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PROCEDE ET TROUSSE DE DIAGNOSTIC ET/OU DE QUANTIFICATION
PAR HYBRIDATION DE TYPE SANDWICH DE SEQUENCES D'ACIDES
NUCLEIOUES SUR SUPPORT SOLIDE Objet de l'invention
La présente invention concerne un procédé et une trousse comprenant des réactifs pour la détection et/ou la quantification par hybridation de type sandwich de séquences d'acides nucléiques sur un support solide.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention
Il est connu de fixer de l'ADN de manière covalente sur un support et de l'utiliser comme séquence nucléotidique capteur pour fixer une séquence nucléotidique cible et pouvoir la détecter directement si elle est fixée à une molécule chimique détectable. Dans le cas où la séquence nucléotidique cible à identifier n'est pas marquée, on peut réaliser une hybridation de type "sandwich"en utilisant une séquence nucléotidique marquée qui viendra se fixer sur la séquence nucléotidique cible.
Cette séquence nucléotidique marquée ne sera ellemême immobilisée que si la séquence nucléotidique cible est présente et immobilisée sur la séquence nucléotidique trappeur. La séquence nucléotidique cible est donc prise en sandwich entre la séquence nucléotidique trappeur et la
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séquence nucléotidique marquée, ce qui requiert une double reconnaissance, et par conséquent augmente la spécificité, réduit le bruit de fond, et permet également une quantification de la séquence nucléotidique cible. Cela n'est possible que si l'hybridation est réalisée de manière quantitative et reproductible. Ceci est d'autant plus vrai que le rendement de cette hybridation est grand.
L'intérêt d'une telle hybridation quantitative est la mesure d'acides nucléiques provenant"d'agents biologiques"pathogènes ou non comme les virus, champignons, bactéries, mycoplasmes, cellules ou tissus animaux et végétaux. Très souvent, ces quantités d'acides nucléiques ne peuvent être mesurées du fait de leur très faible concentration dans les échantillons biologiques. Dès lors, on utilise une étape d'amplification de la séquence nucléotidique cible, telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction (US Patent 4965188), la LCR (Landegren et al., 1988, Science, 241,1077-1080), le NASBA (Kievits et al. 1991, J. Virol. Methods 35.273-286) ou la CPR (Cycling Probe Reaction (WO Patent 95/14106).
Cependant la détection de ces séquences amplifiées appelées ci-après amplicons nécessite de réaliser une détection spécifique sensible et facilement adaptée à un grand nombre d'échantillons si l'on veut pouvoir utiliser ces méthodes comme tests de routine notamment dans le cadre de diagnostics médicaux ou vétérinaires.
Une première solution consiste à utiliser des billes pour réaliser cette hybridation sandwich, telle que décrite dans la demande de brevet EP-0205532, où des billes de Sephacryl de 5 à 50 m sont activées par diazotasion d'amines aromatiques. L'utilisation de plaques multipuits est également une bonne solution car elles
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servent déjà de base pour beaucoup de tests, notamment les ELISA et de nombreux appareils de lecture en photométrie, fluorescence, luminescence existent déjà pour la lecture de ces plaques. Si l'on veut utiliser ces supports pour la détection, il faut pouvoir immobiliser les séquences nucléotidiques cibles sur ces plaques afin de pouvoir les détecter et/ou les quantifier.
Cette fixation peut s'obtenir par simple adsorption sur les micropuits, c'est-à-dire par réaction non covalente. Plusieurs travaux ont été réalisés de cette manière qui permettent effectivement de mesurer des amplicons présents en solution (Dahlem et al. 1987, Mol.
Cell. Probes 1.159-168 ; Cross et al. 1992, The Lancet 340.870-873 ; Allibert et al., EP 486661). Cependant ces méthodes souffrent d'inconvénients, à savoir une absence de contrôle du processus d'adsorption (qui nécessite de travailler avec de très grands fragments, souvent des plasmides entiers, pour éviter ce problème, et ce qui entraîne l'utilisation de trappeurs doubles brins qui peuvent se réassocier rapidement) et la difficulté d'optimaliser rationnellement la taille et la séquence nucléotidique trappeur du fait des aléats liés à l'adsorption. La fixation de ces trappeurs par des liens covalents permet de répondre à ces problèmes.
Dans différents documents de l'état de la technique, on a cherché à optimaliser la longueur d'une séquence simple brin pouvant servir de trappeur pour une séquence cible ou tenté de caractériser la longueur de la séquence cible nécessaire pour être détectée dans les meilleures conditions.
Dans le document"J. of Clin. Microbiol", vol. 28, juin 1990, pp. 1469-1472, Inouye et Hondo et al. décrivent
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un procédé d'hybridation directe sur des séquences fixées sur des microplaques de segments d'ADN de différentes longueurs. Cette hybridation s'effectue sur des segments trappeurs d'ADN adsorbés de manière non covalente sur ces microplaques. Des trappeurs de longueurs différentes sont adsorbés et hybridés avec une séquence biotinylée de 642 paires de bases. Les auteurs observent avec les différentes séquences la même courbe d'hybridation, mais une efficience d'hybridation croissante en fonction de la taille des fragments. Sur base de cette expérimentation, les auteurs ont conclu qu'il est préférable que la séquence cible à identifier présente une longueur de plus de 300 paires de base.
Comme notés par les auteurs, l'adsorption de l'ADN se fait sur de très grandes longueurs ce qui rend impossible la connaissance des longueurs disponibles pour obtenir une hybridation efficace. Ce problème va se retrouver dans tous les travaux utilisant l'adsorption des sondes trappeurs sur le plastic.
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Dans le document"Analytical Biochem.", No. 177, pp.
27-32 (1989), les auteurs Keller et al. décrivent un procédé d'hybridation de type sandwich utilisant comme séquence trappeur un fragment de 3300 paires de base servant à la détection d'une séquence cible de 190 paires de base qui est également complémentaire d'une autre séquence marquée, la séquence trappeur simple brin étant fixée par une fonction NH2 de manière covalente à un support solide. Comme il apparaît à la figure 2 de ce document, il n'existe qu'un recouvrement très partiel de la séquence trappeur ainsi que de la séquence marquée par la séquence cible.
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Dans la publication"Clin. Chem.", No. 31, pp. 1438- 1443 (1985), les auteurs Polsky-Cynkin et al. décrivent un procédé dans lequel la séquence trappeur comporte 4800 paires de base dont 800 paires de base sont complémentaires de la séquence cible de 1600 paires de base à détecter. Comme il apparaît dans la figure 1 de ce document, la séquence cible est également complémentaire d'une autre séquence nucléotidique marquée de manière à obtenir une hybridation de type sandwich.
La demande de brevet japonais JP-8089300 au nom de Mitsui décrit une séquence trappeur présentant une longueur inférieure à 30000 paires de base et comportant au moins 10 unité répétitives de 100 paires de base susceptibles de s'hybrider en série selon la même orientation avec des séquences cibles à détecter. Cette méthode permet une augmentation de la sensibilité des méthodes traditionnelles.
La demande de brevet EP-0079139 au nom de Orion Corp. décrit une séquence trappeur simple brin de 1200 paires de base ou de 1500 paires de base s'hybridant avec des séquences cibles de 600 ou 700 paires de base, susceptibles d'être détectées par une hybridation sandwich au moyen d'une autre séquence marquée et complémentaire d'une autre portion de la séquence cible.
Cependant, dans tous ces dispositifs d'hybridation basés sur une hybridation simple ou une hybridation sandwich, on observe un mauvais'recouvrement de la séquence trappeur par la séquence cible, ainsi qu'un mauvais recouvrement de la séquence cible par la séquence trappeur et/ou la séquence marquée. Par conséquent, lorsque l'on utilise de très longues séquences pour la détection ou de très longues séquences cibles à détecter,
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on observe des risques de reploiement des séquences sur elles-mêmes ou éventuellement avec d'autres séquences "parasites" présentes dans l'échantillon (par exemple des séquences complémentaires d'une séquence amplicon issue d'une PCR que l'on chercherait à caractériser et quantifier).
