<Desc/Clms Page number 1>
PROCEDE ET TROUSSE DE DIAGNOSTIC ET/OU DE QUANTIFICATION
PAR HYBRIDATION DE TYPE SANDWICH DE SEQUENCES D'ACIDES
NUCLEIOUES SUR SUPPORT SOLIDE Objet de l'invention
La présente invention concerne un procédé et une trousse comprenant des réactifs pour la détection et/ou la quantification par hybridation de type sandwich de séquences d'acides nucléiques sur un support solide.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention
Il est connu de fixer de l'ADN de manière covalente sur un support et de l'utiliser comme séquence nucléotidique capteur pour fixer une séquence nucléotidique cible et pouvoir la détecter directement si elle est fixée à une molécule chimique détectable. Dans le cas où la séquence nucléotidique cible à identifier n'est pas marquée, on peut réaliser une hybridation de type "sandwich"en utilisant une séquence nucléotidique marquée qui viendra se fixer sur la séquence nucléotidique cible.
Cette séquence nucléotidique marquée ne sera ellemême immobilisée que si la séquence nucléotidique cible est présente et immobilisée sur la séquence nucléotidique trappeur. La séquence nucléotidique cible est donc prise en sandwich entre la séquence nucléotidique trappeur et la
<Desc/Clms Page number 2>
séquence nucléotidique marquée, ce qui requiert une double reconnaissance, et par conséquent augmente la spécificité, réduit le bruit de fond, et permet également une quantification de la séquence nucléotidique cible. Cela n'est possible que si l'hybridation est réalisée de manière quantitative et reproductible. Ceci est d'autant plus vrai que le rendement de cette hybridation est grand.
L'intérêt d'une telle hybridation quantitative est la mesure d'acides nucléiques provenant"d'agents biologiques"pathogènes ou non comme les virus, champignons, bactéries, mycoplasmes, cellules ou tissus animaux et végétaux. Très souvent, ces quantités d'acides nucléiques ne peuvent être mesurées du fait de leur très faible concentration dans les échantillons biologiques. Dès lors, on utilise une étape d'amplification de la séquence nucléotidique cible, telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction (US Patent 4965188), la LCR (Landegren et al., 1988, Science, 241,1077-1080), le NASBA (Kievits et al. 1991, J. Virol. Methods 35.273-286) ou la CPR (Cycling Probe Reaction (WO Patent 95/14106).
Cependant la détection de ces séquences amplifiées appelées ci-après amplicons nécessite de réaliser une détection spécifique sensible et facilement adaptée à un grand nombre d'échantillons si l'on veut pouvoir utiliser ces méthodes comme tests de routine notamment dans le cadre de diagnostics médicaux ou vétérinaires.
Une première solution consiste à utiliser des billes pour réaliser cette hybridation sandwich, telle que décrite dans la demande de brevet EP-0205532, où des billes de Sephacryl de 5 à 50 m sont activées par diazotasion d'amines aromatiques. L'utilisation de plaques multipuits est également une bonne solution car elles
<Desc/Clms Page number 3>
servent déjà de base pour beaucoup de tests, notamment les ELISA et de nombreux appareils de lecture en photométrie, fluorescence, luminescence existent déjà pour la lecture de ces plaques. Si l'on veut utiliser ces supports pour la détection, il faut pouvoir immobiliser les séquences nucléotidiques cibles sur ces plaques afin de pouvoir les détecter et/ou les quantifier.
Cette fixation peut s'obtenir par simple adsorption sur les micropuits, c'est-à-dire par réaction non covalente. Plusieurs travaux ont été réalisés de cette manière qui permettent effectivement de mesurer des amplicons présents en solution (Dahlem et al. 1987, Mol.
Cell. Probes 1.159-168 ; Cross et al. 1992, The Lancet 340.870-873 ; Allibert et al., EP 486661). Cependant ces méthodes souffrent d'inconvénients, à savoir une absence de contrôle du processus d'adsorption (qui nécessite de travailler avec de très grands fragments, souvent des plasmides entiers, pour éviter ce problème, et ce qui entraîne l'utilisation de trappeurs doubles brins qui peuvent se réassocier rapidement) et la difficulté d'optimaliser rationnellement la taille et la séquence nucléotidique trappeur du fait des aléats liés à l'adsorption. La fixation de ces trappeurs par des liens covalents permet de répondre à ces problèmes.
Dans différents documents de l'état de la technique, on a cherché à optimaliser la longueur d'une séquence simple brin pouvant servir de trappeur pour une séquence cible ou tenté de caractériser la longueur de la séquence cible nécessaire pour être détectée dans les meilleures conditions.
Dans le document"J. of Clin. Microbiol", vol. 28, juin 1990, pp. 1469-1472, Inouye et Hondo et al. décrivent
<Desc/Clms Page number 4>
un procédé d'hybridation directe sur des séquences fixées sur des microplaques de segments d'ADN de différentes longueurs. Cette hybridation s'effectue sur des segments trappeurs d'ADN adsorbés de manière non covalente sur ces microplaques. Des trappeurs de longueurs différentes sont adsorbés et hybridés avec une séquence biotinylée de 642 paires de bases. Les auteurs observent avec les différentes séquences la même courbe d'hybridation, mais une efficience d'hybridation croissante en fonction de la taille des fragments. Sur base de cette expérimentation, les auteurs ont conclu qu'il est préférable que la séquence cible à identifier présente une longueur de plus de 300 paires de base.
Comme notés par les auteurs, l'adsorption de l'ADN se fait sur de très grandes longueurs ce qui rend impossible la connaissance des longueurs disponibles pour obtenir une hybridation efficace. Ce problème va se retrouver dans tous les travaux utilisant l'adsorption des sondes trappeurs sur le plastic.
EMI4.1
Dans le document"Analytical Biochem.", No. 177, pp.
27-32 (1989), les auteurs Keller et al. décrivent un procédé d'hybridation de type sandwich utilisant comme séquence trappeur un fragment de 3300 paires de base servant à la détection d'une séquence cible de 190 paires de base qui est également complémentaire d'une autre séquence marquée, la séquence trappeur simple brin étant fixée par une fonction NH2 de manière covalente à un support solide. Comme il apparaît à la figure 2 de ce document, il n'existe qu'un recouvrement très partiel de la séquence trappeur ainsi que de la séquence marquée par la séquence cible.
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
Dans la publication"Clin. Chem.", No. 31, pp. 1438- 1443 (1985), les auteurs Polsky-Cynkin et al. décrivent un procédé dans lequel la séquence trappeur comporte 4800 paires de base dont 800 paires de base sont complémentaires de la séquence cible de 1600 paires de base à détecter. Comme il apparaît dans la figure 1 de ce document, la séquence cible est également complémentaire d'une autre séquence nucléotidique marquée de manière à obtenir une hybridation de type sandwich.
La demande de brevet japonais JP-8089300 au nom de Mitsui décrit une séquence trappeur présentant une longueur inférieure à 30000 paires de base et comportant au moins 10 unité répétitives de 100 paires de base susceptibles de s'hybrider en série selon la même orientation avec des séquences cibles à détecter. Cette méthode permet une augmentation de la sensibilité des méthodes traditionnelles.
La demande de brevet EP-0079139 au nom de Orion Corp. décrit une séquence trappeur simple brin de 1200 paires de base ou de 1500 paires de base s'hybridant avec des séquences cibles de 600 ou 700 paires de base, susceptibles d'être détectées par une hybridation sandwich au moyen d'une autre séquence marquée et complémentaire d'une autre portion de la séquence cible.
Cependant, dans tous ces dispositifs d'hybridation basés sur une hybridation simple ou une hybridation sandwich, on observe un mauvais'recouvrement de la séquence trappeur par la séquence cible, ainsi qu'un mauvais recouvrement de la séquence cible par la séquence trappeur et/ou la séquence marquée. Par conséquent, lorsque l'on utilise de très longues séquences pour la détection ou de très longues séquences cibles à détecter,
<Desc/Clms Page number 6>
on observe des risques de reploiement des séquences sur elles-mêmes ou éventuellement avec d'autres séquences "parasites" présentes dans l'échantillon (par exemple des séquences complémentaires d'une séquence amplicon issue d'une PCR que l'on chercherait à caractériser et quantifier).
Le document"Nucleic Acid Research", Vol. 21, No. 15, pp. 3469-3472 (1993) de Kosaka et al. décrit des séquences trappeurs fixées par une liaison covalente sur des microplaques. Ces séquences trappeurs très courtes (de l'ordre de 17 paires de base) sont utilisées pour obtenir une hybridation de séquences cibles à identifier et à quantifier en présence de séquences similaires marquées. Comme il apparaît dans le schéma de la figure 2 de ce document, malgré la faible longueur de la séquence trappeur, il n'existe pas de recouvrement optimal de cette séquence trappeur par la séquence cible à quantifier.
EMI6.1
Dans le document"Clin. Chem.", No. 40/2, pp. 200-205 (1994), Rasmussen et al. décrivent une séquence trappeur simple brin fixée par une liaison covalente à des microplaques. Cette séquence trappeur est également très courte (de l'ordre de 25 nucléotides) et est utilisée pour obtenir l'hybridation de séquences cibles de l'ordre de 350 à 500 paires de base.
Dans la demande de brevet W094/06933, on décrit un procédé d'hybridation sandwich au moyen d'une séquence trappeur fixée sur un support insoluble tel que des microplaques, servant à l'hybridation de type sandwich d'une séquence cible susceptible de s'hybrider également avec une séquence marquée. Cependant, dans les exemples d'exécution décrits dans cette demande de brevet, les séquences trappeurs sont de l'ordre d'une vingtaine de
<Desc/Clms Page number 7>
nucléotides utilisées pour l'hybridation de séquences cibles dont la longueur est comprise entre 400 et 600 paires de base. Dans les cas décrits ci-dessus, lorsque les séquences trappeurs sont très courtes, on observe un mauvais recouvrement de la séquence cible par la séquence trappeur et la séquence marquée ce qui serait susceptible de provoquer des faux positifs ou des faux négatifs.
Dans ce type d'expérimentation, on obtient un reploiement de la séquence cible sur elle-même ou une réhybridation de séquences cibles entre elles. Ainsi, le pourcentage d'hybridation de la séquence cible sur la séquence trappeur est particulièrement faible avec des séquences trappeurs très courtes, ce qui diminue la sensibilité.
Dans le document"Journ. of Clin. Microbiol.", vol.
33, pp. 752-754 (1995), Cho et al. décrivent un procédé utilisant une séquence trappeur simple brin de 188 paires de base adsorbée sur des microplaques, cette séquence trappeur permettant d'hybrider une séquence biotinylée cible de 245 paires de base. Cette technique d'hybridation non basée sur la reconnaissance de type sandwich présente l'inconvénient que l'on observera éventuellement un mauvais recouvrement de la séquence trappeur par la séquence cible, et dans tous les cas, un mauvais recouvrement de la séquence cible sur au moins une soixantaine de paires de base.
Par conséquent, cette portion de 60 paires de base suffit pour obtenir des reploiements de la séquence cible, voire de la séquence trappeur, sur elle-même, dont les structures secondaires sont susceptibles de perturber l'hybridation entre la séquence trappeur et la séquence cible, ce qui diminue la sensibilité du test.
<Desc/Clms Page number 8>
Dans le document"Journ. of Clin. Microbiol.", vol.
9, pp. 638-641 (1991), Keller et al. décrivent une séquence trappeur simple brin fixée par une liaison covalente sur des microplaques, cette séquence trappeur simple brin présentant une longueur de 126 paires de base, dont au moins une portion est susceptible de réaliser une hybridation simple avec une séquence cible de 191 paires de base. La fixation se fait après avoir fixé de manière aléatoire sur les bases de la séquence le diamino hexane qui peut alors être fixé sur les puits.
Le document mentionne explicitement que la séquence simple brin n'est complémentaire que d'une partie de la séquence cible de 191 paires de base, mais n'est pas susceptible d'obtenir un recouvrement complet, en particulier des séquences primers de part et d'autre de cette séquence cible de manière à éviter toute homologie de recouvrement entre les primers et la séquence simple brin. On observe donc aux deux extrémités de la séquence cible plus de 30 paires de base qui ne sont pas recouvertes par la séquence trappeur, la reconnaissance de l'hybridation étant détectée par le fait que la séquence cible est marquée par de la biotine et peut être reconnue par le conjugué streptavidine peroxydase permettant sa détection par colorimétrie.
Dans ce document, on n'observe pas un bon recouvrement de la séquence cible à quantifier, et le reploiement de cette séquence peut être particulièrement important, près de l'extrémité de la séquence trappeur fixée sur le support solide. Le risque à ce niveau d'un reploiement d'une structure secondaire est particulièrement important, ce qui pourrait fausser les procédés de détection et de quantification. De plus, comme la fixation du trappeur au
<Desc/Clms Page number 9>
puits se fait de manière aléatoire, la portion du trappeur accessible à la séquence cible n'est pas connue.
La demande de brevet EP-0205532 décrit une séquence trappeur de 341 paires de bases fixée de manière covalente sur des microbilles, cette séquence trappeur étant susceptible de réagir avec une séquence cible pour obtenir un overlap de la séquence trappeur sur la séquence cible de 175 paires de base, la séquence cible étant ensuite susceptible de réagir avec une séquence marquée de 201 paires de base par un phénomène d'hybridation sandwich.
Cependant, ce document ne décrit pas non plus un recouvrement optimal de la séquence trappeur simple brin par la séquence cible. En effet, on observe dans ce document, au niveau de la séquence trappeur simple brin, une portion libre de 166 paires de base au niveau de laquelle on est susceptible d'observer des reploiements de la séquence trappeur simple brin sur elle-même ou l'appariement avec d'autres séquences présentes dans l'échantillon, qui sont susceptibles de diminuer le pourcentage de séquence cible s'hybridant sur la séquence trappeur, et par conséquent la sensibilité de la détection et de la quantification.
Buts de l'invention
La présente invention vise à fournir un nouveau procédé et une trousse permettant la détection et/ou la quantification de séquence d'acides nucléiques qui ne présenteraient pas les inconvénients de l'état de la technique cité.
Un but particulier de la présente invention vise à fournir un procédé et une trousse permettant une hybridation optimale des séquences d'acides nucléiques sur
<Desc/Clms Page number 10>
un support solide, en particulier un haut pourcentage d'hybridation de la séquence trappeur par la séquence cible, un faible risque de reploiement de la séquence cible ou de la séquence trappeur sur elle-même, un faible risque de ré-appariement de séquences cibles par des séquences complémentaires présentes dans l'échantillon ou un faible risque d'appariement"parasite"de la séquence trappeur par d'autres séquences présentes dans l'échantillon.
Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé et une trousse présentant une spécificité et une sensibilité améliorées par rapport aux procédés et aux dispositifs de l'état de la technique.
Un but complémentaire de la présente invention est de fournir un procédé et une trousse permettant d'optimaliser la quantification d'acides nucléiques, en particulier des acides nucléiques présents dans un échantillon biologique et obtenus après une amplification génétique.
Eléments caractéristiques de l'invention
La présente invention est relative à un procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence nucléotidique dénommée"cible"présente dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'elle comprend une mise en contact de type"sandwich"de ladite séquence nucléotidique cible avec une séquence nucléotidique dénommée"trappeur"fixée sur un support solide insoluble, ladite séquence nucléotidique trappeur étant complémentaire d'une partie de la séquence nucléotidique cible, la mise en contact de type" sandwich Il s'effectuant également avec une ou plusieurs autre (s) séquence (s) nucléotidique (s) dont au moins une est marquée, la ou
<Desc/Clms Page number 11>
lesdites séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée)
étant complémentaire (s) d'une autre partie de la séquence nucléotidique cible (une autre partie que celle hybridée par la séquence nucléotidique"trappeur") ; en ce que la séquence nucléotidique trappeur est fixée de manière covalente par une de ses extrémités au support solide ; en ce que la séquence nucléotidique trappeur comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases, de préférence entre 100 et 300 bases, plus particulièrement entre 120 et 250 bases ; et en ce que la partie de la séquence nucléotidique trappeur ne s'hybridant pas avec la séquence nucléotidique complémentaire cible est inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 bases, voire nulle.
De manière avantageuse, la partie de la séquence nucléotidique marquée ne s'hybridant pas avec la séquence complémentaire de la séquence cible est avantageusement inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 bases, voire nulle.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la partie de la séquence nucléotidique cible ne s'hybridant pas avec la séquence nucléotidique trappeur et avec la ou le (s) séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée), est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases, voire nulle.
Dans la suite de la description, la ou les séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée) prendront la dénomination de séquences "helper" lorsque la ou lesdites séquences ne sont pas marquées, et de séquences nucléotidiques"marquées"lorsque celles-ci sont susceptibles d'être reconnues directement ou indirectement par un système de détection et/ou de
<Desc/Clms Page number 12>
quantification, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemoluminescence, l'électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif, la bioluminescence ou un mélange d'entre eux.
Les séquences nucléotidiques"helper"sont utilisées pour stabiliser le"sandwich"et obtenir un recouvrement le plus complet possible de la séquence nucléotidique cible lors de son hybridation sur la séquence nucléotidique marquée et sur la séquence nucléotidique trappeur, ce qui augmente la sensibilité et la spécificité du procédé selon l'invention.
Selon une forme d'exécution particulière de l'invention, dans le cas où la séquence nucléotidique cible est un amplicon résultant d'une amplification génétique, la partie terminale 5'de la séquence nucléotidique cible non recouverte par la ou les séquence (s) marquée (s) et la ou les séquence (s) nucléotidique (s)"helper"est également recouverte par une séquence nucléotidique"primer" (dénommée également "amorce") complémentaire, utilisée pour l'amplification de la séquence nucléotidique cible. Selon l'invention, on
EMI12.1
peut considérer cette séquence nucléotidique"primer" comme étant une séquence de type"helper".
Selon l'invention, il est donc possible d'observer également un recouvrement optimal, voire total, de la séquence nucléotidique cible par la séquence nucléotidique trappeur, la ou les séquence (s) nucléotidique (s) marquée (s), et éventuellement la ou les séquences nucléotidiques"helper".
La présente invention concerne également la trousse de détection et/ou de quantification par hybridation de
<Desc/Clms Page number 13>
type "sandwich" d'une séquence nucléotidique cible comprenant une séquence nucléotidique trappeur fixée sur un support solide insoluble et complémentaire d'une partie de la séquence nucléotidique cible et une ou plusieurs autres séquence (s) nucléotidique (s) (dont au moins une est marquée), la ou lesdites séquence (s) nucléotidique (s) étant complémentaire (s) d'une autre partie de la séquence nucléotidique cible.
Dans la trousse de détection et/ou de quantification, ladite séquence nucléotidique trappeur est fixée de manière covalente par l'une de ses extrémités sur le support solide et comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases, de préférence entre 100 et 300 bases, plus particulièrement entre 120 et 250 bases, et la partie de la séquence nucléotidique trappeur qui ne s'hybride pas avec la partie de la séquence nucléotidique cible est inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 bases, voire nulle.
Il est bien entendu que dans le procédé et la trousse de détection et/ou de quantification selon l'invention, la séquence nucléotidique marquée présente une longueur suffisante pour reconnaître de manière spécifique la séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier, cette spécificité dépendant du type de séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier.
Cette spécificité peut être caractérisée par une reconnaissance par hybridation d'une portion spécifique complémentaire d'au moins 10 bases, de préférence de plus de 20 bases, de la séquence nucléotidique cible.
De préférence, la séquence nucléotidique marquée porte une ou plusieurs molécules chimiques permettant sa détection selon un procédé choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemoluminescence,
<Desc/Clms Page number 14>
l'électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif (telle que la technologie RIA), la bioluminescence ou un mélange d'entre eux.
Selon l'invention, la trousse de détection et/ou de quantification comprendra les réactifs nécessaires pour la détection et la quantification par un propriétaire choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemoluminescence, l'électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif, la bioluminescence ou un mélange d'entre eux.
Selon l'invention, la séquence nucléotidique trappeur est fixée de manière covalente sur le support solide insoluble. Cette fixation se réalise de préférence par l'intermédiaire d'un phosphate 51 terminal sur une ou plusieurs fonctions amines du support solide insoluble par réaction avec du carbodiimide.
Dans le procédé de détection et/ou de quantification, l'hybridation sandwich se réalise de préférence en deux étapes, c'est-à-dire que la première étape consiste en l'hybridation de la séquence nucléotidique cible sur la séquence nucléotidique trappeur, et que la seconde étape est l'hybridation de la séquence nucléotidique cible par une ou plusieurs séquences nucléotidiques dont au moins une est marquée. Les deux étapes sont de préférence séparées par une étape de lavage. Dans le cas où les conditions (TO, concentration en sels, temps de réaction) sont compatibles pour les deux hybridations, celles-ci se réalisent en une seule étape.
Selon l'invention, le support solide est un support solide insoluble choisi parmi le groupe constitué par des tubes, des filtres, des billes, éventuellement
<Desc/Clms Page number 15>
magnétiques, des plaques de multipuits ou un mélange d'entre eux.
Avantageusement, la séquence nucléotidique cible est le résultat d'une amplification préalable par un procédé d'amplification génétique, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la PCR, la LCR, la CPR ou le NASBA.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le procédé de détection comporte également une mise en contact de type sandwich d'une séquence nucléotidique standard dans les mêmes conditions que la séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier, et comporte une étape supplémentaire de quantification du rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard.
De préférence, le procédé de détection et/ou de quantification comporte une étape préalable de préparation d'une quantité connue d'une séquence nucléotidique standard possédant au moins une partie commune à la séquence nucléotidique cible et une partie spécifique dont la séquence est différente de la séquence nucléotidique cible et possède un contenu en base GC/AT proche (c'est-àdire identique à plus de 80%, de préférence plus de 90%), de préférence identique, à la séquence de la partie spécifique de la séquence nucléotidique cible.
En outre, le procédé de détection et/ou de quantification selon l'invention peut comprendre une extraction éventuelle de la séquence nucléotidique cible à quantifier de l'échantillon biologique préalablement à l'étape d'amplification génétique. Cette éventuelle étape d'extraction de la séquence nucléotidique cible peut s'effectuer avant ou après l'addition à l'échantillon
<Desc/Clms Page number 16>
biologique de la séquence nucléotidique standard utilisé pour obtenir une quantification de la séquence nucléotidique cible.
Une mise en contact à la fois de type sandwich des séquences nucléotidiques cibles avec les séquences nucléotidiques trappeurs et avec des séquences nucléotidiques marquées complémentaires soit de la partie spécifique de la séquence nucléotidique cible, soit de la partie spécifique de la séquence nucléotidique standard et une quantification du rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard.
Avantageusement, la trousse de diagnostic comporte également une séquence nucléotidique standard possédant au moins une partie commune à la séquence nucléotidique cible à quantifier et une partie spécifique dont la séquence est différente et possède un contenu en base GC/AT proche (c'est-à-dire identique à plus de 80%, de préférence plus de 90%), de préférence identique, à la partie spécifique de la séquence nucléotidique cible à qunatifier.
Ce procédé de quantification et cette séquence nucléotidique standard sont décrits de manière détaillée dans la demande de brevet belge numéro 09600755 incorporée ici par référence.
Selon l'invention, la séquence nucléotidique cible à détecter et/ou quantifier peut être constituée de tout type d'acides nucléiques, ADN ou ARN. De préférence, les
EMI16.1
séquences nucléotidiques"trappeur","helper", "marquée (s) " et "standard (s) " utilisées selon la présente invention sont constituées d'ADN de manière à éviter toute destruction de ces séquences par des RNase éventuellement présentes dans l'échantillon biologique.
<Desc/Clms Page number 17>
La présente invention sera décrite plus en détails dans les exemples ci-dessous en référence aux figures annexées.
Brève description des figures La figure 1 représente un exemple schématique d'hybridation sandwich selon l'invention.
La figure 2 représente une courbe de concentration d'ADN cible de CMV obtenue après hybridation en sandwich et détection en bioluminescence La figure 3 représente une courbe de concentration de l'ADN cible de Chlamydia obtenue en hybridation en sandwich et mesurée en radioactivité.
La figure 4 représente une courbe de sensibilité d'ADN de Chlamydia trachomatis après amplification par PCR et hybridation sandwich.
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention
La séquence nucléotidique trappeur 5, de préférence une séquence d'ADN, est fixée de manière covalente sur des plaques de multipuits 3. Cette fixation covalente est obtenue par la liaison d'un phosphate situé en position 5' terminale de la séquence du trappeur sur une amine située sur le support en présence de carbodiimide, telle que décrite par Rasmussen et al. (1991, Anal. Biochem. 198, 138-142).
Les séquences nucléotidiques trappeur 5 fixées peuvent hybrider un ADN cible 2, qui sera ensuite hybridé en sandwich par une séquence nucléotidique marquée 6.
<Desc/Clms Page number 18>
Un avantage de l'hybridation en sandwich est un bruit de fond très faible qui permet de réaliser une analyse massive d'échantillons cliniques sans devoir purifier l'ADN extrait.
La quantité de séquences nucléotidiques trappeurs fixées sur les multipuits peut atteindre 1, 2 pmoles pour des petits oligonucléotides, mais en ce qui concerne les séquences nucléotidiques plus grandes, la quantité fixée est moins importante (de l'ordre de 300 fmoles pour des séquences nucléotidiques de 500 bases environ). Une version optimalisée des conditions de fixation sur le support solide de séquences nucléotidiques trappeurs est présentée à l'exemple 1. Cependant, la quantité de séquences nucléotidiques trappeurs fixées est suffisante pour ne pas être limitante dans le procédé d'hybridation de l'invention.
La fixation de la séquence nucléotidique trappeur sur des microbilles permet également d'augmenter le nombre de séquences nucléotidiques trappeur dans la solution de réaction en utilisant une quantité de billes plus importante.
Les séquences nucléotidiques trappeurs selon l'invention choisies sont complémentaires sur toute leur longueur de la séquence nucléotidique cible à détecter.
Ceci permet avantageusement une production aisée de ces séquences nucléotidiques trappeurs par PCR à partir de séquences nucléotidiques cibles clonées dans des plasmides et peuvent ainsi servir à une production industrielle reproductible de ces séquences nucléotidiques trappeurs.
On peut cependant utiliser des trappeurs dont une partie de la séquence nucléotidique comprend une ou des parties de séquences non complémentaires de la séquence du
<Desc/Clms Page number 19>
cible. Les Inventeurs ont testé des séquences nucléotidiques trappeurs possédant une séquence de 20 ou 40 bases non complémentaire de la séquence nucléotidique cible et située en position 5'terminale servant à la fixation sur les multipuits.
Ces séquences servent de"spacers"entre la séquence trappeur proprement dite et le support solide. La séquence portant un"spacer"de 20 bases est plus efficace que les spacers de 40 et 60 bases pour hybrider de petites séquences cibles. Ce résultat est probablement dû aux possibilités supplémentaires de repliement de ces séquences nucléotidiques trappeurs sur elles-mêmes, ce qui diminue, voire inhibe, l'hybridation des séquences nucléotidiques cibles. Ces repliements ont pu être visualisés par l'utilisation des programmes de prédiction des structures secondaires Oligo4 et DNA-fold et ils peuvent effectivement impliquer des portions parfois assez longues de la séquence trappeur.
Ces repliements sont à éviter au maximum, car ils diminuent l'efficacité de l'hybridation, surtout lorsqu'ils impliquent des portions non complémentaires à la séquence cible qui ne peut donc pas les déplacer.
Une autre propriété du procédé et de la trousse de l'invention est l'utilisation avantageuse de séquences nucléotidiques trappeur ayant une taille minimale de 50 bases si possible 100 et au mieux 150 ou plus de bases.
Cette observation est inattendue sur la base de considérations suivantes.
La stabilité des hybrides en solution dépend de divers facteurs, dont l'influence a été étudiée en examinant leur influence sur la température produisant 50% de dissociation de l'hybride (Tm). Plus cette Tm est
<Desc/Clms Page number 20>
élevée, plus les hybrides sont stables. Les facteurs qui influencent cette stabilité sont une force ionique élevée, l'absence ou non d'agents chimiques particuliers comme la formamide et la composition en base (c'est-à-dire le pourcentage de base GC par rapport à AT) et l'absence ou la présence de mésappariements. En l'absence de produits chimiques dans la solution d'hybridation, et lorsque les 2 séquences sont parfaitement complémentaires, les facteurs variables sont la force ionique et la composition en bases.
La formule du Tm est alors : Tm = 81, 5 + 16, 6 log (M) + 0, 41 (% G + C) avec M = la force ionique (Anderson et Young in"Nucleic acid and hybridisation", IRL Press, Hames, B. and Higgins, S. Editeurs, 1985, 73-111, Oxford-Washington DC).
