JP5403573B2 - Primer set for detecting pneumonia - Google Patents
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本発明は、複数種類の肺炎原因菌を検出しうるプライマーセットと、肺炎原因菌の検出方法に関するものであり、より詳しくは、前記プライマーセットを用いて核酸増幅を行うことで、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出する方法に関する。 The present invention relates to a primer set capable of detecting a plurality of types of pneumonia-causing bacteria and a method for detecting the pneumonia-causing bacteria, and more specifically, a plurality of types of pneumonia by performing nucleic acid amplification using the primer set. The present invention relates to a method for quantitatively detecting causative bacteria.
肺炎は日本人の死因別死亡率で第４位、がん等の基礎疾患の合併症としてもしばしば起こり、罹患者数が非常に多い疾患として知られている。従来肺炎の原因となる微生物（原因菌）の探索試験として行われている培養検査は少なくとも数日の時間を要し、更に培養された原因菌について薬剤感受性試験を行うと１週間近くもかかることから、治療選択に十分寄与する検査方法にはなっていない。救急救命病室（ＩＣＵ）に入院が必要な重症の肺炎に関しては、迅速で正確な原因菌の決定が治療選択において極めて重要であり、適切な初期治療は肺炎患者の救命確率を確実に上昇させることが報告されている。しかし実際には、依然として培養法に代わる原因菌同定技術が確立されていないため、原因菌が不明の状態で治療を行わなければならないのが現状である。そのため、経験治療による抗生物質の使用がやむを得ず、耐性菌の出現にも繋がる虞がある。 Pneumonia is the fourth most common cause of death among Japanese causes of death, and it is frequently seen as a complication of basic diseases such as cancer. It is known as a disease with a very large number of affected people. Traditionally, culture tests that have been conducted as exploratory tests for microorganisms that cause pneumonia take at least several days, and when a drug susceptibility test is performed on the cultured causative bacteria, it can take up to a week. Therefore, it is not a testing method that contributes sufficiently to treatment selection. For severe pneumonia that requires hospitalization in an emergency life unit (ICU), rapid and accurate determination of the causative organism is critical in treatment choices, and proper initial treatment ensures that the pneumonia patient's survival rate is increased. Has been reported. However, in reality, no causative bacteria identification technology has yet been established to replace the culture method, and the current situation is that treatment must be performed in a state where the causative bacteria are unknown. Therefore, the use of antibiotics by empirical treatment is unavoidable, and there is a possibility that resistant bacteria may appear.
肺炎の原因となる原因菌は、発生頻度の高い菌種が全体の５０％近くを占め、ウイルスまで含めた主な原因菌は２０−３０種類程度である。この中には通常の手法で培養できないものもあり、培養法による原因菌決定が困難である場合も多い。また、原因菌の種類によって最適な治療薬が異なるが、原因菌決定前に治療を開始するのも医療倫理上やむを得ない実情である。これらの問題を解決するために、複数種類の菌種の中から特定の菌を迅速かつ定量的に検出可能な手法の開発が待たれていた。 The causative bacteria that cause pneumonia account for nearly 50% of the most frequently occurring bacterial species, and there are about 20-30 main causative bacteria including viruses. Some of these cannot be cultivated by ordinary techniques, and it is often difficult to determine the causative bacteria by the culturing method. Moreover, although the optimal therapeutic agent differs depending on the type of causative bacteria, it is inevitable in medical ethics to start treatment before determining the causative bacteria. In order to solve these problems, development of a method capable of detecting specific bacteria quickly and quantitatively from a plurality of types of bacteria has been awaited.
細菌の同定に関しては、従来から用いられてきた培養を介した同定法や染色による同定法、ＡＴＰなど細菌の代謝に係る物質を計測する方法に加え、核酸増幅やマイクロアレイ技術を用いた細菌同定法が開発されている。特に、ある細菌の遺伝子配列に特異的な塩基配列を有する核酸をプローブとして合成し、これを基板上に固定して検体から増幅された遺伝子とハイブリダイズさせる手法は、各菌種が持つ特異的な塩基配列を用いるため、正確な検出が可能であり、現在様々な形で応用が進められている（特許文献１−４、非特許文献１）。 For bacterial identification, in addition to conventional identification methods through culture, staining identification methods, and methods for measuring substances related to bacterial metabolism such as ATP, bacterial identification methods using nucleic acid amplification and microarray technology Has been developed. In particular, the method of synthesizing a nucleic acid having a base sequence specific to a certain bacterial gene sequence as a probe, immobilizing it on a substrate and hybridizing it with a gene amplified from a specimen is specific to each bacterial species. Since accurate base sequences are used, accurate detection is possible, and applications are currently being promoted in various forms (Patent Documents 1-4 and Non-Patent Document 1).
しかしながら、従来の核酸増幅を用いた菌類の検出方法では、個々に肺炎原因菌を検出することは可能であるが、複数種類の肺炎原因菌を検出しようとすると複数回の核酸増幅を行う必要があり、時間とコストを要する。特に、生体検体は微量である場合が多いため、検体量が不足し十分に検出できない問題があった。複数種類の肺炎原因菌を同時に検出する方法としては、例えばマルチプレックスＰＣＲ法がある。マルチプレックスＰＣＲ法は、１回のＰＣＲで複数種類の標的核酸を増幅する方法であり、検体が微量であっても複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。ただし、マルチプレックスＰＣＲ法では、１の反応溶液中に複数のプライマーが存在するため、プライマーダイマーの形成やミスアニーリング等が生じ非特異的な増幅が生じやすい。このため、このような非特異的な核酸の増幅を防止し、かつ一度のＰＣＲ条件で増幅可能である様にＴｍ値や塩基配列等を調整したプライマーからなるプライマーセットを用いる必要がある。しかしながら、主要な肺炎原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の標的核酸を１のＰＣＲで特異的に増幅できるプライマーセットは未だに開発されていなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、核酸増幅によって、肺炎原因菌であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを同時に検出が可能となるプライマーセットを提供することを第一の目的とする。
また、本発明は、上記プライマーセットを用いて、複数種類の肺炎原因菌を一度に特異的に検出する検出方法を提供することを第二の目的とする。
The present invention has been made in view of the above circumstances, and by nucleic acid amplification, S. pneumoniae that is a pneumonia-causing bacterium. pneumoniae, H. et al. influenzae, M.M. pneumoniae, and C.I. It is a first object to provide a primer set that enables simultaneous detection of pneumoniae.
A second object of the present invention is to provide a detection method for specifically detecting a plurality of types of pneumonia-causing bacteria at once using the above primer set.
本発明の請求項１に係るプライマーセットは、複数種類の肺炎原因菌の検出に用いられるプライマーセットであって、配列番号１の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする。
The primer set according to
本発明の請求項２に係るプライマーセットは、請求項１において、更に、配列番号５の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１５の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする。
The primer set according to
本発明の請求項３に係るプライマーセットは、請求項１又は２において、前記プロモーター配列が、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列であることを特徴とする。
The primer set according to
本発明の請求項４に係る肺炎原因菌検出用キットは、肺炎原因菌検出用キットであって、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを有することを特徴とする。
A kit for detecting pneumonia-causing bacteria according to
本発明の請求項５に係る肺炎原因菌の検出方法は、肺炎原因菌の検出方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットを用いることを特徴とする。
A method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to claim 5 of the present invention is a method for detecting a pneumonia-causing bacterium, wherein the primer set according to any one of
本発明の請求項６に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項５において、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットを用いた核酸増幅により、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出することを特徴とする。
According to
本発明の請求項７に係る肺炎原因菌の検出方法は、核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程、（２）工程（１）で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、プロモーター配列と相同的な配列からなるユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅を行う工程、（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物を検出する工程、を少なくとも含むことを特徴とする。
A method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to
本発明の請求項８に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項７において、核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、前記工程（３）の検出方法が、前記工程（２）で得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性する工程、基板に固定された配列番号１〜１０の塩基配列からなるプライマーの群からなる１以上のフォワードプライマーと該一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせることにより二本鎖ＤＮＡを形成する工程、及び該二本鎖ＤＮＡを標識試薬を用いて検出する工程、とを少なくとも有することを特徴とする。
The detection method for pneumoniae causing bacteria according to
本発明の請求項９に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項６乃至８において、マルチプレックスＰＣＲを用いることを特徴とする。
The method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to claim 9 of the present invention is characterized in that, in
本発明の請求項１０に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項７乃至９において、前記ユニバーサルプライマーの濃度が、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットのプライマーの濃度の１０倍以上であることを特徴とする。
The method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to
本発明の請求項１１に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項８乃至１０において、前記基板が平板状またはチューブ状であって、前記プライマーが前記基板表面に固定されていることを特徴とする。
According to Claim 11 of the present invention, in the method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to
本発明の請求項１２に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項８乃至１１において、前記基板が平板状で、かつ、複数の凹部を有し、前記プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする
According to
本発明の請求項１３に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項１２において、前記基板上に設けられた複数の前記凹部を、全て覆うことが可能な透明なカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする。
According to claim 13 of the present invention, the method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to
本発明の請求項１４に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項８乃至１３において、前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする。
The method for detecting a pneumonia-causing bacterium according to
本発明の請求項１５に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項１４において、前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする。
According to
本発明のプライマーセットによれば、複数種類の肺炎原因菌を特異的に検出することが可能となる。
また、本発明のプライマーセットを用いた肺炎原因菌の検出方法によれば、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。
特に該プライマーセットを用いて核酸増幅を行うことで、簡便に複数種類の肺炎原因菌を検出することが可能となる。また、一度の核酸増幅により複数種類の肺炎原因菌を検出することができるため、検体の量が少ない場合においても有効であり、かつ多検体を迅速に検出することが可能である。
更に、上記プライマーセットの５´側にプロモーター配列を有しているキメラプライマーと、該プロモーター配列と相同な塩基配列を有するユニバーサルプライマーとを用いて核酸増幅を行うことで、各プライマー間での増幅効率がユニバーサルプライマーを用いることで統一され、複数種類の肺炎原因菌を簡便にかつ迅速に定量的に検出することが可能となる。
According to the primer set of the present invention, multiple types of pneumonia-causing bacteria can be specifically detected.