Le document"Nucleic Acid Research", Vol. 21, No. 15, pp. 3469-3472 (1993) de Kosaka et al. décrit des séquences trappeurs fixées par une liaison covalente sur des microplaques. Ces séquences trappeurs très courtes (de l'ordre de 17 paires de base) sont utilisées pour obtenir une hybridation de séquences cibles à identifier et à quantifier en présence de séquences similaires marquées. Comme il apparaît dans le schéma de la figure 2 de ce document, malgré la faible longueur de la séquence trappeur, il n'existe pas de recouvrement optimal de cette séquence trappeur par la séquence cible à quantifier.
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Dans le document"Clin. Chem.", No. 40/2, pp. 200-205 (1994), Rasmussen et al. décrivent une séquence trappeur simple brin fixée par une liaison covalente à des microplaques. Cette séquence trappeur est également très courte (de l'ordre de 25 nucléotides) et est utilisée pour obtenir l'hybridation de séquences cibles de l'ordre de 350 à 500 paires de base.
Dans la demande de brevet W094/06933, on décrit un procédé d'hybridation sandwich au moyen d'une séquence trappeur fixée sur un support insoluble tel que des microplaques, servant à l'hybridation de type sandwich d'une séquence cible susceptible de s'hybrider également avec une séquence marquée. Cependant, dans les exemples d'exécution décrits dans cette demande de brevet, les séquences trappeurs sont de l'ordre d'une vingtaine de
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nucléotides utilisées pour l'hybridation de séquences cibles dont la longueur est comprise entre 400 et 600 paires de base. Dans les cas décrits ci-dessus, lorsque les séquences trappeurs sont très courtes, on observe un mauvais recouvrement de la séquence cible par la séquence trappeur et la séquence marquée ce qui serait susceptible de provoquer des faux positifs ou des faux négatifs.
Dans ce type d'expérimentation, on obtient un reploiement de la séquence cible sur elle-même ou une réhybridation de séquences cibles entre elles. Ainsi, le pourcentage d'hybridation de la séquence cible sur la séquence trappeur est particulièrement faible avec des séquences trappeurs très courtes, ce qui diminue la sensibilité.
Dans le document"Journ. of Clin. Microbiol.", vol.
33, pp. 752-754 (1995), Cho et al. décrivent un procédé utilisant une séquence trappeur simple brin de 188 paires de base adsorbée sur des microplaques, cette séquence trappeur permettant d'hybrider une séquence biotinylée cible de 245 paires de base. Cette technique d'hybridation non basée sur la reconnaissance de type sandwich présente l'inconvénient que l'on observera éventuellement un mauvais recouvrement de la séquence trappeur par la séquence cible, et dans tous les cas, un mauvais recouvrement de la séquence cible sur au moins une soixantaine de paires de base.
Par conséquent, cette portion de 60 paires de base suffit pour obtenir des reploiements de la séquence cible, voire de la séquence trappeur, sur elle-même, dont les structures secondaires sont susceptibles de perturber l'hybridation entre la séquence trappeur et la séquence cible, ce qui diminue la sensibilité du test.
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Dans le document"Journ. of Clin. Microbiol.", vol.
9, pp. 638-641 (1991), Keller et al. décrivent une séquence trappeur simple brin fixée par une liaison covalente sur des microplaques, cette séquence trappeur simple brin présentant une longueur de 126 paires de base, dont au moins une portion est susceptible de réaliser une hybridation simple avec une séquence cible de 191 paires de base. La fixation se fait après avoir fixé de manière aléatoire sur les bases de la séquence le diamino hexane qui peut alors être fixé sur les puits.
Le document mentionne explicitement que la séquence simple brin n'est complémentaire que d'une partie de la séquence cible de 191 paires de base, mais n'est pas susceptible d'obtenir un recouvrement complet, en particulier des séquences primers de part et d'autre de cette séquence cible de manière à éviter toute homologie de recouvrement entre les primers et la séquence simple brin. On observe donc aux deux extrémités de la séquence cible plus de 30 paires de base qui ne sont pas recouvertes par la séquence trappeur, la reconnaissance de l'hybridation étant détectée par le fait que la séquence cible est marquée par de la biotine et peut être reconnue par le conjugué streptavidine peroxydase permettant sa détection par colorimétrie.
Dans ce document, on n'observe pas un bon recouvrement de la séquence cible à quantifier, et le reploiement de cette séquence peut être particulièrement important, près de l'extrémité de la séquence trappeur fixée sur le support solide. Le risque à ce niveau d'un reploiement d'une structure secondaire est particulièrement important, ce qui pourrait fausser les procédés de détection et de quantification. De plus, comme la fixation du trappeur au
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puits se fait de manière aléatoire, la portion du trappeur accessible à la séquence cible n'est pas connue.
La demande de brevet EP-0205532 décrit une séquence trappeur de 341 paires de bases fixée de manière covalente sur des microbilles, cette séquence trappeur étant susceptible de réagir avec une séquence cible pour obtenir un overlap de la séquence trappeur sur la séquence cible de 175 paires de base, la séquence cible étant ensuite susceptible de réagir avec une séquence marquée de 201 paires de base par un phénomène d'hybridation sandwich.
Cependant, ce document ne décrit pas non plus un recouvrement optimal de la séquence trappeur simple brin par la séquence cible. En effet, on observe dans ce document, au niveau de la séquence trappeur simple brin, une portion libre de 166 paires de base au niveau de laquelle on est susceptible d'observer des reploiements de la séquence trappeur simple brin sur elle-même ou l'appariement avec d'autres séquences présentes dans l'échantillon, qui sont susceptibles de diminuer le pourcentage de séquence cible s'hybridant sur la séquence trappeur, et par conséquent la sensibilité de la détection et de la quantification.
Buts de l'invention
La présente invention vise à fournir un nouveau procédé et une trousse permettant la détection et/ou la quantification de séquence d'acides nucléiques qui ne présenteraient pas les inconvénients de l'état de la technique cité.
Un but particulier de la présente invention vise à fournir un procédé et une trousse permettant une hybridation optimale des séquences d'acides nucléiques sur
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un support solide, en particulier un haut pourcentage d'hybridation de la séquence trappeur par la séquence cible, un faible risque de reploiement de la séquence cible ou de la séquence trappeur sur elle-même, un faible risque de ré-appariement de séquences cibles par des séquences complémentaires présentes dans l'échantillon ou un faible risque d'appariement"parasite"de la séquence trappeur par d'autres séquences présentes dans l'échantillon.
Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé et une trousse présentant une spécificité et une sensibilité améliorées par rapport aux procédés et aux dispositifs de l'état de la technique.
Un but complémentaire de la présente invention est de fournir un procédé et une trousse permettant d'optimaliser la quantification d'acides nucléiques, en particulier des acides nucléiques présents dans un échantillon biologique et obtenus après une amplification génétique.
Eléments caractéristiques de l'invention
La présente invention est relative à un procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence nucléotidique dénommée"cible"présente dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'elle comprend une mise en contact de type"sandwich"de ladite séquence nucléotidique cible avec une séquence nucléotidique dénommée"trappeur"fixée sur un support solide insoluble, ladite séquence nucléotidique trappeur étant complémentaire d'une partie de la séquence nucléotidique cible, la mise en contact de type" sandwich Il s'effectuant également avec une ou plusieurs autre (s) séquence (s) nucléotidique (s) dont au moins une est marquée, la ou
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lesdites séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée)
étant complémentaire (s) d'une autre partie de la séquence nucléotidique cible (une autre partie que celle hybridée par la séquence nucléotidique"trappeur") ; en ce que la séquence nucléotidique trappeur est fixée de manière covalente par une de ses extrémités au support solide ; en ce que la séquence nucléotidique trappeur comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases, de préférence entre 100 et 300 bases, plus particulièrement entre 120 et 250 bases ; et en ce que la partie de la séquence nucléotidique trappeur ne s'hybridant pas avec la séquence nucléotidique complémentaire cible est inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 bases, voire nulle.