Cette formule est valable pour les fragments au-delà de 50 bases car au-delà de cette taille la stabilité devient maximale (Viscidi, 1988 in"Nucleic acid hybridization assays-DNA probes", Handbook of serodiagnosis in infectious diseases, E. Matthiews R. C. and Burnie J. P. Editeurs, Butterworth Heineman, 106-142).
La stabilité des hybrides, dans le cas où la force ionique est constante et la taille suffisante, ne dépend plus que de la composition (% G + C) et non de la taille des hybrides. L'importance de la taille pour favoriser ou non l'hybridation devrait donc dépendre de la vitesse de l'hybridation. Effectivement en solution, la taille des brins d'acides nucléiques influence la vitesse de réappariement. Celle-ci est proportionnelle à la racine carrée de la longueur (Wetmur, J. G. and Davidson, N. 1968, J. Mol. Biol. 3, 584) et dans le cas où les 2 brins sont de taille différente, la vitesse est proportionnelle à la racine carrée du brin le plus court que ce soit un ADN
<Desc/Clms Page number 21>
(Wetmur, J. G. 1971, Biopolymers 10, 601) ou un ARN (Hutton, J. R. and Wetmur, J. G. 1973, J. Mol.
Biol. 77, 495).
L'autre facteur qui influence la vitesse de l'hybridation est la concentration respective des séquences nucléotidiques cibles et des séquences nucléotidiques trappeurs. La situation dans ce cas est complexe car deux réactions sont possibles : d'une part les séquences nucléotidiques cibles à mesurer étant habituellement double brins dans la solution de départ, vont pouvoir se réassocier entre elles et d'autre part elles vont pouvoir s'hybrider sur la séquence nucléotidique trappeur. Il s'agit donc de deux réactions compétitives, l'une se passant en solution (la réassociation des doubles brins de la séquence nucléotidique cible) et l'autre sur un support solide (l'hybridation sur la séquence nucléotidique trappeur).
On peut considérer tout d'abord la situation où la quantité de séquence nucléotidique trappeur est en excès par rapport à la quantité de séquence nucléotidique cible. On détecte des concentrations de séquence nucléotidique cible de l'ordre du fmole (de 0, 1 à 50 fmoles) alors que la quantité de séquence nucléotidique trappeur peut atteindre 300 fmoles.
Si les 2 réactions compétitives se passaient en solution, la formule cinétique qui exprime la diminution de la concentration en séquence nucléotidique cible simple brin (ADN) en solution (Cs) en fonction du temps est de :
EMI21.1
d (Cs) - = kl [c.] [c. r dans laquelle : k2 : constante cinétique de réassociation de l'ADN
<Desc/Clms Page number 22>
k1 : constante cinétique d'hybridation avec la séquence nucléotidique Cf : concentration de la séquence nucléotidique trappeur.
Comme la réaction s'effectue sur support solide insoluble, il faut tenir compte de la vitesse de diffusion (J) de la séquence nucléotidique cible simple brin vers la surface solide sur laquelle est fixée la séquence nucléotidique trappeur, soit :
EMI22.1
La situation devient très complexe et ne peut être appréhendée dans son ensemble. Anderson et Young (1985) ont essayé de mesurer l'influence de la taille de la séquence nucléotidique cible double brin sur l'hybridation sur filtre en présence d'un excès de séquence nucléotidique fixée et ils concluent"The difference in dependence on molecular weight of the two types of filter hybridization is not understood".
En ce qui concerne l'influence de la taille de la séquence nucléotidique trappeur sur support solide en plastique, les études n'ont pas encore été réalisées et il n'est pas possible d'obtenir une formulation mathématique permettant de prévoir les résultats obtenus avec le procédé de l'invention.
Si on examine cependant les conditions particulières du milieu réactionnel, on constate que la quantité de séquence nucléotidique trappeur (par exemple 300 fmoles) est largement en excès par rapport à la quantité de séquence nucléotidique cible (par exemple 10 fmoles). Si on considère que cet excès permet de compenser les
<Desc/Clms Page number 23>
limitations dues à la diffusion, on se retrouve dans une situation proche de la réaction en solution où la vitesse d'hybridation devrait être proportionnelle à la racine carrée de la longueur des séquences.
En choisissant une séquence nucléotidique trappeur de 360 bases au lieu de 180 bases, on observe le déplacement d'un rendement de 30% à 50% soit une augmentation de 1, 67 fois. Même en se basant sur un effet de taille en solution c'est-à-dire à une vitesse dépendant de la racine carrée de la longueur, on aurait dû s'attendre à une augmentation maximale de 1,4 fois. En outre, un rendement de 50% n'a jamais été décrit à ce jour dans la littérature scientifique.
En comparant les rendements de l'hybridation en fonction de petites séquences nucléotidiques trappeurs allant de 50, 100, 150 et 250 bases, on constate (en prenant l'hybridation sur la séquence nucléotidique trappeur de 50 bases comme référence), une augmentation de rendement de 4,6 et 17 fois alors que les racines carrées de ces séquences sont dans un rapport respectif de 1,4, 1,7 et 2, 2 fois.
On constate donc un effet inattendu de la longueur de ces séquences nucléotidiques trappeurs sur l'augmentation du rendement de l'hybridation.
Une application particulière de ces hauts rendements d'hybridation de l'ADN cible sur support insoluble est son utilisation pour purifier un des deux brins de cet ADN cible. En effet le trappeur est constitué d'un seul brin car on utilise lors de sa construction par PCR une seule amorce phosphorylée en position 5'terminale. Ce phosphate est le seul à pouvoir réagir sur le support aminé. Après fixation, on lave la plaque en présence de Na OH 0,4 N
<Desc/Clms Page number 24>
(cfr. exemple 1) afin d'enlever le deuxième brin. On se retrouve donc avec un seul brin fixé sur le support. Ce brin étant complémentaire d'un seul des deux brins d'ADN cible, il va fixer ce brin. Après lavage, ce brin hybridé peut être déhybridé facilement par exemple par chauffage ou par du NaOH 0, 4 N. On obtient ainsi dans la solution un brin unique d'ADN.
Cette technique peut être utilisée sur une grande échelle par exemple en utilisant des billes sur lesquelles sont fixées les séquences nucléotidiques trappeurs. Cette préparation de brin simple peut avoir de multiples applications comme réactifs en utilisant un brin marqué chimiquement par exemple.
La détection de séquences cibles non marquées est réalisée en réalisant leur hybridation sur des séquences nucléotidiques trappeurs fixées sur un support insoluble en utilisant une ou plusieurs séquences nucléotidiques dont au moins une est marquée (séquences nucléotidiques de détection) qui peuvent s'hybrider sur la partie de la séquence nucléotidique cible non reconnue par la séquence nucléotidique trappeur. Celle-ci peut être marquée chimiquement et détectée suivant les diverses méthodes connues de l'homme de l'art. Il est possible d'obtenir une fixation de 80% au moins de la séquence nucléotidique de détection par rapport à la séquence nucléotidique cible hybridée sur la séquence nucléotidique trappeur.
En examinant l'influence de la longueur de cette séquence nucléotidique marquée sur l'efficacité de l'hybridation sandwich, on constate l'importance d'utiliser une séquence nucléotidique marquée qui recouvre le plus possible la séquence nucléotidique cible. Les meilleurs rendements sont obtenus lorsque la séquence nucléotidique cible est recouverte entièrement d'une part
<Desc/Clms Page number 25>
par la séquence nucléotidique trappeur et d'autre part par la séquence nucléotidique de détection (figure 1).
Dans le cas de la détection d'amplicons obtenus par PCR, on peut laisser du côté 5'terminal de la séquence nucléotidique cible une séquence non recouverte par la séquence nucléotidique de détection mais qui pourra être reconnue par les amorces toujours présentes dans la solution de la PCR. De cette manière l'ensemble de la séquence nucléotidique cible est recouvert lors de l'hybridation et il n'y a pas d'interférence entre les amorces et la séquence nucléotidique pendant l'hybridation.
L'efficacité accrue obtenue par cette procédure peut probablement s'expliquer de la manière suivante. Lorsque l'on réalise l'hybridation en une seule étape, la séquence nucléotidique cible dissociée en simple brin se retrouve dans la solution en présence de son brin de séquence nucléotidique cible complémentaire mais aussi de la séquence nucléotidique de détection (et éventuellement des amorces) et sur le support de la séquence nucléotidique trappeur. La séquence nucléotidique cible peut soit d'abord réagir avec la séquence nucléotidique de détection avant de venir se fixer sur le trappeur, soit se fixer sur le trappeur avant de fixer la séquence nucléotidique de détection. Dans les 2 cas, l'utilisation de grandes séquences nucléotidiques va favoriser la vitesse de réaction ainsi que la stabilité des hybrides formés.
Cependant dans cet état intermédiaire, la séquence nucléotidique cible possède une partie de sa séquence non appariée qui peut alors être reconnue par une séquence nucléotidique cible complémentaire qui pourra redéplacer l'hybride intermédiaire et refaire une séquence
<Desc/Clms Page number 26>
nucléotidique cible double brin. Par contre lorsque la séquence nucléotidique cible sera hybridée et recouverte complètement par la séquence nucléotidique trappeur et par la séquence nucléotidique de détection sans avoir aucun (ou trop peu) de séquence libre, l'appariement (annealing) d'un autre brin de la séquence nucléotidique cible complémentaire ne pourra plus avoir lieu et l'hybride sandwich sera stable.
Dans le cas où la séquence nucléotidique cible même après hybridation sandwich garde une séquence libre, celle-ci pourra toujours servir de site d'appariement pour l'autre brin de la séquence nucléotidique cible complémentaire, ce qui déstabilisera l'hybride et pourra même le dissocier en fonction des conditions expérimentales (T, sels,...), car une fois l'appariement commencé, la propagation de la formation du double brin est très rapide et thermodynamiquement favorable.
Cette optimalisation des divers paramètres et composés intervenant dans cette hybridation sandwich permet de réaliser cette hybridation sandwich à la fois avec une séquence nucléotidique marquée présente dans la solution et une séquence nucléotidique trappeur fixée sur un support insoluble en même temps alors que si ce n'est pas le cas, il faut d'abord réaliser une hybridation en solution avant de faire la capture sur une séquence nucléotidique immobilisée comme décrit par Ghost et al.
(EP. 557456) ou par un système plus complexe d'hybridation sandwich en solution puis capture par un récepteur fixé sur un support solide (Miller, US : 5, 374, 524).
Une autre caractéristique du procédé d'hybridation sandwich selon l'invention est que non seulement la séquence cible peut être entièrement recouverte par la
<Desc/Clms Page number 27>
séquence nucléotidique trappeur et la séquence nucléotidique marquée, mais que la séqeunce trappeur peut être entièrement recouverte par la séquence cible. Ceci permet donc d'utiliser comme séquence nucléotidique marquée des grandes séquences nucléotidiques doubles brins produites par exemple facilement par une amplification en PCR en présence de dUTP-biotine. En effet une fois l'un de ces brins biotinylés appariés avec la séquence nucléotidique cible, il sera totalement recouvert et ne pourra plus être redéplacé par son brin complémentaire, ce qui n'est pas le cas dans ces travaux rapportés par Keller et al. (1989, Anal. Bioch. 177, 27-32).
Cette invention permet donc une production facile en très grande quantité d'une part des séquences nucléotidiques trappeur en utilisant une amorce portant un phosphate en 5'terminal qui permettra la fixation covalente d'un seul de ces brins sur les microplaques aminées et d'autre part des séquences nucléotidiques marquées. Si les séquences marquées sont petites, de 20-30 ou 40 bases, elles seront synthétisées chimiquement et seront simples brins. Si elles sont plus grandes, on peut les produire par amplification.
Le dépassement de la séquence nucléotidique cible en dehors de la partie hybridée sur le capteur et la séquence nucléotidique de détection par son extrémité 5'terminale entraînait une diminution du rendement d'hybridation si cette partie non recouverte devenait importante. C'est aussi le cas si la partie 3'terminale n'est pas recouverte. En choisissant des conditions de réaction optimales, une séquence nucléotidique cible de 20 bases se fixe sur une séquence nucléotidique trappeur de 20 bases qui lui est complémentaire avec un rendement qui peut être 25 fois supérieur par rapport à une séquence qui possède
<Desc/Clms Page number 28>
les mêmes 20 nucléotides mais qui a en outre 20 autres nucléotides supplémentaires du côté 3'terminal.
On voit donc une différence d'efficacité de 25 fois entre ces 2 séquences du fait de la présence d'un morceau de la séquence non hybridée du côté 3'. L'explication d'un tel effet est sans doute due à un effet d'encombrement stérique de cette séquence libre située près du support. Cet effet inattendu peut être utilisé afin de pouvoir mesurer des petites séquences de nucléotides en présence de séquences plus grandes c'est le cas dans des méthodes d'amplifications comme la CPR où le produit de la réaction à mesurer est une petite séquence provenant d'une séquence nucléotidique de départ plus grande.
Exemple 1 : Fixation par liaison covalente des sondes trappeurs sur multipuits pour le dosage de Chlamydia trachomatis
La fixation de sondes nucléotidiques sur des multipuits se réalise par la formation d'un lien covalent entre le phosphate 5'de la sonde et un groupement amine présent sur le plastique en présence de carbodiimide. Les amplicons sont préparés à partir d'amorces dont l'une est phosphorylée à son extrémité 5'terminale.
La séquence nucléotidique est d'abord amplifiée par
EMI28.1
PCR en utilisant les amorces suivantes : Cl : 5'GAATTCTTAAGTTCGGTCGG3' C, : 5'CGCGTTCATATTCGATATGC3'
Ces deux amorces sont spécifiques du plasmide de Chlamydia trachomatis et amplifient une séquence de 288 paires de base. La première amorce est phosphorylée à son extrémité 5'.
<Desc/Clms Page number 29>
EMI29.1
Les amplicons sont dénaturés par chauffage à 100 C pendant 10 minutes, puis refroidis à 0 C. Les plaques multipuits Covalink NH (Nunk, Danemark) portant en surface une fonction amine secondaire sont utilisées pour le couplage. Dans certains exemples, on utilise des plaques de polystyrène fonctionnalisées par greffage d'amines comme décrit par Zammatteo et al. (Anal. Biochem. 236, pp.
