JP5403573B2 - Pneumonia-causing bacteria detection primer set - Google Patents

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本発明は、複数種類の肺炎原因菌を検出しうるプライマーセットと、肺炎原因菌の検出方法に関するものであり、より詳しくは、前記プライマーセットを用いて核酸増幅を行うことで、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出する方法に関する。 The present invention includes a primer set capable of detecting a plurality of types of pneumonia causing bacteria, relates detecting method of pneumonia causing bacteria, and more particularly, by performing nucleic acid amplification using the primer set, a plurality of types of pneumonia the causative bacteria relates to a method for quantitatively detecting.

肺炎は日本人の死因別死亡率で第4位、がん等の基礎疾患の合併症としてもしばしば起こり、罹患者数が非常に多い疾患として知られている。 Pneumonia Ranked # 4 in cause-specific mortality of the Japanese, also often occur as complications of underlying diseases such as cancer, sufferers number is known as a very large disease. 従来肺炎の原因となる微生物(原因菌)の探索試験として行われている培養検査は少なくとも数日の時間を要し、更に培養された原因菌について薬剤感受性試験を行うと1週間近くもかかることから、治療選択に十分寄与する検査方法にはなっていない。 Conventional pneumonia-causing microorganisms search conducted by that culture test as a test for (causative bacteria) of is time consuming at least a few days, when the drug sensitivity test 1 week close take for further cultured causative bacteria from, not in a sufficiently contribute inspection method for the treatment selection. 救急救命病室(ICU)に入院が必要な重症の肺炎に関しては、迅速で正確な原因菌の決定が治療選択において極めて重要であり、適切な初期治療は肺炎患者の救命確率を確実に上昇させることが報告されている。 For the critical care hospital room (ICU) requires hospitalization for severe pneumonia, rapid and extremely important in determining the treatment selection of the exact cause bacteria, appropriate initial treatment can be reliably raised lifesaving probability of patients with pneumonia There has been reported. しかし実際には、依然として培養法に代わる原因菌同定技術が確立されていないため、原因菌が不明の状態で治療を行わなければならないのが現状である。 However, in practice, because they are not still established the cause bacteria identification technology to replace the culture method, the causative organism is at present, it must be carried out treatment in unknown condition. そのため、経験治療による抗生物質の使用がやむを得ず、耐性菌の出現にも繋がる虞がある。 Therefore, use of antibiotics empirical therapy forced, there is a risk that leads to the emergence of resistant bacteria.

肺炎の原因となる原因菌は、発生頻度の高い菌種が全体の50%近くを占め、ウイルスまで含めた主な原因菌は20−30種類程度である。 Causative bacteria causing pneumonia, accounting for nearly 50% higher bacterial strains of the entire occurrence frequency, the major causative bacteria including up viruses are 20-30 Type about. この中には通常の手法で培養できないものもあり、培養法による原因菌決定が困難である場合も多い。 Some of this may not be cultured in a conventional manner, in many cases it is difficult to cause bacteria determined by the culture method. また、原因菌の種類によって最適な治療薬が異なるが、原因菌決定前に治療を開始するのも医療倫理上やむを得ない実情である。 Although the optimal therapeutic agents differ depending on the kind of causative bacteria, which is a medical ethical unavoidable circumstances also to begin treatment before causing bacteria determination. これらの問題を解決するために、複数種類の菌種の中から特定の菌を迅速かつ定量的に検出可能な手法の開発が待たれていた。 To solve these problems, development of a rapid and quantitatively detect possible approach specific bacteria from a plurality of types of bacterial species has been awaited.

細菌の同定に関しては、従来から用いられてきた培養を介した同定法や染色による同定法、ATPなど細菌の代謝に係る物質を計測する方法に加え、核酸増幅やマイクロアレイ技術を用いた細菌同定法が開発されている。 For the bacterial identification, identification method according to the identification method and dyeing through culture which has been used conventionally, in addition to the method for measuring a substance according to the bacterial metabolism such as ATP, bacterial identification method using a nucleic acid amplification and microarray technology There has been developed. 特に、ある細菌の遺伝子配列に特異的な塩基配列を有する核酸をプローブとして合成し、これを基板上に固定して検体から増幅された遺伝子とハイブリダイズさせる手法は、各菌種が持つ特異的な塩基配列を用いるため、正確な検出が可能であり、現在様々な形で応用が進められている(特許文献1−4、非特許文献1)。 In particular, specific nucleic acid synthesized as a probe, which approach to gene hybridized amplified from the specimen was fixed on a substrate, with each species having a nucleotide sequence specific to the gene sequence of a bacterial such for using nucleotide sequence, are possible accurate detection, it has been advanced applications currently in various forms (Patent Document 1-4, non-patent Document 1).

しかしながら、従来の核酸増幅を用いた菌類の検出方法では、個々に肺炎原因菌を検出することは可能であるが、複数種類の肺炎原因菌を検出しようとすると複数回の核酸増幅を行う必要があり、時間とコストを要する。 However, in the method of detecting fungi using conventional nucleic acid amplification, it is possible to detect pneumonia causing bacteria individually, it must be performed a plurality of times of nucleic acid amplification when you try to detect multiple types of pneumonia causing bacteria Yes, it takes time and cost. 特に、生体検体は微量である場合が多いため、検体量が不足し十分に検出できない問題があった。 In particular, the biological specimen because often a small amount, a problem of sample volume can not be sufficiently detected shortage. 複数種類の肺炎原因菌を同時に検出する方法としては、例えばマルチプレックスPCR法がある。 As a method of detecting a plurality of types of pneumonia causing bacteria simultaneously, for example, a multiplex PCR method. マルチプレックスPCR法は、1回のPCRで複数種類の標的核酸を増幅する方法であり、検体が微量であっても複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。 Multiplex PCR method is a method of amplifying a plurality of types of target nucleic acids in a single PCR, it is possible to detect analyte multiple types of pneumonia causing bacteria even trace amounts simultaneously. ただし、マルチプレックスPCR法では、1の反応溶液中に複数のプライマーが存在するため、プライマーダイマーの形成やミスアニーリング等が生じ非特異的な増幅が生じやすい。 However, multiplex PCR method, since a plurality of primers are present in a reaction solution, nonspecific amplification is likely to occur is formed and misannealing such primer dimers. このため、このような非特異的な核酸の増幅を防止し、かつ一度のPCR条件で増幅可能である様にTm値や塩基配列等を調整したプライマーからなるプライマーセットを用いる必要がある。 Therefore, to prevent the amplification of such a non-specific nucleic acid, and it is necessary to use a primer set consisting of primers by adjusting the Tm values ​​or nucleotide sequence such as is amplifiable in a single PCR conditions. しかしながら、主要な肺炎原因菌であるStreptococcus pneumoniae(S.pneumoniae)、Hemophilus influenzae(H.influenzae)、Mycoplasma pneumoniae(M.pneumoniae)、及びChlamydophilia pneumoniae(C.pneumoniae)の標的核酸を1のPCRで特異的に増幅できるプライマーセットは未だに開発されていなかった。 However, a major pneumonia causative bacteria Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae), Hemophilus influenzae (H.influenzae), Mycoplasma pneumoniae (M.pneumoniae), and Chlamydophilia pneumoniae specific target nucleic acid in 1 PCR of (C. pneumoniae) primer set that can amplify had not yet been developed.
特開2002−512688号公報 JP 2002-512688 JP 特開2006−025791号公報 JP 2006-025791 JP 特開2006−061155号公報 JP 2006-061155 JP 特開2006−300268号公報 JP 2006-300268 JP

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、核酸増幅によって、肺炎原因菌であるS. The present invention was made in view of the above circumstances, the nucleic acid amplification, a pneumonia-causing bacteria S. pneumoniae、H. pneumoniae, H. influenzae、M. influenzae, M. pneumoniae、及びC. pneumoniae, and C. pneumoniaeを同時に検出が可能となるプライマーセットを提供することを第一の目的とする。 To provide a primer set pneumoniae becomes possible to simultaneously detect the first object.
また、本発明は、上記プライマーセットを用いて、複数種類の肺炎原因菌を一度に特異的に検出する検出方法を提供することを第二の目的とする。 Further, the present invention uses the above primer set, and a second object is to provide a detecting method for detecting a plurality of types of pneumonia causing bacteria in specifically once.

本発明の請求項1に係るプライマーセットは、複数種類の肺炎原因菌の検出に用いられるプライマーセットであって、配列番号1の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号3の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号4の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号12の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号13の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からな Primer set according to claim 1 of the present invention is a primer set used to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria, a promoter sequence consists added in the nucleotide sequence on the 5 'side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and forward primer consists of a forward primer promoter sequence consists of added base sequence, the base sequence of SEQ ID NO: 3 5'-side nucleotide sequence promoter sequence is added to the 5 'side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and forward primer consists of a forward primer promoter sequence consists of added base sequence, the base sequence of SEQ ID NO: 12 5'-side nucleotide sequence promoter sequence is added to the 5 'side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and reverse primer, I nucleotide sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 リバースプライマーとを有し、前記各プライマー 5´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする。 And a reverse primer, wherein said a promoter sequence promoter sequences are both the same 5'-side of each primer.

本発明の請求項2に係るプライマーセットは、請求項1において、更に、配列番号5の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号6の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号7の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号8の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号9の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号10の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号14の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された Primer set according to claim 2 of the present invention, in claim 1, further comprising: a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and 5'-side forward primer promoter sequence consists of the added nucleotide sequence, and a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 a forward primer promoter sequence consists added in the nucleotide sequence on the 5 'side of, and forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 a forward primer having a promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 基配列からなるリバースプライマーと、配列番号15の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、前記各プライマー 5´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする。 Same reverse primer consisting of group sequence, and a reverse primer comprising a nucleotide sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, both the promoter sequence 5'-side of each primer characterized in that it is a promoter sequence.

本発明の請求項3に係るプライマーセットは、請求項1又は2において、 前記プロモーター配列が、T7RNA合成酵素のプロモーター配列であることを特徴とする。 Primer set according to claim 3 of the present invention, in claim 1 or 2, wherein the promoter sequence, characterized in that it is a promoter sequence of T7RNA synthase.