In addition, according to the method for detecting pneumonia-causing bacteria using the primer set of the present invention, it is possible to simultaneously detect a plurality of types of pneumonia-causing bacteria.
In particular, by performing nucleic acid amplification using the primer set, it is possible to easily detect multiple types of pneumonia-causing bacteria. In addition, since a plurality of types of pneumonia-causing bacteria can be detected by a single nucleic acid amplification, it is effective even when the amount of the sample is small, and multiple samples can be detected quickly.
Furthermore, amplification between each primer is performed by performing nucleic acid amplification using a chimeric primer having a promoter sequence on the 5 'side of the primer set and a universal primer having a base sequence homologous to the promoter sequence. Efficiency is unified by using a universal primer, and a plurality of types of pneumonia-causing bacteria can be detected quantitatively simply and quickly.
本発明の第一実施形態は、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することができるプライマーセットである。 The first embodiment of the present invention is a primer set that can simultaneously detect a plurality of types of pneumonia-causing bacteria.
以下、プライマーセットを構成するフォワードプライマーについて説明する。
配列番号１の塩基配列を有するプライマーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡをコードする遺伝子領域の転写開始部位を１位としたとき（以下同様）、２０２位〜２２３位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。
配列番号２の塩基配列を有するプライマーは、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１６５位〜１８７位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号３の塩基配列を有するプライマーは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１２２５位〜１２４５位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号４の塩基配列を有するプライマーは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の９９４位〜１０１７位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号５の塩基配列を有するプライマーは、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の４３６位〜４５９位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号６の塩基配列を有するプライマーは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の５２位〜７１位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号７の塩基配列を有するプライマーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１６４位〜１８５位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号８の塩基配列を有するプライマーは、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の４５３位〜４７３位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号９の塩基配列を有するプライマーは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｓｐａＡ遺伝子をコードする遺伝子領域の転写開始部位を１位としたとき、１１６０位〜１１８３位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。
配列番号１０の塩基配列を有するプライマーは、Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）のｍｅｃＡ遺伝子をコードする遺伝子領域の転写開始部位を１位としたとき、２７０位〜２９２位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。
このように、上記の各フォワードプライマーは、それぞれの菌種に特異的な１６ｓｒＲＮＡ遺伝子、ｓｐａＡ遺伝子又はｍｅｃＡ遺伝子の塩基配列に相同的な塩基配列を有している。
Hereinafter, the forward primer which comprises a primer set is demonstrated.
A primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is homologous to the base sequence of positions 202 to 223 when the transcription start site of the gene region encoding 16s rRNA of Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) is defined as position 1 (the same applies hereinafter). It has a typical base sequence.
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 2 has a base sequence homologous to the bases at positions 165 to 187 of the 16s rRNA gene of Hemophilus influenzae (H. influenzae).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 3 has a base sequence homologous to the base positions 1225 to 1245 of the 16s rRNA gene of Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 4 has a base sequence homologous to the bases at positions 994 to 1017 of the 16s rRNA gene of Chlamydophilia pneumoniae (C. pneumoniae).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 5 has a base sequence homologous to the bases at positions 436 to 459 in the 16s rRNA gene of Legionella pneumoniae (Legionella spp.).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 6 has a base sequence that is homologous to the 52nd to 71st base positions of the 16s rRNA gene of Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 7 has a base sequence homologous to the bases at positions 164 to 185 of the 16s rRNA gene of Pseudomonas aeruginosaae (P. aeruginosaae).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 8 has a base sequence homologous to the bases at positions 453 to 473 of the 16s rRNA gene of Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis).
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 9 is a base homologous to the base sequence of positions 1160 to 1183 when the transcription start site of the gene region encoding the spaA gene of Staphylococcus aureus (S. aureus) is defined as
The primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 is homologous to the nucleotide sequence of positions 270 to 292 when the transcription start site of the gene region encoding the mecA gene of Methiclin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) is defined as
Thus, each of the above forward primers has a base sequence that is homologous to the base sequence of the 16s rRNA gene, spaA gene, or mecA gene specific to each bacterial species.
次に、プライマーセットを構成するリバースプライマーについて説明する。
配列番号１２の塩基配列を有するリバースプライマーは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対応するものであり、前記６菌種の肺炎原因菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の共通配列で、５０２位〜５１９位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
配列番号１３の塩基配列を有するプライマーは、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対応するものであり、前記２菌種の肺炎原因菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の共通配列で、１３７８位〜１３９２位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
配列番号１４の塩基配列を有するリバースプライマーは、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子に対応するものであり、４０２位〜４１９位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
配列番号１５の塩基配列を有するリバースプライマーは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ遺伝子に対応するものであり、１３６３位〜１３８３位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
Next, the reverse primer which comprises a primer set is demonstrated.
The reverse primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12 pneumoniae, H. et al. influenzae, Legionella spp. K. pneumoniae, P .; aeruginosae, M. et al. It corresponds to catarrhalis and is a common sequence of 16S rRNA genes of the above 6 bacterial strains causing pneumonia, and has a base sequence complementary to the base sequence of positions 502 to 519.
The primer having the base sequence of SEQ ID NO: 13 is M.P. pneumoniae and C. pneumoniae. It corresponds to pneumoniae, and is a common sequence of 16S rRNA genes of the above-mentioned two strains of pneumonia causing bacteria, and has a base sequence complementary to the base sequence of positions 1378 to 1392.
The reverse primer having the base sequence of SEQ ID NO: 14 corresponds to the mecA gene of MRSA, and has a base sequence complementary to the base sequence at positions 402 to 419.
The reverse primer having the base sequence of SEQ ID NO: 15 It corresponds to the spaA gene of aureus and has a base sequence complementary to the base sequence of positions 1363 to 1383.
配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２０２位〜５１９位の領域が増幅され、３１８塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号２の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１６５位〜５１９位の領域が増幅され、３５５塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２２５位〜１３９２位の領域が増幅され、１６８塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の９９４位〜１３９２位の領域が増幅され、３９９塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の４３６位〜５１９位の領域が増幅され、８４塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号６の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５２位〜５１９位の領域が増幅され、４６８塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号７の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１６４位〜５１９位の領域が増幅され、３５６塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号８の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の４５３位〜５１９位の領域が増幅され、６７塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号９の塩基配列を有するプライマーと配列番号１５の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ遺伝子の１１６０位〜１３８３位の領域が増幅され、２２４塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号１０の塩基配列を有するプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子の２７０位〜４１９位の領域が増幅され、１５１塩基対の増幅産物が得られる。
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, The region from position 202 to position 519 of the pneumoniae 16S rRNA gene is amplified to obtain an amplification product of 318 base pairs.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, A region of positions 165 to 519 of the 16S rRNA gene of influenzae is amplified, and an amplification product of 355 base pairs is obtained.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 13, The region from positions 1225 to 1392 of the 16S rRNA gene of pneumoniae is amplified, and an amplified product of 168 base pairs is obtained.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 4 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 13, C.I. A region of positions 994 to 1392 of the 16S rRNA gene of pneumoniae is amplified to obtain an amplification product of 399 base pairs.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, Legionella spp. A region from position 436 to position 519 of the 16S rRNA gene is amplified to obtain an 84 base pair amplification product.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 6 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, The region from position 52 to position 519 of the 16S rRNA gene of pneumoniae is amplified, and an amplified product of 468 base pairs is obtained.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, A region from positions 164 to 519 of the 16S rRNA gene of aeruginosae is amplified, and an amplification product of 356 base pairs is obtained.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, The region from position 453 to position 519 of the catarrhalis 16S rRNA gene is amplified, and an amplified product of 67 base pairs is obtained.
By performing PCR using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 9 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 15, The region from positions 1160 to 1383 of the Aureus spaA gene is amplified, and an amplified product of 224 base pairs is obtained.
By performing PCR using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, the region from position 270 to position 419 of the mecA gene of MRSA is amplified, and an amplification product of 151 base pairs Is obtained.
図１は、上記プライマーの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の増幅領域を模式的に示した図である。図中、欄外の直線は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１位から１５００位までを模式的に示している。図中、矢印は、各プライマーを表しており、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対応する部位に配置している。矢印の矢尻は５´側を示している。また、太い直線はフォワードプライマーとリバースプライマーとで増幅される領域を示している。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ遺伝子、及びＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子の増幅領域は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内には設定されていないので、図中には記されていない。
図中「Ｉｎｔ．ｃｏｎｔ」は内部コントロールを意味する。
FIG. 1 is a diagram schematically showing an amplification region in the 16S rRNA gene of the primer. In the figure, the straight line outside the column schematically shows the 1st to 1500th positions of the 16S rRNA gene. In the figure, each arrow represents each primer and is arranged at a site corresponding to the 16S rRNA gene. The arrowhead of the arrow indicates the 5 'side. A thick straight line indicates a region amplified by the forward primer and the reverse primer. S. The amplification regions of the aureus spaA gene and the MRSA mecA gene are not set in the 16S rRNA gene, and thus are not shown in the figure.
In the figure, “Int.cont” means an internal control.
内部コントロールとして、人の常在菌ではないＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ（Ａ．ａｃｅｔｉ）を用いることが好ましい。核酸増幅に用いるプライマーとしては、配列番号１１の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を有するリバースプライマーとを用いる。
配列番号１１の塩基配列を有するフォワードプライマーは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５３位〜３７４位の塩基配列に相同的な配列を有する。配列番号１１の塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ａ．ａｃｅｔｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５３位〜５１９位の領域が増幅され、１６７塩基対の増幅産物が得られる。
As an internal control, it is preferable to use Acetobacter acetic (A. acetici) which is not a human resident bacteria. As a primer used for nucleic acid amplification, a forward primer having a base sequence of SEQ ID NO: 11 and a reverse primer having a base sequence of SEQ ID NO: 12 are used.