85-94 (1996) ). Dans chaque puits est ajouté 530 fmoles d'amplicons phosphorylés dans 0,1 ml de solution contenant du tampon 1-méthylimidazole 10 mM pH 7,5 et du 1-éthyle-3 (3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide 0,025 M (Sigma, St Louis, Mi). Les plaques sont incubées 5 heures à 50 C et puis sont lavées 6 fois avec du NaOH 0,4 M contenant du Tween 20 à 0, 25%. Dans ces conditions, le pourcentage de fixation des amplicons est de 49% pour la séquence définie ci-dessus.
Exemple 2 : Influence de la longueur du trappeur pour une hybridation simple d'un ADN cible de HPV-18
L'expérience a été réalisée sur des amplicons de 586 paires de base correspondant à une séquence de HPV-18
EMI29.2
située en position 6193 à 6779 de l'ADN viral. Cette séquence a été amplifiée par les amorces suivantes : 1 = 5'TTTTGGAAGATGGTGATATGG 3' 2 = S'CATAACATCTGCAGTTAAAGT 3'
L'hybridation a été réalisée à partir de ces amplicons marqués à l'extrémité 5'terminale par l'intermédiaire de la T4 polynucléotide kinase en présence de [yATP-au"P].
Deux types de trappeurs ont été utilisés, correspondant à 180 et 360 bases complémentaires de la séquence des amplicons. Les hybridations ont été réalisées
<Desc/Clms Page number 30>
en présence de concentrations croissantes d'amplicons de cible à 45 oc pendant 20 heures dans une solution constituée de SSC 2x concentré, de Denhart 5x concentré, de DNA de sperme de saumon dénaturé à 0,1 mg/ml.
Des concentrations des amplicons allant de 0,13 à 13 fmoles ont été testées, et la quantité fixée a été mesurée en radioactivité. Rapporté en pourcentage d'ADN fixé, ceci représente 30% sur le trappeur de 180 bases et 50% sur le trappeur de 360 bases quelles que soient les concentrations en cible testées.
Le fait que ce pourcentage soit stable entre 0,13 et 13 fmoles indique également que la quantité de trappeur n'est pas limitante.
Exemple 3 : Effet de la longueur du trappeur sur une hybridation simple d'un ADN cible de CMV
L'expérience a été réalisée pour une hybridation d'amplicons de 437 paires de base correspondant à une séquence de CMV en position.....
Cette séquence a été amplifiée par les amorces suivantes : MIE4 : sens : 5'TGGCCAAGCGGCCTCTGATAACC MIE5 : antisens : 51 CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG comme décrit par Demmler et al. (J. Infect. Dis., 158, pp ; 1177-1184 (1988) ) et marquées au 32p en utilisant lors de l'amplification par PCR des cDTP marqués au 32p. Les trappeurs de 50,100, 150 et 250 bases ont été produits par PCR et correspondent à la partie 3'terminale des amplicons.
L'hybridation a été réalisée à 60 oc pendant 2 heures dans une solution de SSC 2x concentré et de Denhart 5x concentré en présence de 0,1 mg/ml d'aADN de sperme de
<Desc/Clms Page number 31>
saumon. Une quantité de 10 fmoles d'amplicons 32p a été ajoutée à chaque puits. Après réaction, les puits ont été découplés et la radioactivité mesurée. Les résultats montrent que pour les trappeurs de 50,100, 150 et 250 bases, on obtient respectivement 0,09 ; 0,035 ; 0,53 et 1, 55 fmoles de séquence cible hybridée. On observe bien un effet spectaculaire de la longueur du trappeur sur l'hybridation.
Exemple 4 : Influence de la longueur du trappeur pour une
EMI31.1
hybridation en sandwich dfun ADN cible de HPV-18
L'expérience a été réalisée pour l'hybridation d'amplicons de 586 paires de base correspondant à une séquence de HPV-18 située en position 6193 à 6779 de l'ADN viral. Cette séquence a été amplifiée par les amorces décrites à l'exemple 2.
Trois types de trappeurs ont été utilisés, correspondant à une séquence de 25,180 et 360 bases complémentaires de la séquence des amplicons.
Les divers trappeurs reconnaissant la partie des amplicons situés du côté 3'terminale. Les sondes comprenaient soit 360 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 180 bases, soit 180 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 360 bases, soit 21 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 25 bases. Elles ont été marquées au 32p par phosphorylation en position 5' terminale par la T4 kinase en présence de [32p] ATP. Elles correspondaient à l'extrémité 5'terminale de la séquence cible. Les sondes de 21 bases étaient simple brin, alors que les sondes de 180 et 360 bases étaient double brin. Les hybridations en sandwich ont été optimalisées en ce qui concerne la température, la concentration en sels et
<Desc/Clms Page number 32>
la concentration en amplicons.
En ce qui concerne le trappeur de 25 bases, l'hybridation réalisée à 45 C en présence de 2,5 fmoles d'amplicons pendant 2 heures dans une solution de SSC 2x concentrée puis après lavage incubé pendant 2 heures avec 15 fmoles de sonde marquée au 32p. On obtient une fixation de 0,280 fmoles avec un coefficient de variation de 80%. L'hybridation sur les trappeurs de 180 et 360 bases s'est faite en une seule étape et dans les conditions suivantes : les amplicons ont été ajoutés respectivement à raison de 2,5 fmoles en présence de 15 fmoles de sonde marquée. L'hybridation s'est déroulée pendant 20 heures d'une solution SSC 2x concentrée à 45 C. La quantité de sonde marquée hybridée est de 0,54 fmoles pour le trappeur de 180 bases et de 0,69 fmoles pour le trappeur de 360 bases.
La différence de fixation de la sonde était due à un rendement plus élevé de l'hybridation de la séquence cible sur le grand trappeur (cf. exemple 2).
En effet, si l'on rapporte la fixation de la sonde marquée par rapport à la quantité de séquence cible trappée, on obtient dans les deux cas un rapport de 0,8. Ceci signifie que 80% des séquences cibles hybridées sur la séquence capteur ont fixé les séquences marquées. On constate donc dans cet exemple qu'il est possible d'utiliser des sondes de détection marquées, même double brin, et d'obtenir un très bon rendement de leur hybridation (80%).
Le facteur limitant pour la formation du sandwich dans ces conditions est alors la longueur de la sonde capteur.
<Desc/Clms Page number 33>
EMI33.1
ExemDle 5 : Intluence du recouvrement de la sequence nucléotidique cible par l'ADN trappeur et l'ADN sonde pour le rendement de l'hybridation (exemple de Mycobactérie tuberculosis)
Dans cet exemple, l'ADN extrait de Mycobactérie tuberculosis a été amplifié par sa séquence Mt 308 en utilisant les amorces suivantes : T2MT3' (amorce 5'-3') :
GTCGACACGCCTCTGCACGGAAGTCCTT DMT3' (amorce antisens 5'-3') :
GCTCGACTTCTGGTCACGACGTCCGTCGAA
Ces amorces ont été utilisées par Thierry et al.
(Mol. Cell. Probes, 6, p. 181 (1992) ), et permettent l'amplification d'un fragment de 279 paires de base.
Le trappeur a été obtenu en utilisant la sonde T2MT3' phosphorylée en position 5'et une amorce antisens SMT5' : GGGCATCCGCGAGTTGAAGACCTGAAGTGG.
Ces deux amorces permettent la production d'amplicons de 144 paires de base, dont l'un des deux brins possède un phosphate en 5'. Celui-ci a servi à fixer le trappeur par un brin covalent sur l'amine des multipuits comme expliqué à l'exemple 1.
Deux sondes marquées ont été réalisées, l'une de 135 paires de base obtenue par l'utilisation d'une amorce antisens GSMT5'portant une biotine :
TCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCCTTGGG et l'autre par l'amorce antisens DMT3'. L'autre sonde était simple brin et portait également une biotine :
5'CAGCCACCAAGTCGAGCACTTTGCGGCGGAACTACTCGGG-biotine 3'
L'hybridation sandwich a été réalisée en ajoutant dans chaque puits 54 fmoles d'ADN cible amplifié par PCR en présence de 50 ng de sonde de 40 bases et de 25 ng pour
<Desc/Clms Page number 34>
la séquence de 135 bases. L'hybridation a été effectuée pendant 2 heures à 60 OC.
Après lavage, le conjugué streptavidine-kinase a été ajouté et après 45 minutes d'incubation, l'activité de la kinase a été dosée en bioluminescence comme décrit dans la demande de brevet W094/06933.
La lecture est faite pendant une heure. On obtient après soustraction du blanc une valeur de 1,5 million de RLU (Relative Light Unit) pour la sonde de 40 bases et de 2,7 millions de RLU pour la sonde de 135 bases.
Dans cet exemple, la sonde de 135 bases était double brin et mise en quantité plus faible. Malgré ces deux conditions défavorables, le signal obtenu est presque deux fois supérieur, ce qui indique bien l'importance de réaliser une grande sonde de détection qui recouvre l'entièreté de la séquence cible.
Exemple 6 : Courbe de concentrations en amplicons de CMV après hybridation sandwich
Les amplicons provenant de l'ADN de CMV ont été obtenus à partir d'une PCR réalisée avec les amorces MIE4 et MIME5 décrites dans l'exemple 3. Elles permettent d'obtenir des amplicons de 437 paires de bases. Les amplicons ont servi pour réaliser la courbe d'hybridation sandwich décrite ci-dessous. Celle-ci a été réalisée sur des plaques multipuits sur lesquelles étaient fixés des trappeurs complémentaires à cette séquence cible et une sonde biotinylée de 185 bases produite également par PCR. La taille du trappeur était de 257 bases.
Ils ont été produits à partir d'une PCR utilisant des amorces MIE4 décrites à l'exemple 3 et MEI-6 dont la séquence était :
GTACAGGGGACTCTGGGGGTGAC
<Desc/Clms Page number 35>
Le trappeur une fois produit est purifiée sur spin colonne G25.
La fixation covalente du trappeur sur le polystyrène se fait comme suit : chaque puits contenant 100 ng de trappeur dénaturé, MIEM 0.01 M pH 7,5, carbodiimide 0,2 M.
Ces puits sont incubés 5 heures à 50 OC. Après incubation, deux lavages avec 200 gl de NaOH 0,2 N, un lavage à l'eau et un séchage sont réalisés. Pour l'hybridation, les puits sont dénaturés avec 200 lil de NaOH 0,2 N et rincés avec 200 pl de SSC 2x.
Le volume total d'hybridation par puits est de 110 pl, contenant : - 50 #l de tampon d'hybridation : SSC 4.4x, Denhart 10x,
ADN de sperme de saumon 200 g/ml dénaturé 10 minutes à 100 C ;
EMI35.1
- 10 J, Ll de sonde biotinylée à une concentration de 900 pg/10 gl dénaturée 10 minutes à 100 C ; - 50 1 d'ADN cible amplifié par PCR en utilisant deux amorces MIE4 et MIE5 décrites à l'exemple 3, non purifié et dénaturé 10 minutes à 100 C. Les quantités testées vont de 3,5 attomoles à 3500 attomoles.
L'hybridation dure 2 heures à 70 C.
Après hybridation, les puits sont lavés deux fois avec 200 gl de SSC O, lx puis avec 200 #l de tampon maléate 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,3% pH 7,5 durant 15 minutes.
Après rinçage avec 200 gl de tampon maléate 100 mM pH 7,5 contenant NaCl 150 mM et du blocking reagent 1%, 100 gl de streptavidine-kinase sont ajoutés. Les puits sont rincés avec 400 Ml de tampon maléate 100 mM pH 7,5 contenant NaCl 150 mM, Tween 0, 3% pendant 10 minutes puis 3 fois 5 minutes avec 200 pl de tampon maléate 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,3% pH 7,5.
<Desc/Clms Page number 36>
L'activité de la kinase est révélée dans du Tris buffer 20 mM pH 7,75 contenant du DTT 60 MM, EDTA 100 MM, MgCl2 5 mM, Luciferine 8 MM, luciferase 6 mU par puits KCl 20 mM, Phosphoenolpyruvate 1 mM et ADP 3,2 MM. L'émission de lumière est suivie pendant une heure avec un luminomètre (Luminoskan, Labsystem, Finlande) et les résultats sont exprimés en RLU. min (Figure 2).
Exemple 7 : Courbe de concentration en amplicons des Chlamydia trachomatis après hybridation sandwich
Les amplicons provenant de l'ADN de Chlamydia trachomatis ont été obtenus en utilisant les amorces suivantes : sens : 5'GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGT 3' antisens : 51 GAATTCTTAAGTTCGGTCGG.
Cette amplification permet d'obtenir des amplicons cibles de 415 paires de base. Ces amplicons ont été utilisés afin de réaliser une courbe de concentration en hybridation sandwich sur des trappeurs fixés sur plaques multipuits.
Les trappeurs sont issus d'une PCR utilisant les primers GAATTCAAATGGTCTGAGAATAGT phosphorylé en 5'et TTTTCAACAAAAATTCGTCGA produisant des amplicons de taille de 288 bases. Le trappeur une fois produit est purifié sur spin colonne G25.
La fixation covalente du trappeur sur polystyrène se fait comme suit : chaque puits contenant 100 ng de trappeur dénaturé, MEIM 0,01 M, pH 7,5, carbodiimide 0,2 M. Ces puits sont incubés 5 heures à 50 OC. Après incubation, deux lavages avec 200 l de NaOH 0,2 N, un lavage à l'eau et un séchage sont réalisés. Pour
<Desc/Clms Page number 37>
l'hybridation, les puits sont dénaturés avec 200 lil de NaOH 0,2 N et rincés avec 200 pl de SSC 2x.
Le volume total d'hybridation par puits est de 110
EMI37.1
gl, contenant SSC 2x, Denhart 5x, de l'ADN de sperme de saumon 100 gag/1, 11 fentomoles de sonde marquée au P32 de 124 bases qui correspondent à la partie 5'terminale de la cible et différentes quantités d'ADN cible. sens 5'GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGT3' antisens 5'GAATTCTTAAGTTCGGTCGG allant de 1 pg à 5000 pg par puits.
L'hybridation se déroule à 45 oc pendant 15 heures.
Après hybridation, un lavage avec 200 pl de SSC O, lx est réalisé pendant 5 minutes puis la radioactivité contenue dans les puis est comptée (Figure 3).
EMI37.2
ExemDle 8 : Courbe de concentration en Mycobactérie tuberculosis après hybridation sandwich
Une courbe de concentration en ADN de Mycobactérie tuberculosis a été réalisée sur des amplicons obtenus après amplification par PCR à l'aide des amorces T2MT3'et DMT3'décrites dans l'exemple 5. Ces amplicons avaient une taille de 279 paires de base. Le trappeur était constitué des 144 premières bases de cette séquence alors que la sonde marquée était constituée des 135 dernières bases.
