の一列になった原子を含む線状鎖からなり、一方において２本の鎖の間の距離および他方において二重らせんの空間配置とが付着して、二本鎖の間に良好なハイブリダイゼーションができるようになるものでなければならないので、スペーサー基として用いることができる。
一つの態様では、上記のカルボキシル基は、２位が置換された１，３−プロパンジオールの非ヌクレオチドインサートと末端に上記のカルボキシル基を有する脂肪族基（Ｒ）とからなるヌクレオチド類似体によって支持されている。

もう一つの態様では、上記のカルボキシル基は、２′−デオキシヌクレオチドの２′位で置換された脂肪族基によって支持されている。
しかしながら、糖の環および／またはプリンまたはピリミジン塩基の各種の他の官能基においてヌクレオチドを保護する必要がない限り、反応は容易に行われるので、ヌクレオチド類似体を用いるのが好ましい。
適当な場合には、分子間または分子内共有結合に関与する（複数の）ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は、対になる位置にあることができ、すなわち対になった断片のそれぞれの鎖で向かい合っていることができる。
しかしながら、上記の脂肪族基の大きさによっては、共有結合に関与した（複数の）ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は幾つかの場合には対になる位置になく、１個以上のヌクレオチドだけが、対になる位置に対してずれていることが好ましいことがある。従って、共有結合に関与している（複数の）ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は、対になる位置に対して１〜５個のヌクレオチドだけずれているのが好都合である。
有利なことには、上記の脂肪族基は、上記アミド結合とヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の置換されている部位との間に３〜２３個の一列に並んだ線状原子を有し、これは、上記のように、結合に関与する（複数の）ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体の間の５〜２５個の原子の距離に相当するものである。
更に好ましいものとしては、上記の脂肪族基は、７〜１６個の原子を含む。
一つの態様では、上記の脂肪族基は９個の原子を含んでおり、共有結合に関与するヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は、対になる位置に対して２個のヌクレオチドだけずれている。
カルボキシル基で置換された上記の脂肪族スペーサー基は、それ自身ヌクレオチドの２′位またはヌクレオチド類似体の２位で直接置換された第一アミン基の酸無水物

によるアシル化によって得ることができる。
有利な別態様では、カルボキシル基で置換された上記の脂肪族スペーサー基は、ヌクレオチド上の２′位またはヌクレオチド類似体上の２位で、ＮＨ_２末端自身が酸無水物でアシル化されているアミノ酸で直接置換されたアミン基のアシル化によって生じる。
アミノ酸がβ−アラニンである例を、具体的に記載することができる。
酸無水物は、コハク酸無水物または無水酒石酸のような環状無水物であるのが好ましい。
共有結合が無水コハク酸または酒石酸にカップリングしたβ−アラニンを含む場合には、一方の鎖の２′−デオキシヌクレオチドの２′位の残基が、もう一方の鎖、またはそれぞれ式

または

の２価の残基を介して同一の鎖の１，３−プロパンジオール型の類似体の２位の残基に結合している。
酸無水物はシス−グリコール基を含むのが好ましい。実際に、このグリコール基は、二本鎖のハイブリダイゼーションを混乱させることなく温和な酸化反応で開裂させることができる。
２′−デオキシヌクレオチドの２′位、または特に１，３−プロパンジオール型のヌクレオチド類似体の２位のアミン基のもう一つの利点は、特に自動ホスホルアミダイト合成反応において、特にトリフルオロアセチル基