De manière avantageuse, la partie de la séquence nucléotidique marquée ne s'hybridant pas avec la séquence complémentaire de la séquence cible est avantageusement inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 bases, voire nulle.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la partie de la séquence nucléotidique cible ne s'hybridant pas avec la séquence nucléotidique trappeur et avec la ou le (s) séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée), est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases, voire nulle.
Dans la suite de la description, la ou les séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée) prendront la dénomination de séquences "helper" lorsque la ou lesdites séquences ne sont pas marquées, et de séquences nucléotidiques"marquées"lorsque celles-ci sont susceptibles d'être reconnues directement ou indirectement par un système de détection et/ou de
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quantification, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemoluminescence, l'électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif, la bioluminescence ou un mélange d'entre eux.
Les séquences nucléotidiques"helper"sont utilisées pour stabiliser le"sandwich"et obtenir un recouvrement le plus complet possible de la séquence nucléotidique cible lors de son hybridation sur la séquence nucléotidique marquée et sur la séquence nucléotidique trappeur, ce qui augmente la sensibilité et la spécificité du procédé selon l'invention.
Selon une forme d'exécution particulière de l'invention, dans le cas où la séquence nucléotidique cible est un amplicon résultant d'une amplification génétique, la partie terminale 5'de la séquence nucléotidique cible non recouverte par la ou les séquence (s) marquée (s) et la ou les séquence (s) nucléotidique (s)"helper"est également recouverte par une séquence nucléotidique"primer" (dénommée également "amorce") complémentaire, utilisée pour l'amplification de la séquence nucléotidique cible. Selon l'invention, on
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peut considérer cette séquence nucléotidique"primer" comme étant une séquence de type"helper".
Selon l'invention, il est donc possible d'observer également un recouvrement optimal, voire total, de la séquence nucléotidique cible par la séquence nucléotidique trappeur, la ou les séquence (s) nucléotidique (s) marquée (s), et éventuellement la ou les séquences nucléotidiques"helper".
La présente invention concerne également la trousse de détection et/ou de quantification par hybridation de
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type "sandwich" d'une séquence nucléotidique cible comprenant une séquence nucléotidique trappeur fixée sur un support solide insoluble et complémentaire d'une partie de la séquence nucléotidique cible et une ou plusieurs autres séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée), la ou lesdites séquence (s) nucléotidique (s) étant complémentaire (s) d'une autre partie de la séquence nucléotidique cible.
Dans la trousse de détection et/ou de quantification, ladite séquence nucléotidique trappeur est fixée de manière covalente par l'une de ses extrémités sur le support solide et comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases, de préférence entre 100 et 300 bases, plus particulièrement entre 120 et 250 bases, et la partie de la séquence nucléotidique trappeur qui ne s'hybride pas avec la partie de la séquence nucléotidique cible est inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 bases, voire nulle.
Il est bien entendu que dans le procédé et la trousse de détection et/ou de quantification selon l'invention, la séquence nucléotidique marquée présente une longueur suffisante pour reconnaître de manière spécifique la séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier, cette spécificité dépendant du type de séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier.
Cette spécificité peut être caractérisée par une reconnaissance par hybridation d'une portion spécifique complémentaire d'au moins 10 bases, de préférence de plus de 20 bases, de la séquence nucléotidique cible.
De préférence, la séquence nucléotidique marquée porte une ou plusieurs molécules chimiques permettant sa détection selon un procédé choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemoluminescence,
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l'électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif (telle que la technologie RIA), la bioluminescence ou un mélange d'entre eux.
Selon l'invention, la trousse de détection et/ou de quantification comprendra les réactifs nécessaires pour la détection et la quantification par un propriétaire choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemoluminescence, l'électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif, la bioluminescence ou un mélange d'entre eux.
Selon l'invention, la séquence nucléotidique trappeur est fixée de manière covalente sur le support solide insoluble. Cette fixation se réalise de préférence par l'intermédiaire d'un phosphate 51 terminal sur une ou plusieurs fonctions amines du support solide insoluble par réaction avec du carbodiimide.
Dans le procédé de détection et/ou de quantification, l'hybridation sandwich se réalise de préférence en deux étapes, c'est-à-dire que la première étape consiste en l'hybridation de la séquence nucléotidique cible sur la séquence nucléotidique trappeur, et que la seconde étape est l'hybridation de la séquence nucléotidique cible par une ou plusieurs séquences nucléotidiques dont au moins une est marquée. Les deux étapes sont de préférence séparées par une étape de lavage. Dans le cas où les conditions (TO, concentration en sels, temps de réaction) sont compatibles pour les deux hybridations, celles-ci se réalisent en une seule étape.
Selon l'invention, le support solide est un support solide insoluble choisi parmi le groupe constitué par des tubes, des filtres, des billes, éventuellement
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magnétiques, des plaques de multipuits ou un mélange d'entre eux.
Avantageusement, la séquence nucléotidique cible est le résultat d'une amplification préalable par un procédé d'amplification génétique, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la PCR, la LCR, la CPR ou le NASBA.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le procédé de détection comporte également une mise en contact de type sandwich d'une séquence nucléotidique standard dans les mêmes conditions que la séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier, et comporte une étape supplémentaire de quantification du rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard.
De préférence, le procédé de détection et/ou de quantification comporte une étape préalable de préparation d'une quantité connue d'une séquence nucléotidique standard possédant au moins une partie commune à la séquence nucléotidique cible et une partie spécifique dont la séquence est différente de la séquence nucléotidique cible et possède un contenu en base GC/AT proche (c'est-àdire identique à plus de 80%, de préférence plus de 90%), de préférence identique, à la séquence de la partie spécifique de la séquence nucléotidique cible.
En outre, le procédé de détection et/ou de quantification selon l'invention peut comprendre une extraction éventuelle de la séquence nucléotidique cible à quantifier de l'échantillon biologique préalablement à l'étape d'amplification génétique. Cette éventuelle étape d'extraction de la séquence nucléotidique cible peut s'effectuer avant ou après l'addition à l'échantillon
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biologique de la séquence nucléotidique standard utilisé pour obtenir une quantification de la séquence nucléotidique cible.
Une mise en contact à la fois de type sandwich des séquences nucléotidiques cibles avec les séquences nucléotidiques trappeurs et avec des séquences nucléotidiques marquées complémentaires soit de la partie spécifique de la séquence nucléotidique cible, soit de la partie spécifique de la séquence nucléotidique standard et une quantification du rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard.
Avantageusement, la trousse de diagnostic comporte également une séquence nucléotidique standard possédant au moins une partie commune à la séquence nucléotidique cible à quantifier et une partie spécifique dont la séquence est différente et possède un contenu en base GC/AT proche (c'est-à-dire identique à plus de 80%, de préférence plus de 90%), de préférence identique, à la partie spécifique de la séquence nucléotidique cible à qunatifier.
Ce procédé de quantification et cette séquence nucléotidique standard sont décrits de manière détaillée dans la demande de brevet belge numéro 09600755 incorporée ici par référence.
Selon l'invention, la séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier peut être constituée de tout type d'acides nucléiques, ADN ou ARN. De préférence, les
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séquences nucléotidiques"trappeur","helper", "marquée (s) " et "standard (s) " utilisées selon la présente invention sont constituées d'ADN de manière à éviter toute destruction de ces séquences par des RNase éventuellement présentes dans l'échantillon biologique.
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La présente invention sera décrite plus en détails dans les exemples ci-dessous en référence aux figures annexées.