Leur production est décrite à l'exemple 5. Les inventeurs ont utilisé une sonde marquée par incorporation de dUTPbiotine, ce qui permet d'avoir une sonde portant plusieurs biotines.
Une courbe de concentration en amplicons a été réalisée et la détection réalis e en utilisant des concentrations de 1, 5, 4 et 54 fmoles d'amplicons en bioluminescence à l'aide d'un conjugué streptavidinekinase. Les résultats de ces dosages ont donné que une
<Desc/Clms Page number 38>
EMI38.1
émission de lumière mesurée en 1 h respectivement de 2, 5 - 3, 5 et 8, 8 de RLU. On obtient une courbe de dosage dans cette zone de concentration en amplicons. cette zone de concentration en amplicons.
Exemple 9 : Courbe de concentration en licons de HPV-18 après hybridation sandwich
Les amplicons ont été obtenus par les amorces 1 et 2 décrites à l'exemple 2. Elles permettent la formation après PCR d'amplicons de 586 paires de base de HPV-18.
Les trappeurs correspondent aux 180 bases de ces amplicons situées du côté 3'terminal des amplicons.
Des trappeurs de 180 bases ont été fixés de manière covalente sur les micropuits. Ces trappeurs reconnaissent
EMI38.2
les amplicons du côté 3'terminal. Les sondes de 380 bases étaient situées du côté 5'terminal des amplicons. Une petite séquence de 26 bases reste libre à l'extrémité des amplicons après hybridation.
Dans cette expérience, des quantités croissantes d'amplicons cibles de 50,500 et 5000 pg sont incubés pendant 20 heures à 45 C dans une solution SSC 2x concentrée en présence de 15 fmoles de sonde biotinylée.
Après hybridation et lavage, un conjugué streptavidineperoxydase est ajouté et son activité mesurée en chemoluminescence.
On obtient pour les trois concentrations d'amplicons cibles une valeur relative de lumière (RLU) respectivement de 171,941 et 2354 RLU. Les valeurs des blancs obtenues en utilisant une séquence non spécifique ont été enlevées des tests.
<Desc/Clms Page number 39>
EMI39.1
Exemple 10 : Mesure du nombre de copies d'ADN de Chlamydia trachomatis après PCR et hybridation sandwich
Des quantités croissantes d'ADN de Chlamydia trachomatis cloné dans un plasmide sont utilisées pour une PCR. Celle-ci est réalisée en présence de Polymérase Amplitaq Gold (Perkin Elmer) dans 100 pl de tampon comprenant du MgC12 2 mM, les divers dNTP à 200 MM et les amorces à MM. Ces amorces sont celles décrites à l'exemple 7.
Après 45 cycles de PCR comprenant 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 600C et 30 secondes à 72 C, la PCR est laissée 10 minutes à 72 C.
Un échantillon de 20 l est alors placé dans les puits contenant le trappeur et une sonde biotinylée comme ceux décrits à l'exemple 7 et l'hybridation se réalise pour 2 heures à 65 C. Après cette hybridation, les puits sont lavés 4 fois avec une solution contenant du tampon Maléate 100 mM pH 7,5 et 150 mM NaCl et 0,3 % de Tween 20.
Un conjugué streptavidine-peroxydase dilué 2 000 fois dans le même tampon contenant du lait en poudre à 0,1 % est incubé 45 minutes à 20 C. Les puits sont alors lavés 4 fois comme précédemment et l'activité de la peroxydase mesurée pr la formation d'un produit coloré en présence de son substrat TMB et H202. La D. O. du produit formé est mesuré à 450 nM (Figure 4).
Exemple 11 : Hybridation différentielle d'un petit et d'un long brin d'ADN ayant une partie de sa séquence identique
Lors de certaines amplifications comme la CPR, les sondes de départ marquées sont grandes et sont coupées en deux morceaux qu'il faut pouvoir détecter et mesurer. Le problème est donc de pouvoir mesurer par hybridation une petite sonde en présence de sa séquence mère qui est plus
<Desc/Clms Page number 40>
grande. Les inventeurs ont choisi dans cet exemple une séquence mère (OL1) biotinylée de 40 bases qui ont la séquence suivante : 5'CCGCGACTATCCCTCTGTCCTCAGTAATTGTGGCTGAGAA 3'
Cette séquence correspond à une séquence spécifique du génome de CMV située sur le"Major Immédiate Early Gene" (Akrigg et al., Virus Res. 2, p. 107).
Les inventeurs ont voulu détecter une sonde biotinylée (OL2) correspondant aux 20 premières bases de cette sonde en présence de la séquence mère (OL1). Le trappeur était constitué d'un oligonucléotide de 20 bases complémentaires à la sonde OL2 et terminée par un groupement phosphate en 5'. Ce trappeur a été fixé sur les multipuits aminés par réaction covalente.
Dans l'expérience suivante, 100 fmoles de deux des séquences biotinylées OL1 ou OL2 ont été incubés pendant 2 heures à 45 C dans une solution de SSC 0, 5x concentrée (soit 75 mM NaCl et 7,5 mM de nitrate de Na). Après l'hybridation, les puits ont été lavés par une solution de SSC 0, lx concentré à 45 OC. Après quatre lavages, les puits sont incubés avec le conjugué streptavidine-kinase et sa fixation est estimée par la mesure de l'activité kinase en bioluminescence. Dans ces conditions, les puits ayant le grand fragment (OLA) montraient une RLU x min de 9 alors que les petits fragments montraient une RLU x min de 210.
La présence sur OL1 d'une séquence de 20 nucléotides supplémentaires sur OL1 situés du côté 5'par rapport à OL2, c'est-à-dire du côté du plastique, déstabilise donc fortement l'hybridation de cette sonde sur le trappeur.
<Desc / Clms Page number 1>
DIAGNOSTIC AND / OR QUANTIFICATION PROCESS AND KIT
BY SANDWICH-TYPE HYBRIDIZATION OF ACID SEQUENCES
NUCLEIOUES ON SOLID SUPPORT Object of the invention
The present invention relates to a method and a kit comprising reagents for the detection and / or quantification by sandwich-type hybridization of nucleic acid sequences on a solid support.
Technological background underlying the invention
It is known to fix DNA covalently on a support and to use it as a sensor nucleotide sequence to fix a target nucleotide sequence and be able to detect it directly if it is attached to a detectable chemical molecule. In the case where the target nucleotide sequence to be identified is not marked, a “sandwich” type hybridization can be carried out using a marked nucleotide sequence which will be fixed on the target nucleotide sequence.
This labeled nucleotide sequence will itself not be immobilized unless the target nucleotide sequence is present and immobilized on the trapping nucleotide sequence. The target nucleotide sequence is therefore sandwiched between the trapper nucleotide sequence and the
<Desc / Clms Page number 2>
tagged nucleotide sequence, which requires double recognition, and therefore increases specificity, reduces background, and also allows quantification of the target nucleotide sequence. This is only possible if the hybridization is carried out quantitatively and reproducibly. This is all the more true as the yield from this hybridization is high.
The advantage of such quantitative hybridization is the measurement of nucleic acids originating from "biological agents", pathogenic or not, such as viruses, fungi, bacteria, mycoplasmas, animal or plant cells or tissues. Very often, these quantities of nucleic acids cannot be measured because of their very low concentration in biological samples. Therefore, an amplification step of the target nucleotide sequence is used, such as PCR (Polymerase Chain Reaction (US Patent 4965188), LCR (Landegren et al., 1988, Science, 241.1077-1080), NASBA (Kievits et al. 1991, J. Virol. Methods 35.273-286) or the CPR (Cycling Probe Reaction (WO Patent 95/14106).
However, the detection of these amplified sequences hereinafter called amplicons requires carrying out a specific sensitive detection which is easily adapted to a large number of samples if it is wished to be able to use these methods as routine tests in particular in the context of medical diagnostics or veterinarians.
A first solution consists in using beads to carry out this sandwich hybridization, as described in patent application EP-0205532, where Sephacryl beads from 5 to 50 m are activated by diazotasion of aromatic amines. The use of multi-well plates is also a good solution because they
<Desc / Clms Page number 3>
already serve as the basis for many tests, in particular the ELISAs and many reading devices in photometry, fluorescence, luminescence already exist for reading these plates. If these supports are to be used for detection, it is necessary to be able to immobilize the target nucleotide sequences on these plates in order to be able to detect and / or quantify them.
This fixation can be obtained by simple adsorption on the microwells, that is to say by non-covalent reaction. Several studies have been carried out in this way which effectively make it possible to measure amplicons present in solution (Dahlem et al. 1987, Mol.
Cell. Probes 1.159-168; Cross et al. 1992, The Lancet 340.870-873; Allibert et al., EP 486661). However, these methods suffer from drawbacks, namely a lack of control of the adsorption process (which requires working with very large fragments, often whole plasmids, to avoid this problem, and which leads to the use of double trappers strands that can reassociate quickly) and the difficulty of rationally optimizing the size and the trapping nucleotide sequence due to the hazards linked to adsorption. The fixing of these trappers by covalent links makes it possible to respond to these problems.
In various documents of the state of the art, we have sought to optimize the length of a single-stranded sequence that can serve as a trapper for a target sequence or attempted to characterize the length of the target sequence necessary to be detected in the best conditions .
In the document "J. Of Clin. Microbiol", vol. 28, June 1990, pp. 1469-1472, Inouye and Hondo et al. describe
<Desc / Clms Page number 4>
a method of direct hybridization on sequences fixed on microplates of DNA segments of different lengths. This hybridization takes place on DNA trapping segments non-covalently adsorbed on these microplates. Trappers of different lengths are adsorbed and hybridized with a biotinylated sequence of 642 base pairs. The authors observe with the different sequences the same hybridization curve, but an increasing hybridization efficiency as a function of the size of the fragments. Based on this experiment, the authors concluded that it is preferable that the target sequence to be identified has a length of more than 300 base pairs.
As noted by the authors, the adsorption of DNA takes place over very long lengths, which makes it impossible to know the lengths available for effective hybridization. This problem will be found in all works using the adsorption of trapping probes on plastic.
EMI4.1
In the document "Analytical Biochem.", No. 177, pp.
27-32 (1989), the authors Keller et al. describe a sandwich hybridization method using as trapper sequence a fragment of 3300 base pairs used for the detection of a target sequence of 190 base pairs which is also complementary to another labeled sequence, the single strand trapper sequence being fixed by an NH2 function covalently to a solid support. As it appears in FIG. 2 of this document, there is only a very partial overlap of the trapper sequence as well as of the sequence marked by the target sequence.
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
In the publication "Clin. Chem.", No. 31, pp. 1438-1443 (1985), the authors Polsky-Cynkin et al. describe a method in which the trapper sequence comprises 4800 base pairs of which 800 base pairs are complementary to the target sequence of 1600 base pairs to be detected. As it appears in FIG. 1 of this document, the target sequence is also complementary to another nucleotide sequence labeled so as to obtain a hybridization of the sandwich type.
Japanese patent application JP-8089300 in the name of Mitsui describes a trapper sequence having a length of less than 30,000 base pairs and comprising at least 10 repeating units of 100 base pairs capable of hybridizing in series in the same orientation with target sequences to be detected. This method increases the sensitivity of traditional methods.
Patent application EP-0079139 in the name of Orion Corp. describes a single strand trapper sequence of 1200 base pairs or 1500 base pairs hybridizing with target sequences of 600 or 700 base pairs capable of being detected by sandwich hybridization using another labeled sequence and complementary to another portion of the target sequence.
However, in all of these hybridization devices based on a simple hybridization or a sandwich hybridization, there is a poor recovery of the trapper sequence by the target sequence, as well as a poor recovery of the target sequence by the trapper sequence and / or the marked sequence. So when you use very long sequences for detection or very long target sequences for detection,
<Desc / Clms Page number 6>
there are risks of folding the sequences back onto themselves or possibly with other “parasitic” sequences present in the sample (for example sequences complementary to an amplicon sequence resulting from a PCR which one would seek to characterize and quantify).
The document "Nucleic Acid Research", Vol. 21, No. 15, pp. 3469-3472 (1993) of Kosaka et al. describes trapper sequences fixed by a covalent bond on microplates. These very short trapper sequences (of the order of 17 base pairs) are used to obtain a hybridization of target sequences to be identified and quantified in the presence of similar labeled sequences. As it appears in the diagram of figure 2 of this document, in spite of the short length of the trapper sequence, there is no optimal overlap of this trapper sequence by the target sequence to be quantified.
EMI6.1
In the document "Clin. Chem.", No. 40/2, pp. 200-205 (1994), Rasmussen et al. describe a single strand trapper sequence attached by a covalent bond to microplates. This trapper sequence is also very short (of the order of 25 nucleotides) and is used to obtain the hybridization of target sequences of the order of 350 to 500 base pairs.
In patent application WO94 / 06933, a method of sandwich hybridization is described by means of a trapper sequence fixed on an insoluble support such as microplates, serving for sandwich type hybridization of a target sequence capable of s also hybridize with a labeled sequence. However, in the exemplary embodiments described in this patent application, the trapper sequences are of the order of twenty
<Desc / Clms Page number 7>
nucleotides used for the hybridization of target sequences whose length is between 400 and 600 base pairs. In the cases described above, when the trapper sequences are very short, we observe a poor overlap of the target sequence by the trapper sequence and the marked sequence which would be liable to cause false positives or false negatives.
In this type of experiment, one obtains a refolding of the target sequence on itself or a rehybridization of target sequences between them. Thus, the percentage of hybridization of the target sequence on the trapper sequence is particularly low with very short trapper sequences, which decreases the sensitivity.
In the document "Journ. Of Clin. Microbiol.", Vol.
33, pp. 752-754 (1995), Cho et al. describe a method using a single-strand trapper sequence of 188 base pairs adsorbed on microplates, this trapper sequence making it possible to hybridize a target biotinylated sequence of 245 base pairs. This hybridization technique not based on the sandwich type recognition has the disadvantage that one will possibly observe a bad overlap of the trapper sequence by the target sequence, and in all cases, a bad overlap of the target sequence on the minus sixty base pairs.
Consequently, this portion of 60 base pairs is sufficient to obtain replenishments of the target sequence, or even of the trapper sequence, on itself, the secondary structures of which are liable to disturb the hybridization between the trapper sequence and the target sequence , which decreases the sensitivity of the test.