によって２′位が保護されたＮＨ_２基を用いるオリゴヌクレオチド合成の通常の方法に用いることができるシントン(synthons)を得ることができることである。
従って、合成の経過中に、１個以上の改変をヌクレオチド中に、オリゴヌクレオチド鎖の任意の所定部位に適当なモノマーシントンを用いて導入することができる。
従って、本発明の主題は、本発明のオリゴヌクレオチドの製造に用いられるヌクレオチドシントンであって、核酸、および保護された２′位がトリフルオロアセチル基によって置換されたアミン基の自動および手動合成の方法に用いられるようにするための適当に保護された５′および３′末端を含むことを特徴とするものでもある。
このトリフルオロアセチル基は、次にこれを含むオリゴヌクレオチドを酸無水物とカップリングするため選択的に除去することができる。
更に、本発明の主題は、本発明によるオリゴヌクレオチドの製造に用いられる非ヌクレオチドシントンであって、プロパンジオール化合物の１および３位のヒドロキシル官能基がオリゴヌクレオチド合成反応におけるヌクレオチドの５′および３′官能基に対する通常の保護基によって保護されており、２位がＮＨ_２基または遊離のＮＨ_２基がトリフルオロアセチル基によって保護されているアミノ酸のアシル残基で直接置換されているプロパンジオール化合物からなることを特徴とするものである。
上記のヒドロキシル基は、オリゴヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法に用いられる保護基によって保護されている。
ホスホルアミダイト合成に用いられる態様では、ヌクレオチドシントンは、式

に相当する。
一つの態様では、非ヌクレオチドシントンは、式

（上記式中、
Ｘ_１およびＸ_２はオリゴヌクレオチド合成の方法に用いられるヌクレオチドの５′−および３′−ＯＨ基の通常の保護基である。Ｘ_３はアミン基保護基、またはＮＨ_２基がアミン基保護基によって保護されているアミノ酸のアシル残基である）に相当する。
特に、下式のシントンが用いられる。

最後に、本発明の主題は、本発明によるオリゴヌクレオチドの製造法であって、アミド型の共有結合を、一方の鎖の第一アミン基と、他の鎖または同一の鎖の別の部分のカルボキシル基との間において、ｐＨ６．５で縮合剤の存在下での縮合反応によって生成させることを特徴とする方法である。
縮合剤は、水溶性のカルボジイミドであるのが好ましい。
好都合なことには、カルボキシル基を含む鎖は、通常のヌクレオチドシントンと、請求の範囲第１５〜２０項のいずれか一項に記載のシントンとを用いて得られるアミン基を含む鎖から製造され、これを上記の脂肪族基を含む酸無水物にカップリングさせるのである。
固形物支持体上での核酸の化学合成の原理は、現在では専門的文献に詳細に報告されており、合成の段階の総てまたは一部を自動的に行う多くの装置が市販されている。報告された化学的方法の中でも、いわゆるホスホルアミダイト法（ＥＰ ０ ０３５ ７１９ Ｂ１号明細書、ＥＰ ６１７−４６号明細書）は、現在のところは、工業的規模での核酸の生産のための十分な効率を示す。
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明を考慮すれば明らかになるであろう。
オリゴヌクレオチド(A)および(B)は、ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成の標準的手順に従って製造した。

次に、(A)と無水スクシニム酸とのカップリングを行って、(C)を得た。

次に、２本の鎖(B)および(C)のカップリングを行い、下記の二本鎖を得た。

このために、一方では３′−ホスホルアミダイト−２′−アミノ−２′−デオキシシチジン(2)および２′−アミノ−２′−デオキシウリジン(1)ヌクレオチドを、他方では非ヌクレオチドインサートのホスホルアミダイトを合成した。

非ヌクレオシドインサート(3)上に配置された出発脂肪族アミン基を、標的二本鎖の第二の鎖に導入した。対応するホスホルアミダイト(4)は、Ｎ−Ｆｍｏｃでブロックしたβ−アラニンの活性エステル(5)と２−アミノ−１，３−プロパンジオールのジメトキシトリチル（Ｄｍｔｒ）誘導体(6)とから、下記のように進行して合成した（反応工程図１）。
ジオキサン中で化合物(5)および(6)の縮合による標的化合物(3)の生成、化合物(3)のβ−シアノエチル＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミドクロロホスファイトを用いるホスフィチル化によるホスホルアミダイトシントン(4)の形成。
反応工程図１