Brève description des figures La figure 1 représente un exemple schématique d'hybridation sandwich selon l'invention.
La figure 2 représente une courbe de concentration d'ADN cible de CMV obtenue après hybridation en sandwich et détection en bioluminescence La figure 3 représente une courbe de concentration de l'ADN cible de Chlamydia obtenue en hybridation en sandwich et mesurée en radioactivité.
La figure 4 représente une courbe de sensibilité d'ADN de Chlamydia trachomatis après amplification par PCR et hybridation sandwich.
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention
La séquence nucléotidique trappeur 5, de préférence une séquence d'ADN, est fixée de manière covalente sur des plaques de multipuits 3. Cette fixation covalente est obtenue par la liaison d'un phosphate situé en position 5' terminale de la séquence du trappeur sur une amine située sur le support en présence de carbodiimide, telle que décrite par Rasmussen et al. (1991, Anal. Biochem. 198, 138-142).
Les séquences nucléotidiques trappeur 5 fixées peuvent hybrider un ADN cible 2, qui sera ensuite hybridé en sandwich par une séquence nucléotidique marquée 6.
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Un avantage de l'hybridation en sandwich est un bruit de fond très faible qui permet de réaliser une analyse massive d'échantillons cliniques sans devoir purifier l'ADN extrait.
La quantité de séquences nucléotidiques trappeurs fixées sur les multipuits peut atteindre 1, 2 pmoles pour des petits oligonucléotides, mais en ce qui concerne les séquences nucléotidiques plus grandes, la quantité fixée est moins importante (de l'ordre de 300 fmoles pour des séquences nucléotidiques de 500 bases environ). Une version optimalisée des conditions de fixation sur le support solide de séquences nucléotidiques trappeurs est présentée à l'exemple 1. Cependant, la quantité de séquences nucléotidiques trappeurs fixées est suffisante pour ne pas être limitante dans le procédé d'hybridation de l'invention.
La fixation de la séquence nucléotidique trappeur sur des microbilles permet également d'augmenter le nombre de séquences nucléotidiques trappeur dans la solution de réaction en utilisant une quantité de billes plus importante.
Les séquences nucléotidiques trappeurs selon l'invention choisies sont complémentaires sur toute leur longueur de la séquence nucléotidique cible à détecter.
Ceci permet avantageusement une production aisée de ces séquences nucléotidiques trappeurs par PCR à partir de séquences nucléotidiques cibles clonées dans des plasmides et peuvent ainsi servir à une production industrielle reproductible de ces séquences nucléotidiques trappeurs.
On peut cependant utiliser des trappeurs dont une partie de la séquence nucléotidique comprend une ou des parties de séquences non complémentaires de la séquence du
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cible. Les Inventeurs ont testé des séquences nucléotidiques trappeurs possédant une séquence de 20 ou 40 bases non complémentaire de la séquence nucléotidique cible et située en position 5'terminale servant à la fixation sur les multipuits.
Ces séquences servent de"spacers"entre la séquence trappeur proprement dite et le support solide. La séquence portant un"spacer"de 20 bases est plus efficace que les spacers de 40 et 60 bases pour hybrider de petites séquences cibles. Ce résultat est probablement dû aux possibilités supplémentaires de repliement de ces séquences nucléotidiques trappeurs sur elles-mêmes, ce qui diminue, voire inhibe, l'hybridation des séquences nucléotidiques cibles. Ces repliements ont pu être visualisés par l'utilisation des programmes de prédiction des structures secondaires Oligo4 et DNA-fold et ils peuvent effectivement impliquer des portions parfois assez longues de la séquence trappeur.
Ces repliements sont à éviter au maximum, car ils diminuent l'efficacité de l'hybridation, surtout lorsqu'ils impliquent des portions non complémentaires à la séquence cible qui ne peut donc pas les déplacer.
Une autre propriété du procédé et de la trousse de l'invention est l'utilisation avantageuse de séquences nucléotidiques trappeur ayant une taille minimale de 50 bases si possible 100 et au mieux 150 ou plus de bases.
Cette observation est inattendue sur la base de considérations suivantes.
La stabilité des hybrides en solution dépend de divers facteurs, dont l'influence a été étudiée en examinant leur influence sur la température produisant 50% de dissociation de l'hybride (Tm). Plus cette Tm est
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élevée, plus les hybrides sont stables. Les facteurs qui influencent cette stabilité sont une force ionique élevée, l'absence ou non d'agents chimiques particuliers comme la formamide et la composition en base (c'est-à-dire le pourcentage de base GC par rapport à AT) et l'absence ou la présence de mésappariements. En l'absence de produits chimiques dans la solution d'hybridation, et lorsque les 2 séquences sont parfaitement complémentaires, les facteurs variables sont la force ionique et la composition en bases.
La formule du Tm est alors : Tm = 81, 5 + 16, 6 log (M) + 0, 41 (% G + C) avec M = la force ionique (Anderson et Young in"Nucleic acid and hybridisation", IRL Press, Hames, B. and Higgins, S. Editeurs, 1985, 73-111, Oxford-Washington DC).
Cette formule est valable pour les fragments au-delà de 50 bases car au-delà de cette taille la stabilité devient maximale (Viscidi, 1988 in"Nucleic acid hybridization assays-DNA probes", Handbook of serodiagnosis in infectious diseases, E. Matthiews R. C. and Burnie J. P. Editeurs, Butterworth Heineman, 106-142).
La stabilité des hybrides, dans le cas où la force ionique est constante et la taille suffisante, ne dépend plus que de la composition (% G + C) et non de la taille des hybrides. L'importance de la taille pour favoriser ou non l'hybridation devrait donc dépendre de la vitesse de l'hybridation. Effectivement en solution, la taille des brins d'acides nucléiques influence la vitesse de réappariement. Celle-ci est proportionnelle à la racine carrée de la longueur (Wetmur, J. G. and Davidson, N. 1968, J. Mol. Biol. 3, 584) et dans le cas où les 2 brins sont de taille différente, la vitesse est proportionnelle à la racine carrée du brin le plus court que ce soit un ADN
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(Wetmur, J. G. 1971, Biopolymers 10, 601) ou un ARN (Hutton, J. R. and Wetmur, J. G. 1973, J. Mol.
Biol. 77, 495).
L'autre facteur qui influence la vitesse de l'hybridation est la concentration respective des séquences nucléotidiques cibles et des séquences nucléotidiques trappeurs. La situation dans ce cas est complexe car deux réactions sont possibles : d'une part les séquences nucléotidiques cibles à mesurer étant habituellement double brins dans la solution de départ, vont pouvoir se réassocier entre elles et d'autre part elles vont pouvoir s'hybrider sur la séquence nucléotidique trappeur. Il s'agit donc de deux réactions compétitives, l'une se passant en solution (la réassociation des doubles brins de la séquence nucléotidique cible) et l'autre sur un support solide (l'hybridation sur la séquence nucléotidique trappeur).
On peut considérer tout d'abord la situation où la quantité de séquence nucléotidique trappeur est en excès par rapport à la quantité de séquence nucléotidique cible. On détecte des concentrations de séquence nucléotidique cible de l'ordre du fmole (de 0, 1 à 50 fmoles) alors que la quantité de séquence nucléotidique trappeur peut atteindre 300 fmoles.
Si les 2 réactions compétitives se passaient en solution, la formule cinétique qui exprime la diminution de la concentration en séquence nucléotidique cible simple brin (ADN) en solution (Cs) en fonction du temps est de :
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d (Cs) - = kl [c.] [c. r dans laquelle : k2 : constante cinétique de réassociation de l'ADN
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k1 : constante cinétique d'hybridation avec la séquence nucléotidique Cf : concentration de la séquence nucléotidique trappeur.