本発明の請求項4に係る肺炎原因菌検出用キットは、肺炎原因菌検出用キットであって、請求項1〜3のいずれかに記載のプライマーセットと、DNAポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを有することを特徴とする。 Pneumonia causing bacteria detection kit according to claim 4 of the present invention is a pneumonia-causing bacteria detection kit, and primer set according to claim 1, and DNA polymerase, and nucleotides, nucleic acid amplification and having a use buffer.

本発明の請求項5に係る肺炎原因菌の検出方法は、肺炎原因菌の検出方法であって、請求項1〜3のいずれかに記載のプライマーセットを用いることを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 5 of the present invention provides a method of detecting pneumonia causing bacteria, which comprises using the primer set according to claim 1.

本発明の請求項6に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項5において、請求項1〜3のいずれかに記載のプライマーセットを用いた核酸増幅により、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出することを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to Claim 6 of the present invention, in claim 5, by a nucleic acid amplification using the primer set according to any of claims 1 to 3, quantitative multiple types of pneumonia causing bacteria and detecting the.

本発明の請求項7に係る肺炎原因菌の検出方法は、核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、(1)請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程、(2)工程(1)で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、プロモーター配列と相同的な配列からなるユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅を行う工程、(3)工程(2)で得られた核酸増幅産物を検出する工程、を少なくとも含むことを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 7 of the present invention provides a method of detecting pneumonia causing bacteria by nucleic acid amplification, (1) using the primer set according to any one of claims 1 to 3 step of performing a nucleic acid amplification, (2) a nucleic acid amplification product obtained in step (1) as a template, performing nucleic acid amplification using the universal primers consisting of promoter sequences homologous to sequences process, (3) step (2 detecting the nucleic acid amplification products obtained by), characterized in that the at least.

本発明の請求項8に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項7において、核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、前記工程(3)の検出方法が、前記工程(2)で得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性する工程、基板に固定された配列番号1〜10の塩基配列からなるプライマーの群からなる1以上のフォワードプライマーと該一本鎖DNAとをハイブリダイズさせることにより二本鎖DNAを形成する工程、及び該二本鎖DNAを標識試薬を用いて検出する工程、とを少なくとも有することを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 8 of the present invention, in claim 7, a method for detecting pneumonia causing bacteria by nucleic acid amplification, detection method of the step (3) is, in the step (2) the step of modifying the obtained nucleic acid amplification products into single strands, one or more forward primer and hybridized with said single stranded DNA consisting of the group of primer consisting of fixed SEQ ID NO: 10 nucleotide sequence to the substrate forming a double-stranded DNA by, and the step of detecting using a labeled reagent the double-stranded DNA, characterized by having at least a city.

本発明の請求項9に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項6乃至8において、マルチプレックスPCRを用いることを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 9 of the present invention, in claims 6 to 8, characterized by using a multiplex PCR.

本発明の請求項10に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項7乃至9において、前記ユニバーサルプライマーの濃度が、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットのプライマーの濃度の10倍以上であることを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 10 of the present invention is the claims 7 to 9, the concentration of the universal primer, the concentration of primers in the primer set according to any one of claims 1 to 3 characterized in that it is 10 times or more.

本発明の請求項11に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項8乃至10において、前記基板が平板状またはチューブ状であって、前記プライマーが前記基板表面に固定されていることを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 11 of the present invention, in claim 8 to 10, and wherein the substrate is a plate-like or tubular, wherein the primer is fixed on the substrate surface to.

本発明の請求項12に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項8乃至11において、前記基板が平板状で、かつ、複数の凹部を有し、前記プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 12 of the present invention, in claim 8 or 11, wherein the substrate is a flat plate shape and has a plurality of recesses, that the primer is fixed on the recess and wherein the

本発明の請求項13に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項12において、前記基板上に設けられた複数の前記凹部を、全て覆うことが可能な透明なカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 13 of the present invention, in claim 12, a plurality of said recesses provided on the substrate, with a transparent cover that can cover all of the reaction solution and introducing into the recess by surface tension.

本発明の請求項14に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項8乃至13において、前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 14 of the present invention, in claim 8 to 13, wherein the labeling reagent is a fluorescent dye.

本発明の請求項15に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項14において、前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 15 of the present invention, in claim 14, the fluorescence amount of the fluorescent dye, characterized in that measured over time.

本発明のプライマーセットによれば、複数種類の肺炎原因菌を特異的に検出することが可能となる。 According to the primer set of the present invention, it is possible to specifically detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria.
また、本発明のプライマーセットを用いた肺炎原因菌の検出方法によれば、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。 Further, according to the detection method of pneumonia causing bacteria using the primer set of the present invention, it is possible to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria simultaneously.
特に該プライマーセットを用いて核酸増幅を行うことで、簡便に複数種類の肺炎原因菌を検出することが可能となる。 In particular, by performing nucleic acid amplification using the primer set, conveniently it is possible to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria. また、一度の核酸増幅により複数種類の肺炎原因菌を検出することができるため、検体の量が少ない場合においても有効であり、かつ多検体を迅速に検出することが可能である。 Further, it is possible to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria by a single nucleic acid amplification, it is effective even when the amount of the analyte is small, and it is possible to quickly detect multiple analytes.
更に、上記プライマーセットの5´側にプロモーター配列を有しているキメラプライマーと、該プロモーター配列と相同な塩基配列を有するユニバーサルプライマーとを用いて核酸増幅を行うことで、各プライマー間での増幅効率がユニバーサルプライマーを用いることで統一され、複数種類の肺炎原因菌を簡便にかつ迅速に定量的に検出することが可能となる。 Furthermore, by performing nucleic acid amplification using a chimeric primer that has a promoter sequence on the 5'-side of the primer set, a universal primer having the promoter sequence homologous to the base sequence, amplification between each primer efficiency is unified by use of the universal primers, it is possible to easily and quickly quantitatively detecting a plurality of types of pneumonia causing bacteria.

本発明の第一実施形態は、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することができるプライマーセットである。 First embodiment of the present invention is a primer set capable of detecting a plurality of types of pneumonia causing bacteria simultaneously.

以下、プライマーセットを構成するフォワードプライマーについて説明する。 The following describes a forward primer that constitutes the primer set.
配列番号1の塩基配列を有するプライマーは、Streptococcus pneumoniae(S.pneumoniae)の16srRNAをコードする遺伝子領域の転写開始部位を1位としたとき(以下同様)、202位〜223位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, homologous to 16srRNA when the 1-position of the transcription start site of the gene encoding region (hereinafter the same), position 202 to 223 of the nucleotide sequence of Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) having base sequences.
配列番号2の塩基配列を有するプライマーは、Hemophilus influenzae(H.influenzae)の16srRNA遺伝子の165位〜187位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 has a homologous nucleotide sequence to position 165 ~187 positional base of 16srRNA gene Hemophilus influenzae (H.influenzae).
配列番号3の塩基配列を有するプライマーは、Mycoplasma pneumoniae(M.pneumoniae)の16srRNA遺伝子の1225位〜1245位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 has a homologous nucleotide sequence to the 1225 position ~1245 positional base of 16srRNA gene Mycoplasma pneumoniae (M.pneumoniae).
配列番号4の塩基配列を有するプライマーは、Chlamydophilia pneumoniae(C.pneumoniae)の16srRNA遺伝子の994位〜1017位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 has a homologous nucleotide sequence to 994 of ~1017 positional base of 16srRNA gene Chlamydophilia pneumoniae (C.pneumoniae).
配列番号5の塩基配列を有するプライマーは、Legionella pneumoniae(Legionella spp.)の16srRNA遺伝子の436位〜459位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 has a homologous nucleotide sequence to position 436 ~459 positional base of 16srRNA gene Legionella pneumoniae (Legionella spp.).
配列番号6の塩基配列を有するプライマーは、Klebsiella pneumoniae(K.pneumoniae)の16srRNA遺伝子の塩基配列の52位〜71位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 has a homologous nucleotide sequence to the 52-position to 71-position base of the base sequence of the 16srRNA gene Klebsiella pneumoniae (K.pneumoniae).
配列番号7の塩基配列を有するプライマーは、Pseudomonas aeruginosae(P.aeruginosae)の16srRNA遺伝子の164位〜185位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 has a homologous nucleotide sequence to position 164 to 185 of bases of 16srRNA gene Pseudomonas aeruginosae (P.aeruginosae).
配列番号8の塩基配列を有するプライマーは、Moraxella catarrhalis(M.catarrhalis)の16srRNA遺伝子の453位〜473位の塩基に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 has a homologous nucleotide sequence to 453 of ~473 positional base of 16srRNA gene Moraxella catarrhalis (M.catarrhalis).
配列番号9の塩基配列を有するプライマーは、Staphylococcus aureus(S.aureus)のspaA遺伝子をコードする遺伝子領域の転写開始部位を1位としたとき、1160位〜1183位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, when the Staphylococcus aureus 1 of the transcription start site of the coding gene region of spaA gene (S.aureus), homologous to base 1160 of ~1183 position of the base sequence having the sequence.
配列番号10の塩基配列を有するプライマーは、Methicillin−Resistant Staphylococcus Aureus(MRSA)のmecA遺伝子をコードする遺伝子領域の転写開始部位を1位としたとき、270位〜292位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。 Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, when the Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus 1 of the transcription start site of the coding gene region of mecA gene (MRSA), a homologous to position 270 ~292 position of the base sequence having the nucleotide sequence.
このように、上記の各フォワードプライマーは、それぞれの菌種に特異的な16srRNA遺伝子、spaA遺伝子又はmecA遺伝子の塩基配列に相同的な塩基配列を有している。 Thus, each forward primer described above, 16s rRNA gene specific for each species, have a homologous nucleotide sequence to the nucleotide sequence of spaA gene or mecA gene.