Ｎ−Ｆｍｏｃでブロックしたβ−アラニンのｐ−ニトロフェニルエステル(5)の合成を、反応工程図２に示し、下記の段階に従って行った。
Ｆｍｏｃ−コハク酸イミド(8)との反応によるＦｍｏｃ保護を用いるβ−アラニン(7)のアミン基のブロック、
ジオキサンに含まれるジシクリルヘキシルカルボジイミドを用いて(9)に対するｐ−ニトロフェノールを作用させることによるＮ−Ｆｍｏｃでブロックしたβ−アラニンの活性化エステルの生成。
反応工程図２

１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−アミノ−プロパンジオール(6)の製造を反応工程図３に示し、下記の反応を伴った。
トリフルオロアセチル基を用いる２−アミノ−１，３−プロパンジオール(10)の第一アミン官能基のブロック、
ピリジン中での塩化ジメトキシトリチル（化合物(11)０．５モル当たり１モル）の作用による化合物(11)の２個のヒドロキシル基のそれぞれの保護、
濃水酸化アンモニウム溶液の作用によるトリフルオロアセチルによる保護の除去。
反応工程図３

脂肪族アミン基を含む標的化合物(4)を、オリゴヌクレオチド合成の標準的ないわゆるホスホルアミダイト法におけるオリゴヌクレオチド鎖の精確に定義された部位の方向に導入した。この非ヌクレオシド類似体は、ヌクレオチド間結合を形成するヒドロキシルの間に（天然ヌクレオチドに特有の）３個の炭素原子の距離を保持している。化合物(4)を用いて、多数の改変オリゴヌクレオチドを得た。しかしながら、トリフルオロアセチル保護基は、Ｆｍｏｃ基より選択的に除去することが容易であるので、ＴＦＡを用いるのが好ましい。このようにして改変オリゴヌクレオチドに挿入された脂肪族第一アミン基は、親電子試薬を有する反応において反応性が極めて高いことが明らかとなった。従って、反応を無水酢酸を用いて行った後、反応の生成物のイオン対ＨＰＬＣ分析を行い、同様にしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いる反応の後に生成物の分光光度法分析を行った。ＦＩＴＣを用いる反応から得られる生成物のスペクトルは、それぞれオリゴヌクレオチドおよびフルオレセインに相当する２６０および４９５ｎｍに２個の吸収ピーク（比率６：１）を示した。
更に、(4)と無水コハク酸との縮合反応によって、アミン官能基を含む改変オリゴヌクレオチドにカルボキシル基を導入した。オリゴヌクレオチドと無水コハク酸とのカルボキシル化から得られる生成物の反応収率は、９５％を上回った。
イオン対ＨＰＬＣによって分析した改変オリゴヌクレオチドの保持時間は、導入された官能基の性質によって変化する点に留意すべきである。従って、アミン基を有するオリゴヌクレオチドの保持時間は、類似の一次構造を有する天然オリゴヌクレオチドの保持時間より低かった。これは、このようなオリゴヌクレオチドは追加の正電荷を有するという事実によるものであった。カルボキシル基を有するオリゴヌクレオチドの保持時間は、反対に、追加の陰電荷の結果として高くなった。
オリゴヌクレオチドの非ヌクレオシドインサート上に位置したアミン官能基も無水酒石酸でアシル化した。カルボキシルを含むこのような前駆体を用いて合成した架橋二本鎖は、シスグリコール型結合を有する。この架橋二本鎖では、（鎖の間の結合を開裂した）二本鎖の鎖を酸化反応によって分離することができる。
下記の実施例によって、本発明を説明する。
実施例１ オリゴヌクレオチドの標準的合成
オリゴヌクレオチド合成は、標準的ホスホルアミダイトプロトコールと製造業者によって供給される試薬を用いるサイクルに従ってApplied Biosystems 380B合成装置で行った。改変ホスホルアミダイトを用いる場合には、長めのカップリング時間（５〜７分）を用いた。オリゴヌクレオチドは、通常は「トリチル−オン(Trytil-On)」方式で０．４マイクロモルの規模で合成した。脱保護の標準的条件（３０％アンモニウム、５５℃、１６時間）を用いた。
ＨＰＬＣは、Kratos UV検出器を備えたAltex上で行った。オリゴヌクレオチドは、Diasorb 130 C16_T（７ミクロン）カラム（４ｍｍ直径×２５０ｍｍ）上で逆相高圧液体クロマトグラフィによって分析し、精製した。溶媒Ａは０．１Ｍ ＡｃＯＮＨ_４（酢酸アンモニウム）、ｐＨ７．０であり、溶媒ＢはＡｃＯＮＨ_４、ｐＨ７．０、４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルであった。Ｂの０％〜１００％の線形グラディエントを６０分間行った。溶出物を２６０ｎｍまたは２９０ｎｍで監視した。