The forward primer having the base sequence of SEQ ID NO: 11 has a sequence homologous to the base sequence at positions 353 to 374 of the 16S rRNA gene. By performing PCR using a forward primer having the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a reverse primer having the base sequence of SEQ ID NO: 12, A region of positions 353 to 519 of the 16S rRNA gene of aceti is amplified, and an amplified product of 167 base pairs is obtained.
本発明におけるプライマーの合成は、当該技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。 The synthesis of the primer in the present invention can be performed using a technique known in the art.
配列番号１〜１５の塩基配列を有する各プライマーは、Ｔｍ値がほぼ一致しているため、同一のＰＣＲ条件で核酸増幅をすることができる。又、これら全てのプライマーは特異性に優れているために、１の反応溶液中に添加した状態でＰＣＲを行った場合には、プライマーダイマーの形成やミスアニーリング等による非特異的な核酸増幅はほとんど生じない。このため、本発明のプライマーセットを用いることにより複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。特に、配列番号１〜１５の各塩基配列を有する各プライマーを有するプライマーセットを用いることにより、主要な肺炎原因菌である１０菌種全てを同時に特異的に検出することが可能である。 Since the primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 15 have substantially the same Tm value, nucleic acid amplification can be performed under the same PCR conditions. In addition, since all these primers are excellent in specificity, non-specific nucleic acid amplification due to formation of primer dimers, mis-annealing, etc. is not possible when PCR is performed in a state where it is added to one reaction solution. Almost does not occur. For this reason, by using the primer set of the present invention, it is possible to simultaneously detect a plurality of types of pneumonia-causing bacteria. In particular, by using a primer set having each primer having each base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 15, it is possible to simultaneously and specifically detect all 10 species that are major pneumonia-causing bacteria.
また、本発明のプライマーセットの各プライマーは、各遺伝子の塩基配列に対する特異性を喪失しない限り、付加的な塩基配列を有していてもよく、標識されていてもよい。該標識は、通常核酸の標識に用いることができる物質であれば特に限定されるものではなく、蛍光物質やビオチン等の低分子化合物等が挙げられる。又、該付加的な塩基配列として、制限酵素認識配列や各種プロモーター配列等がある。 In addition, each primer of the primer set of the present invention may have an additional base sequence or may be labeled as long as the specificity to the base sequence of each gene is not lost. The label is not particularly limited as long as it is a substance that can be usually used for labeling nucleic acids, and examples thereof include fluorescent substances and low molecular weight compounds such as biotin. Examples of the additional base sequence include restriction enzyme recognition sequences and various promoter sequences.
特に、本発明のプライマーセットは、第一実施形態のプライマーセットの５´側にプロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットとすることが好ましい。
該プロモーター配列に関しては、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡ−３´）、Ｔ３ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ−３´）、ＳＰ６ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−３´）など適宜選択して用いることができ、このうちＴ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列が好ましい。
配列番号１６〜３０の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーは、配列番号１〜１５の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーの５´側に、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列を付加したものである。
In particular, the primer set of the present invention is preferably a primer set comprising a chimeric primer having a promoter sequence added to the 5 ′ side of the primer set of the first embodiment.
Regarding the promoter sequence, the promoter sequence of T7 RNA synthetase (5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3 '), the promoter sequence of T3 RNA synthetase (5'-TTATTAACCCTCACTAAAGGAGAGA-3'), and the promoter sequence of SP6 RNA synthetase (5'-ATTTAGGTGACACTATAGATACAC- 3 ′) can be appropriately selected and used, and among these, the promoter sequence of T7 RNA synthetase is preferable.
Each primer having each base sequence of SEQ ID NOs: 16 to 30 is obtained by adding a T7 RNA synthase promoter sequence to the 5 ′ side of each primer having each base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 15.
配列番号１６〜３０の各塩基配列を有するそれぞれのキメラプライマーからなるプライマーセットは、第一実施形態のプライマーセットの５´側にそれぞれ同一のプロモーター配列が付加されたものであるので、第一実施形態のプライマーセットと同様に、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出することが可能である。 Since the primer set consisting of the respective chimeric primers having the respective base sequences of SEQ ID NOs: 16 to 30 has the same promoter sequence added to the 5 ′ side of the primer set of the first embodiment, Similar to the primer set of the form, a plurality of types of pneumonia-causing bacteria can be specifically detected simultaneously.
検出方法に関しては、特に限定されるものはなく、例えば、核酸増幅による検出や、プライマーセットをプローブとして用いたハイブリダイゼーション等により、肺炎原因菌を検出することができる。核酸増幅による検出方法は、例えば、核酸増幅産物の塩基配列を電気泳動やシーケンサー等により決定する方法が挙げられ、ハイブリダイゼーションによる検出方法は、例えばスポットハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーション、Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、核酸サンドウィッチハイブリダイゼーション等が挙げられる。
微量な検体量で検出が行えることや、短時間で検出できることから、核酸増幅により肺炎原因菌を検出することが好ましい。
The detection method is not particularly limited, and for example, pneumonia-causing bacteria can be detected by detection using nucleic acid amplification, hybridization using a primer set as a probe, or the like. Examples of the detection method by nucleic acid amplification include a method of determining the base sequence of the nucleic acid amplification product by electrophoresis, sequencer, etc., and detection methods by hybridization include, for example, spot hybridization, colony hybridization, in situ hybridization, Examples include nucleic acid sandwich hybridization.
It is preferable to detect pneumonia-causing bacteria by nucleic acid amplification because detection can be performed with a very small amount of specimen or in a short time.
核酸増幅に関しては、ポリメラーゼを用いた塩基の伸長反応を行うものであれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて行うことができる。例えば通常のＰＣＲに加えて、マルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられるが、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することを考慮すると、マルチプレックスＰＣＲが好ましい。
また、用いるポリメラーゼは、増幅塩基数や増幅塩基配列、反応温度等、考慮して適宜選択可能であるが、非特異的増幅を抑制することからも、ホットスタート用ポリメラーゼを用いることが好ましい。
核酸増幅用バッファーとしては、用いるポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。
核酸増幅用ヌクレオチドに関しては、標識試薬等で標識されたものを用いることもできる。
The nucleic acid amplification is not particularly limited as long as it performs a base extension reaction using a polymerase, and can be performed using a known method. For example, in addition to normal PCR, multiplex PCR, real-time PCR, RT-PCR and the like can be mentioned. In consideration of simultaneously detecting a plurality of types of pneumonia-causing bacteria, multiplex PCR is preferable.
The polymerase to be used can be appropriately selected in consideration of the number of amplified bases, the amplified base sequence, the reaction temperature, etc., but it is preferable to use a hot start polymerase from the viewpoint of suppressing non-specific amplification.
As the nucleic acid amplification buffer, a known one can be appropriately adjusted and used in consideration of the polymerase to be used.
Regarding nucleotides for nucleic acid amplification, those labeled with a labeling reagent or the like can also be used.
核酸試料としては特に限定されるものではなく、生体試料や、生体試料から得られた培養物、及びこれらの試料から主に核酸を抽出した試料であってもよい。また、株化した細胞、ＰＣＲにより合成した試料等を用いることもできる。これら核酸の抽出方法としては、特に限定されるものではなく、例えばエタノール沈殿法等で行うことができる。その他、市販のキット等を用いてもよい。 The nucleic acid sample is not particularly limited, and may be a biological sample, a culture obtained from the biological sample, or a sample in which nucleic acid is mainly extracted from these samples. In addition, established cells, samples synthesized by PCR, and the like can also be used. The method for extracting these nucleic acids is not particularly limited, and can be carried out, for example, by ethanol precipitation. In addition, a commercially available kit or the like may be used.
本発明のプライマーセットは、複数種類のプライマーを同時に用いることができることから、マルチプレックスＰＣＲに用いることで複数種類の肺炎原因菌を一度に検出することが可能である。 Since the primer set of the present invention can use a plurality of types of primers at the same time, it can detect a plurality of types of pneumonia-causing bacteria at a time by using it for multiplex PCR.
更に、公知の定量的ＰＣＲを用いることで複数種類の肺炎原因菌を一度に、定量的に検出することが可能である。 Furthermore, it is possible to quantitatively detect a plurality of types of pneumonia-causing bacteria at once by using a known quantitative PCR.
特に、第一実施形態のプライマーセットの５´側にプロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットと、該プロモーター配列と相同な塩基配列を有するユニバーサルプライマーとを用いて核酸増幅を行うことで、定量的かつ精度よく検出することが可能である。 In particular, by performing nucleic acid amplification using a primer set consisting of a chimeric primer with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the primer set of the first embodiment, and a universal primer having a base sequence homologous to the promoter sequence, It is possible to detect quantitatively and accurately.
ユニバーサルプライマーには、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列、Ｔ３ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列、ＳＰ６ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列等、キメラプライマーで用いたプロモーター配列と相同な配列をもつプライマーを用いる。 As the universal primer, a primer having a sequence homologous to the promoter sequence used in the chimeric primer, such as a promoter sequence of T7 RNA synthetase, a promoter sequence of T3 RNA synthetase, or a promoter sequence of SP6 RNA synthetase, is used.
具体的には、以下のように行う。
まず、核酸試料、キメラプライマーから成るプライマーセット、ユニバーサルプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用バッファー、デオキシヌクレオチドをそれぞれ適宜調整した混合溶液を作製し、ＰＣＲを行う。
Specifically, this is performed as follows.
First, a mixed solution in which a nucleic acid sample, a primer set consisting of a chimeric primer, a universal primer, a DNA polymerase, a PCR buffer, and deoxynucleotides are appropriately prepared is prepared, and PCR is performed.