次に、プライマーセットを構成するリバースプライマーについて説明する。 It will now be described reverse primer that constitutes the primer set.
配列番号12の塩基配列を有するリバースプライマーは、S. Reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, S. pneumoniae、H. pneumoniae, H. influenzae、Legionella spp. influenzae, Legionella spp. 、K. , K. pneumoniae、P. pneumoniae, P. aeruginosae、M. aeruginosae, M. catarrhalisに対応するものであり、前記6菌種の肺炎原因菌の16SrRNA遺伝子の共通配列で、502位〜519位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。 Are those corresponding to catarrhalis, a common sequence of 16SrRNA gene of the 6 species of pneumonia causing bacteria has a nucleotide sequence complementary to 502 of ~519 position of the base sequence.
配列番号13の塩基配列を有するプライマーは、M. Primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, M. pneumoniae及びC. pneumoniae and C. pneumoniaeに対応するものであり、前記2菌種の肺炎原因菌の16SrRNA遺伝子の共通配列で、1378位〜1392位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。 Are those corresponding to pneumoniae, a common sequence of 16SrRNA gene pneumoniae bacteria causing the two species, it has a nucleotide sequence complementary to 1378 position ~1392 position of the base sequence.
配列番号14の塩基配列を有するリバースプライマーは、MRSAのmecA遺伝子に対応するものであり、402位〜419位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。 Reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14, which corresponds to the mecA gene of MRSA, with a nucleotide sequence complementary to position 402 ~419 position of the base sequence.
配列番号15の塩基配列を有するリバースプライマーは、S. Reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, S. aureusのspaA遺伝子に対応するものであり、1363位〜1383位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。 Is intended to correspond to the spaA gene aureus, it has a nucleotide sequence complementary to 1363 position ~1383 position of the base sequence.

配列番号1の塩基配列を有するプライマーと配列番号12の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、S. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, S. pneumoniaeの16SrRNA遺伝子の202位〜519位の領域が増幅され、318塩基対の増幅産物が得られる。 Region of position 202 ~519 position of 16SrRNA gene pneumoniae is amplified, the amplification product of 318 bp is obtained.
配列番号2の塩基配列を有するプライマーと配列番号12の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、H. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, H. influenzaeの16SrRNA遺伝子の165位〜519位の領域が増幅され、355塩基対の増幅産物が得られる。 Region of position 165 ~519 position of 16SrRNA gene influenzae is amplified, the amplification product of 355 bp is obtained.
配列番号3の塩基配列を有するプライマーと配列番号13の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、M. By performing PCR using primers having a primer with a base sequence of SEQ ID NO: 13 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, M. pneumoniaeの16SrRNA遺伝子の1225位〜1392位の領域が増幅され、168塩基対の増幅産物が得られる。 Area of ​​1225 positions ~1392 position of 16SrRNA gene pneumoniae is amplified, the amplification product of 168 bp is obtained.
配列番号4の塩基配列を有するプライマーと配列番号13の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、C. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 13 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, C. pneumoniaeの16SrRNA遺伝子の994位〜1392位の領域が増幅され、399塩基対の増幅産物が得られる。 Region of 994 of ~1392 position of 16SrRNA gene pneumoniae is amplified, the amplification product of 399 bp is obtained.
配列番号5の塩基配列を有するプライマーと配列番号12の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、Legionella spp. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, Legionella spp. の16SrRNA遺伝子の436位〜519位の領域が増幅され、84塩基対の増幅産物が得られる。 It is amplified 436 of ~519 position of the region of the 16SrRNA gene amplification product of 84 bp is obtained.
配列番号6の塩基配列を有するプライマーと配列番号12の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、K. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, K. pneumoniaeの16SrRNA遺伝子の52位〜519位の領域が増幅され、468塩基対の増幅産物が得られる。 Region of position 52 ~519 position of 16SrRNA gene pneumoniae is amplified, the amplification product of 468 bp is obtained.
配列番号7の塩基配列を有するプライマーと配列番号12の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、P. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, P. aeruginosaeの16SrRNA遺伝子の164位〜519位の領域が増幅され、356塩基対の増幅産物が得られる。 Region of position 164 ~519 position of 16SrRNA gene aeruginosae is amplified, the amplification product of 356 bp is obtained.
配列番号8の塩基配列を有するプライマーと配列番号12の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、M. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, M. catarrhalisの16SrRNA遺伝子の453位〜519位の領域が増幅され、67塩基対の増幅産物が得られる。 Region of 453 of ~519 position of 16SrRNA gene catarrhalis is amplified, the amplified product of 67 bp is obtained.
配列番号9の塩基配列を有するプライマーと配列番号15の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、S. By performing PCR using primers having the base sequence of primer SEQ ID NO: 15 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, S. aureusのspaA遺伝子の1160位〜1383位の領域が増幅され、224塩基対の増幅産物が得られる。 Area of ​​1160 positions ~1383 position of spaA gene aureus is amplified, the amplification product of 224 bp is obtained.
配列番号10の塩基配列を有するプライマーと配列番号14の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより、MRSAのmecA遺伝子の270位〜419位の領域が増幅され、151塩基対の増幅産物が得られる。 By performing PCR using primers having the nucleotide sequence of the primer with SEQ ID NO: 14 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, the region of position 270 ~419 position of the mecA gene of MRSA is amplified, the 151 base pair amplification product It is obtained.

図1は、上記プライマーの16SrRNA遺伝子内の増幅領域を模式的に示した図である。 Figure 1 is a diagram schematically showing the amplification region within the 16SrRNA gene the primer. 図中、欄外の直線は16SrRNA遺伝子の1位から1500位までを模式的に示している。 In the figure, the margin of the straight line indicates the 1500 position from position 1 16SrRNA gene schematically. 図中、矢印は、各プライマーを表しており、16SrRNA遺伝子に対応する部位に配置している。 In the figure, arrows represent each primer, are arranged at portions corresponding to the 16SrRNA gene. 矢印の矢尻は5´側を示している。 Arrowhead arrows indicate 5'-side. また、太い直線はフォワードプライマーとリバースプライマーとで増幅される領域を示している。 Further, the thick straight line indicates the region amplified by the forward primer and reverse primer. S. S. aureusのspaA遺伝子、及びMRSAのmecA遺伝子の増幅領域は、16SrRNA遺伝子内には設定されていないので、図中には記されていない。 Amplification region of spaA gene and the mecA gene of MRSA S. aureus is because in the 16SrRNA gene is not set, not listed in the figure.
図中「Int.cont」は内部コントロールを意味する。 In the figure, "Int.cont" refers to the internal control.

内部コントロールとして、人の常在菌ではないAcetobacter aceti(A.aceti)を用いることが好ましい。 As an internal control, it is preferable to use the Acetobacter aceti (A.aceti) not normal flora of humans. 核酸増幅に用いるプライマーとしては、配列番号11の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号12の塩基配列を有するリバースプライマーとを用いる。 The primers used for nucleic acid amplification, a forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, using a reverse primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
配列番号11の塩基配列を有するフォワードプライマーは、16SrRNA遺伝子の353位〜374位の塩基配列に相同的な配列を有する。 Forward primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 has a sequence homologous to position 353 ~374 position of the base sequence of 16SrRNA gene. 配列番号11の塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号12の塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCRを行うことにより、A. By performing PCR using a reverse primer having the nucleotide sequence of the forward primer and SEQ ID NO: 12 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, A. acetiの16SrRNA遺伝子の353位〜519位の領域が増幅され、167塩基対の増幅産物が得られる。 Region of position 353 ~519 position of 16SrRNA gene aceti is amplified, the amplification product of 167 bp is obtained.

本発明におけるプライマーの合成は、当該技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。 Synthesis of the primer of the present invention can be carried out using techniques known in the art.

配列番号1〜15の塩基配列を有する各プライマーは、Tm値がほぼ一致しているため、同一のPCR条件で核酸増幅をすることができる。 Each primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1-15, since the Tm value is substantially equal to, can be a nucleic acid amplification under the same PCR conditions. 又、これら全てのプライマーは特異性に優れているために、1の反応溶液中に添加した状態でPCRを行った場合には、プライマーダイマーの形成やミスアニーリング等による非特異的な核酸増幅はほとんど生じない。 Also, since all of the primers of these are excellent in specificity, 1 when PCR was carried out in a state of being added to the reaction solution of the non-specific nucleic acid amplification by forming and misannealing such primer dimers hardly. このため、本発明のプライマーセットを用いることにより複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。 Therefore, it is possible to simultaneously detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria by using a primer set of the present invention. 特に、配列番号1〜15の各塩基配列を有する各プライマーを有するプライマーセットを用いることにより、主要な肺炎原因菌である10菌種全てを同時に特異的に検出することが可能である。 In particular, by using a primer set having a respective primers having the respective nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15, it is possible to simultaneously specifically detect 10 species are all major pneumonia causing bacteria.

また、本発明のプライマーセットの各プライマーは、各遺伝子の塩基配列に対する特異性を喪失しない限り、付加的な塩基配列を有していてもよく、標識されていてもよい。 Furthermore, each primer of the primer set of the present invention, unless loss of specificity to the nucleotide sequence of each gene may have additional nucleotide sequences, may be labeled. 該標識は、通常核酸の標識に用いることができる物質であれば特に限定されるものではなく、蛍光物質やビオチン等の低分子化合物等が挙げられる。 The label is not particularly limited as long as it is a substance which can be used for the normal labeling of nucleic acids, low molecular compounds such as fluorescent substance or biotin. 又、該付加的な塩基配列として、制限酵素認識配列や各種プロモーター配列等がある。 Further, as the additional nucleotide sequence, there is a restriction enzyme recognition sequence and various promoter sequences and the like.