Comme la réaction s'effectue sur support solide insoluble, il faut tenir compte de la vitesse de diffusion (J) de la séquence nucléotidique cible simple brin vers la surface solide sur laquelle est fixée la séquence nucléotidique trappeur, soit :
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La situation devient très complexe et ne peut être appréhendée dans son ensemble. Anderson et Young (1985) ont essayé de mesurer l'influence de la taille de la séquence nucléotidique cible double brin sur l'hybridation sur filtre en présence d'un excès de séquence nucléotidique fixée et ils concluent"The difference in dependence on molecular weight of the two types of filter hybridization is not understood".
En ce qui concerne l'influence de la taille de la séquence nucléotidique trappeur sur support solide en plastique, les études n'ont pas encore été réalisées et il n'est pas possible d'obtenir une formulation mathématique permettant de prévoir les résultats obtenus avec le procédé de l'invention.
Si on examine cependant les conditions particulières du milieu réactionnel, on constate que la quantité de séquence nucléotidique trappeur (par exemple 300 fmoles) est largement en excès par rapport à la quantité de séquence nucléotidique cible (par exemple 10 fmoles). Si on considère que cet excès permet de compenser les
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limitations dues à la diffusion, on se retrouve dans une situation proche de la réaction en solution où la vitesse d'hybridation devrait être proportionnelle à la racine carrée de la longueur des séquences.
En choisissant une séquence nucléotidique trappeur de 360 bases au lieu de 180 bases, on observe le déplacement d'un rendement de 30% à 50% soit une augmentation de 1, 67 fois. Même en se basant sur un effet de taille en solution c'est-à-dire à une vitesse dépendant de la racine carrée de la longueur, on aurait dû s'attendre à une augmentation maximale de 1,4 fois. En outre, un rendement de 50% n'a jamais été décrit à ce jour dans la littérature scientifique.
En comparant les rendements de l'hybridation en fonction de petites séquences nucléotidiques trappeurs allant de 50, 100, 150 et 250 bases, on constate (en prenant l'hybridation sur la séquence nucléotidique trappeur de 50 bases comme référence), une augmentation de rendement de 4,6 et 17 fois alors que les racines carrées de ces séquences sont dans un rapport respectif de 1,4, 1,7 et 2, 2 fois.
On constate donc un effet inattendu de la longueur de ces séquences nucléotidiques trappeurs sur l'augmentation du rendement de l'hybridation.
Une application particulière de ces hauts rendements d'hybridation de l'ADN cible sur support insoluble est son utilisation pour purifier un des deux brins de cet ADN cible. En effet le trappeur est constitué d'un seul brin car on utilise lors de sa construction par PCR une seule amorce phosphorylée en position 5'terminale. Ce phosphate est le seul à pouvoir réagir sur le support aminé. Après fixation, on lave la plaque en présence de Na OH 0,4 N
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(cfr. exemple 1) afin d'enlever le deuxième brin. On se retrouve donc avec un seul brin fixé sur le support. Ce brin étant complémentaire d'un seul des deux brins d'ADN cible, il va fixer ce brin. Après lavage, ce brin hybridé peut être déhybridé facilement par exemple par chauffage ou par du NaOH 0, 4 N. On obtient ainsi dans la solution un brin unique d'ADN.
Cette technique peut être utilisée sur une grande échelle par exemple en utilisant des billes sur lesquelles sont fixées les séquences nucléotidiques trappeurs. Cette préparation de brin simple peut avoir de multiples applications comme réactifs en utilisant un brin marqué chimiquement par exemple.
La détection de séquences cibles non marquées est réalisée en réalisant leur hybridation sur des séquences nucléotidiques trappeurs fixées sur un support insoluble en utilisant une ou plusieurs séquences nucléotidiques dont au moins une est marquée (séquences nucléotidiques de détection) qui peuvent s'hybrider sur la partie de la séquence nucléotidique cible non reconnue par la séquence nucléotidique trappeur. Celle-ci peut être marquée chimiquement et détectée suivant les diverses méthodes connues de l'homme de l'art. Il est possible d'obtenir une fixation de 80% au moins de la séquence nucléotidique de détection par rapport à la séquence nucléotidique cible hybridée sur la séquence nucléotidique trappeur.
En examinant l'influence de la longueur de cette séquence nucléotidique marquée sur l'efficacité de l'hybridation sandwich, on constate l'importance d'utiliser une séquence nucléotidique marquée qui recouvre le plus possible la séquence nucléotidique cible. Les meilleurs rendements sont obtenus lorsque la séquence nucléotidique cible est recouverte entièrement d'une part
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par la séquence nucléotidique trappeur et d'autre part par la séquence nucléotidique de détection (figure 1).
Dans le cas de la détection d'amplicons obtenus par PCR, on peut laisser du côté 5'terminal de la séquence nucléotidique cible une séquence non recouverte par la séquence nucléotidique de détection mais qui pourra être reconnue par les amorces toujours présentes dans la solution de la PCR. De cette manière l'ensemble de la séquence nucléotidique cible est recouvert lors de l'hybridation et il n'y a pas d'interférence entre les amorces et la séquence nucléotidique pendant l'hybridation.
L'efficacité accrue obtenue par cette procédure peut probablement s'expliquer de la manière suivante. Lorsque l'on réalise l'hybridation en une seule étape, la séquence nucléotidique cible dissociée en simple brin se retrouve dans la solution en présence de son brin de séquence nucléotidique cible complémentaire mais aussi de la séquence nucléotidique de détection (et éventuellement des amorces) et sur le support de la séquence nucléotidique trappeur. La séquence nucléotidique cible peut soit d'abord réagir avec la séquence nucléotidique de détection avant de venir se fixer sur le trappeur, soit se fixer sur le trappeur avant de fixer la séquence nucléotidique de détection. Dans les 2 cas, l'utilisation de grandes séquences nucléotidiques va favoriser la vitesse de réaction ainsi que la stabilité des hybrides formés.
Cependant dans cet état intermédiaire, la séquence nucléotidique cible possède une partie de sa séquence non appariée qui peut alors être reconnue par une séquence nucléotidique cible complémentaire qui pourra redéplacer l'hybride intermédiaire et refaire une séquence
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nucléotidique cible double brin. Par contre lorsque la séquence nucléotidique cible sera hybridée et recouverte complètement par la séquence nucléotidique trappeur et par la séquence nucléotidique de détection sans avoir aucun (ou trop peu) de séquence libre, l'appariement (annealing) d'un autre brin de la séquence nucléotidique cible complémentaire ne pourra plus avoir lieu et l'hybride sandwich sera stable.
Dans le cas où la séquence nucléotidique cible même après hybridation sandwich garde une séquence libre, celle-ci pourra toujours servir de site d'appariement pour l'autre brin de la séquence nucléotidique cible complémentaire, ce qui déstabilisera l'hybride et pourra même le dissocier en fonction des conditions expérimentales (T, sels,...), car une fois l'appariement commencé, la propagation de la formation du double brin est très rapide et thermodynamiquement favorable.
Cette optimalisation des divers paramètres et composés intervenant dans cette hybridation sandwich permet de réaliser cette hybridation sandwich à la fois avec une séquence nucléotidique marquée présente dans la solution et une séquence nucléotidique trappeur fixée sur un support insoluble en même temps alors que si ce n'est pas le cas, il faut d'abord réaliser une hybridation en solution avant de faire la capture sur une séquence nucléotidique immobilisée comme décrit par Ghost et al.
(EP. 557456) ou par un système plus complexe d'hybridation sandwich en solution puis capture par un récepteur fixé sur un support solide (Miller, US : 5, 374, 524).
Une autre caractéristique du procédé d'hybridation sandwich selon l'invention est que non seulement la séquence cible peut être entièrement recouverte par la
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séquence nucléotidique trappeur et la séquence nucléotidique marquée, mais que la séqeunce trappeur peut être entièrement recouverte par la séquence cible. Ceci permet donc d'utiliser comme séquence nucléotidique marquée des grandes séquences nucléotidiques doubles brins produites par exemple facilement par une amplification en PCR en présence de dUTP-biotine. En effet une fois l'un de ces brins biotinylés appariés avec la séquence nucléotidique cible, il sera totalement recouvert et ne pourra plus être redéplacé par son brin complémentaire, ce qui n'est pas le cas dans ces travaux rapportés par Keller et al. (1989, Anal. Bioch. 177, 27-32).