核酸増幅の反応初期においては、プライマーセットの各キメラプライマーが鋳型である核酸試料と反応し、キメラプライマーに付加されたプロモーター配列を両端に有する核酸増幅産物が得られる。
次いで、上記で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、核酸増幅産物中のプロモーター配列とユニバーサルプライマーとを介して核酸増幅産物が得られる。
得られた核酸増幅産物を解析することで、定量的な検出を行うことができる。
In the initial stage of the nucleic acid amplification reaction, each chimeric primer in the primer set reacts with a nucleic acid sample as a template to obtain a nucleic acid amplification product having promoter sequences added to the chimeric primer at both ends.
Next, using the nucleic acid amplification product obtained above as a template, a nucleic acid amplification product is obtained via the promoter sequence in the nucleic acid amplification product and the universal primer.
Quantitative detection can be performed by analyzing the obtained nucleic acid amplification product.
ユニバーサルプライマーとキメラプライマーとを用いて核酸増幅することにより得られた核酸増幅産物は、プロモーター配列を有する。このプロモーター配列を有する核酸増幅産物は、ユニバーサルプライマーを介して増幅されるようにもなる。従来は、核酸増幅に用いるプライマーによって核酸増幅の効率が異なっていたが、同一のユニバーサルプライマーを用いて核酸を増幅することで、プライマー間での増幅効率を同一にすることができるため、核酸増幅による定量的な解析が可能となる。 A nucleic acid amplification product obtained by nucleic acid amplification using a universal primer and a chimeric primer has a promoter sequence. The nucleic acid amplification product having this promoter sequence is also amplified via a universal primer. Previously, the efficiency of nucleic acid amplification differed depending on the primer used for nucleic acid amplification, but amplification of nucleic acid using the same universal primer makes it possible to achieve the same amplification efficiency between primers. Quantitative analysis is possible.
また、プライマーの濃度比は、ユニバーサルプライマーの濃度を、キメラプライマーの濃度よりも多くすることが必要であり、ユニバーサルプライマー：キメラプライマーの濃度比が、１０：１から５０：１であることが好ましく、より好ましくは２０：１から４０：１、更に好ましくは４０：１である。ユニバーサルプライマーの濃度を高くすることで、該プライマーの反応性が増し、定量性が向上する。 In addition, the primer concentration ratio needs to be higher than that of the chimeric primer, and the universal primer: chimeric primer concentration ratio is preferably 10: 1 to 50: 1. More preferably, it is 20: 1 to 40: 1, more preferably 40: 1. Increasing the concentration of the universal primer increases the reactivity of the primer and improves the quantitativeness.
従来のリアルタイムＰＣＲでは、鋳型やプライマー毎に定量に適したサイクル数を予め調べておく必要があるが、本発明の構成をとることにより、核酸増幅がプラトーに達した時点の核酸増幅産物は、もともと核酸試料に含有されていた鋳型の量に依存する。そのため、通常のＰＣＲにおいて行われるサイクル数であれば、特にサイクル数を考慮することなくＰＣＲを行い、定量することが可能である。これは、プライマー間の増幅効率が統一されるためと推察される。 In conventional real-time PCR, it is necessary to examine in advance the number of cycles suitable for quantification for each template and primer, but by adopting the configuration of the present invention, the nucleic acid amplification product at the time when the nucleic acid amplification reaches a plateau, It depends on the amount of template originally contained in the nucleic acid sample. Therefore, PCR can be performed and quantified without considering the number of cycles as long as the number of cycles is performed in normal PCR. This is presumably because the amplification efficiency between primers is unified.
このように、キメラプライマーとユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅することにより、１の試料中に含まれる多数の肺炎原因菌を、リアルタイムＰＣＲをすることなく、簡便にかつ定量的に検出することが可能となる。また、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量できることから、簡便にかつ迅速に肺炎原因菌の定量的に検出することができる。更に、新たな病原菌を検出する場合においても、キメラプライマーを追加するだけで定量的に検出することが可能である。 In this way, by performing nucleic acid amplification using a chimeric primer and a universal primer, it is possible to easily and quantitatively detect a number of pneumonia-causing bacteria contained in one sample without performing real-time PCR. It becomes. In addition, since a plurality of types of pneumonia-causing bacteria can be quantified simultaneously, the pneumonia-causing bacteria can be quantitatively detected easily and quickly. Furthermore, even when a new pathogenic bacterium is detected, it is possible to detect it quantitatively simply by adding a chimeric primer.
上記の核酸増幅により得られた二本鎖ＤＮＡの検出方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、核酸増幅産物をハイブリダイゼーションさせて検出する方法や、核酸増幅産物を標識試薬によって検出する方法等が挙げられる。
特に、基板上にて検出する方法が好ましい。基板上にて検出することで、複数の核酸増幅産物を簡便に定量できるためである。また、サイズの差異が小さい核酸増幅産物も識別して定量することができるためである。
The detection method of the double-stranded DNA obtained by the nucleic acid amplification is not particularly limited, and can be performed using a known method. For example, a method of detecting a nucleic acid amplification product by hybridization, a method of detecting a nucleic acid amplification product with a labeling reagent, and the like can be mentioned.
In particular, a detection method on a substrate is preferable. This is because a plurality of nucleic acid amplification products can be easily quantified by detecting on the substrate. Moreover, it is because a nucleic acid amplification product with a small difference in size can be identified and quantified.
基板上における検出方法として、例えば以下の定量的な検出方法がある。
該方法は、核酸増幅により得られた二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性し、この一本鎖ＤＮＡと、基板上に固定した該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとを介して二本鎖ＤＮＡを形成すると同時に、該二本鎖ＤＮＡを標識し、検出する方法である。該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとして、特に本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーを用いることが好ましい。特異性に優れるためである。以下、該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとして、本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーを用いた方法について説明する。
まず、フォワードプライマーを基板上に固定する。
Examples of the detection method on the substrate include the following quantitative detection methods.
In this method, a double-stranded DNA obtained by nucleic acid amplification is denatured into a single strand, and this single-stranded DNA and a primer having a sequence complementary to the nucleic acid amplification product immobilized on a substrate are used. In this method, double-stranded DNA is formed and simultaneously labeled and detected. As a primer having a sequence complementary to the nucleic acid amplification product, a forward primer constituting the primer set of the present invention is particularly preferably used. It is because it is excellent in specificity. Hereinafter, a method using a forward primer constituting the primer set of the present invention as a primer having a sequence complementary to the nucleic acid amplification product will be described.
First, the forward primer is fixed on the substrate.
このような基板としては、熱可塑性樹脂を用いたプラスチック材料が好適である。 このような熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることが好ましい。このような熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂、等を用いることができる。このうち、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に優れた飽和感情ポリオレフィンを使用することが好ましい。 As such a substrate, a plastic material using a thermoplastic resin is suitable. As such a thermoplastic resin, it is preferable to use a resin that generates a small amount of fluorescence. As such a thermoplastic resin, for example, linear polyolefin such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefin, fluorine-containing resin, and the like can be used. Among these, it is preferable to use a saturated emotion polyolefin excellent in heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, transparency and moldability.
また、基板の形状としては特に限定されるものではなく、板状の他に、例えば、フィルム状やシート状、チューブ状等が挙げられる。例えば、９６穴等のマルチプレートが挙げられる。
また、基板の表面を微細加工により小さなマイクロプレート用構造にすることが好ましい。この場合、多数の凹部を形成し、この凹部にて固相プライマーを結合させることが好ましい。凹部に関しては、深さ１５０〜２５０μｍ、底部直径０．５〜１．５ｍｍのウェルとすることが好ましい。凹部を形成することで、効率よくフォワードプライマーとハイブリダイズすることが可能となる。
Moreover, it does not specifically limit as a shape of a board | substrate, For example, a film form, a sheet form, a tube form etc. other than plate shape is mentioned. For example, a multi-plate with 96 holes or the like can be mentioned.
Moreover, it is preferable to make the surface of a board | substrate into the structure for small microplates by fine processing. In this case, it is preferable to form a large number of recesses and bind the solid phase primer in these recesses. Regarding the recess, it is preferable to use a well having a depth of 150 to 250 μm and a bottom diameter of 0.5 to 1.5 mm. By forming the recess, it is possible to efficiently hybridize with the forward primer.
基板へのフォワードプライマーの固定方法としては、公知のものであれば限定されるものではなく、例えば、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が挙げられる。このプライマーを溶解または分散した液体としては、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができ、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）などが挙げられる。 The method for fixing the forward primer to the substrate is not limited as long as it is a known method, and examples thereof include a method of spotting a liquid in which a primer is dissolved or dispersed. The liquid in which the primer is dissolved or dispersed can be neutral to alkaline, for example, pH 7.6 or higher, and includes TE buffer (pH 8.0).
特に、基板の表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が基板表面に存在するような場合には、この高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。 In particular, a polymer substance containing a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting a hydrophilic part of a phospholipid and a second unit having a carboxylic acid-derived group is present on the surface of the substrate. In this case, a part of the active ester group contained in the polymer substance reacts with the primer, and a covalent bond is formed between the primers.
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。 A polymer substance having a first unit containing a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of the phospholipid and a second unit containing a carboxylic acid-derived group suppresses nonspecific adsorption of DNA strands. It is a polymer having both properties and the property of immobilizing DNA strands. In particular, a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of the phospholipid contained in the first unit plays a role in suppressing nonspecific adsorption of the template DNA fragment, and the carboxylic acid-derived group contained in the second unit. Serves to chemically immobilize the primer. That is, the primer is immobilized on the surface of the substrate by covalent bonding at the site of the carboxylic acid derivative group of the coating layer made of the polymer material.