特に、本発明のプライマーセットは、第一実施形態のプライマーセットの5´側にプロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットとすることが好ましい。 In particular, the primer set of the present invention, it is preferable that the primer set consisting of a chimeric primer added a promoter sequence at the 5 'side of the primer set of the first embodiment.
該プロモーター配列に関しては、T7RNA合成酵素のプロモーター配列(5´−TAATACGACTCACTATAGGGCGA−3´)、T3RNA合成酵素のプロモーター配列(5´−TTATTAACCCTCACTAAAGGGAAG−3´)、SP6RNA合成酵素のプロモーター配列(5´−ATTTAGGTGACACTATAGAATAC−3´)など適宜選択して用いることができ、このうちT7RNA合成酵素のプロモーター配列が好ましい。 With respect to the promoter sequence, the promoter sequence of T7RNA synthase (5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3'), promoter sequences T3RNA synthase (5'-TTATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3'), promoter sequences SP6RNA synthase (5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC- 3 ') can be used suitably selected and such, promoter sequence among T7RNA synthase are preferred.
配列番号16〜30の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーは、配列番号1〜15の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーの5´側に、T7RNA合成酵素のプロモーター配列を付加したものである。 Each primer having the respective nucleotide sequences of SEQ ID NO: 16-30 are the 5 'side of the respective primers having the respective nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 is obtained by adding a promoter sequence T7RNA synthase.

配列番号16〜30の各塩基配列を有するそれぞれのキメラプライマーからなるプライマーセットは、第一実施形態のプライマーセットの5´側にそれぞれ同一のプロモーター配列が付加されたものであるので、第一実施形態のプライマーセットと同様に、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出することが可能である。 Since a primer set consisting of each of the chimeric primers with respective base sequence of SEQ ID NO: 16-30 are those each identical promoter sequences at the 5 'side of the primer set of the first embodiment is added, the first embodiment Like the primer sets of the form, it is possible to simultaneously specifically detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria.

検出方法に関しては、特に限定されるものはなく、例えば、核酸増幅による検出や、プライマーセットをプローブとして用いたハイブリダイゼーション等により、肺炎原因菌を検出することができる。 For the detection method is not limited particularly, for example, detection and by nucleic acid amplification, hybridization or the like using a primer set can be used as a probe to detect pneumonia causing bacteria. 核酸増幅による検出方法は、例えば、核酸増幅産物の塩基配列を電気泳動やシーケンサー等により決定する方法が挙げられ、ハイブリダイゼーションによる検出方法は、例えばスポットハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーション、In situハイブリダイゼーション、核酸サンドウィッチハイブリダイゼーション等が挙げられる。 Detection method according to nucleic acid amplification, for instance, include a method of determining the nucleotide sequence of the nucleic acid amplification products by electrophoresis or sequencer, etc., the detection method by hybridization, for example spot hybridization or colony hybridization, an In situ hybridization, nucleic acid sandwich hybridization, and the like.
微量な検体量で検出が行えることや、短時間で検出できることから、核酸増幅により肺炎原因菌を検出することが好ましい。 And can be performed is detected by the small amount of sample volume, since it can be detected in a short time, it is preferable to detect pneumonia causing bacteria by nucleic acid amplification.

核酸増幅に関しては、ポリメラーゼを用いた塩基の伸長反応を行うものであれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて行うことができる。 With respect to nucleic acid amplification, the present invention is not particularly limited as long as it performs the extension reaction of a base with a polymerase, it can be carried out using known methods. 例えば通常のPCRに加えて、マルチプレックスPCR、リアルタイムPCR、RT−PCR等が挙げられるが、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することを考慮すると、マルチプレックスPCRが好ましい。 For example, in addition to conventional PCR, multiplex PCR, real time PCR, but RT-PCR, and the like, considering that to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria simultaneously, multiplex PCR is preferred.
また、用いるポリメラーゼは、増幅塩基数や増幅塩基配列、反応温度等、考慮して適宜選択可能であるが、非特異的増幅を抑制することからも、ホットスタート用ポリメラーゼを用いることが好ましい。 Further, the polymerase used, amplification bases and amplified nucleotide sequence, the reaction temperature, etc., but can be appropriately selected in consideration of, from suppressing the non-specific amplification, it is preferable to use a hot-start polymerase.
核酸増幅用バッファーとしては、用いるポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。 The nucleic acid amplification buffer, taking into account the polymerase used, can be appropriately adjusted as known.
核酸増幅用ヌクレオチドに関しては、標識試薬等で標識されたものを用いることもできる。 With respect to nucleic acid amplification nucleotide may be used one which is labeled with a labeling reagent and the like.

核酸試料としては特に限定されるものではなく、生体試料や、生体試料から得られた培養物、及びこれらの試料から主に核酸を抽出した試料であってもよい。 The nucleic acid sample is not particularly limited, and biological samples, culture obtained from a biological sample, and may be a sample mainly nucleic acids were extracted from these samples. また、株化した細胞、PCRにより合成した試料等を用いることもできる。 It is also possible to use a cell line cell, sample or the like synthesized by PCR. これら核酸の抽出方法としては、特に限定されるものではなく、例えばエタノール沈殿法等で行うことができる。 The method of extracting these nucleic acids, the present invention is not particularly limited, and may be carried out by, for example, ethanol precipitation or the like. その他、市販のキット等を用いてもよい。 Others, may be used a commercially available kit or the like.

本発明のプライマーセットは、複数種類のプライマーを同時に用いることができることから、マルチプレックスPCRに用いることで複数種類の肺炎原因菌を一度に検出することが可能である。 Primer sets of the present invention, since it is possible to use a plurality of types of primers simultaneously, it is possible to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria at once by using the multiplex PCR.

更に、公知の定量的PCRを用いることで複数種類の肺炎原因菌を一度に、定量的に検出することが可能である。 Further, at a time a plurality of types of pneumonia causing bacteria by using a known quantitative PCR, can be quantitatively detected.

特に、第一実施形態のプライマーセットの5´側にプロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットと、該プロモーター配列と相同な塩基配列を有するユニバーサルプライマーとを用いて核酸増幅を行うことで、定量的かつ精度よく検出することが可能である。 In particular, by performing a primer set a primer set consisting of a chimeric primer added a promoter sequence at the 5 'side of the first embodiment, the nucleic acid amplified using the universal primer having the promoter sequence homologous to the base sequence, It can be detected well quantitatively and accurately.

ユニバーサルプライマーには、T7RNA合成酵素のプロモーター配列、T3RNA合成酵素のプロモーター配列、SP6RNA合成酵素のプロモーター配列等、キメラプライマーで用いたプロモーター配列と相同な配列をもつプライマーを用いる。 The universal primers, promoter sequences T7RNA synthase promoter sequences T3RNA synthase, promoter sequences, etc. SP6RNA synthase, using primers having a promoter sequence homologous to sequences used in the chimeric primers.

具体的には、以下のように行う。 Specifically, it carried out as follows.
まず、核酸試料、キメラプライマーから成るプライマーセット、ユニバーサルプライマー、DNAポリメラーゼ、PCR用バッファー、デオキシヌクレオチドをそれぞれ適宜調整した混合溶液を作製し、PCRを行う。 First, a nucleic acid sample, a primer set consisting of a chimeric primer, universal primer, to produce a DNA polymerase, PCR buffer, mixed solution deoxynucleotides was adjusted respectively, performing PCR.

核酸増幅の反応初期においては、プライマーセットの各キメラプライマーが鋳型である核酸試料と反応し、キメラプライマーに付加されたプロモーター配列を両端に有する核酸増幅産物が得られる。 In the initial reaction of the nucleic acid amplification, each chimeric primer of the primer set reacted with a nucleic acid sample as a template, a nucleic acid amplification product that has at both ends an added promoter sequences to the chimeric primers is obtained.
次いで、上記で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、核酸増幅産物中のプロモーター配列とユニバーサルプライマーとを介して核酸増幅産物が得られる。 Then, the nucleic acid amplification product obtained above as a template, the nucleic acid amplification product obtained through the promoter sequence and the universal primers in nucleic acid amplification products.
得られた核酸増幅産物を解析することで、定量的な検出を行うことができる。 By analyzing the obtained nucleic acid amplification products, it is possible to perform a quantitative detection.

ユニバーサルプライマーとキメラプライマーとを用いて核酸増幅することにより得られた核酸増幅産物は、プロモーター配列を有する。 Nucleic acid amplification product obtained by nucleic acid amplification using the universal primer and chimeric primer has a promoter sequence. このプロモーター配列を有する核酸増幅産物は、ユニバーサルプライマーを介して増幅されるようにもなる。 Nucleic acid amplification product having this promoter sequence is also to be amplified through the universal primer. 従来は、核酸増幅に用いるプライマーによって核酸増幅の効率が異なっていたが、同一のユニバーサルプライマーを用いて核酸を増幅することで、プライマー間での増幅効率を同一にすることができるため、核酸増幅による定量的な解析が可能となる。 Conventionally, were different efficiency of nucleic acid amplification by the primers used for nucleic acid amplification, to amplify nucleic acids using the same universal primer, it is possible to equalize the amplification efficiency between the primer, the nucleic acid amplification quantitative analysis by becomes possible.

また、プライマーの濃度比は、ユニバーサルプライマーの濃度を、キメラプライマーの濃度よりも多くすることが必要であり、ユニバーサルプライマー:キメラプライマーの濃度比が、10:1から50:1であることが好ましく、より好ましくは20:1から40:1、更に好ましくは40:1である。 The concentration ratio of primers, the concentration of the universal primer, it is necessary to more than the concentration of the chimeric primer, universal primer: concentration ratio of the chimeric primer, 10: 1 to 50: preferably 1 , more preferably 20: 1 to 40: 1, more preferably 40: 1. ユニバーサルプライマーの濃度を高くすることで、該プライマーの反応性が増し、定量性が向上する。 By increasing the concentration of the universal primer, reactive of the primer increases, quantitative property is improved.

従来のリアルタイムPCRでは、鋳型やプライマー毎に定量に適したサイクル数を予め調べておく必要があるが、本発明の構成をとることにより、核酸増幅がプラトーに達した時点の核酸増幅産物は、もともと核酸試料に含有されていた鋳型の量に依存する。 In conventional real-time PCR, it is necessary to examine in advance the number of cycles that are suitable for quantification for each template and primer, by taking the configuration of the present invention, the nucleic acid amplification product when the nucleic acid amplification reaches a plateau, originally depends on the amount of template was contained in the nucleic acid sample. そのため、通常のPCRにおいて行われるサイクル数であれば、特にサイクル数を考慮することなくPCRを行い、定量することが可能である。 Therefore, if the number of cycles performed in a normal PCR, PCR performed without particular consideration of the number of cycles, it is possible to quantify. これは、プライマー間の増幅効率が統一されるためと推察される。 This is presumably because it is unified amplification efficiency between the primers.