<Desc / Clms Page number 8>
In the document "Journ. Of Clin. Microbiol.", Vol.
9, pp. 638-641 (1991), Keller et al. describe a single-strand trapper sequence attached by a covalent bond to microplates, this single-strand trapper sequence having a length of 126 base pairs, at least a portion of which is capable of performing simple hybridization with a target sequence of 191 base pairs . The fixation is done after having randomly fixed on the bases of the sequence the diamino hexane which can then be fixed on the wells.
The document explicitly mentions that the single-stranded sequence is only complementary to a part of the target sequence of 191 base pairs, but is not likely to obtain complete recovery, in particular primer sequences of part and d other of this target sequence so as to avoid any overlapping homology between the primers and the single-stranded sequence. Therefore, at the two ends of the target sequence, more than 30 base pairs are observed which are not covered by the trapper sequence, the recognition of the hybridization being detected by the fact that the target sequence is labeled with biotin and can be recognized by the conjugate streptavidin peroxidase allowing its detection by colorimetry.
In this document, a good overlap of the target sequence to be quantified is not observed, and the deployment of this sequence can be particularly significant, near the end of the trapper sequence fixed on the solid support. The risk at this level of re-deployment of a secondary structure is particularly high, which could distort the detection and quantification procedures. In addition, such as fixing the trapper to the
<Desc / Clms Page number 9>
wells are done randomly, the portion of the trapper accessible to the target sequence is not known.
Patent application EP-0205532 describes a trapper sequence of 341 base pairs fixed covalently on microbeads, this trapper sequence being capable of reacting with a target sequence to obtain an overlap of the trapper sequence on the target sequence of 175 pairs base, the target sequence then being capable of reacting with a marked sequence of 201 base pairs by a phenomenon of sandwich hybridization.
However, this document also does not describe an optimal recovery of the single-stranded trapper sequence by the target sequence. Indeed, in this document, we observe, at the level of the single-strand trapper sequence, a free portion of 166 base pairs at the level of which we are likely to observe re-deployments of the single-strand trapper sequence on itself or the 'pairing with other sequences present in the sample, which are likely to decrease the percentage of target sequence hybridizing on the trapper sequence, and therefore the sensitivity of detection and quantification.
Aims of the invention
The present invention aims to provide a new method and a kit enabling the detection and / or quantification of nucleic acid sequences which would not have the drawbacks of the cited prior art.
A particular aim of the present invention is to provide a method and a kit allowing optimal hybridization of the nucleic acid sequences on
<Desc / Clms Page number 10>
a solid support, in particular a high percentage of hybridization of the trapper sequence by the target sequence, a low risk of folding of the target sequence or of the trapper sequence onto itself, a low risk of re-pairing of target sequences by complementary sequences present in the sample or a low risk of "parasitic" pairing of the trapper sequence by other sequences present in the sample.
Another object of the present invention is to provide a method and a kit having improved specificity and sensitivity compared to the methods and devices of the prior art.
A complementary object of the present invention is to provide a method and a kit making it possible to optimize the quantification of nucleic acids, in particular nucleic acids present in a biological sample and obtained after genetic amplification.
Character-defining elements of the invention
The present invention relates to a method for detecting and / or quantifying a nucleotide sequence called "target" present in a biological sample, characterized in that it comprises contacting of the "sandwich" type of said nucleotide sequence target with a nucleotide sequence called "trapper" fixed on an insoluble solid support, said nucleotide sequence trapper being complementary to part of the target nucleotide sequence, the contacting of the "sandwich" type It also taking place with one or more other (s) nucleotide sequence (s) of which at least one is marked, the or
<Desc / Clms Page number 11>
said nucleotide sequence (s) (at least one of which is marked)
being complementary (s) to another part of the target nucleotide sequence (another part than that hybridized by the nucleotide sequence "trapper"); in that the trapping nucleotide sequence is covalently attached by one of its ends to the solid support; in that the trapping nucleotide sequence has a length of between 50 and 500 bases, preferably between 100 and 300 bases, more particularly between 120 and 250 bases; and in that the part of the trapping nucleotide sequence which does not hybridize with the target complementary nucleotide sequence is less than 40 bases, preferably less than 20 bases, or even zero.
Advantageously, the part of the labeled nucleotide sequence which does not hybridize with the sequence complementary to the target sequence is advantageously less than 40 bases, preferably less than 20 bases, or even zero.
According to a preferred embodiment of the invention, the part of the target nucleotide sequence which does not hybridize with the trapping nucleotide sequence and with the nucleotide sequence (s) (including at least one is marked), is less than 60 bases, preferably less than 40 bases, or even zero.
In the following description, the nucleotide sequence (s) (at least one of which is marked) will take the name of "helper" sequences when the said sequence (s) are not marked, and of nucleotide sequences "marked "when these are likely to be recognized directly or indirectly by a detection and / or
<Desc / Clms Page number 12>
quantification, preferably chosen from the group consisting of fluorescence, chemoluminescence, electroluminescence, coloring, detection by radioactive labeling, bioluminescence or a mixture of them.
The "helper" nucleotide sequences are used to stabilize the "sandwich" and obtain the fullest possible recovery of the target nucleotide sequence during its hybridization on the labeled nucleotide sequence and on the trapper nucleotide sequence, which increases the sensitivity and the specificity of the process according to the invention.
According to a particular embodiment of the invention, in the case where the target nucleotide sequence is an amplicon resulting from a genetic amplification, the 5 ′ terminal part of the target nucleotide sequence not covered by the sequence (s) marked (s) and the nucleotide sequence (s) "helper" is also covered by a complementary "primer" nucleotide sequence (also called "primer"), used for the amplification of the target nucleotide sequence. According to the invention,
EMI12.1
may consider this "primer" nucleotide sequence as being a "helper" type sequence.
According to the invention, it is therefore possible to also observe an optimal, even total, covering of the target nucleotide sequence by the trapping nucleotide sequence, the labeled nucleotide sequence (s), and optionally the or the "helper" nucleotide sequences.
The present invention also relates to the kit for detection and / or quantification by hybridization of
<Desc / Clms Page number 13>
sandwich type of a target nucleotide sequence comprising a trapping nucleotide sequence fixed on an insoluble solid support and complementary to part of the target nucleotide sequence and one or more other nucleotide sequence (s) (including at least one is labeled), said nucleotide sequence (s) being complementary to another part of the target nucleotide sequence.
In the detection and / or quantification kit, said trapping nucleotide sequence is covalently attached by one of its ends to the solid support and has a length of between 50 and 500 bases, preferably between 100 and 300 bases, more particularly between 120 and 250 bases, and the part of the trapping nucleotide sequence which does not hybridize with the part of the target nucleotide sequence is less than 40 bases, preferably less than 20 bases, or even zero.
It is understood that in the detection and / or quantification method and kit according to the invention, the labeled nucleotide sequence has a length sufficient to specifically recognize the target nucleotide sequence to be detected and / or quantified, this specificity depending the type of target nucleotide sequence to be detected and / or quantified.
This specificity can be characterized by recognition by hybridization of a specific complementary portion of at least 10 bases, preferably more than 20 bases, of the target nucleotide sequence.
Preferably, the labeled nucleotide sequence carries one or more chemical molecules allowing its detection according to a method chosen from the group consisting of fluorescence, chemoluminescence,
<Desc / Clms Page number 14>
electroluminescence, staining, detection by radioactive labeling (such as RIA technology), bioluminescence or a mixture of them.
According to the invention, the detection and / or quantification kit will include the reagents necessary for detection and quantification by an owner chosen from the group consisting of fluorescence, chemoluminescence, electroluminescence, coloring, detection by labeling. radioactive, bioluminescence or a mixture of them.
According to the invention, the trapper nucleotide sequence is covalently attached to the insoluble solid support. This fixing is preferably carried out by means of a terminal phosphate 51 on one or more amine functions of the insoluble solid support by reaction with carbodiimide.
In the detection and / or quantification process, the sandwich hybridization is preferably carried out in two stages, that is to say that the first stage consists in the hybridization of the target nucleotide sequence to the trapping nucleotide sequence, and that the second step is the hybridization of the target nucleotide sequence with one or more nucleotide sequences of which at least one is labeled. The two stages are preferably separated by a washing stage. In the case where the conditions (TO, salt concentration, reaction time) are compatible for the two hybridizations, these are carried out in a single step.
According to the invention, the solid support is an insoluble solid support chosen from the group consisting of tubes, filters, beads, optionally
<Desc / Clms Page number 15>
magnetic, multiwell plates or a mixture of them.
Advantageously, the target nucleotide sequence is the result of a prior amplification by a genetic amplification method, preferably chosen from the group consisting of PCR, LCR, CPR or NASBA.
According to a preferred embodiment of the invention, the detection method also comprises a sandwich-type contacting of a standard nucleotide sequence under the same conditions as the target nucleotide sequence to be detected and / or quantified, and comprises a additional step of quantifying the relationship between the specific labeling of the target nucleotide sequence and the specific labeling of the standard nucleotide sequence.
Preferably, the detection and / or quantification method comprises a prior step of preparing a known quantity of a standard nucleotide sequence having at least one part common to the target nucleotide sequence and one specific part whose sequence is different from the target nucleotide sequence and has a close GC / AT base content (that is to say identical to more than 80%, preferably more than 90%), preferably identical, to the sequence of the specific part of the nucleotide sequence target.
In addition, the detection and / or quantification method according to the invention can comprise an optional extraction of the target nucleotide sequence to be quantified from the biological sample prior to the genetic amplification step. This possible step of extraction of the target nucleotide sequence can be carried out before or after the addition to the sample.
<Desc / Clms Page number 16>
standard nucleotide sequence assay used to obtain quantification of the target nucleotide sequence.
Contacting both the target nucleotide sequences with the sandwich nucleotide sequences and with the labeled nucleotide sequences complementary either to the specific part of the target nucleotide sequence or to the specific part of the standard nucleotide sequence and to quantification of the relationship between the specific labeling of the target nucleotide sequence and the specific labeling of the standard nucleotide sequence.
Advantageously, the diagnostic kit also includes a standard nucleotide sequence having at least one part common to the target nucleotide sequence to be quantified and a specific part whose sequence is different and has a close GC / AT base content (i.e. say more than 80% identical, preferably more than 90%), preferably identical, to the specific part of the target nucleotide sequence to be quantified.
This quantification method and this standard nucleotide sequence are described in detail in Belgian patent application number 09600755 incorporated here by reference.
According to the invention, the target nucleotide sequence to be detected and / or quantified can consist of any type of nucleic acid, DNA or RNA. Preferably,
EMI16.1
"trapper", "helper", "marked (s)" and "standard (s)" nucleotide sequences used according to the present invention consist of DNA so as to avoid any destruction of these sequences by RNase possibly present in the biological sample.
<Desc / Clms Page number 17>
The present invention will be described in more detail in the examples below with reference to the appended figures.
Brief description of the figures Figure 1 shows a schematic example of sandwich hybridization according to the invention.
FIG. 2 represents a concentration curve of target CMV DNA obtained after sandwich hybridization and detection in bioluminescence FIG. 3 represents a concentration curve of target DNA of Chlamydia obtained in sandwich hybridization and measured in radioactivity.
FIG. 4 represents a DNA sensitivity curve for Chlamydia trachomatis after amplification by PCR and sandwich hybridization.
Description of a preferred embodiment of the invention
The trapper nucleotide sequence 5, preferably a DNA sequence, is covalently attached to multiwell plates 3. This covalent attachment is obtained by the binding of a phosphate located at the 5 'terminal position of the trapper sequence on an amine located on the support in the presence of carbodiimide, as described by Rasmussen et al. (1991, Anal. Biochem. 198, 138-142).
The attached trapper 5 nucleotide sequences can hybridize a target DNA 2, which will then be sandwiched by a labeled nucleotide sequence 6.
<Desc / Clms Page number 18>
An advantage of sandwich hybridization is very low background noise, which allows massive analysis of clinical samples without having to purify the extracted DNA.
The quantity of trapping nucleotide sequences fixed on the multiwells can reach 1.2 pmol for small oligonucleotides, but as regards the larger nucleotide sequences, the quantity fixed is less important (of the order of 300 fmoles for nucleotide sequences about 500 bases). An optimized version of the conditions for fixing on the solid support of trapping nucleotide sequences is presented in Example 1. However, the quantity of trapped nucleotide sequences fixed is sufficient not to be limiting in the hybridization process of the invention.
The fixation of the trapper nucleotide sequence on microbeads also makes it possible to increase the number of trapper nucleotide sequences in the reaction solution by using a larger quantity of beads.
The trapper nucleotide sequences according to the invention chosen are complementary over their entire length to the target nucleotide sequence to be detected.
This advantageously allows easy production of these trapping nucleotide sequences by PCR from target nucleotide sequences cloned into plasmids and can thus be used for a reproducible industrial production of these trapping nucleotide sequences.
It is however possible to use trappers of which part of the nucleotide sequence comprises one or more parts of sequences which are not complementary to the sequence of the
<Desc / Clms Page number 19>
target. The inventors tested trapping nucleotide sequences having a sequence of 20 or 40 bases not complementary to the target nucleotide sequence and located in the 5'terminal position used for attachment to the multiwells.
These sequences serve as "spacers" between the trapper sequence proper and the solid support. The 20 base spacer sequence is more efficient than 40 and 60 base spacers for hybridizing small target sequences. This result is probably due to the additional possibilities of folding of these trapping nucleotide sequences on themselves, which decreases, or even inhibits, the hybridization of the target nucleotide sequences. These folds could be visualized by the use of the predictive programs of the secondary structures Oligo4 and DNA-fold and they can indeed involve sometimes quite long portions of the trapper sequence.
These folds are to be avoided as much as possible, because they reduce the efficiency of the hybridization, especially when they involve portions which are not complementary to the target sequence which therefore cannot displace them.
Another property of the method and of the kit of the invention is the advantageous use of trapping nucleotide sequences having a minimum size of 50 bases if possible 100 and at best 150 or more bases.
This observation is unexpected based on the following considerations.
The stability of hybrids in solution depends on various factors, the influence of which has been studied by examining their influence on the temperature producing 50% dissociation of the hybrid (Tm). The higher this Tm
<Desc / Clms Page number 20>
the higher, the more stable the hybrids. The factors which influence this stability are a high ionic strength, the absence or not of particular chemical agents such as formamide and the composition in base (i.e. the percentage of GC base compared to AT) and l absence or presence of mismatches. In the absence of chemicals in the hybridization solution, and when the 2 sequences are perfectly complementary, the variable factors are the ionic strength and the base composition.