Cette invention permet donc une production facile en très grande quantité d'une part des séquences nucléotidiques trappeur en utilisant une amorce portant un phosphate en 5'terminal qui permettra la fixation covalente d'un seul de ces brins sur les microplaques aminées et d'autre part des séquences nucléotidiques marquées. Si les séquences marquées sont petites, de 20-30 ou 40 bases, elles seront synthétisées chimiquement et seront simples brins. Si elles sont plus grandes, on peut les produire par amplification.
Le dépassement de la séquence nucléotidique cible en dehors de la partie hybridée sur le capteur et la séquence nucléotidique de détection par son extrémité 5'terminale entraînait une diminution du rendement d'hybridation si cette partie non recouverte devenait importante. C'est aussi le cas si la partie 3'terminale n'est pas recouverte. En choisissant des conditions de réaction optimales, une séquence nucléotidique cible de 20 bases se fixe sur une séquence nucléotidique trappeur de 20 bases qui lui est complémentaire avec un rendement qui peut être 25 fois supérieur par rapport à une séquence qui possède
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les mêmes 20 nucléotides mais qui a en outre 20 autres nucléotides supplémentaires du côté 3'terminal.
On voit donc une différence d'efficacité de 25 fois entre ces 2 séquences du fait de la présence d'un morceau de la séquence non hybridée du côté 3'. L'explication d'un tel effet est sans doute due à un effet d'encombrement stérique de cette séquence libre située près du support. Cet effet inattendu peut être utilisé afin de pouvoir mesurer des petites séquences de nucléotides en présence de séquences plus grandes c'est le cas dans des méthodes d'amplifications comme la CPR où le produit de la réaction à mesurer est une petite séquence provenant d'une séquence nucléotidique de départ plus grande.
Exemple 1 : Fixation par liaison covalente des sondes trappeurs sur multipuits pour le dosage de Chlamydia trachomatis
La fixation de sondes nucléotidiques sur des multipuits se réalise par la formation d'un lien covalent entre le phosphate 5'de la sonde et un groupement amine présent sur le plastique en présence de carbodiimide. Les amplicons sont préparés à partir d'amorces dont l'une est phosphorylée à son extrémité 5'terminale.
La séquence nucléotidique est d'abord amplifiée par
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PCR en utilisant les amorces suivantes : Cl : 5'GAATTCTTAAGTTCGGTCGG3' C, : 5'CGCGTTCATATTCGATATGC3'
Ces deux amorces sont spécifiques du plasmide de Chlamydia trachomatis et amplifient une séquence de 288 paires de base. La première amorce est phosphorylée à son extrémité 5'.
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Les amplicons sont dénaturés par chauffage à 100 C pendant 10 minutes, puis refroidis à 0 C. Les plaques multipuits Covalink NH (Nunk, Danemark) portant en surface une fonction amine secondaire sont utilisées pour le couplage. Dans certains exemples, on utilise des plaques de polystyrène fonctionnalisées par greffage d'amines comme décrit par Zammatteo et al. (Anal. Biochem. 236, pp.
85-94 (1996) ). Dans chaque puits est ajouté 530 fmoles d'amplicons phosphorylés dans 0,1 ml de solution contenant du tampon 1-méthylimidazole 10 mM pH 7,5 et du 1-éthyle-3 (3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide 0,025 M (Sigma, St Louis, Mi). Les plaques sont incubées 5 heures à 50 C et puis sont lavées 6 fois avec du NaOH 0,4 M contenant du Tween 20 à 0, 25%. Dans ces conditions, le pourcentage de fixation des amplicons est de 49% pour la séquence définie ci-dessus.
Exemple 2 : Influence de la longueur du trappeur pour une hybridation simple d'un ADN cible de HPV-18
L'expérience a été réalisée sur des amplicons de 586 paires de base correspondant à une séquence de HPV-18
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située en position 6193 à 6779 de l'ADN viral. Cette séquence a été amplifiée par les amorces suivantes : 1 = 5'TTTTGGAAGATGGTGATATGG 3' 2 = S'CATAACATCTGCAGTTAAAGT 3'
L'hybridation a été réalisée à partir de ces amplicons marqués à l'extrémité 5'terminale par l'intermédiaire de la T4 polynucléotide kinase en présence de [yATP-au"P].
Deux types de trappeurs ont été utilisés, correspondant à 180 et 360 bases complémentaires de la séquence des amplicons. Les hybridations ont été réalisées
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en présence de concentrations croissantes d'amplicons de cible à 45 oc pendant 20 heures dans une solution constituée de SSC 2x concentré, de Denhart 5x concentré, de DNA de sperme de saumon dénaturé à 0,1 mg/ml.
Des concentrations des amplicons allant de 0,13 à 13 fmoles ont été testées, et la quantité fixée a été mesurée en radioactivité. Rapporté en pourcentage d'ADN fixé, ceci représente 30% sur le trappeur de 180 bases et 50% sur le trappeur de 360 bases quelles que soient les concentrations en cible testées.
Le fait que ce pourcentage soit stable entre 0,13 et 13 fmoles indique également que la quantité de trappeur n'est pas limitante.
Exemple 3 : Effet de la longueur du trappeur sur une hybridation simple d'un ADN cible de CMV
L'expérience a été réalisée pour une hybridation d'amplicons de 437 paires de base correspondant à une séquence de CMV en position.....
Cette séquence a été amplifiée par les amorces suivantes : MIE4 : sens : 5'TGGCCAAGCGGCCTCTGATAACC MIE5 : antisens : 51 CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG comme décrit par Demmler et al. (J. Infect. Dis., 158, pp ; 1177-1184 (1988) ) et marquées au 32p en utilisant lors de l'amplification par PCR des cDTP marqués au 32p. Les trappeurs de 50,100, 150 et 250 bases ont été produits par PCR et correspondent à la partie 3'terminale des amplicons.
L'hybridation a été réalisée à 60 oc pendant 2 heures dans une solution de SSC 2x concentré et de Denhart 5x concentré en présence de 0,1 mg/ml d'aADN de sperme de
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saumon. Une quantité de 10 fmoles d'amplicons 32p a été ajoutée à chaque puits. Après réaction, les puits ont été découplés et la radioactivité mesurée. Les résultats montrent que pour les trappeurs de 50,100, 150 et 250 bases, on obtient respectivement 0,09 ; 0,035 ; 0,53 et 1, 55 fmoles de séquence cible hybridée. On observe bien un effet spectaculaire de la longueur du trappeur sur l'hybridation.
Exemple 4 : Influence de la longueur du trappeur pour une
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hybridation en sandwich dfun ADN cible de HPV-18
L'expérience a été réalisée pour l'hybridation d'amplicons de 586 paires de base correspondant à une séquence de HPV-18 située en position 6193 à 6779 de l'ADN viral. Cette séquence a été amplifiée par les amorces décrites à l'exemple 2.
Trois types de trappeurs ont été utilisés, correspondant à une séquence de 25,180 et 360 bases complémentaires de la séquence des amplicons.
Les divers trappeurs reconnaissant la partie des amplicons situés du côté 3'terminale. Les sondes comprenaient soit 360 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 180 bases, soit 180 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 360 bases, soit 21 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 25 bases. Elles ont été marquées au 32p par phosphorylation en position 5' terminale par la T4 kinase en présence de [32p] ATP. Elles correspondaient à l'extrémité 5'terminale de la séquence cible. Les sondes de 21 bases étaient simple brin, alors que les sondes de 180 et 360 bases étaient double brin. Les hybridations en sandwich ont été optimalisées en ce qui concerne la température, la concentration en sels et
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la concentration en amplicons.