このように、キメラプライマーとユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅することにより、1の試料中に含まれる多数の肺炎原因菌を、リアルタイムPCRをすることなく、簡便にかつ定量的に検出することが可能となる。 Thus, by nucleic acid amplification using chimeric primers and universal primers, the number of pneumonia causing bacteria contained in the first sample, without the real-time PCR, simply and quantitatively can be detected to become. また、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量できることから、簡便にかつ迅速に肺炎原因菌の定量的に検出することができる。 Further, since a plurality of types of pneumonia causing bacteria can be quantified simultaneously, it is possible to quantitatively detect the easily and rapidly pneumonia causing bacteria. 更に、新たな病原菌を検出する場合においても、キメラプライマーを追加するだけで定量的に検出することが可能である。 Further, in a case of detecting a new pathogens also, we are possible to quantitatively detect by simply adding chimeric primers.

上記の核酸増幅により得られた二本鎖DNAの検出方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて行うことができる。 Detection methods of the double-stranded DNA obtained by the above nucleic acid amplification is not particularly limited, it can be performed using a known method. 例えば、核酸増幅産物をハイブリダイゼーションさせて検出する方法や、核酸増幅産物を標識試薬によって検出する方法等が挙げられる。 For example, a method to detect a nucleic acid amplification product was hybridized, a method for detecting a nucleic acid amplification products with a labeling reagent and the like.
特に、基板上にて検出する方法が好ましい。 In particular, a method of detecting at the substrate is preferred. 基板上にて検出することで、複数の核酸増幅産物を簡便に定量できるためである。 By detecting at the substrate, in order to be easily quantified a plurality of nucleic acid amplification products. また、サイズの差異が小さい核酸増幅産物も識別して定量することができるためである。 Further, because the can be quantified also identify nucleic acid amplification products difference is small size.

基板上における検出方法として、例えば以下の定量的な検出方法がある。 Detection methods on the substrate, for example, the following quantitative detection methods.
該方法は、核酸増幅により得られた二本鎖DNAを一本鎖に変性し、この一本鎖DNAと、基板上に固定した該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとを介して二本鎖DNAを形成すると同時に、該二本鎖DNAを標識し、検出する方法である。 The method of double-stranded DNA obtained by nucleic acid amplification denatured into single strands through a single-stranded DNA, and a primer having a sequence complementary to a fixed nucleic acid amplification products on a substrate and at the same time form double-stranded DNA, and labeling said double-stranded DNA, DNA that is a method of detecting. 該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとして、特に本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーを用いることが好ましい。 As a primer having a sequence complementary to the nucleic acid amplification products, it is preferable to use a forward primer that constitutes the primer set of the present invention particularly. 特異性に優れるためである。 This is because the excellent specificity. 以下、該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとして、本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーを用いた方法について説明する。 Hereinafter, the primer having a sequence complementary to the nucleic acid amplification product, the method will be described using the forward primer that constitutes the primer set of the present invention.
まず、フォワードプライマーを基板上に固定する。 First, to secure the forward primer on the substrate.

このような基板としては、熱可塑性樹脂を用いたプラスチック材料が好適である。 Examples of such a substrate, a plastic material using a thermoplastic resin is preferable. このような熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることが好ましい。 Examples of such a thermoplastic resin, it is preferable to use a low fluorescence emissions. このような熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂、等を用いることができる。 Such thermoplastic resins can be used, for example, polyethylene, linear polyolefins such as polypropylene, cyclic polyolefin, fluororesin, or the like. このうち、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に優れた飽和感情ポリオレフィンを使用することが好ましい。 Among them, heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, it is preferred to use a good saturation feelings polyolefin transparency and moldability.

また、基板の形状としては特に限定されるものではなく、板状の他に、例えば、フィルム状やシート状、チューブ状等が挙げられる。 Further, the invention is not particularly limited shape of the substrate, in addition to the plate, for example, a film or sheet, tubular and the like. 例えば、96穴等のマルチプレートが挙げられる。 For example, multi-plate, such as 96.
また、基板の表面を微細加工により小さなマイクロプレート用構造にすることが好ましい。 Further, it is preferable that the surface of the substrate in a small microplate structure by microfabrication. この場合、多数の凹部を形成し、この凹部にて固相プライマーを結合させることが好ましい。 In this case, to form a large number of concave portions, it is preferred to attach the solid phase primer in the recess. 凹部に関しては、深さ150〜250μm、底部直径0.5〜1.5mmのウェルとすることが好ましい。 With respect to the concave portion, it is preferable that the depth 150 to 250 [mu] m, the bottom diameter 0.5~1.5mm wells. 凹部を形成することで、効率よくフォワードプライマーとハイブリダイズすることが可能となる。 By forming the recess, it is possible to efficiently forward primer hybridizes.

基板へのフォワードプライマーの固定方法としては、公知のものであれば限定されるものではなく、例えば、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が挙げられる。 The method of fixing the forward primer to the substrate, is not limited as long as it is known, for example, a method for spotting a liquid obtained by dissolving or dispersing the primer. このプライマーを溶解または分散した液体としては、例えば中性からアルカリ性、例えばpHが7.6以上とすることができ、TEバッファー(pH8.0)などが挙げられる。 The liquid obtained by dissolving or dispersing the primer, for example, the neutral to alkaline, for example pH may be a 7.6 or, TE buffer (pH 8.0), and the like.

特に、基板の表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が基板表面に存在するような場合には、この高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。 In particular, as the polymeric substance and a second unit having a first unit and a carboxylic acid-derived group having a group derived from phosphoric acid ester constituting the hydrophilic portion of the phospholipid on the surface of the substrate is present on the substrate surface the case, part of the active ester group contained in the polymer material reacts with a primer, covalent bond between the primer is formed.

このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、DNA鎖の非特異的吸着を抑制する性質とDNA鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。 Polymeric material and a second unit comprising a first unit and a carboxylic acid derivative group containing a group derived from phosphoric acid ester constituting the hydrophilic portion of the phospholipid inhibits nonspecific adsorption of a DNA strand a polymer having both properties of immobilizing the nature and DNA strands. 特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型DNA断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。 In particular, a group derived from phosphoric acid ester constituting the hydrophilic portion of the phospholipid contained in the first unit plays a role in suppressing non-specific adsorption of the template DNA fragments, carboxylic acid derivative groups contained in the second unit It serves to chemically immobilize the primer. すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。 That is, the primer is covalently bound at the site of a carboxylic acid derivative group of the coating layer made of polymeric material is immobilized on the surface of the substrate.

また、固定するフォワードプライマーの5´側には、基板と結合するためのリンカー部を有していることが好ましい。 Also, the 5 'side of the forward primer to be fixed, it is preferable to have a linker moiety for coupling with the substrate. リンカー部は、基板に固定されるために用いられるのであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板表面上に活性エステル基がある場合、このエステル基反応性を高めるため、5´側にアミノ基を導入しておくことが好ましい。 The linker portion, if used to be fixed to the substrate, but are not particularly limited, for example, if the substrate surface is an active ester group, to enhance the ester group reactive 5' it is preferable to introduce an amino group on the side. アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基を導入されたフォワードプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上に固定化することができる。 Amino group is excellent in reactivity with the active ester group can be by using a forward primer introduced an amino group, immobilized efficiently and firmly on the surface of the substrate.

フォワードプライマーの点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液等で洗浄し、洗浄後はプライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。 After spotting the forward primer, in order to remove the primers which have not been immobilized on the substrate surface, pure water and was washed with buffer solution, after washing inactivation of the active ester of the substrate surface other than the immobilized primer treating the alkali compound, or is preferably performed with a compound having a primary amino group.

このようなアルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等が挙げられる。 Such alkali compounds include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, lithium hydroxide, potassium phosphate etc. the.

また、一級アミノ基を有する化合物としては、例えばグリシン、9−アミノアクアジン、アミノブタノール、4−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、5−アミノ2,3−ジヒドロー1,4−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、2−(2−アミノエチルアミノ)エタノール、リン酸二水素2−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、4−(2−アミノエチル)モルホリン、5-アミノフルオレセイン、6−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、p−アミノ馬尿酸、2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール、5−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、2−アミノオクタン、2−アミノオクタン酸、1−アミノ2−プロパノール、3−ア The compound having a primary amino group, such as glycine, 9-amino Aqua Jin, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino-2,3-dihydro 1,4-pentanol, aminoethanethiol hydrochloride, aminoethanethiol sulfuric acid, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, dihydrogen phosphate 2-aminoethyl hydrogen aminoethyl sulfate, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-amino-fluorescein , 6-aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p- amino hippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-amino isophthalate, aminomethane, aminophenol, 2-amino octane, 2-amino octanoic acid, 1-amino 2-propanol, 3-A ミノ−1−プロパノール、3−アミノプロペン、3−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、11−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、4−アミノフタロニトリル、3−アミノフタルイミド、p−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が挙げられる。 Mino-1-propanol, 3-amino-propene, 3-aminopropionitrile, aminopyridine, 11-aminoundecanoic acid, aminosalicylic acid, aminoquinoline, 4-amino-phthalonitrile, 3-aminophthalimide, p- amino propiophenone , amino phenylacetic acid, aminonaphthalene, and the like. これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。 Of these, aminoethanol, it is preferable to use glycine.

洗浄後は、75〜85℃の温度で1時間加熱することが好ましい。 After cleaning, it is preferable to heat for one hour at a temperature of 75-85 ° C.. 加熱処理の後、120mJ/cm のUVを照射し、DNAを更に固定化することがより好ましい。 After the heat treatment, irradiation with UV of 120 mJ / cm 2, it is more preferable to further immobilize the DNA.