また、固定するフォワードプライマーの５´側には、基板と結合するためのリンカー部を有していることが好ましい。リンカー部は、基板に固定されるために用いられるのであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板表面上に活性エステル基がある場合、このエステル基反応性を高めるため、５´側にアミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基を導入されたフォワードプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上に固定化することができる。 Moreover, it is preferable to have the linker part for couple | bonding with a board | substrate on the 5 'side of the forward primer to fix. The linker part is not particularly limited as long as it is used for fixing to the substrate. For example, when there is an active ester group on the surface of the substrate, in order to enhance this ester group reactivity, 5 ′ It is preferable to introduce an amino group on the side. Since the amino group is excellent in reactivity with the active ester group, it can be efficiently and firmly immobilized on the surface of the substrate by using a forward primer into which the amino group has been introduced.
フォワードプライマーの点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液等で洗浄し、洗浄後はプライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。 After spotting the forward primer, in order to remove the primer that is not immobilized on the substrate surface, it is washed with pure water or a buffer solution, and after washing, the active ester on the substrate surface other than the primer immobilized is deactivated. The treatment is preferably performed with an alkali compound or a compound having a primary amino group.
このようなアルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等が挙げられる。 Examples of such alkali compounds include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, and potassium phosphate. Etc.
また、一級アミノ基を有する化合物としては、例えばグリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が挙げられる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。 Examples of the compound having a primary amino group include glycine, 9-amino aquadine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino-2,3-dihydro-1,4-pentanol, Aminoethanethiol hydrochloride, aminoethanethiolsulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogensulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein 6-aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2-aminooctane, 2-aminooctanoic acid, 1-amino-2-propanol, 3-a Mino-1-propanol, 3-aminopropene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-aminophthalonitrile, 3-aminophthalimide, p-aminopropiophenone Aminophenylacetic acid, aminonaphthalene and the like. Of these, aminoethanol and glycine are preferably used.
洗浄後は、７５〜８５℃の温度で1時間加熱することが好ましい。加熱処理の後、１２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶを照射し、ＤＮＡを更に固定化することがより好ましい。 After washing, it is preferable to heat at a temperature of 75 to 85 ° C. for 1 hour. More preferably, the DNA is further immobilized by irradiating with 120 mJ / cm 2 of UV after the heat treatment.
また、基板上にゲルを展開させ、このゲルに固相プライマーを結合させることもできる。この場合、固相プライマーを三次元で固定できるので、より効率よく反応を進めることができる。このようなゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等が挙げられる。 It is also possible to develop a gel on the substrate and bind a solid phase primer to the gel. In this case, since the solid phase primer can be fixed in three dimensions, the reaction can proceed more efficiently. Examples of such gels include agarose gel and polyacrylamide gel.
基板に設けた各凹部にそれぞれの肺炎原因菌に特異的なフォワードプライマーを固定することで、核酸増幅により合成された二本鎖ＤＮＡが基板上で混在することなく、一度に定量することが可能となる。 By fixing a forward primer specific to each pneumonia-causing bacteria in each recess on the substrate, double-stranded DNA synthesized by nucleic acid amplification can be quantified at once without mixing on the substrate. It becomes.
次に、核酸増幅により得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性し、前記フォワードプライマーを固定した基板上に導入する。
核酸の一本鎖への変性方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば、熱変性により行うことが好ましい。この場合、９５℃で１〜１０分処理することが好ましい。
Next, the nucleic acid amplification product obtained by nucleic acid amplification is denatured into a single strand and introduced onto the substrate on which the forward primer is immobilized.
The method for denaturing a nucleic acid into a single strand can be performed by a known method, for example, preferably by heat denaturation. In this case, it is preferable to process at 95 degreeC for 1 to 10 minutes.
基板に反応溶液を導入するには、基板上に設けられた複数の凹部全てを覆うことが可能な透明なカバーを基板に被せて、表面張力によって反応溶液を凹部内に導入することが好ましい。これにより、反応溶液を分注する手間が省けるばかりでなく、コンタミネーションの抑制や、反応溶液の総量を軽減することができ、低コスト化が図られる。 In order to introduce the reaction solution into the substrate, it is preferable to cover the substrate with a transparent cover capable of covering all of the plurality of recesses provided on the substrate and introduce the reaction solution into the recesses by surface tension. This not only saves time and effort for dispensing the reaction solution, but also reduces contamination and reduces the total amount of the reaction solution, thereby reducing costs.
次いで、一本鎖に変性した核酸と基板に固定されたプライマーとをハイブリダイズさせ、デオキシヌクレオチドとポリメラーゼにより基板上に二本鎖ＤＮＡを形成させると同時に標識試薬を取り込ませ、検出を行う。
上記ハイブリダイゼーションから二本鎖ＤＮＡ形成までの反応は７０℃のワンステップで行うことが可能であり、３０分反応させれば十分である。
ここで、検出のために新たにデオキシヌクレオチドやポリメラーゼ等を加えても良いが、核酸増幅を行った反応溶液をそのまま熱変性を加えて基板上に導入することで、核酸増幅に用いたヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼを、基板上に二本鎖ＤＮＡを形成する際にも用いることができるため、低コスト化が図れる。
Next, the nucleic acid denatured to a single strand is hybridized with a primer fixed to the substrate, and a double-stranded DNA is formed on the substrate by deoxynucleotide and polymerase, and at the same time, a labeling reagent is incorporated and detection is performed.
The reaction from the hybridization to the formation of double-stranded DNA can be performed in one step at 70 ° C., and it is sufficient to react for 30 minutes.
Here, deoxynucleotides or polymerases may be newly added for detection, but the reaction solution subjected to nucleic acid amplification is subjected to heat denaturation as it is and introduced onto the substrate, so that nucleotides used for nucleic acid amplification can be added. Since DNA polymerase can also be used when forming double-stranded DNA on a substrate, the cost can be reduced.
標識試薬に関しては、二本鎖ＤＮＡを標識する公知のものを用いることができ、例えば、二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれるインターカレーターであるＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ等が挙げられる。ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎを反応溶液中に加えることで、基板上で二本鎖ＤＮＡが形成されるときに該ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎが取り込まれ、簡便に標識することが可能である。
また、デオキシヌクレオチドを予め標識しておくことも可能であり、必要に応じ適宜選択すればよい。デオキシヌクレオチドの標識に関しては特に限定されるものではなく、例えば、ＦＩＴＣ、やローダミン、Ｃｙ３やＣｙ５などのサイアニン、ビオチンやジゴキシゲニン、ＲＩ等が挙げられる。これら標識されたデオキシヌクレオチドは、基板上における二本鎖ＤＮＡの形成に用いられるため、形成された二本鎖ＤＮＡを簡便に標識することができる。
このような標識試薬は、核酸増幅産物を一本鎖に変性させる前に、反応溶液中に加えても良く、核酸増幅産物を一本鎖に変性させた後に、反応溶液中に加えても良い。
この二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれた標識試薬の蛍光等を測定することで、核酸を定量することができる。この標識試薬の測定に関しては、公知の方法を用いて行うことができ、標識試薬を考慮して適宜調節して行えばよい。例えばマイクロアレイ・スキャナーを用いて、標識試薬がＣＹ３であった場合、５４３ｎｍの励起光で、５７６ｎｍの蛍光を経時的に観察することが好ましい。
As the labeling reagent, a known reagent that labels double-stranded DNA can be used, and examples thereof include SYBER Green, which is an intercalator incorporated between double-stranded DNAs. By adding SYBER Green to the reaction solution, the SYBER Green is incorporated when double-stranded DNA is formed on the substrate and can be labeled easily.
In addition, deoxynucleotides can be labeled in advance, and may be appropriately selected as necessary. The labeling of deoxynucleotide is not particularly limited, and examples thereof include FITC, rhodamine, cyanonin such as Cy3 and Cy5, biotin, digoxigenin, RI and the like. Since these labeled deoxynucleotides are used to form double-stranded DNA on a substrate, the formed double-stranded DNA can be labeled easily.
Such a labeling reagent may be added to the reaction solution before the nucleic acid amplification product is denatured into a single strand, or may be added to the reaction solution after the nucleic acid amplification product is denatured to a single strand. .
The nucleic acid can be quantified by measuring the fluorescence of the labeling reagent incorporated between the double-stranded DNAs. The measurement of the labeling reagent can be performed using a known method, and may be appropriately adjusted in consideration of the labeling reagent. For example, when the labeling reagent is CY3 using a microarray scanner, it is preferable to observe fluorescence at 576 nm over time with 543 nm excitation light.
また、リアルタイムＰＣＲ等により、検出に用いた蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することも可能である。このようにして得た測定値を積算することにより、得られたＰＣＲ産物を定量することができる。 It is also possible to measure the fluorescence amount of the fluorescent dye used for detection over time by real-time PCR or the like. By integrating the measured values thus obtained, the obtained PCR product can be quantified.
本発明のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを予め調整して混合したものをキットとすることができる。キットとすることで、試薬の調整等の手間が省け、簡便に行うことができる。また各種溶液を混合する際のコンタミなどを抑制することもできる。
キットに含まれるプライマーセットとしては、本発明の第一実施形態であるプライマーセットでも良いし、プロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットでも良い。
また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、核酸の増幅塩基数やＴｍ値、塩基配列等を適宜考慮して選択し、用いることができる。
ヌクレオチドに関しては、標識試薬で標識されたデオキシヌクレオチド等を用いることもできる。
核酸増幅用バッファーとしては、用いるＤＮＡポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。
A kit in which the primer set of the present invention, a DNA polymerase, nucleotides, and a nucleic acid amplification buffer are prepared and mixed in advance can be used as a kit. By using a kit, it is possible to simplify the procedure by eliminating the need for reagent adjustment and the like. Further, contamination at the time of mixing various solutions can be suppressed.
The primer set included in the kit may be the primer set according to the first embodiment of the present invention, or may be a primer set composed of a chimeric primer to which a promoter sequence is added.