反応分析の結果については、イオン対ＨＰＬＣを２残基／分のステップで用いた。WatersＨＰＬＣグラディエント装置、Diasorb 130 C16_T（７ミクロン）を充填した４×２５０ｍｍカラム、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）および２ｍＭテトラブチルアンモニウム、および５〜４０％のアセトニトリルのグラディエントを含んでなる溶離液、１ｍｌ／分の流速、および４５℃の温度を用いた。
総てのオリゴヌクレオチド配列は、左から右へ標準的な５′から３′の順で一覧表に示している。接頭辞「ｄ」（デオキシ）は、２′−デオキシリボヌクレオシドおよびオリゴデオキシリボヌクレオシドの同定では省略している。
実施例２ 活性化して保護したヌクレオチドおよびスペーサー基と活性な官能基を有する非ヌクレオシドインサートの製造
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）は、Silica gel 60 F₂₅₄プレート(Merck)上で行い、カラムクロマトグラフィは、Silica gel 60(Merck)上で下記の溶媒系a)ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＨ９５：５（ｖ／ｖ）、b)ＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＨ９：１（ｖ／ｖ）、c)ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／Ｅｔ_３Ｎ９４：５：１（ｖ／ｖ／ｖ）の一つを用いて行い、ＵＶスペクトルは150-20分光光度計（日立、日本国）上で得た。
５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−トリフルオロアセタミド−２′−デオキシウリジン＝３′−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミド）ホスファイト(1)、および５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−Ｎ^４−ベンゾイル−２′−トリフルオロアセタミド−２′−デオキシシチジン＝３′−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミド）ホスファイト(2)は、Kuznetsova L.G., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Oretskaya T.S., Krynetskaya N.F., Shabarova Z.A. Bioorganicheskaya khimia (Russ.) 1993, 19, 455-466に従って製造した。
２−アミノ−１，３−プロパンジオール(10)の製造
２−アミノ−１，３−プロパンジオールオキサレート（３．０ｇ、１１ミリモル）を見ず１００ｍｌに溶解した。水酸化カルシウム（０．８２ｇ、１１ミリモル）を攪拌しながら加えた。３０分後、沈殿を濾別し、上清を真空濃縮した。１．９ｇ（９５％）が得られる。
(10)のトリフルオロアセチル化は、Kuznetsova L.G., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Oretskaya T.S., Krynetskaya N.F., Shabarova Z.A. Bioorganicheskaya khimia (Russ.) 1993, 19, 455-466に従って製造した。
２−トリフルオロアセタミド−１，３−プロパンジオール(11)のトリチル化は、ヌクレオチドについて意図したのと同様の手順、すなわちJones R.A.,オリゴヌクレオチド合成：実際的方法(Oligonucleotide synthesis: a Practical Approach.)M.J. Gait監修、オックスフォード、ワシントンＤＣ：IRL Press、１９８４年、２３〜２４頁、を用いて行った。
１−ジメトキシトリチル−２−アミノ−３−プロパノール(6)の製造
化合物(12)（２．９４ｇ、６ミリモル）をＥｔＯＨ３０ｍｌに溶解し、ＮＨ_４ＯＨ（１８ｍｌ）を攪拌しながら滴加した。反応混合物を４５℃まで２時間加熱し、溶媒を真空留去した。残渣を、シリカゲルカラム上で溶媒系b)で溶出して精製し、１．７３ｇ（７３％）の(6)、Ｒ_ｆ０．２５（系ａ）を得た。
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−β−アラニン(9)の製造