En ce qui concerne le trappeur de 25 bases, l'hybridation réalisée à 45 C en présence de 2,5 fmoles d'amplicons pendant 2 heures dans une solution de SSC 2x concentrée puis après lavage incubé pendant 2 heures avec 15 fmoles de sonde marquée au 32p. On obtient une fixation de 0,280 fmoles avec un coefficient de variation de 80%. L'hybridation sur les trappeurs de 180 et 360 bases s'est faite en une seule étape et dans les conditions suivantes : les amplicons ont été ajoutés respectivement à raison de 2,5 fmoles en présence de 15 fmoles de sonde marquée. L'hybridation s'est déroulée pendant 20 heures d'une solution SSC 2x concentrée à 45 C. La quantité de sonde marquée hybridée est de 0,54 fmoles pour le trappeur de 180 bases et de 0,69 fmoles pour le trappeur de 360 bases.
La différence de fixation de la sonde était due à un rendement plus élevé de l'hybridation de la séquence cible sur le grand trappeur (cf. exemple 2).
En effet, si l'on rapporte la fixation de la sonde marquée par rapport à la quantité de séquence cible trappée, on obtient dans les deux cas un rapport de 0,8. Ceci signifie que 80% des séquences cibles hybridées sur la séquence capteur ont fixé les séquences marquées. On constate donc dans cet exemple qu'il est possible d'utiliser des sondes de détection marquées, même double brin, et d'obtenir un très bon rendement de leur hybridation (80%).
Le facteur limitant pour la formation du sandwich dans ces conditions est alors la longueur de la sonde capteur.
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ExemDle 5 : Intluence du recouvrement de la sequence nucléotidique cible par l'ADN trappeur et l'ADN sonde pour le rendement de l'hybridation (exemple de Mycobactérie tuberculosis)
Dans cet exemple, l'ADN extrait de Mycobactérie tuberculosis a été amplifié par sa séquence Mt 308 en utilisant les amorces suivantes : T2MT3' (amorce 5'-3') :
GTCGACACGCCTCTGCACGGAAGTCCTT DMT3' (amorce antisens 5'-3') :
GCTCGACTTCTGGTCACGACGTCCGTCGAA
Ces amorces ont été utilisées par Thierry et al.
(Mol. Cell. Probes, 6, p. 181 (1992) ), et permettent l'amplification d'un fragment de 279 paires de base.
Le trappeur a été obtenu en utilisant la sonde T2MT3' phosphorylée en position 5'et une amorce antisens SMT5' : GGGCATCCGCGAGTTGAAGACCTGAAGTGG.
Ces deux amorces permettent la production d'amplicons de 144 paires de base, dont l'un des deux brins possède un phosphate en 5'. Celui-ci a servi à fixer le trappeur par un brin covalent sur l'amine des multipuits comme expliqué à l'exemple 1.
Deux sondes marquées ont été réalisées, l'une de 135 paires de base obtenue par l'utilisation d'une amorce antisens GSMT5'portant une biotine :
TCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCCTTGGG et l'autre par l'amorce antisens DMT3'. L'autre sonde était simple brin et portait également une biotine :
5'CAGCCACCAAGTCGAGCACTTTGCGGCGGAACTACTCGGG-biotine 3'
L'hybridation sandwich a été réalisée en ajoutant dans chaque puits 54 fmoles d'ADN cible amplifié par PCR en présence de 50 ng de sonde de 40 bases et de 25 ng pour
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la séquence de 135 bases. L'hybridation a été effectuée pendant 2 heures à 60 OC.
Après lavage, le conjugué streptavidine-kinase a été ajouté et après 45 minutes d'incubation, l'activité de la kinase a été dosée en bioluminescence comme décrit dans la demande de brevet W094/06933.
La lecture est faite pendant une heure. On obtient après soustraction du blanc une valeur de 1,5 million de RLU (Relative Light Unit) pour la sonde de 40 bases et de 2,7 millions de RLU pour la sonde de 135 bases.
Dans cet exemple, la sonde de 135 bases était double brin et mise en quantité plus faible. Malgré ces deux conditions défavorables, le signal obtenu est presque deux fois supérieur, ce qui indique bien l'importance de réaliser une grande sonde de détection qui recouvre l'entièreté de la séquence cible.
Exemple 6 : Courbe de concentrations en amplicons de CMV après hybridation sandwich
Les amplicons provenant de l'ADN de CMV ont été obtenus à partir d'une PCR réalisée avec les amorces MIE4 et MIME5 décrites dans l'exemple 3. Elles permettent d'obtenir des amplicons de 437 paires de bases. Les amplicons ont servi pour réaliser la courbe d'hybridation sandwich décrite ci-dessous. Celle-ci a été réalisée sur des plaques multipuits sur lesquelles étaient fixés des trappeurs complémentaires à cette séquence cible et une sonde biotinylée de 185 bases produite également par PCR. La taille du trappeur était de 257 bases.
Ils ont été produits à partir d'une PCR utilisant des amorces MIE4 décrites à l'exemple 3 et MEI-6 dont la séquence était :
GTACAGGGGACTCTGGGGGTGAC
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Le trappeur une fois produit est purifiée sur spin colonne G25.
La fixation covalente du trappeur sur le polystyrène se fait comme suit : chaque puits contenant 100 ng de trappeur dénaturé, MIEM 0.01 M pH 7,5, carbodiimide 0,2 M.
Ces puits sont incubés 5 heures à 50 OC. Après incubation, deux lavages avec 200 gl de NaOH 0,2 N, un lavage à l'eau et un séchage sont réalisés. Pour l'hybridation, les puits sont dénaturés avec 200 lil de NaOH 0,2 N et rincés avec 200 pl de SSC 2x.
Le volume total d'hybridation par puits est de 110 pl, contenant : - 50 #l de tampon d'hybridation : SSC 4.4x, Denhart 10x,
ADN de sperme de saumon 200 g/ml dénaturé 10 minutes à 100 C ;
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- 10 J, Ll de sonde biotinylée à une concentration de 900 pg/10 gl dénaturée 10 minutes à 100 C ; - 50 1 d'ADN cible amplifié par PCR en utilisant deux amorces MIE4 et MIE5 décrites à l'exemple 3, non purifié et dénaturé 10 minutes à 100 C. Les quantités testées vont de 3,5 attomoles à 3500 attomoles.
L'hybridation dure 2 heures à 70 C.
Après hybridation, les puits sont lavés deux fois avec 200 gl de SSC O, lx puis avec 200 #l de tampon maléate 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,3% pH 7,5 durant 15 minutes.
Après rinçage avec 200 gl de tampon maléate 100 mM pH 7,5 contenant NaCl 150 mM et du blocking reagent 1%, 100 gl de streptavidine-kinase sont ajoutés. Les puits sont rincés avec 400 Ml de tampon maléate 100 mM pH 7,5 contenant NaCl 150 mM, Tween 0, 3% pendant 10 minutes puis 3 fois 5 minutes avec 200 pl de tampon maléate 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,3% pH 7,5.
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L'activité de la kinase est révélée dans du Tris buffer 20 mM pH 7,75 contenant du DTT 60 MM, EDTA 100 MM, MgCl2 5 mM, Luciferine 8 MM, luciferase 6 mU par puits KCl 20 mM, Phosphoenolpyruvate 1 mM et ADP 3,2 MM. L'émission de lumière est suivie pendant une heure avec un luminomètre (Luminoskan, Labsystem, Finlande) et les résultats sont exprimés en RLU. min (Figure 2).
Exemple 7 : Courbe de concentration en amplicons des Chlamydia trachomatis après hybridation sandwich
Les amplicons provenant de l'ADN de Chlamydia trachomatis ont été obtenus en utilisant les amorces suivantes : sens : 5'GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGT 3' antisens : 51 GAATTCTTAAGTTCGGTCGG.