The formula for Tm is then: Tm = 81.5 + 16.6 log (M) + 0.41 (% G + C) with M = ionic strength (Anderson and Young in "Nucleic acid and hybridization", IRL Press , Hames, B. and Higgins, S. Editeurs, 1985, 73-111, Oxford-Washington DC).
This formula is valid for fragments beyond 50 bases because beyond this size stability becomes maximum (Viscidi, 1988 in "Nucleic acid hybridization assays-DNA probes", Handbook of serodiagnosis in infectious diseases, E. Matthiews RC and Burnie JP Editors, Butterworth Heineman, 106-142).
The stability of the hybrids, in the case where the ionic strength is constant and the size sufficient, only depends on the composition (% G + C) and not on the size of the hybrids. The importance of size to favor or not hybridization should therefore depend on the speed of hybridization. Effectively in solution, the size of the nucleic acid strands influences the rate of re-pairing. This is proportional to the square root of the length (Wetmur, JG and Davidson, N. 1968, J. Mol. Biol. 3, 584) and in the case where the 2 strands are of different size, the speed is proportional at the square root of the shortest strand be DNA
<Desc / Clms Page number 21>
(Wetmur, J. G. 1971, Biopolymers 10, 601) or an RNA (Hutton, J. R. and Wetmur, J. G. 1973, J. Mol.
Biol. 77, 495).
The other factor which influences the speed of hybridization is the respective concentration of the target nucleotide sequences and the trapping nucleotide sequences. The situation in this case is complex because two reactions are possible: on the one hand the target nucleotide sequences to be measured being usually double strands in the starting solution, will be able to reassociate with each other and on the other hand they will be able to hybridize on the trapper nucleotide sequence. These are therefore two competitive reactions, one taking place in solution (reassociation of the double strands of the target nucleotide sequence) and the other on a solid support (hybridization on the trapping nucleotide sequence).
We can first consider the situation where the quantity of trapping nucleotide sequence is in excess relative to the quantity of target nucleotide sequence. Concentrations of target nucleotide sequence of the order of fmole are detected (from 0.1 to 50 fmoles) while the amount of trapping nucleotide sequence can reach 300 fmoles.
If the 2 competitive reactions took place in solution, the kinetic formula which expresses the decrease in the concentration of single stranded target nucleotide sequence (DNA) in solution (Cs) as a function of time is:
EMI21.1
d (Cs) - = kl [c.] [c. r in which: k2: kinetic constant of DNA reassociation
<Desc / Clms Page number 22>
k1: kinetic constant of hybridization with the nucleotide sequence Cf: concentration of the trapping nucleotide sequence.
As the reaction is carried out on an insoluble solid support, account must be taken of the diffusion rate (J) of the target single-stranded nucleotide sequence towards the solid surface on which the trapping nucleotide sequence is fixed, that is:
EMI22.1
The situation becomes very complex and cannot be understood as a whole. Anderson and Young (1985) tried to measure the influence of the size of the double-stranded target nucleotide sequence on filter hybridization in the presence of an excess of fixed nucleotide sequence and they conclude "The difference in dependence on molecular weight of the two types of filter hybridization is not understood ".
With regard to the influence of the size of the trapping nucleotide sequence on a solid plastic support, the studies have not yet been carried out and it is not possible to obtain a mathematical formulation making it possible to predict the results obtained with the method of the invention.
If, however, the particular conditions of the reaction medium are examined, it is found that the quantity of trapping nucleotide sequence (for example 300 fmoles) is largely in excess compared to the quantity of target nucleotide sequence (for example 10 fmoles). If we consider that this excess compensates for the
<Desc / Clms Page number 23>
limitations due to diffusion, we find ourselves in a situation close to the reaction in solution where the speed of hybridization should be proportional to the square root of the length of the sequences.
By choosing a trapping nucleotide sequence of 360 bases instead of 180 bases, the displacement of a yield from 30% to 50% is observed, ie an increase of 1.67 times. Even based on a size effect in solution, i.e. at a speed depending on the square root of the length, we should have expected a maximum increase of 1.4 times. Furthermore, a yield of 50% has never been described to date in the scientific literature.
By comparing the yields of hybridization as a function of small trapping nucleotide sequences ranging from 50, 100, 150 and 250 bases, there is (by taking hybridization on the trapping nucleotide sequence of 50 bases as a reference), an increase in yield of 4.6 and 17 times while the square roots of these sequences are in a respective ratio of 1.4, 1.7 and 2.2 times.
There is therefore an unexpected effect of the length of these trapping nucleotide sequences on the increase in the yield of hybridization.
A particular application of these high yields of hybridization of the target DNA on an insoluble support is its use for purifying one of the two strands of this target DNA. In fact, the trapper consists of a single strand because a single phosphorylated primer in the 5'terminal position is used during its construction by PCR. This phosphate is the only one able to react on the amino support. After fixing, the plate is washed in the presence of 0.4 N Na OH
<Desc / Clms Page number 24>
(see example 1) to remove the second strand. So we end up with a single strand fixed on the support. This strand being complementary to only one of the two strands of target DNA, it will fix this strand. After washing, this hybrid strand can be easily dehybridized, for example by heating or with 0.4 N NaOH. A single strand of DNA is thus obtained in the solution.
This technique can be used on a large scale, for example by using beads on which the trapping nucleotide sequences are fixed. This single strand preparation can have multiple applications as reagents using a chemically labeled strand for example.
Detection of unlabeled target sequences is carried out by hybridizing them to trapping nucleotide sequences fixed on an insoluble support using one or more nucleotide sequences of which at least one is labeled (detection nucleotide sequences) which can hybridize on the part of the target nucleotide sequence not recognized by the trapper nucleotide sequence. This can be chemically labeled and detected according to the various methods known to those skilled in the art. It is possible to obtain a fixation of at least 80% of the detection nucleotide sequence with respect to the target nucleotide sequence hybridized to the trapping nucleotide sequence.
By examining the influence of the length of this marked nucleotide sequence on the efficiency of sandwich hybridization, we note the importance of using a marked nucleotide sequence which covers as much as possible the target nucleotide sequence. The best yields are obtained when the target nucleotide sequence is completely covered on the one hand
<Desc / Clms Page number 25>
by the trapping nucleotide sequence and on the other hand by the detection nucleotide sequence (FIG. 1).
In the case of detection of amplicons obtained by PCR, it is possible to leave on the 5'terminal side of the target nucleotide sequence a sequence not covered by the detection nucleotide sequence but which can be recognized by the primers still present in the solution of the PCR. In this way, the entire target nucleotide sequence is covered during hybridization and there is no interference between the primers and the nucleotide sequence during hybridization.
The increased efficiency obtained by this procedure can probably be explained as follows. When the hybridization is carried out in a single step, the target nucleotide sequence dissociated in single strand is found in the solution in the presence of its strand of complementary target nucleotide sequence but also of the detection nucleotide sequence (and possibly primers) and on the support of the trapping nucleotide sequence. The target nucleotide sequence can either react first with the detection nucleotide sequence before binding to the trapper, or it can bind to the trapper before fixing the detection nucleotide sequence. In both cases, the use of large nucleotide sequences will promote the reaction speed as well as the stability of the hybrids formed.
However in this intermediate state, the target nucleotide sequence has a part of its unpaired sequence which can then be recognized by a complementary target nucleotide sequence which will be able to move the intermediate hybrid and redo a sequence
<Desc / Clms Page number 26>
double stranded target nucleotide. On the other hand, when the target nucleotide sequence will be hybridized and completely covered by the trapping nucleotide sequence and by the detection nucleotide sequence without having any (or too little) free sequence, the annealing of another strand of the sequence complementary target nucleotide can no longer take place and the sandwich hybrid will be stable.
In the case where the target nucleotide sequence even after sandwich hybridization keeps a free sequence, this can always serve as a pairing site for the other strand of the complementary target nucleotide sequence, which will destabilize the hybrid and may even dissociate according to the experimental conditions (T, salts, ...), because once the pairing has started, the propagation of the formation of the double strand is very rapid and thermodynamically favorable.
This optimization of the various parameters and compounds involved in this sandwich hybridization makes it possible to carry out this sandwich hybridization both with a marked nucleotide sequence present in the solution and a trapper nucleotide sequence fixed on an insoluble support at the same time whereas, if not not the case, it is first necessary to carry out a hybridization in solution before making the capture on an immobilized nucleotide sequence as described by Ghost et al.
(EP. 557456) or by a more complex sandwich hybridization system in solution then capture by a receptor fixed on a solid support (Miller, US: 5, 374, 524).
Another characteristic of the sandwich hybridization method according to the invention is that not only the target sequence can be entirely covered by the
<Desc / Clms Page number 27>
trapper nucleotide sequence and the labeled nucleotide sequence, but that the trapper sequence may be completely covered by the target sequence. This therefore makes it possible to use, as marked nucleotide sequence, large double-stranded nucleotide sequences produced for example easily by PCR amplification in the presence of dUTP-biotin. Indeed, once one of these biotinylated strands paired with the target nucleotide sequence, it will be completely covered and can no longer be re-displaced by its complementary strand, which is not the case in the work reported by Keller et al. (1989, Anal. Bioch. 177, 27-32).
This invention therefore allows easy production in a very large quantity of the trapping nucleotide sequences on the one hand using a primer carrying a phosphate at 5'terminal which will allow the covalent fixing of only one of these strands on the amino microplates and on the other hand share of the labeled nucleotide sequences. If the labeled sequences are small, 20-30 or 40 bases, they will be chemically synthesized and will be single stranded. If they are larger, they can be produced by amplification.
Exceeding the target nucleotide sequence outside the hybridized part on the sensor and the detection nucleotide sequence by its 5'terminal end resulted in a reduction in the hybridization yield if this uncovered part became important. This is also the case if the 3'terminal part is not covered. By choosing optimal reaction conditions, a target nucleotide sequence of 20 bases is fixed on a trapping nucleotide sequence of 20 bases which is complementary to it with a yield which can be 25 times greater compared to a sequence which has
<Desc / Clms Page number 28>
the same 20 nucleotides but which additionally has 20 additional nucleotides on the 3'terminal side.
We therefore see a difference in efficiency of 25 times between these 2 sequences due to the presence of a piece of the non-hybridized sequence on the 3 'side. The explanation for such an effect is undoubtedly due to an effect of steric hindrance of this free sequence located near the support. This unexpected effect can be used in order to be able to measure small nucleotide sequences in the presence of larger sequences, this is the case in amplification methods such as CPR where the reaction product to be measured is a small sequence originating from a larger starting nucleotide sequence.
Example 1: Fixation by covalent bond of the trapping probes on multiwells for the assay of Chlamydia trachomatis
The fixation of nucleotide probes on multiwells is achieved by the formation of a covalent link between the phosphate 5 ′ of the probe and an amine group present on the plastic in the presence of carbodiimide. The amplicons are prepared from primers, one of which is phosphorylated at its 5'terminal end.
The nucleotide sequence is first amplified by
EMI28.1
PCR using the following primers: Cl: 5'GAATTCTTAAGTTCGGTCGG3 'C,: 5'CGCGTTCATATTCGATATGC3'
These two primers are specific for the Chlamydia trachomatis plasmid and amplify a sequence of 288 base pairs. The first primer is phosphorylated at its 5 'end.
<Desc / Clms Page number 29>
EMI29.1
The amplicons are denatured by heating at 100 C for 10 minutes, then cooled to 0 C. The Covalink NH multi-well plates (Nunk, Denmark) carrying a secondary amine function on the surface are used for coupling. In certain examples, polystyrene plates functionalized by grafting of amines are used as described by Zammatteo et al. (Anal. Biochem. 236, pp.
85-94 (1996)). To each well is added 530 fmoles of phosphorylated amplicons in 0.1 ml of solution containing 1-methylimidazole buffer 10 mM pH 7.5 and 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide 0.025 M (Sigma, St Louis, Mi). The plates are incubated for 5 hours at 50 ° C. and then are washed 6 times with 0.4 M NaOH containing 0.25% Tween 20. Under these conditions, the percentage of fixation of the amplicons is 49% for the sequence defined above.
Example 2 Influence of the Trapper Length for a Simple Hybridization of a Target DNA from HPV-18
The experiment was carried out on amplicons of 586 base pairs corresponding to a sequence of HPV-18
EMI29.2
located in position 6193 to 6779 of the viral DNA. This sequence was amplified by the following primers: 1 = 5'TTTTGGAAGATGGTGATATGG 3 '2 = S'CATAACATCTGCAGTTAAAGT 3'
Hybridization was carried out from these amplicons labeled at the 5 ′ end via the T4 polynucleotide kinase in the presence of [yATP-to "P".
Two types of trappers were used, corresponding to 180 and 360 bases complementary to the amplicon sequence. Hybridizations have been carried out
<Desc / Clms Page number 30>
in the presence of increasing concentrations of target amplicons at 45 ° C. for 20 hours in a solution consisting of 2x concentrated SSC, concentrated Denhart 5x, denatured salmon sperm DNA at 0.1 mg / ml.
Concentrations of the amplicons ranging from 0.13 to 13 fmoles were tested, and the fixed amount was measured in radioactivity. Reported as a percentage of fixed DNA, this represents 30% on the 180-base trapper and 50% on the 360-base trapper whatever the target concentrations tested.
The fact that this percentage is stable between 0.13 and 13 fmoles also indicates that the amount of trapper is not limiting.
Example 3 Effect of the Trapper Length on a Simple Hybridization of a Target CMV DNA
The experiment was carried out for a hybridization of amplicons of 437 base pairs corresponding to a CMV sequence in position .....
This sequence was amplified by the following primers: MIE4: sense: 5'TGGCCAAGCGGCCTCTGATAACC MIE5: antisense: 51 CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG as described by Demmler et al. (J. Infect. Dis., 158, pp; 1177-1184 (1988)) and labeled with 32p using, during PCR amplification, cDTP labeled with 32p. The trappers of 50,100, 150 and 250 bases were produced by PCR and correspond to the 3'terminal part of the amplicons.
Hybridization was carried out at 60 ° C. for 2 hours in a solution of 2x concentrated SSC and concentrated Denhart 5x in the presence of 0.1 mg / ml of sperm DNA.
<Desc / Clms Page number 31>
Salmon. 10 µmoles of 32p amplicons were added to each well. After reaction, the wells were decoupled and the radioactivity measured. The results show that for the trappers of 50,100, 150 and 250 bases, 0.09 is obtained respectively; 0.035; 0.53 and 1.55 fmoles of hybridized target sequence. We can clearly observe a spectacular effect of the length of the trapper on hybridization.