The DNA polymerase can be selected and used by appropriately considering the number of nucleic acid amplification bases, Tm value, base sequence and the like.
Regarding nucleotides, deoxynucleotides labeled with a labeling reagent can also be used.
As the nucleic acid amplification buffer, a known one can be appropriately adjusted in consideration of the DNA polymerase to be used.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
マイクロアレイ基板上での肺炎原因菌の検出
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＡ．ａｃｅｔｉを検出するため、各菌種に対するフォワードプライマー（配列番号１，４，８，１１）をマイクロアレイ基板上に固定し、ＰＣＲにより増幅して得た核酸増幅産物を基板上で検出した。
まず始めに、各フォワードプライマーを固定したマイクロアレイ基板を作製した。
長さ７６ｍｍ、幅２６ｍｍのプラスチック製基板の上に、深さ２００μｍ、底部直径１ｍｍのウェル６０個を備えたマイクロアレイ基板を作製した。この基板の表面に活性エステルを有するポリマーをコートし、フォワードプライマーの５´末端に導入したアミノ基との結合機能を付与した。
その後、各フォワードプライマーをそれぞれ１μＭに調整し、固定用のスポッティング溶液（住友ベークライト社製）に溶解させ、この１μｌを各ウェルに滴下した。滴下後、基板を８０℃で１時間保温し、各フォワードプライマーを基板に固定した。
ポジティブコントロールとしてはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓ及びＡ．ａｃｅｔｉの増幅部位に共通な配列である、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３４１位〜３５９位の領域の塩基配列を有するプローブを基板に固定し、ネガティブコントロールとしては、２０塩基対からなるポリＴ配列を基板に固定した。
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＡ．ａｃｅｔｉのゲノム１ｎｇをそれぞれＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、それぞれに、０．１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、０．１５μＭに調整した各フォワードプライマー（配列番号１〜１１）の混合液、及び０．１５μＭに調整した各リバースプライマー（配列番号１２〜１５）の混合液、を混合させ反応溶液を作製した。本実施例１で用いたプライマーの配列を、表１に示す。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to a following example.
Example 1
Detection of pneumonia-causing bacteria on microarray substrate pneumoniae, M .; catarrahalis, C.I. pneumoniae, and A. pneumoniae. In order to detect aceti, forward primers (SEQ ID NOs: 1, 4, 8, and 11) for each bacterial species were immobilized on a microarray substrate, and nucleic acid amplification products obtained by amplification by PCR were detected on the substrate.
First, a microarray substrate on which each forward primer was fixed was prepared.
A microarray substrate having 60 wells with a depth of 200 μm and a bottom diameter of 1 mm was fabricated on a plastic substrate having a length of 76 mm and a width of 26 mm. The surface of this substrate was coated with a polymer having an active ester to give a binding function with an amino group introduced at the 5 ′ end of the forward primer.
Thereafter, each forward primer was adjusted to 1 μM and dissolved in a fixing spotting solution (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and 1 μl thereof was dropped into each well. After the dropping, the substrate was kept at 80 ° C. for 1 hour, and each forward primer was fixed to the substrate.
As a positive control, S. pneumoniae, M .; catarrahalis and A.C. A probe having a base sequence in the region of positions 341 to 359 of the 16S rRNA gene, which is a sequence common to the amplification site of aceti, is immobilized on the substrate, and as a negative control, a poly T sequence consisting of 20 base pairs is immobilized on the substrate. did.
S. pneumoniae, M .; catarrahalis, C.I. pneumoniae, and A. pneumoniae. 1 ng of the genome of aceti was suspended in TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA), respectively, 0.1 mM deoxyribonucleotide (manufactured by Pharmacia), 4 units of DNA-dependent DNA polymerase, 0.15 μM A mixed solution of each forward primer (SEQ ID NO: 1 to 11) adjusted to 1 and a mixed solution of each reverse primer (SEQ ID NO: 12 to 15) adjusted to 0.15 μM were mixed to prepare a reaction solution. Table 1 shows the primer sequences used in Example 1.
次に、上記反応溶液に対し、９５℃を３０秒、６０℃を９０秒、７２℃を３０秒で４５サイクル反応させてＰＣＲを行った。ＰＣＲ終了後、９５℃で５分反応させた後、各フォワードプライマーを結合させた基板に透明なカバーを被せて、ＰＣＲ反応溶液を凹部に導入した。その後、基板を７０℃の恒温槽に設置し、温度を７０℃に保ち、基板に固定した固相プライマー伸長反応を３０分間行った後、ビオチン標識ｄＵＴＰをストレプトアビジン・アルカリフォスファラーゼを介してＢＩＰＣ／ＮＢＴ発色させ観察した。
この結果を図２に示す。
（ａ）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行い、この反応溶液を基板に展開してＭＰＥＸを行った結果である。基板には表記されている菌種に対する各フォワードプライマーが固定されている。図中、ウェルの色が濃くなっているものが、陽性であったもので、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとポジティブコントロールのウェルで、核酸が検出された。
（ｂ）は、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったもので、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓとポジティブコントロールのウェルで、核酸が検出された。
（ｃ）は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったもので、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのフォワードプライマーが固定されたウェルで、核酸が検出された。ポジティブコントロールに関しては、今回用いたポジティブコントロール用のプライマーにはＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増幅領域が含まれていないため、検出されなかった。
（ｄ）は、対照実験であり、ＰＣＲの鋳型としてＡ．ａｃｅｔｉが用いられている。核酸はポジティブコントロールのみ、検出された。
以上より、基板上で本発明のプライマーセットを用いて、肺炎原因菌の特異的な検出が可能であることが観察された。
Next, PCR was carried out by reacting the reaction solution for 45 cycles at 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 90 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. After completion of PCR, the reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes, and then a transparent cover was placed on the substrate to which each forward primer was bound, and the PCR reaction solution was introduced into the recess. After that, the substrate was placed in a constant temperature bath at 70 ° C., the temperature was kept at 70 ° C., and a solid phase primer extension reaction fixed to the substrate was performed for 30 minutes, and then biotin-labeled dUTP was passed through streptavidin / alkaline phosphatase. BIPC / NBT color was observed and observed.
The result is shown in FIG.
(A) It is the result of performing PCR using the genome of pneumoniae as a template, developing this reaction solution on a substrate, and performing MPEX. Each forward primer for the indicated bacterial species is fixed on the substrate. In the figure, the wells with darker colors were positive. Nucleic acids were detected in pneumoniae and positive control wells.
(B) PCR was performed using the Catarahalis genome as a template. Nucleic acids were detected in the catarahalis and positive control wells.
(C) is C.I. PCR was performed using the genome of P. pneumoniae as a template. Nucleic acids were detected in the wells in which the pneumoniae forward primer was immobilized. Regarding the positive control, the positive control primer used this time was C.I. Since the amplified region of pneumoniae was not included, it was not detected.
(D) is a control experiment where A. aceti is used. Nucleic acid was detected only in the positive control.
From the above, it was observed that pneumonia-causing bacteria can be specifically detected on the substrate using the primer set of the present invention.
（実施例２）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌２菌種の検出
試料中の肺炎原因菌の核酸を同定するため、表１に記載の各肺炎原因菌に特異的なフォワードプライマー（配列番号１〜１１）とリバースプライマー（配列番号１２〜１５）とを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。その後、フォワードプライマーを固定した基板にＰＣＲ産物を展開し、基板に固定した固相プライマー伸長反応を行うと同時に、蛍光試薬により二本鎖ＤＮＡを標識した。その後、蛍光強度を測定することで、肺炎原因菌由来の核酸を検出できるかどうかを検討した。
基板には、各フォワードプライマーを０．５μＭに調整し、図３（ａ）に示すように、基板の各ウェルに、各菌種に特異的なフォワードプライマーを実施例１と同様な方法により固定した。なお、図３（ａ）中、ｍｅｃＡ２、Ｓ．ｓｐＡ２、Ｐ．ａｅｒ２、Ｋ．ｐｎｅ２、Ｌｅｇｉｏ２、Ｍ．ｐｎｅ２に関しては、各フォワードプライマーを１μＭに調整して基板に固定した。
次に、終濃度が１ｎＭとなるようにＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅの核酸、１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、０．1５μＭに調整した各フォワードキメラプライマー、同様に調整した各リバースプライマー、４ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、添付のバッファー、を混合し、９５℃で５分間加熱した後、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行い、ＰＣＲ終了後、９５℃で５分反応させた後、各フォワードプライマーを結合させた基板に透明なカバーを被せて、ＰＣＲ反応溶液を凹部に導入した。その後、基板を７０℃の恒温槽に設置し、温度を７０℃に保ち、ＭＰＥＸ反応を３０分間行った後、５４３ｎｍの励起光で５７６ｎｍの蛍光を観察し，ＣＹ３の蛍光を観察した。
この結果を図３（ｂ）に示す。
図３（ｂ）は、反応終了後の基板をマイクロアレイ・スキャナーで取り込んだ画像である。この図より、試料中に含まれるＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅに対して特異的なフォワードプライマーを配したウェル及びポジティブコントロールを配したウェルにおいて、ＣＹ３の蛍光が観察された。
図３（ｂ）で観察された蛍光強度を、ネガティブコントロールの蛍光強度に対する相対比で表したグラフが、図３（ｃ）である。図３（ｂ）と同様に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅで蛍光強度の増加が観察された。また、固相プライマーの濃度を２倍で固定すると蛍光強度が増加することが観察された。
以上より、複数種類の肺炎原因菌に対する特異的なプライマーが固定された基板において、本発明のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことで、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
(Example 2)
Detection of two pneumonia-causing bacteria using multiplex PCR In order to identify the nucleic acid of pneumonia-causing bacteria in the sample, a forward primer (SEQ ID NO: 1 to 11) specific for each pneumonia-causing bacteria listed in Table 1 Multiplex PCR was performed using reverse primers (SEQ ID NOs: 12-15). Thereafter, the PCR product was developed on the substrate on which the forward primer was fixed, and a solid phase primer extension reaction fixed on the substrate was performed, and at the same time, double-stranded DNA was labeled with a fluorescent reagent. Then, it was investigated whether the nucleic acid derived from a pneumoniae causative microbe could be detected by measuring fluorescence intensity.