９−フルオレニルメトキシスクシンイミド(8)（０．８６ｇ、２．５６ミリモル）を、β−アラニン(7)（０．４６ｇ、５．１６ミリモル）を水１０ｍｌにＥｔ_３Ｎ７００ｍｌを用いて溶解したものに攪拌しながら滴加した。３０分後、混合物を真空濃縮し、残渣を１．５Ｍ ＨＣｌ ８ｍｌに加えた。不溶性物質を濾過によって除去し、水で２回洗浄し、４５℃で乾燥した。(9)の収量０．７６ｇ（９５％）、Ｒ_ｆ０．５（系ａ）。
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−β−アラニン＝ｐ−ニトロフェニルエーテル(5)の製造
ｐ−ニトロフェノール（０．４０ｇ、３．２ミリモル）を、脱水したジオキサン５ｍｌに溶解した(9)（０．９０ｇ、２．９ミリモル）に加えた。混合物を室温で２４時間攪拌した。不溶性物質を濾過によって除去した。濾液を、真空で濃縮乾固した。(5)の収量１．２ｇ（９５％），Ｒ_ｆ０．８（系ａ）。
化合物(3)は、(5)（１．２ｇ、２．８ミリモル）から、脱水したジオキサン（１０ｍｌ）中で(6)（１．１４ｇ、０．３ミリモル）と反応させることによって製造した。混合物を室温で２４時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルのカラム上で溶媒系c)を用いて精製した。(3)１．２ｇ（６３％）が得られる。Ｒ_ｆ０．４（系ｂ）。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）６．１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ−ＮＨ−ＣＯ，Ｊ７．９Ｈｚ）；５．５３（ｔ，１Ｈ，ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ，Ｊ６．１Ｈｚ）；４．３５（ｄ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ，Ｊ７．０Ｈｚ）；４．１８（ｔ，１Ｈ，ＣＨ_２−ＣＨ，Ｊ７．０Ｈｚ）；４．１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_２−ＣＨ−ＣＨ_２），３．７５（ｓ，６Ｈ，ＣＨ _３Ｏ）；３．７（２ｄ，２Ｈ，ＯＣＨ _２−ＣＨ，Ｊ_１１１．３Ｈｚ，Ｊ_２４．８Ｈｚ）；３．４８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２−ＣＨ _２−ＮＨ）；３．３（２ｄ，２Ｈ，ＣＨ−ＣＨ _２ＯＨ，Ｊ１１．３Ｈｚ，Ｊ４．０Ｈｚ）；２．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ _２−ＣＨ_２）。
(3)のホスフィチル化は、Jones R.A.,オリゴヌクレオチド合成：実際的方法(Oligonucleotide synthesis: a Practical Approach.)M.J. Gait監修、オックスフォード、ワシントンＤＣ: IRL Press、１９８４年に従って行った。
実施例３ ２′−アミノ−２′−デオキシピリミジンヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドの製造
1．単一の２′−アミノ−２−デオキシシチジン残基を有するオリゴヌクレオチド
配列オリゴマー(A)
ＡＴＣ ＣＴＡ ＴＡＡ ＴＧＣ ＧＣ^ｎＣ ＣＴＧ ＣＡ
（上記式中、
Ｃ^ｎは２′−アミノ−２′−デオキシシチジンヌクレオチドである）のオリゴヌクレオチドは、実施例１の手順を用いて製造した。配列の中央に位置した２′−アミノ−２′−デオキシシチジンは、２′−アミノ−２′−デオキシシチジンホスホルアミダイト(2)を用いて合成中に加えた。
2．単一２′−アミノ−２′−デオキシウリジン残基を有するオリゴヌクレオチド
配列
オリゴマー(B)
Ｇ ＣＣＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＣＵ^ｎＡ ＣＣＧ
オリゴマー(C)
Ｇ ＣＣＡ Ｕ^ｎＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＣＴＡ ＣＣＧ
オリゴマー(D)
Ｇ ＣＣＡ ＣＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＵ^ｎＡ ＣＣＧ
オリゴマー(E)
Ｇ ＣＣＡ Ｕ^ｎＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＴＡ ＣＣＧ
（上記式中、
Ｕ^ｎは２′−アミノ−２′−デオキシウリジンヌクレオチドである）のオリゴヌクレオチドは、実施例１の手順を用いて製造した。配列の中央に位置した２′−アミノ−２′−デオキシウリジンは、２′−アミノ−２′−デオキシウリジンホスホルアミダイト(1)を用いて合成中に加えた。