また、基板上にゲルを展開させ、このゲルに固相プライマーを結合させることもできる。 Further, the gel is spread on a substrate, may also be coupled to a solid phase primer into the gel. この場合、固相プライマーを三次元で固定できるので、より効率よく反応を進めることができる。 In this case, since the solid-phase primers can be fixed in three dimensions, it can proceed more efficiently reactions. このようなゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等が挙げられる。 Such gels, e.g., agarose gel, polyacrylamide gel, and the like.

基板に設けた各凹部にそれぞれの肺炎原因菌に特異的なフォワードプライマーを固定することで、核酸増幅により合成された二本鎖DNAが基板上で混在することなく、一度に定量することが可能となる。 By fixing the specific forward primer to each of pneumonia causing bacteria in the recesses provided on the substrate, without double-stranded DNA synthesized by a nucleic acid amplification are mixed on the substrate, it can be quantitatively at a time to become.

次に、核酸増幅により得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性し、前記フォワードプライマーを固定した基板上に導入する。 Then, the nucleic acid amplification product obtained by nucleic acid amplification denatured into single strands, is introduced onto the substrate which is fixed the forward primer.
核酸の一本鎖への変性方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば、熱変性により行うことが好ましい。 As modified method to single-stranded nucleic acid can be carried out by known methods, for example, it is preferably performed by heat denaturation. この場合、95℃で1〜10分処理することが好ましい。 In this case, it is preferable to process 10 min at 95 ° C..

基板に反応溶液を導入するには、基板上に設けられた複数の凹部全てを覆うことが可能な透明なカバーを基板に被せて、表面張力によって反応溶液を凹部内に導入することが好ましい。 To introduce the reaction solution on the substrate, a transparent cover that can cover all of the plurality of recesses provided on the substrate over the substrate, it is preferable to introduce the reaction solution in the recess by surface tension. これにより、反応溶液を分注する手間が省けるばかりでなく、コンタミネーションの抑制や、反応溶液の総量を軽減することができ、低コスト化が図られる。 Thus, the reaction solution not only Habukeru is dispensing hassle, suppression or contamination, it is possible to reduce the total amount of the reaction solution, the cost can be reduced.

次いで、一本鎖に変性した核酸と基板に固定されたプライマーとをハイブリダイズさせ、デオキシヌクレオチドとポリメラーゼにより基板上に二本鎖DNAを形成させると同時に標識試薬を取り込ませ、検出を行う。 Then, a primer fixed to denatured nucleic acid substrate to the single-stranded hybridized, by incorporating simultaneously labeled reagent when the formation of a double strand DNA on the substrate by deoxynucleotides and a polymerase, to detect.
上記ハイブリダイゼーションから二本鎖DNA形成までの反応は70℃のワンステップで行うことが可能であり、30分反応させれば十分である。 The reaction to double-stranded DNA formed from the hybridization can be performed in a single step of 70 ° C., it is sufficient for 30 minutes the reaction.
ここで、検出のために新たにデオキシヌクレオチドやポリメラーゼ等を加えても良いが、核酸増幅を行った反応溶液をそのまま熱変性を加えて基板上に導入することで、核酸増幅に用いたヌクレオチドやDNAポリメラーゼを、基板上に二本鎖DNAを形成する際にも用いることができるため、低コスト化が図れる。 Here, may newly be added deoxynucleotides and a polymerase such as for detection, by reaction solution was subjected to nucleic acid amplification by adding directly heat denaturation is introduced onto the substrate, Ya nucleotides used in the nucleic acid amplification the DNA polymerase, since the substrate can also be used in forming a double-stranded DNA, cost reduction can be achieved.

標識試薬に関しては、二本鎖DNAを標識する公知のものを用いることができ、例えば、二本鎖DNA間に取り込まれるインターカレーターであるSYBER Green等が挙げられる。 For the labeling reagent can be a known labeling the double stranded DNA, such as, SYBER Green and the like is intercalator incorporated between the double-stranded DNA. SYBER Greenを反応溶液中に加えることで、基板上で二本鎖DNAが形成されるときに該SYBER Greenが取り込まれ、簡便に標識することが可能である。 By adding SYBER Green in the reaction solution, the SYBER Green is taken when the double-stranded DNA on the substrate is formed, it is possible to easily labeled.
また、デオキシヌクレオチドを予め標識しておくことも可能であり、必要に応じ適宜選択すればよい。 It is also possible to previously labeled deoxynucleotides may be appropriately selected as needed. デオキシヌクレオチドの標識に関しては特に限定されるものではなく、例えば、FITC、やローダミン、Cy3やCy5などのサイアニン、ビオチンやジゴキシゲニン、RI等が挙げられる。 The invention is not specifically defined, the labeled deoxynucleotide, e.g., FITC, and rhodamine, Saianin such Cy3 and Cy5, biotin or digoxigenin, RI and the like. これら標識されたデオキシヌクレオチドは、基板上における二本鎖DNAの形成に用いられるため、形成された二本鎖DNAを簡便に標識することができる。 These labeled deoxynucleotides, since used to form the double-stranded DNA on the substrate, a double-stranded DNA formed can be easily labeled.
このような標識試薬は、核酸増幅産物を一本鎖に変性させる前に、反応溶液中に加えても良く、核酸増幅産物を一本鎖に変性させた後に、反応溶液中に加えても良い。 Such labeling reagent, prior to denature the nucleic acid amplification products in a single-stranded, may be added to the reaction solution, the nucleic acid amplification products after denaturation to single strands, or may be added to the reaction solution .
この二本鎖DNA間に取り込まれた標識試薬の蛍光等を測定することで、核酸を定量することができる。 By measuring the fluorescence or the like of the labeled reagent incorporated between the double-stranded DNA, it is possible to quantify the nucleic acid. この標識試薬の測定に関しては、公知の方法を用いて行うことができ、標識試薬を考慮して適宜調節して行えばよい。 For the measurement of the labeling reagent can be performed using a known method may be carried out suitably adjusted in consideration of the labeling reagent. 例えばマイクロアレイ・スキャナーを用いて、標識試薬がCY3であった場合、543nmの励起光で、576nmの蛍光を経時的に観察することが好ましい。 For example using a microarray scanner, when labeled reagent was CY3, by the excitation light of 543 nm, it is preferable that over time observing fluorescence of 576 nm.

また、リアルタイムPCR等により、検出に用いた蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することも可能である。 Also, by real-time PCR or the like, the fluorescence amount of the fluorescent dye used for detection, it is also possible to measured over time. このようにして得た測定値を積算することにより、得られたPCR産物を定量することができる。 By integrating such measured values ​​thus obtained, it is possible to quantify the resulting PCR product.

本発明のプライマーセットと、DNAポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを予め調整して混合したものをキットとすることができる。 It can be a primer set of the present invention, a DNA polymerase, and nucleotides, and kits a mixture in advance adjusting the nucleic acid amplification buffer. キットとすることで、試薬の調整等の手間が省け、簡便に行うことができる。 With the kit, eliminates the need for adjustment of the reagent may be conveniently carried out. また各種溶液を混合する際のコンタミなどを抑制することもできる。 It is also possible to suppress such contamination when mixing the various solutions.
キットに含まれるプライマーセットとしては、本発明の第一実施形態であるプライマーセットでも良いし、プロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットでも良い。 The primer sets included in the kit may be a primer set is a first embodiment of the present invention may be a primer set consisting of a chimeric primer added promoter sequences.
また、DNAポリメラーゼとしては、核酸の増幅塩基数やTm値、塩基配列等を適宜考慮して選択し、用いることができる。 As the DNA polymerase, the amplification bases and Tm values ​​of the nucleotide, the nucleotide sequences and the like as appropriate consideration to choose, can be used.
ヌクレオチドに関しては、標識試薬で標識されたデオキシヌクレオチド等を用いることもできる。 For the nucleotide it can also be used deoxynucleotide or the like which is labeled with a labeling reagent.
核酸増幅用バッファーとしては、用いるDNAポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。 The nucleic acid amplification buffer, can be appropriately adjusted in consideration of the DNA polymerase, a known used.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, a more detailed description of the present invention through examples, the present invention is not limited to the following examples.
(実施例1) (Example 1)
マイクロアレイ基板上での肺炎原因菌の検出 S. Detection of S. pneumoniae bacteria causing on microarrays substrate pneumoniae、M. pneumoniae, M. catarrahalis、C. catarrahalis, C. pneumoniae、及びA. pneumoniae, and A. acetiを検出するため、各菌種に対するフォワードプライマー(配列番号1,4,8,11)をマイクロアレイ基板上に固定し、PCRにより増幅して得た核酸増幅産物を基板上で検出した。 To detect the aceti, a forward primer (SEQ ID NO: 1,4,8,11) for each species immobilized on a microarray substrate and a nucleic acid amplification product obtained by amplifying by PCR and detected on the substrate.
まず始めに、各フォワードプライマーを固定したマイクロアレイ基板を作製した。 First, to produce a microarray substrate having secure each forward primer.
長さ76mm、幅26mmのプラスチック製基板の上に、深さ200μm、底部直径1mmのウェル60個を備えたマイクロアレイ基板を作製した。 Length 76 mm, on a plastic substrate having a width 26 mm, to prepare a microarray substrate having a depth 200 [mu] m, the 60 wells of the bottom diameter of 1 mm. この基板の表面に活性エステルを有するポリマーをコートし、フォワードプライマーの5´末端に導入したアミノ基との結合機能を付与した。 Coated with a polymer having an active ester on the surface of the substrate to impart a binding function of an amino group introduced into the 5 'end of the forward primer.
その後、各フォワードプライマーをそれぞれ1μMに調整し、固定用のスポッティング溶液(住友ベークライト社製)に溶解させ、この1μlを各ウェルに滴下した。 Thereafter, each forward primer was adjusted to 1μM respectively, dissolved in a spotting solution for fixing (Sumitomo Bakelite) was added dropwise to this 1μl each well. 滴下後、基板を80℃で1時間保温し、各フォワードプライマーを基板に固定した。 After the dropwise addition, the substrate was incubated for 1 hour at 80 ° C., and fixing each forward primer to the substrate.
ポジティブコントロールとしてはS. S. as a positive control pneumoniae、M. pneumoniae, M. catarrahalis及びA. catarrahalis and A. acetiの増幅部位に共通な配列である、16SrRNA遺伝子の341位〜359位の領域の塩基配列を有するプローブを基板に固定し、ネガティブコントロールとしては、20塩基対からなるポリT配列を基板に固定した。 Is a common sequence in the amplification site of aceti, the probe was fixed to a substrate having a base sequence of a region of 341 ~359 position of 16SrRNA gene, as a negative control, fixing a poly T sequence consisting of 20 base pairs to the substrate did.
S. S. pneumoniae、M. pneumoniae, M. catarrahalis、C. catarrahalis, C. pneumoniae、及びA. pneumoniae, and A. acetiのゲノム1ngをそれぞれTE緩衝液(10mM Tris−HClpH8.0、1mM EDTA)に懸濁し、それぞれに、0.1mMデオキシリボヌクレオチド(Pharmacia社製)、4ユニットのDNA依存性DNAポリメラーゼ、0.15μMに調整した各フォワードプライマー(配列番号1〜11)の混合液、及び0.15μMに調整した各リバースプライマー(配列番号12〜15)の混合液、を混合させ反応溶液を作製した。 Genomic 1ng of aceti were suspended in TE buffer respectively (10mM Tris-HClpH8.0,1mM EDTA), respectively, 0.1 mM deoxyribonucleotides (Pharmacia Inc.), 4 units of DNA-dependent DNA polymerase, 0.15 .mu.M mixture of each forward primer (SEQ ID NO: 1 to 11) was adjusted to, and mixed solution of the reverse primer was adjusted to 0.15 .mu.M (SEQ ID NO: 12-15), to prepare a reaction solution by mixing. 本実施例1で用いたプライマーの配列を、表1に示す。 The sequences of the primers used in this Example 1, are shown in Table 1.