For each substrate, each forward primer was adjusted to 0.5 μM, and as shown in FIG. 3A, a forward primer specific for each bacterial species was immobilized in each well of the substrate in the same manner as in Example 1. did. In FIG. 3A, mecA2, S.M. spA2, P.I. aer2, K.K. pne2, Legio2, M.P. For pne2, each forward primer was adjusted to 1 μM and immobilized on the substrate.
Next, the S.P. aureus and P.A. aeruginosae nucleic acid, 1 mM deoxyribonucleotide (Pharmacia), each forward chimeric primer adjusted to 0.15 μM, each similarly adjusted reverse primer, 4 units of Taq polymerase (TaKaRa), and the attached buffer were mixed. After heating at 95 ° C. for 5 minutes, PCR was performed in the same manner as in Example 1. After completion of PCR, the reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes, and then a transparent cover was placed on the substrate to which each forward primer was bound. The PCR reaction solution was introduced into the recess. Thereafter, the substrate was placed in a constant temperature bath at 70 ° C., the temperature was kept at 70 ° C., and the MPEX reaction was performed for 30 minutes. Then, 576 nm fluorescence was observed with 543 nm excitation light, and CY3 fluorescence was observed.
The result is shown in FIG.
FIG. 3B is an image obtained by capturing the substrate after completion of the reaction with a microarray scanner. From this figure, the S.I. aureus and P.A. CY3 fluorescence was observed in wells with a forward primer specific for aeruginosae and wells with a positive control.
FIG. 3C is a graph showing the fluorescence intensity observed in FIG. 3B as a relative ratio to the fluorescence intensity of the negative control. Similar to FIG. aureus and P.A. An increase in fluorescence intensity was observed with aeruginosae. It was also observed that the fluorescence intensity increased when the concentration of the solid phase primer was fixed at 2 times.
As described above, multiple types of pneumonia-causing bacteria can be specifically detected simultaneously by performing multiplex PCR using the primer of the present invention on a substrate on which specific primers for multiple types of pneumonia-causing bacteria are immobilized. Observed.
（実施例３）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌２菌種の検出
肺炎原因菌由来の核酸を実施例２のＳ．ａｕｒｅｕｓからＭＲＳＡに変えて行った。実施方法は、実施例２と同様である。
図４（ｂ）は、反応終了後の基板をマイクロアレイ・スキャナーで測定した結果である。この結果より、試料中に含まれるＭＲＳＡ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅに対して特異的なフォワードプライマーを配したウェルにおいて、ＣＹ３の蛍光が観察された。
図４（ｂ）で観察された蛍光強度を、ネガティブコントロールの蛍光強度に対する相対比で表したグラフが、図４（ｃ）である。図４（ｂ）と同様に、ｍｅｃＡ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅで蛍光強度の増加が観察された。また、基板に固定したフォワードプライマーの濃度を２倍で固定すると蛍光強度が増加することが観察された。
以上より、複数種類の肺炎原因菌に対する特異的なプライマーが固定された基板において、本発明のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことで、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
(Example 3)
Detection of two types of pneumonia-causing bacteria using multiplex PCR. I went from aureus to MRSA. The implementation method is the same as that of Example 2.
FIG. 4B shows the result of measuring the substrate after completion of the reaction with a microarray scanner. From this result, MRSA and P.I. CY3 fluorescence was observed in wells provided with a forward primer specific for aeruginosae.
FIG. 4C is a graph showing the fluorescence intensity observed in FIG. 4B as a relative ratio to the fluorescence intensity of the negative control. Similarly to FIG. 4B, mecA and P.I. An increase in fluorescence intensity was observed with aeruginosae. Further, it was observed that the fluorescence intensity increased when the concentration of the forward primer immobilized on the substrate was fixed twice.
As described above, multiple types of pneumonia-causing bacteria can be specifically detected simultaneously by performing multiplex PCR using the primer of the present invention on a substrate on which specific primers for multiple types of pneumonia-causing bacteria are immobilized. Observed.
（実施例４）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌５菌種の検出
試料中の肺炎原因菌５菌種を検出するために、各肺炎原因菌に特異的なフォワードキメラプライマー（配列番号１６〜２０）とリバースキメラプライマー（配列番号２７〜３０）とを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動にて分離し、各菌種の検出を行った。増幅部位は図１に示す通りである。また、本実施例４で用いたプライマー配列を表２に示す。
Example 4
Detection of 5 pneumonia-causing bacteria using multiplex PCR In order to detect 5 pneumonia-causing bacteria in a sample, a forward chimera primer (SEQ ID NO: 16-20) and reverse chimera specific for each pneumonia-causing fungus Multiplex PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 27 to 30). The obtained PCR products were separated by electrophoresis, and each bacterial species was detected. The amplification site is as shown in FIG. The primer sequences used in Example 4 are shown in Table 2.
等量の肺炎原因菌１０菌種のゲノムを混合した混合溶液を作製し、それぞれの肺炎原因菌のゲノムコピー数が１０６となるように、限界希釈した溶液を調整した。次に、この溶液それぞれに、０．０１ｍＭのデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、に対する０．０２５μＭの各フォワードキメラプライマー、０．０２５μＭに調整した各リバースキメラプライマー、1μＭのユニバーサルプライマー、及び１０００ｐｇのＣＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、を混合させマルチプレックスＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、実施例１と同様である。
ＰＣＲ終了後、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動して各ＰＣＲ産物を分離し、蛍光を観察した。
この結果を、図５及に示す。
図５は、電気泳動後に蛍光強度を測定しグラフにしたもので、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＣＲ産物の塩基数はそれぞれ順に１４６塩基対（図中＜１＞）、２２２塩基対（図中＜２＞）、３８８塩基対（図中＜３＞）、４１６塩基対（図中＜４＞）、４７４塩基対（図中＜５＞）、となっている。なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。
図５より、本発明のキメラプライマーセットを用いることで、マルチプレックスＰＣＲにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
To prepare a mixed solution obtained by mixing equal amounts of
PCR reaction conditions are the same as in Example 1.
After completion of PCR, each PCR product was separated by electrophoresis using a 1.5% agarose gel, and fluorescence was observed.
The results are shown in FIG.
FIG. 5 is a graph showing the fluorescence intensity measured after electrophoresis, and is graphed. , M.M. pneumoniae, S .; pneumoniae, H. et al. influenzae, C.I. The number of bases of the PCR product of pneumoniae was 146 base pairs (<1> in the figure), 222 base pairs (<2> in the figure), 388 base pairs (<3> in the figure), 416 base pairs (in the figure <4>) and 474 base pairs (<5> in the figure). In addition, the number of bases mentioned above has shown the measured value at the time of electrophoresis.
From FIG. 5, it was observed that by using the chimeric primer set of the present invention, multiple types of pneumonia-causing bacteria can be specifically detected simultaneously by multiplex PCR.
（実施例５）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌他の５菌種の検出
実施例４で用いたフォワードキメラプライマーをＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォワードキメラプライマー（配列番号２１〜２５）に変更し、また、リバースキメラプライマーを、配列番号２７，２９，３０の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーに変更して、実施例４と同様な方法によって肺炎原因菌由来の核酸の検出を行った。この結果を、図６に示す。
図６は、電気泳動後に蛍光強度を測定しグラフにしたもので、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＰＣＲ産物の塩基数は、それぞれ順に１２９塩基対（図中＜６＞）、２０８塩基対（図中＜７＞）、２８１塩基対（図中＜８＞）、４０９塩基対（図中＜９＞）、５４７塩基対（図中＜１０＞）、となっている。なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。
図６より、本発明のプライマーセットを用いることで、マルチプレックスＰＣＲにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
(Example 5)
Detection of pneumoniae and other 5 bacterial species using multiplex PCR The forward chimeric primer used in Example 4 catarrhalis, mecA of MRSA, S. aureus spaA, P. a. aeruginosae, K. et al. It changed to the forward chimera primer (sequence number 21-25) with respect to pneumoniae, and the reverse chimera primer was changed into each primer which has each base sequence of
FIG. 6 is a graph showing fluorescence intensity measured after electrophoresis. catarrhalis, mecA of MRSA, S. aureus spaA, P. a. aeruginosae, K. et al. The numbers of pneumoniae and PCR product were 129 base pairs (<6> in the figure), 208 base pairs (<7> in the figure), 281 base pairs (<8> in the figure), and 409 base pairs (in the figure), respectively. <9>), 547 base pairs (<10> in the figure). In addition, the number of bases mentioned above has shown the measured value at the time of electrophoresis.
From FIG. 6, it was observed that multiple types of pneumonia-causing bacteria can be specifically detected simultaneously by multiplex PCR by using the primer set of the present invention.