3．２′−アミノ−２′−デオキシウリジンの多重残基を有するオリゴヌクレオチド
配列
オリゴマー(F)
Ｇ ＣＣＡ Ｕ^ｎＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＣＵ^ｎＡ ＣＣＧ
オリゴマー(G)
Ｇ ＣＣＡ Ｕ^ｎＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＵ^ｎＡ ＣＣＧ
（上記式中、
Ｕ^ｎは２′−アミノ−２′−デオキシウリジンである）のオリゴヌクレオチドは、実施例３．２の手順を用いて製造した。
実施例４ 非ヌクレオシドインサートを有するオリゴヌクレオチドの製造
1．単一の非ヌクレオシドインサートを有するオリゴヌクレオチド
配列
オリゴマー(H)
ＴＣＧ ＡＧＧ ＮＧＣ ＧＣＡ ＴＴＡ ＴＡＧ ＧＡＴ
オリゴマー(I)
ＣＧＧ ＴＮＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＧＧ Ｃ
オリゴマー(J)
ＣＧＧ ＴＡＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＮ ＴＧＧ Ｃ
オリゴマー(K)
ＣＧＧ ＴＮＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＧＧ Ｃ
オリゴマー(L)
ＣＧＧ ＴＡＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＮ ＴＧＧ Ｃ
オリゴマー(M)
ＣＧＧ ＴＡＧ ＮＧＧ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＣＣ Ｃ
（上記式中、
Ｎは非ヌクレオシドインサートである）のオリゴヌクレオチドは、実施例１の手順を用いて製造した。非ヌクレオシドインサートは、非ヌクレオシドホスホルアミダイト(4)を用いて合成中に配列中に導入した。オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホルアミダイト法を用いて製造した。それらを、通常の脱保護法によって脱保護し、ＨＰＬＣによって精製し、脱トリチル化した。
2．多数の非ヌクレオシドインサートを有するオリゴヌクレオチド
配列
オリゴマー(N)
ＣＧＧ ＴＮＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＮ ＴＧＧ Ｃ
オリゴマー(O)
ＣＧＧ ＴＮＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＡＮ ＴＧＧ Ｃ
（上記式中、
Ｎは非ヌクレオシドインサートである）のオリゴヌクレオチドは、実施例４．１の手順を用いて製造した。
3．オリゴマー(H)〜(O)の非ヌクレオシドインサート上に位置したアミン基のカルボキシル化は、０．２５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で無水コハク酸を用いて行った。塩を除去した後、０．２５Ｍ中炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５００ｍｌ中にアミンを含むオリゴヌクレオチド１．０Ａ₂₆₀単位を溶解し、０．１Ｍ無水コハク酸／無水アセトニトリル５００ｍｌを加えた。混合物を３７℃で３時間攪拌した。反応混合物を、Sephadex G-25カラムを用いてゲル濾過法によって単離した。最終生成物は、イオン対方式で逆相ＨＰＬＣを用いて分析した。WatersＨＰＬＣグラディエント装置、Diasorb 130 C16_T（７ミクロン）を充填した４×２５０ｍｍカラム、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）および２ｍＭテトラブチルアンモニウム、および５〜４０％のアセトニトリルのグラディエントを含んでなる溶離液、１ｍｌ／分の流速、および４５℃の温度を用いた。これにより、非ヌクレオシドインサート上に配置されたカルボキシル官能基を有するオリゴヌクレオチド(H′)〜(O′)が得られ、これは架橋反応に用いることができる。
実施例５ ２′−デオキシヌクレオシドの２′−アミン官能基を有するオリゴヌクレオチドと相補性二本鎖の非ヌクレオシドインサート上に配置されたカルボキシル基を有するオリゴヌクレオチドとのカップリング反応
A．２本の鎖の間に共有結合を有する二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド二本鎖における改変は、互いに反対である。
架橋二本鎖Ｉ