次に、上記反応溶液に対し、95℃を30秒、60℃を90秒、72℃を30秒で45サイクル反応させてPCRを行った。 Then, to the reaction solution, a 95 ° C. 30 seconds, a 60 ° C. 90 seconds, PCR was carried out by 45 cycles reacting 72 ° C. for 30 seconds. PCR終了後、95℃で5分反応させた後、各フォワードプライマーを結合させた基板に透明なカバーを被せて、PCR反応溶液を凹部に導入した。 After completion of the PCR, after 5 minutes of reaction at 95 ° C., it is covered with a transparent cover to the substrate bound with each forward primer, was introduced PCR reaction solution in the recess. その後、基板を70℃の恒温槽に設置し、温度を70℃に保ち、基板に固定した固相プライマー伸長反応を30分間行った後、ビオチン標識dUTPをストレプトアビジン・アルカリフォスファラーゼを介してBIPC/NBT発色させ観察した。 Thereafter, the substrate was placed in a thermostat at 70 ° C., maintaining the temperature at 70 ° C., after 30 minutes fixed solid phase primer extension reaction on the substrate, a biotinylated dUTP via streptavidin-alkaline phosphatase hydrolase BIPC / NBT allowed to develop color was observed.
この結果を図2に示す。 The results are shown in Figure 2.
(a)は、S. (A) it is, S. pneumoniaeのゲノムを鋳型としてPCRを行い、この反応溶液を基板に展開してMPEXを行った結果である。 PCR was carried out with pneumoniae genome as a template, a result of MPEX expand the reaction solution to the substrate. 基板には表記されている菌種に対する各フォワードプライマーが固定されている。 Each forward primer for bacterial species are labeled is fixed to the substrate. 図中、ウェルの色が濃くなっているものが、陽性であったもので、S. In the figure, those which color of wells has become darker, were positive, S. pneumoniaeとポジティブコントロールのウェルで、核酸が検出された。 In pneumoniae and positive control of the well, the nucleic acid has been detected.
(b)は、M. (B) is, M. catarrahalisのゲノムを鋳型としてPCRを行ったもので、M. The genome of catarrahalis in which PCR was carried out as a template, M. catarrahalisとポジティブコントロールのウェルで、核酸が検出された。 In catarrahalis and positive control of the well, the nucleic acid has been detected.
(c)は、C. (C) is, C. pneumoniaeのゲノムを鋳型としてPCRを行ったもので、C. The pneumoniae genome in which PCR was carried out as a template, C. pneumoniaeのフォワードプライマーが固定されたウェルで、核酸が検出された。 In wells where the forward primer is fixed pneumoniae, nucleic acid was detected. ポジティブコントロールに関しては、今回用いたポジティブコントロール用のプライマーにはC. With respect to the positive control, C. is the primer of the positive control used in this study pneumoniaeの増幅領域が含まれていないため、検出されなかった。 Since the amplified region of pneumoniae is not included, it was not detected.
(d)は、対照実験であり、PCRの鋳型としてA. (D) is a control experiment, A. as a template for PCR acetiが用いられている。 aceti has been used. 核酸はポジティブコントロールのみ、検出された。 The nucleic acid positive control only, has been detected.
以上より、基板上で本発明のプライマーセットを用いて、肺炎原因菌の特異的な検出が可能であることが観察された。 Thus, using the primer set of the present invention on the substrate, it was observed to be capable of specific detection of pneumonia causing bacteria.

(実施例2) (Example 2)
マルチプレックスPCRを利用した肺炎原因菌2菌種の検出 試料中の肺炎原因菌の核酸を同定するため、表1に記載の各肺炎原因菌に特異的なフォワードプライマー(配列番号1〜11)とリバースプライマー(配列番号12〜15)とを用いてマルチプレックスPCRを行った。 To identify nucleic acids of pneumonia causing bacteria in the multiplex PCR pneumonia causing bacteria 2 species detection in a sample using a specific forward primer to each pneumonia causing bacteria according to Table 1 (SEQ ID NO: 1 to 11) been multiplex PCR assay using a reverse primer (SEQ ID NO: 12-15). その後、フォワードプライマーを固定した基板にPCR産物を展開し、基板に固定した固相プライマー伸長反応を行うと同時に、蛍光試薬により二本鎖DNAを標識した。 Thereafter, the PCR product was developed in a substrate with a fixed forward primer, and at the same time carrying out solid phase primer extension reaction was fixed to a substrate, labeled double-stranded DNA by fluorescent reagent. その後、蛍光強度を測定することで、肺炎原因菌由来の核酸を検出できるかどうかを検討した。 Then, by measuring the fluorescence intensity was examined whether detectable nucleic acids from the pneumonia causing bacteria.
基板には、各フォワードプライマーを0.5μMに調整し、図3(a)に示すように、基板の各ウェルに、各菌種に特異的なフォワードプライマーを実施例1と同様な方法により固定した。 The substrate of each forward primer was adjusted to 0.5 [mu] M, as shown in FIG. 3 (a) fixed to each well of the substrate by a method similar to that in Example 1 a specific forward primer to each species did. なお、図3(a)中、mecA2、S. In FIG. 3 (a), mecA2, S. spA2、P. spA2, P. aer2、K. aer2, K. pne2、Legio2、M. pne2, Legio2, M. pne2に関しては、各フォワードプライマーを1μMに調整して基板に固定した。 Regarding Pne2, was fixed to a substrate of each forward primer was adjusted to 1 [mu] M.
次に、終濃度が1nMとなるようにS. Next, S. to a final concentration of 1nM aureus及びP. aureus and P. aeruginosaeの核酸、1mMデオキシリボヌクレオチド(Pharmacia社製)、0.15μMに調整した各フォワードキメラプライマー、同様に調整した各リバースプライマー、4ユニットのTaqポリメラーゼ(TaKaRa社製)、添付のバッファー、を混合し、95℃で5分間加熱した後、実施例1と同様な方法によりPCRを行い、PCR終了後、95℃で5分反応させた後、各フォワードプライマーを結合させた基板に透明なカバーを被せて、PCR反応溶液を凹部に導入した。 Nucleic acid Aeruginosae, 1 mM deoxyribonucleotides (Pharmacia Inc.), each forward chimeric primer adjusted to 0.15 .mu.M, the reverse primer was prepared in the same manner, 4 units of Taq polymerase (TaKaRa Co.), attached buffer were mixed after heating for 5 minutes at 95 ° C., PCR performed in the same manner as in example 1, after the completion of PCR, after 5 minutes of reaction at 95 ° C., covered with a transparent cover to the substrate bound with each forward primer Te was introduced PCR reaction solution in the recess. その後、基板を70℃の恒温槽に設置し、温度を70℃に保ち、MPEX反応を30分間行った後、543nmの励起光で576nmの蛍光を観察し,CY3の蛍光を観察した。 Thereafter, the substrate was placed in a thermostat at 70 ° C., maintaining the temperature at 70 ° C., after MPEX react for 30 minutes, to observe the fluorescence of 576nm with excitation light of 543 nm, fluorescence was observed in CY3.
この結果を図3(b)に示す。 The results shown in FIG. 3 (b).
図3(b)は、反応終了後の基板をマイクロアレイ・スキャナーで取り込んだ画像である。 Figure 3 (b) is a captured image of the substrate after the completion of the reaction with a microarray scanner. この図より、試料中に含まれるS. From this figure, S. contained in the sample aureus及びP. aureus and P. aeruginosaeに対して特異的なフォワードプライマーを配したウェル及びポジティブコントロールを配したウェルにおいて、CY3の蛍光が観察された。 In wells arranged wells and positive control which arranged specific forward primers against Aeruginosae, fluorescence CY3 was observed.
図3(b)で観察された蛍光強度を、ネガティブコントロールの蛍光強度に対する相対比で表したグラフが、図3(c)である。 The fluorescence intensities observed in FIG. 3 (b), the graph showing a relative ratio to the fluorescence intensity of the negative control is a diagram 3 (c). 図3(b)と同様に、S. Similar to FIG. 3 (b), S. aureus及びP. aureus and P. aeruginosaeで蛍光強度の増加が観察された。 Increase in fluorescence intensity was observed in Aeruginosae. また、固相プライマーの濃度を2倍で固定すると蛍光強度が増加することが観察された。 The fluorescent intensity was observed to increase when the concentration of the solid phase primer fixed at twice.
以上より、複数種類の肺炎原因菌に対する特異的なプライマーが固定された基板において、本発明のプライマーを用いてマルチプレックスPCRを行うことで、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。 From the above, the substrate-specific primers is fixed with respect to a plurality of types of pneumonia causing bacteria, by performing the multiplex PCR using the primers of the present invention, it can be simultaneously specifically detect multiple types of pneumonia causing bacteria It was observed.