Cette amplification permet d'obtenir des amplicons cibles de 415 paires de base. Ces amplicons ont été utilisés afin de réaliser une courbe de concentration en hybridation sandwich sur des trappeurs fixés sur plaques multipuits.
Les trappeurs sont issus d'une PCR utilisant les primers GAATTCAAATGGTCTGAGAATAGT phosphorylé en 5'et TTTTCAACAAAAATTCGTCGA produisant des amplicons de taille de 288 bases. Le trappeur une fois produit est purifié sur spin colonne G25.
La fixation covalente du trappeur sur polystyrène se fait comme suit : chaque puits contenant 100 ng de trappeur dénaturé, MEIM 0,01 M, pH 7,5, carbodiimide 0,2 M. Ces puits sont incubés 5 heures à 50 OC. Après incubation, deux lavages avec 200 l de NaOH 0,2 N, un lavage à l'eau et un séchage sont réalisés. Pour
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l'hybridation, les puits sont dénaturés avec 200 lil de NaOH 0,2 N et rincés avec 200 pl de SSC 2x.
Le volume total d'hybridation par puits est de 110
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gl, contenant SSC 2x, Denhart 5x, de l'ADN de sperme de saumon 100 gag/1, 11 fentomoles de sonde marquée au P32 de 124 bases qui correspondent à la partie 5'terminale de la cible et différentes quantités d'ADN cible. sens 5'GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGT3' antisens 5'GAATTCTTAAGTTCGGTCGG allant de 1 pg à 5000 pg par puits.
L'hybridation se déroule à 45 oc pendant 15 heures.
Après hybridation, un lavage avec 200 pl de SSC O, lx est réalisé pendant 5 minutes puis la radioactivité contenue dans les puis est comptée (Figure 3).
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ExemDle 8 : Courbe de concentration en Mycobactérie tuberculosis après hybridation sandwich
Une courbe de concentration en ADN de Mycobactérie tuberculosis a été réalisée sur des amplicons obtenus après amplification par PCR à l'aide des amorces T2MT3'et DMT3'décrites dans l'exemple 5. Ces amplicons avaient une taille de 279 paires de base. Le trappeur était constitué des 144 premières bases de cette séquence alors que la sonde marquée était constituée des 135 dernières bases.
Leur production est décrite à l'exemple 5. Les inventeurs ont utilisé une sonde marquée par incorporation de dUTPbiotine, ce qui permet d'avoir une sonde portant plusieurs biotines.
Une courbe de concentration en amplicons a été réalisée et la détection réalis e en utilisant des concentrations de 1, 5, 4 et 54 fmoles d'amplicons en bioluminescence à l'aide d'un conjugué streptavidinekinase. Les résultats de ces dosages ont donné que une
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émission de lumière mesurée en 1 h respectivement de 2, 5 - 3, 5 et 8, 8 de RLU. On obtient une courbe de dosage dans cette zone de concentration en amplicons. cette zone de concentration en amplicons.
Exemple 9 : Courbe de concentration en licons de HPV-18 après hybridation sandwich
Les amplicons ont été obtenus par les amorces 1 et 2 décrites à l'exemple 2. Elles permettent la formation après PCR d'amplicons de 586 paires de base de HPV-18.
Les trappeurs correspondent aux 180 bases de ces amplicons situées du côté 3'terminal des amplicons.
Des trappeurs de 180 bases ont été fixés de manière covalente sur les micropuits. Ces trappeurs reconnaissent
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les amplicons du côté 3'terminal. Les sondes de 380 bases étaient situées du côté 5'terminal des amplicons. Une petite séquence de 26 bases reste libre à l'extrémité des amplicons après hybridation.
Dans cette expérience, des quantités croissantes d'amplicons cibles de 50,500 et 5000 pg sont incubés pendant 20 heures à 45 C dans une solution SSC 2x concentrée en présence de 15 fmoles de sonde biotinylée.
Après hybridation et lavage, un conjugué streptavidineperoxydase est ajouté et son activité mesurée en chemoluminescence.
On obtient pour les trois concentrations d'amplicons cibles une valeur relative de lumière (RLU) respectivement de 171,941 et 2354 RLU. Les valeurs des blancs obtenues en utilisant une séquence non spécifique ont été enlevées des tests.
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Exemple 10 : Mesure du nombre de copies d'ADN de Chlamydia trachomatis après PCR et hybridation sandwich
Des quantités croissantes d'ADN de Chlamydia trachomatis cloné dans un plasmide sont utilisées pour une PCR. Celle-ci est réalisée en présence de Polymérase Amplitaq Gold (Perkin Elmer) dans 100 pl de tampon comprenant du MgC12 2 mM, les divers dNTP à 200 MM et les amorces à MM. Ces amorces sont celles décrites à l'exemple 7.
Après 45 cycles de PCR comprenant 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 600C et 30 secondes à 72 C, la PCR est laissée 10 minutes à 72 C.
Un échantillon de 20 l est alors placé dans les puits contenant le trappeur et une sonde biotinylée comme ceux décrits à l'exemple 7 et l'hybridation se réalise pour 2 heures à 65 C. Après cette hybridation, les puits sont lavés 4 fois avec une solution contenant du tampon Maléate 100 mM pH 7,5 et 150 mM NaCl et 0,3 % de Tween 20.
Un conjugué streptavidine-peroxydase dilué 2 000 fois dans le même tampon contenant du lait en poudre à 0,1 % est incubé 45 minutes à 20 C. Les puits sont alors lavés 4 fois comme précédemment et l'activité de la peroxydase mesurée pr la formation d'un produit coloré en présence de son substrat TMB et H202. La D. O. du produit formé est mesuré à 450 nM (Figure 4).
Exemple 11 : Hybridation différentielle d'un petit et d'un long brin d'ADN ayant une partie de sa séquence identique
Lors de certaines amplifications comme la CPR, les sondes de départ marquées sont grandes et sont coupées en deux morceaux qu'il faut pouvoir détecter et mesurer. Le problème est donc de pouvoir mesurer par hybridation une petite sonde en présence de sa séquence mère qui est plus
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grande. Les inventeurs ont choisi dans cet exemple une séquence mère (OL1) biotinylée de 40 bases qui ont la séquence suivante : 5'CCGCGACTATCCCTCTGTCCTCAGTAATTGTGGCTGAGAA 3'
Cette séquence correspond à une séquence spécifique du génome de CMV située sur le"Major Immédiate Early Gene" (Akrigg et al., Virus Res. 2, p. 107).
Les inventeurs ont voulu détecter une sonde biotinylée (OL2) correspondant aux 20 premières bases de cette sonde en présence de la séquence mère (OL1). Le trappeur était constitué d'un oligonucléotide de 20 bases complémentaires à la sonde OL2 et terminée par un groupement phosphate en 5'. Ce trappeur a été fixé sur les multipuits aminés par réaction covalente.
Dans l'expérience suivante, 100 fmoles de deux des séquences biotinylées OL1 ou OL2 ont été incubés pendant 2 heures à 45 C dans une solution de SSC 0, 5x concentrée (soit 75 mM NaCl et 7,5 mM de nitrate de Na). Après l'hybridation, les puits ont été lavés par une solution de SSC 0, lx concentré à 45 OC. Après quatre lavages, les puits sont incubés avec le conjugué streptavidine-kinase et sa fixation est estimée par la mesure de l'activité kinase en bioluminescence. Dans ces conditions, les puits ayant le grand fragment (OLA) montraient une RLU x min de 9 alors que les petits fragments montraient une RLU x min de 210.
La présence sur OL1 d'une séquence de 20 nucléotides supplémentaires sur OL1 situés du côté 5'par rapport à OL2, c'est-à-dire du côté du plastique, déstabilise donc fortement l'hybridation de cette sonde sur le trappeur.