（上記式中、
Ｎ^ｃはカルボキシル基を有する非ヌクレオシドインサートであり、「｜」はオリゴヌクレオチド鎖のカルボキシルとアミン官能基との間の架橋である）を、０．０２Ｍ ＭｇＣｌ_２を含む０．０５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）中で行った反応によって製造する。２個のオリゴマー(A)および(H′)０．１Ａ₂₆₀単位を緩衝液３７．５ｍｌに溶解し、混合物を９５℃に加熱した後、徐冷し、０．４Ｍ ＣＤＩ（カルボジイミド）を同じ緩衝液に溶解したもの３７．５ｍｌを加えた。１２０時間後、反応混合物を分析し、最終生成物を上記のようにイオン対方式で逆相ＨＰＬＣを用いて単離した。
架橋した二本鎖(I)の精製は２６％の収率で得られた。
同様な手順により、架橋二本鎖を５６％〜８２％の範囲の収率で製造した。

B．鎖の間に２個の共有結合を有する二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド二本鎖における改質は、互いに反対である。
架橋二本鎖

（上記式中、
Ｎ^ｃはカルボキシル基を有する非ヌクレオシドインサートであり、「｜」はオリゴヌクレオチド鎖のカルボキシルとアミン官能基との間の架橋である）は、実施例５．Ａと同様な方法で製造する。二本鎖(VI)および(VII)の収率は、それぞれ５７％および８４％である。
二本鎖配列５′．．．ＡＧＣＴ．．．３′を認識する制限エンドヌクレアーゼＡｌｕＩを用いて２個の共有結合を有する架橋二本鎖の存在を示すことができる。対照としては、架橋を有する架橋二本鎖(II)および(III)を用いる。
C．鎖の間に共有結合を有する二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド
二本鎖のオリゴヌクレオチドの一方における改質は、２個のヌクレオチドのもう一方に対してずれている。
ずれた架橋を有する二本鎖Ｉ

(VIII)の収率は、８４％である。
実施例６ 二本鎖の安定性
熱融解曲線は、150-20分光光度計（日立、日本国）を用いて決定した。Ｔ_ｍ値を決定するため、第一の誘導体を計算した。架橋二本鎖の融解挙動は、０．０５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５、０．０２Ｍ ＭｇＣｌ_２）中で決定した。比較のため、類似構造を有する天然二本鎖および改変したオリゴヌクレオチド前駆体からなる二本鎖の熱安定性を検討した。