Example 4: Influence of the length of the trapper for a
EMI31.1
sandwich hybridization of a target DNA of HPV-18
The experiment was carried out for the hybridization of amplicons of 586 base pairs corresponding to a sequence of HPV-18 located at position 6193 to 6779 of the viral DNA. This sequence was amplified by the primers described in Example 2.
Three types of trappers were used, corresponding to a sequence of 25,180 and 360 bases complementary to the sequence of the amplicons.
The various trappers recognizing the part of the amplicons located on the 3'terminal side. The probes included either 360 bases for hybridization on the 180-base trapper, or 180 bases for hybridization on the 360-base trapper, or 21 bases for hybridization on the 25-base trapper. They were labeled with 32p by phosphorylation in the 5 'terminal position by T4 kinase in the presence of [32p] ATP. They corresponded to the 5'terminal end of the target sequence. The 21 base probes were single strand, while the 180 and 360 base probes were double strand. The sandwich hybridizations have been optimized with regard to temperature, salt concentration and
<Desc / Clms Page number 32>
the concentration of amplicons.
With regard to the 25 base trapper, the hybridization carried out at 45 ° C. in the presence of 2.5 fmoles of amplicons for 2 hours in a solution of SSC 2x concentrated then after washing incubated for 2 hours with 15 fmoles of labeled probe at 32p. A fixation of 0.280 fmoles is obtained with a coefficient of variation of 80%. Hybridization on the 180 and 360 base trappers was carried out in a single step and under the following conditions: the amplicons were added respectively at a rate of 2.5 fmoles in the presence of 15 fmoles of labeled probe. Hybridization took place for 20 hours of a 2x SSC solution concentrated at 45 C. The amount of labeled hybridized probe is 0.54 fmol for the 180-base trapper and 0.69 fmol for the 360-trapper. basics.
The difference in probe fixation was due to a higher efficiency of hybridization of the target sequence on the large trapper (cf. example 2).
Indeed, if we report the binding of the labeled probe relative to the quantity of trapped target sequence, we obtain in both cases a ratio of 0.8. This means that 80% of the target sequences hybridized on the sensor sequence have fixed the labeled sequences. It can therefore be seen in this example that it is possible to use labeled detection probes, even double stranded, and to obtain a very good yield from their hybridization (80%).
The limiting factor for the formation of the sandwich under these conditions is then the length of the sensor probe.
<Desc / Clms Page number 33>
EMI33.1
Example 5: Intluence of recovery of the target nucleotide sequence by trapper DNA and probe DNA for the yield of hybridization (example of Mycobacterium tuberculosis)
In this example, the DNA extracted from Mycobacterium tuberculosis was amplified by its sequence Mt 308 using the following primers: T2MT3 '(primer 5'-3'):
GTCGACACGCCTCTGCACGGAAGTCCTT DMT3 '(antisense primer 5'-3'):
GCTCGACTTCTGGTCACGACGTCCGTCGAA
These primers were used by Thierry et al.
(Mol. Cell. Probes, 6, p. 181 (1992)), and allow the amplification of a fragment of 279 base pairs.
The trapper was obtained using the T2MT3 'phosphorylated probe in position 5' and an SMT5 'antisense primer: GGGCATCCGCGAGTTGAAGACCTGAAGTGG.
These two primers allow the production of amplicons of 144 base pairs, one of the two strands of which has a 5 'phosphate. This was used to fix the trapper by a covalent strand on the amine of the multiwells as explained in Example 1.
Two labeled probes were carried out, one of 135 base pairs obtained by the use of a GSMT5 'antisense primer carrying a biotin:
TCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCCTTGGG and the other by the antisense primer DMT3 '. The other probe was single strand and also carried a biotin:
5'CAGCCACCAAGTCGAGCACTTTGCGGCGGAACTACTCGGG-biotin 3 '
The sandwich hybridization was carried out by adding to each well 54 fmoles of target DNA amplified by PCR in the presence of 50 ng of 40 bases probe and 25 ng for
<Desc / Clms Page number 34>
the sequence of 135 bases. Hybridization was carried out for 2 hours at 60 OC.
After washing, the streptavidin-kinase conjugate was added and after 45 minutes of incubation, the kinase activity was assayed in bioluminescence as described in patent application WO94 / 06933.
The reading is done for an hour. After subtracting the white, a value of 1.5 million RLU (Relative Light Unit) for the 40 base probe and 2.7 million RLU for the 135 base probe are obtained.
In this example, the 135 base probe was double stranded and lowered. Despite these two unfavorable conditions, the signal obtained is almost twice as high, which clearly indicates the importance of making a large detection probe which covers the entire target sequence.
EXAMPLE 6 Curve of CMV Amplicon Concentrations After Sandwich Hybridization
The amplicons originating from the CMV DNA were obtained from a PCR carried out with the primers MIE4 and MIME5 described in example 3. They make it possible to obtain amplicons of 437 base pairs. The amplicons were used to produce the sandwich hybridization curve described below. This was carried out on multi-well plates on which were fixed trappers complementary to this target sequence and a biotinylated probe of 185 bases also produced by PCR. The size of the trapper was 257 bases.
They were produced from a PCR using primers MIE4 described in Example 3 and MEI-6 whose sequence was:
GTACAGGGGACTCTGGGGGTGAC
<Desc / Clms Page number 35>
The trapper once produced is purified on spin column G25.
The covalent fixing of the trapper on the polystyrene is done as follows: each well containing 100 ng of denatured trapper, MIEM 0.01 M pH 7.5, carbodiimide 0.2 M.
These wells are incubated for 5 hours at 50 ° C. After incubation, two washes with 200 g of 0.2 N NaOH, washing with water and drying are carried out. For hybridization, the wells are denatured with 200 μl of 0.2 N NaOH and rinsed with 200 μl of 2x SSC.
The total hybridization volume per well is 110 μl, containing: - 50 #l of hybridization buffer: SSC 4.4x, Denhart 10x,
Salmon sperm DNA 200 g / ml denatured 10 minutes at 100 C;
EMI35.1
- 10 J, Ll of biotinylated probe at a concentration of 900 pg / 10 gl denatured 10 minutes at 100 C; - 50 1 of target DNA amplified by PCR using two primers MIE4 and MIE5 described in Example 3, unpurified and denatured 10 minutes at 100 C. The quantities tested range from 3.5 attomoles to 3500 attomoles.
Hybridization lasts 2 hours at 70 C.
After hybridization, the wells are washed twice with 200 g of SSC O, 1x and then with 200 μl of 100 mM maleate buffer, 150 mM NaCl, 0.3% Tween pH 7.5 for 15 minutes.
After rinsing with 200 g of 100 mM maleate buffer pH 7.5 containing 150 mM NaCl and 1% blocking reagent, 100 g of streptavidin kinase are added. The wells are rinsed with 400 ml of 100 mM maleate buffer pH 7.5 containing 150 mM NaCl, 0.3% Tween for 10 minutes then 3 times 5 minutes with 200 μl of 100 mM maleate buffer, 150 mM NaCl, Tween 0, 3% pH 7.5.
<Desc / Clms Page number 36>
The kinase activity is revealed in 20 mM Tris buffer pH 7.75 containing 60 MM DTT, 100 MM EDTA, 5 mM MgCl2, 8 MM Luciferine, 6 mU luciferase per 20 mM KCl well, 1 mM Phosphoenolpyruvate and ADP 3.2 MM. The light emission is followed for one hour with a luminometer (Luminoskan, Labsystem, Finland) and the results are expressed in RLU. min (Figure 2).
Example 7 Concentration Curve in Amplicons of Chlamydia Trachomatis After Sandwich Hybridization
The amplicons originating from the DNA of Chlamydia trachomatis were obtained using the following primers: sense: 5'GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGT 3 'antisense: 51 GAATTCTTAAGTTCGGTCGG.
This amplification makes it possible to obtain target amplicons of 415 base pairs. These amplicons were used to produce a sandwich hybridization concentration curve on trappers fixed on multiwell plates.
The trappers are from a PCR using the primers GAATTCAAATGGTCTGAGAATAGT phosphorylated in 5 ′ and TTTTCAACAAAAATTCGTCGA producing amplicons of size 288 bases. The trapper once produced is purified on spin column G25.
The covalent fixing of the trapper on polystyrene is carried out as follows: each well containing 100 ng of denatured trapper, MEIM 0.01 M, pH 7.5, carbodiimide 0.2 M. These wells are incubated for 5 hours at 50 ° C. After incubation, two washes with 200 l of 0.2 N NaOH, washing with water and drying are carried out. For
<Desc / Clms Page number 37>
on hybridization, the wells are denatured with 200 μl of 0.2 N NaOH and rinsed with 200 μl of 2x SSC.
The total hybridization volume per well is 110
EMI37.1
gl, containing SSC 2x, Denhart 5x, salmon sperm DNA 100 gag / 1, 11 fentomoles of P32-labeled probe of 124 bases which correspond to the 5'terminal part of the target and different quantities of target DNA . sense 5'GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGT3 'antisense 5'GAATTCTTAAGTTCGGTCGG ranging from 1 pg to 5000 pg per well.
Hybridization takes place at 45 oc for 15 hours.
After hybridization, washing with 200 μl of SSC O, 1 × is carried out for 5 minutes and then the radioactivity contained in them is then counted (FIG. 3).
EMI37.2
Example 8: Mycobacterium tuberculosis concentration curve after sandwich hybridization
A Mycobacterium tuberculosis DNA concentration curve was carried out on amplicons obtained after amplification by PCR using the primers T2MT3 ′ and DMT3 ′ described in Example 5. These amplicons had a size of 279 base pairs. The trapper consisted of the first 144 bases of this sequence while the labeled probe consisted of the last 135 bases.
Their production is described in Example 5. The inventors used a probe labeled by incorporation of dUTPbiotin, which makes it possible to have a probe carrying several biotins.
An amplicon concentration curve was produced and the detection carried out using concentrations of 1, 5, 4 and 54 fmoles of amplicons in bioluminescence using a streptavidinkinase conjugate. The results of these assays gave that a
<Desc / Clms Page number 38>
EMI38.1
light emission measured in 1 hour respectively from 2, 5 - 3, 5 and 8, 8 of RLU. A dosage curve is obtained in this amplicon concentration zone. this amplicon concentration zone.
EXAMPLE 9 Concentration Curve of HPV-18 Licons After Sandwich Hybridization
The amplicons were obtained by primers 1 and 2 described in Example 2. They allow the formation after PCR of amplicons of 586 base pairs of HPV-18.
The trappers correspond to the 180 bases of these amplicons located on the 3'terminal side of the amplicons.
180 base trappers were covalently attached to the microwells. These trappers recognize
EMI38.2
the amplicons on the 3'terminal side. The 380 base probes were located on the 5'terminal side of the amplicons. A small sequence of 26 bases remains free at the end of the amplicons after hybridization.
In this experiment, increasing quantities of target amplicons of 50,500 and 5000 μg are incubated for 20 hours at 45 ° C. in a 2x SSC solution concentrated in the presence of 15 fmoles of biotinylated probe.
After hybridization and washing, a streptavidinperoxidase conjugate is added and its activity measured in chemoluminescence.
For the three target amplicon concentrations, a relative light value (RLU) of 171.941 and 2354 RLU is obtained respectively. Blank values obtained using a non-specific sequence were removed from the tests.
<Desc / Clms Page number 39>
EMI39.1
Example 10 Measurement of the Number of DNA Copies of Chlamydia Trachomatis After PCR and Sandwich Hybridization
Increasing amounts of Chlamydia trachomatis DNA cloned into a plasmid are used for PCR. This is carried out in the presence of Amplitaq Gold Polymerase (Perkin Elmer) in 100 μl of buffer comprising 2 mM MgCl 2, the various dNTPs at 200 MM and the primers with MM. These primers are those described in Example 7.
After 45 cycles of PCR comprising 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 600 ° C. and 30 seconds at 72 ° C., the PCR is left for 10 minutes at 72 ° C.
A 20 l sample is then placed in the wells containing the trapper and a biotinylated probe like those described in Example 7 and the hybridization is carried out for 2 hours at 65 C. After this hybridization, the wells are washed 4 times with a solution containing 100 mM Maleate buffer pH 7.5 and 150 mM NaCl and 0.3% Tween 20.
A streptavidin-peroxidase conjugate diluted 2,000 times in the same buffer containing 0.1% powdered milk is incubated for 45 minutes at 20 C. The wells are then washed 4 times as before and the peroxidase activity measured by the formation of a colored product in the presence of its substrate TMB and H202. The D.O. of the product formed is measured at 450 nM (Figure 4).
EXAMPLE 11 Differential Hybridization of a Small and a Long Strand of DNA Having Part of Its Identical Sequence
During certain amplifications such as CPR, the marked initial probes are large and are cut into two pieces which must be able to be detected and measured. The problem is therefore to be able to measure by hybridization a small probe in the presence of its mother sequence which is more
<Desc / Clms Page number 40>
big. The inventors have chosen in this example a mother sequence (OL1) biotinylated with 40 bases which have the following sequence: 5'CCGCGACTATCCCTCTGTCCTCAGTAATTGTGGCTGAGAA 3 '
This sequence corresponds to a specific sequence of the CMV genome located on the "Major Immediate Early Gene" (Akrigg et al., Virus Res. 2, p. 107).
The inventors wanted to detect a biotinylated probe (OL2) corresponding to the first 20 bases of this probe in the presence of the mother sequence (OL1). The trapper consisted of an oligonucleotide of 20 bases complementary to the OL2 probe and terminated by a phosphate group at 5 '. This trapper was fixed on the amino multiwells by covalent reaction.
In the following experiment, 100 fmoles of two of the biotinylated sequences OL1 or OL2 were incubated for 2 hours at 45 ° C. in a solution of concentrated SSC 0.5 × (ie 75 mM NaCl and 7.5 mM Na nitrate). After hybridization, the wells were washed with 0.1 x concentrated SSC solution at 45 OC. After four washes, the wells are incubated with the streptavidin-kinase conjugate and its fixation is estimated by measuring the kinase activity in bioluminescence. Under these conditions, the wells having the large fragment (OLA) showed an RLU x min of 9 while the small fragments showed an RLU x min of 210.
The presence on OL1 of a sequence of 20 additional nucleotides on OL1 located on the 5 ′ side compared to OL2, that is to say on the plastic side, therefore greatly destabilizes the hybridization of this probe on the trapper.