（実施例６）
マルチプレックスＰＣＲを利用した複数種類の肺炎原因菌の定量的な検出
複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出するために、表２に記載のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するキメラプライマーに特異的なフォワードキメラプライマー（配列番号１６〜２６）、リバースキメラプライマー（配列番号２７〜３０）、及びユニバーサルプライマー（配列番号３１）を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動にて分離し、その後、蛍光強度を測定することで、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出できるかどうかを検討した。増幅部位は図１に示す通りである。
各肺炎原因菌１０菌種のゲノムをそれぞれ終濃度１０１、１０２、１０３、１０４、１０５１０6コピーとなるように混合して調整し、それぞれに１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、上記０．０２５μＭの各フォワードキメラプライマーとリバースキメラプライマー、1μＭのユニバーサルプライマー、１０００ｐｇのＣＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、を混合した。
その後、実施例４と同様にＰＣＲを行い、電気泳動した後、蛍光を観察した。
この結果を図７に示す。
図７は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するキメラプライマーとユニバーサルプライマーとを用いてＰＣＲを行った結果であり、それぞれ順に、ＰＣＲ産物の塩基数は１２９塩基対（図中＜１＞）、１４６塩基対（図中＜２＞）、２０８塩基対（図中＜３＞）、２２２塩基対（図中＜４＞）、２８１塩基対（図中＜５＞）、３８８塩基対（図中＜６＞）、４０９塩基対（図中＜７＞）、４１６塩基対（図中＜８＞）、４７４塩基対（図中＜９＞）、５４７塩基対（図中＜１０＞）となっている。なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。
図７において、鋳型となる核酸のコピー数の増加に伴い、蛍光強度（ＦＵ）の増加が観察された。
(Example 6)
Quantitative detection of multiple types of pneumoniae causative bacteria using multiplex PCR In order to quantitatively detect multiple types of pneumoniae causative bacteria, the M.P. catarrhalis, Legionella spp. MRSA mecA, M.M. pneumoniae, S .; aureus spaA, S. aureus. pneumoniae, P .; aeruginosae, H. et al. influenzae, and C.I. pneumoniae, K. et al. Multiplex PCR was performed using a forward chimera primer (SEQ ID NO: 16-26), a reverse chimera primer (SEQ ID NO: 27-30), and a universal primer (SEQ ID NO: 31) specific for the chimera primer for pneumoniae. The obtained PCR product was separated by electrophoresis, and then it was examined whether multiple types of pneumonia-causing bacteria could be detected quantitatively by measuring fluorescence intensity. The amplification site is as shown in FIG.
The genomes of 10 pneumoniae-causing species are mixed and adjusted so that the final concentrations are 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 10 6 copies, respectively, and 1 mM deoxyribonucleotide (manufactured by Pharmacia) is prepared for each. 4 units of DNA-dependent DNA polymerase (manufactured by Takara), 0.025 μM of each forward chimera primer and reverse chimera primer, 1 μM universal primer, and 1000 pg CYBER Green were mixed.
Thereafter, PCR was performed in the same manner as in Example 4, and after electrophoresis, fluorescence was observed.
The result is shown in FIG.
FIG. catarrhalis, Legionella spp. MRSA mecA, M.M. pneumoniae, S .; aureus spaA, S. aureus. pneumoniae, P .; aeruginosae, H. et al. influenzae, C.I. pneumoniae and K. pneumoniae. It is the result of having performed PCR using the chimera primer and universal primer with respect to pneumoniae, respectively, the number of bases of the PCR product is 129 base pairs (<1> in the figure), 146 base pairs (<2> in the figure), 208 base pairs (<3> in the figure), 222 base pairs (<4> in the figure), 281 base pairs (<5> in the figure), 388 base pairs (<6> in the figure), 409 base pairs (in the figure) <7>), 416 base pairs (<8> in the figure), 474 base pairs (<9> in the figure), and 547 base pairs (<10> in the figure). In addition, the number of bases mentioned above has shown the measured value at the time of electrophoresis.
In FIG. 7, an increase in fluorescence intensity (FU) was observed with an increase in the copy number of the nucleic acid serving as a template.
（実施例７）
マルチプレックスＰＣＲを利用した複数種類の肺炎原因菌の定量的な検出
図８〜図１１はリアルタイムＰＣＲによって蛍光強度を経時的に観察したものである。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムをそれぞれ終濃度１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０6コピーとなるように混合して調整し、また、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに関しては、ゲノムをそれぞれ終濃度１０１、１０２、１０３、１０４、１０５コピーとなるように混合して調整し、ＭＲＳＡに関しては、ゲノムをそれぞれ終濃度１０６１０７１０８となるように混合して調整し、ゲノム溶液を作製した。それぞれのゲノム溶液に、１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、表２に記載の０．０２５μＭの各フォワードキメラプライマーとリバースキメラプライマー、1μＭのユニバーサルプライマー、１０００ｐｇのＣＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、を混合した。その後、リアルタイムＰＣＲを行い、蛍光を観察した。ＰＣＲの反応条件は、実施例１と同様である。
この結果を図８〜図１１に示す。図８〜図１１より、サイクル数が増加していったとき、鋳型の量に依存した蛍光強度の増加が観察された。
よって、本発明のキメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いることで、マルチプレックスＰＣＲにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量的に検出できることが観察された。
(Example 7)
Quantitative detection of multiple types of pneumonia causing bacteria using multiplex PCR FIG. 8 to FIG. 11 are observations of fluorescence intensity over time by real-time PCR. M.M. catarrhalis, Legionella spp. , M.M. pneumoniae, S .; aureus spaA, P. a. aeruginosae, C.I. pneumoniae and K. pneumoniae. pneumoniae genomes were mixed and adjusted to final concentrations of 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 copies, respectively. pneumoniae and H. pneumoniae. For influenza, the genomes were mixed and adjusted to a final concentration of 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 copies, respectively, and for MRSA, the genomes were adjusted to a final concentration of 10 6 10 7 10 8 respectively. The genomic solution was prepared by mixing and adjusting. In each genome solution, 1 mM deoxyribonucleotide (manufactured by Pharmacia), 4 units of DNA-dependent DNA polymerase (manufactured by Takara), 0.025 μM of each forward chimera primer and reverse chimera primer described in Table 2, 1 μM universal Primers, 1000 pg CYBER Green, were mixed. Thereafter, real-time PCR was performed and fluorescence was observed. PCR reaction conditions are the same as in Example 1.
The results are shown in FIGS. From FIG. 8 to FIG. 11, when the number of cycles increased, an increase in fluorescence intensity depending on the amount of the template was observed.
Therefore, it was observed that multiple types of pneumonia-causing bacteria can be simultaneously and quantitatively detected by multiplex PCR using the chimeric primer and universal primer of the present invention.
本発明を用いることにより、複数種類の肺炎原因菌を一度に検出することができる。また、定量的な検出が可能であるので、微量でも肺炎を起こす原因菌の検出や、感染量により病症が異なる原因菌の検出に有効である。
本発明のプライマーセットを用いた肺炎原因菌の検出システムは、クラミジアやリッケッチアなど培養困難な病原微生物、薬剤耐性菌など院内感染原因菌に対して適切な治療法選択のための臨床診断用簡易検査試薬として利用可能である。更に、本発明では基板に合成樹脂を用いており、取り扱いが簡便で検出用機器に合わせた加工が可能な汎用性の高いシステムを提供することが可能となる。
By using the present invention, multiple types of pneumonia-causing bacteria can be detected at once. Further, since quantitative detection is possible, it is effective for detection of causative bacteria that cause pneumonia even in a minute amount, and detection of causative bacteria having different diseases depending on the amount of infection.
The detection system for pneumonia-causing bacteria using the primer set of the present invention is a simple clinical diagnostic test for selecting appropriate treatments for pathogenic microorganisms such as chlamydia and rickettsia, which are difficult to culture, and drug-resistant bacteria. It can be used as a reagent. Furthermore, in the present invention, a synthetic resin is used for the substrate, so that it is possible to provide a highly versatile system that is easy to handle and can be processed according to the detection device.
Claims (15)
配列番号１の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、
前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とするプライマーセット。 It is a primer set used for detection of multiple types of pneumonia causing bacteria,
A forward primer consisting of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 1, a forward primer consisting of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 2, A forward primer consisting of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 3, a forward primer consisting of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 4, A reverse primer consisting of a base sequence having a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 12 and a reverse primer consisting of a base sequence having a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 13 Have
The primer set, wherein the promoter sequence 5'-side of each primer are both the same promoter sequence.
前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。 Furthermore, a forward primer consisting of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a forward primer consisting of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 6 And a forward primer composed of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a forward primer composed of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 8 A forward primer composed of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 9 and a forward primer composed of a base sequence with a promoter sequence added to the 5 ′ side of the base sequence of SEQ ID NO: 10 When, it the nucleotide sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 Has a reverse primer, 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer promoter sequence consists added in the nucleotide sequence,
The primer set according to claim 1 in which the promoter sequence 5'-side of each primer and wherein the both are identical promoter sequences.
（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程、
（２）工程（１）で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、プロモーター配列と相同的な配列からなるユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅を行う工程、
（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物を検出する工程、
を少なくとも含むことを特徴とする肺炎原因菌の検出方法。 A method for detecting pneumonia-causing bacteria by nucleic acid amplification,
(1) A step of performing nucleic acid amplification using the primer set according to any one of claims 1 to 3,
(2) a nucleic acid amplification product obtained in step (1) as a template, performing nucleic acid amplification using the universal primers consisting of promoter sequences homologous to sequences process,
(3) detecting the nucleic acid amplification product obtained in step (2),
A method for detecting a pneumonia-causing bacterium characterized by comprising:
前記工程（３）の検出方法が、
前記工程（２）で得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性する工程、
基板に固定された配列番号１〜１０の塩基配列からなるプライマーの群からなる１以上のフォワードプライマーと該一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせることにより二本鎖ＤＮＡを形成する工程、
及び該二本鎖ＤＮＡを標識試薬を用いて検出する工程、
を少なくとも有することを特徴とする請求項７に記載の肺炎原因菌の検出方法。 A method for detecting pneumonia-causing bacteria by nucleic acid amplification,
The detection method of the step (3) includes:
Denaturing the nucleic acid amplification product obtained in the step (2) into a single strand;
Forming a double-stranded DNA by hybridizing the single-stranded DNA with one or more forward primers consisting of a group of primers consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 fixed to a substrate;
And detecting the double-stranded DNA using a labeling reagent,
The method for detecting pneumonia-causing bacteria according to claim 7, comprising:
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