架橋二本鎖のＴ_ｍが高いことにより、二本の鎖の間に共有結合が存在することによる安定化を確認した。
実施例７ 特定のエキソヌクレアーゼに対する架橋二本鎖の耐性
カタツムリ粘着物のホスホジエステラーゼとアルカリホスファターゼの混合物の作用により生じる加水分解に対する化合物の安定性を、完全な酵素加水分解の後、加水分解物の逆相ＨＰＬＣの厳密な条件下（５６℃、１８０分）で検討した。これらの条件下では、天然二本鎖と改質オリゴヌクレオチド前駆体の混合物（オリゴマー(A)および(H)）は完全に加水分解したが、「結合した」二本鎖(I)は３０％しか加水分解しなかった。この加水分解が少ないことは、「結合した」二本鎖(I)を構成するオリゴヌクレオチド間に存在する共有結合の結果であることは明らかである。

Claims (15)

1. それぞれ一以上のオリゴヌクレオチド間または内の共有結合的架橋を有する二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドであって、
   このまたはそれぞれの共有結合が、一方の鎖の第一アミン基と、それぞれ他方の鎖または同一鎖のカルボキシル基との間のアミド結合からなり、
   上記の第一アミン基が、一方のヌクレオチドの糖の環の２’位で直接置換されており、
   上記カルボキシル基が、それぞれ他方の鎖または同一鎖に含まれるヌクレオチド類似体上で置換された脂肪族スペーサー基によって支持されており、
   上記ヌクレオチド類似体は、１，３−プロパンジオール型の非ヌクレオチドインサートからなり、上記脂肪族スペーサー基は、１，３−プロパンジオール型の非ヌクレオチドインサート上の２位で、直接置換されている第一アミン基の酸無水物によるアシル化によって得られたものであるオリゴヌクレオチド。
2. 脂肪族スペーサー基が、非ヌクレオチドインサート上の２位で、ＮＨ₂末端自体が酸無水物でアシル化されているアミノ酸で直接置換されたアミン基のアシル化によって得られたものである請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
3. アミノ酸が、β−アラニンである請求の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 酸無水物が、無水コハク酸又は無水酒石酸である請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 分子間または内共有結合に関与する一以上のヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体が対になる位置に存在する請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 共有結合に関与する一以上のヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体が対になる位置に存在しない請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 共有結合に関与する一以上のヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体が、対になる位置に対して１〜５個のヌクレオチドだけずれている請求の範囲第６項に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 脂肪族スペーサー基が、アミド結合とヌクレオチド類似体の置換されている部位との間に３〜２３個の線状原子を有する請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 脂肪族スペーサー基が７〜１６個の原子を有する請求の範囲第８項に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 脂肪族スペーサー基が９個の原子を有し、共有結合に関与するヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体が対になる位置に対して２ヌクレオチドだけずれている請求の範囲第９項に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 請求の範囲第１〜１０項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造法であって、共有結合を、一方の鎖の第一アミン基と、他の鎖または同一の鎖の別の部分のカルボキシル基との間において、ｐＨ６．５で縮合剤の存在下での縮合反応によるカップリングによって生成させる方法。
12. 縮合剤が水溶性カルボジイミドである請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. カルボキシル基を含む鎖を、核酸およびトリフルオロアセチル基によって保護された２’位で置換されたアミン基の自動または手動合成の方法に用いるために、適切に保護された５’および３’末端のヒドロキシル基を含むヌクレオチドシントンを用いて得たアミン基を含む鎖から製造し、上記アミン基を脱保護した後、上記脂肪族スペーサー基を含む酸無水物にカップリングさせることを特徴とする請求の範囲第１１又は１２項のいずれか一項に記載の方法。
14. ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法で用いられる保護基によって保護されているヌクレオチドシントンを用いる請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. 下記の式
    

    

    に相当するヌクレオチドシントンを用いる請求の範囲第１４項に記載の方法。