(実施例3) (Example 3)
マルチプレックスPCRを利用した肺炎原因菌2菌種の検出 肺炎原因菌由来の核酸を実施例2のS. S. multiplex PCR performing nucleic acid detection pneumoniae causes from bacteria pneumonia causative bacteria 2 species using Example 2 aureusからMRSAに変えて行った。 It was carried out in place of the MRSA from aureus. 実施方法は、実施例2と同様である。 Implementation is the same as in Example 2.
図4(b)は、反応終了後の基板をマイクロアレイ・スキャナーで測定した結果である。 4 (b) is a result of the substrate after the completion of the reaction was measured by microarray scanner. この結果より、試料中に含まれるMRSA及びP. This result, MRSA and P. contained in the sample aeruginosaeに対して特異的なフォワードプライマーを配したウェルにおいて、CY3の蛍光が観察された。 In wells arranged specific forward primers against Aeruginosae, fluorescence CY3 was observed.
図4(b)で観察された蛍光強度を、ネガティブコントロールの蛍光強度に対する相対比で表したグラフが、図4(c)である。 The fluorescence intensities observed in FIG. 4 (b), the graph representing a relative ratio to the fluorescence intensity of the negative control is a diagram 4 (c). 図4(b)と同様に、mecA及びP. Like FIG. 4 and (b), mecA and P. aeruginosaeで蛍光強度の増加が観察された。 Increase in fluorescence intensity was observed in Aeruginosae. また、基板に固定したフォワードプライマーの濃度を2倍で固定すると蛍光強度が増加することが観察された。 The fluorescent intensity was observed to increase when fixing the concentration of the forward primer fixed on the substrate twice.
以上より、複数種類の肺炎原因菌に対する特異的なプライマーが固定された基板において、本発明のプライマーを用いてマルチプレックスPCRを行うことで、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。 From the above, the substrate-specific primers is fixed with respect to a plurality of types of pneumonia causing bacteria, by performing the multiplex PCR using the primers of the present invention, it can be simultaneously specifically detect multiple types of pneumonia causing bacteria It was observed.

(実施例4) (Example 4)
マルチプレックスPCRを利用した肺炎原因菌5菌種の検出 試料中の肺炎原因菌5菌種を検出するために、各肺炎原因菌に特異的なフォワードキメラプライマー(配列番号16〜20)とリバースキメラプライマー(配列番号27〜30)とを用いてマルチプレックスPCRを行った。 To detect pneumonia causing bacteria 5 strains of multiplex PCR pneumonia causing bacteria 5 strains of detection sample using specific forward chimeric primer to each pneumonia causing bacteria (SEQ ID NO: 16 to 20) and reverse chimeric It was performed multiplex PCR using a primer (SEQ ID NO: 27-30). 得られたPCR産物を電気泳動にて分離し、各菌種の検出を行った。 The resulting PCR products were separated by electrophoresis, was detected for each species. 増幅部位は図1に示す通りである。 Amplification sites are shown in Figure 1. また、本実施例4で用いたプライマー配列を表2に示す。 Furthermore, the primer sequences used in this example 4 shown in Table 2.

等量の肺炎原因菌10菌種のゲノムを混合した混合溶液を作製し、それぞれの肺炎原因菌のゲノムコピー数が10 となるように、限界希釈した溶液を調整した。 To prepare a mixed solution obtained by mixing equal amounts of pneumonia causing bacteria 10 strains of the genome, the genome copy number of the respective pneumonia caused bacteria so as to be 10 6 to prepare a solution limiting dilution. 次に、この溶液それぞれに、0.01mMのデオキシリボヌクレオチド(Pharmacia社製)、4ユニットのDNA依存性DNAポリメラーゼ(タカラ社製)、Legionella spp. Next, to this solution, respectively, (manufactured by Pharmacia) deoxyribonucleotides of 0.01 mM, 4 units of DNA-dependent DNA polymerase (Takara), Legionella spp. 、M. , M. pneumoniae、S. pneumoniae, S. pneumoniae、H. pneumoniae, H. influenzae、C. influenzae, C. pneumoniae、に対する0.025μMの各フォワードキメラプライマー、0.025μMに調整した各リバースキメラプライマー、1μMのユニバーサルプライマー、及び1000pgのCYBER Green、を混合させマルチプレックスPCRを行った。 pneumoniae, was performed each forward chimeric primer 0.025 uM, each reverse chimeric primer was adjusted to 0.025 uM, universal primers 1 [mu] M, and 1000pg of CYBER Green, multiplex PCR by mixing for.
PCRの反応条件は、実施例1と同様である。 The reaction conditions for PCR were the same as in Example 1.
PCR終了後、1.5%のアガロースゲルを用いて電気泳動して各PCR産物を分離し、蛍光を観察した。 After completion of the PCR, it separates each PCR product was electrophoresed using 1.5% agarose gel to observe the fluorescence.
この結果を、図5及に示す。 The results, shown in Figure 5 及.
図5は、電気泳動後に蛍光強度を測定しグラフにしたもので、Legionella spp. Figure 5 is intended for fluorescence intensity after electrophoresis was measured graph, Legionella spp. 、M. , M. pneumoniae、S. pneumoniae, S. pneumoniae、H. pneumoniae, H. influenzae、C. influenzae, C. pneumoniaeのPCR産物の塩基数はそれぞれ順に146塩基対(図中<1>)、222塩基対(図中<2>)、388塩基対(図中<3>)、416塩基対(図中<4>)、474塩基対(図中<5>)、となっている。 Base number of PCR products 146 base pairs, respectively in this order pneumoniae (in FIG. <1>), 222 bp (in the figure <2>), (in Fig. <3>) 388 bp, 416 bp (in the figure < 4>), 474 bp (in the figure <5>), has become. なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。 The nucleotide number described above, shows the measured values ​​at the time of electrophoresis.
図5より、本発明のキメラプライマーセットを用いることで、マルチプレックスPCRにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。 5 that by using a chimeric primer set of the present invention, the multiplex PCR, has it been observed that a plurality of types of pneumonia causing bacteria can be simultaneously detected specifically.

(実施例5) (Example 5)
マルチプレックスPCRを利用した肺炎原因菌他の5菌種の検出 実施例4で用いたフォワードキメラプライマーをM. Forward chimeric primer used in detecting Example 4 Multiplex PCR pneumonia causing bacteria other 5 species using M. catarrhalis、MRSAのmecA、S. catarrhalis, MRSA of mecA, S. aureusのspaA、P. aureus of spaA, P. aeruginosae、K. aeruginosae, K. pneumoniaeに対するフォワードキメラプライマー(配列番号21〜25)に変更し、また、リバースキメラプライマーを、配列番号27,29,30の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーに変更して、実施例4と同様な方法によって肺炎原因菌由来の核酸の検出を行った。 Change the forward chimeric primer (SEQ ID NO: 21-25) against pneumoniae, also a reverse chimeric primer, and change the respective primers having the respective nucleotide sequences of SEQ ID NO: 27, 29, 30, similar to that in Example 4 It went the detection of nucleic acids derived from the pneumonia-causing bacteria by the method. この結果を、図6に示す。 The results, shown in Figure 6.
図6は、電気泳動後に蛍光強度を測定しグラフにしたもので、M. 6, in which the fluorescence intensity after the electrophoresis was measured graph, M. catarrhalis、MRSAのmecA、S. catarrhalis, MRSA of mecA, S. aureusのspaA、P. aureus of spaA, P. aeruginosae、K. aeruginosae, K. pneumoniae、PCR産物の塩基数は、それぞれ順に129塩基対(図中<6>)、208塩基対(図中<7>)、281塩基対(図中<8>)、409塩基対(図中<9>)、547塩基対(図中<10>)、となっている。 pneumoniae, nucleotide number of the PCR product, order 129 base pairs, respectively (in FIG. <6>), 208 bp (in the drawing <7>), 281 bp (in the figure <8>), 409 bp (figure <9>), 547 bp (in the figure <10>), has become. なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。 The nucleotide number described above, shows the measured values ​​at the time of electrophoresis.
図6より、本発明のプライマーセットを用いることで、マルチプレックスPCRにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。 From FIG. 6, by using the primer set of the present invention, the multiplex PCR, it was observed that a plurality of types of pneumonia causing bacteria can be simultaneously detected specifically.

(実施例6) (Example 6)
マルチプレックスPCRを利用した複数種類の肺炎原因菌の定量的な検出 複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出するために、表2に記載のM. The quantitative detection plurality of types of pneumonia causing bacteria in the plurality of types of pneumonia causing bacteria using multiplex PCR for quantitative detection, M. in Table 2 catarrhalis、Legionella spp. catarrhalis, Legionella spp. 、MRSAのmecA、M. , Of MRSA mecA, M. pneumoniae、S. pneumoniae, S. aureusのspaA、S. aureus of spaA, S. pneumoniae、P. pneumoniae, P. aeruginosae、H. aeruginosae, H. influenzae、及びC. influenzae, and C. pneumoniae、K. pneumoniae, K. pneumoniaeに対するキメラプライマーに特異的なフォワードキメラプライマー(配列番号16〜26)、リバースキメラプライマー(配列番号27〜30)、及びユニバーサルプライマー(配列番号31)を用いてマルチプレックスPCRを行った。 Specific forward chimeric primer chimeric primer to pneumoniae (SEQ ID NO: 16-26), a reverse chimeric primer (SEQ ID NO: 27-30), and was subjected to multiplex PCR using universal primers (SEQ ID NO: 31). 得られたPCR産物を電気泳動にて分離し、その後、蛍光強度を測定することで、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出できるかどうかを検討した。 The resulting PCR products were separated by electrophoresis, then, by measuring the fluorescence intensity, and the plurality of types of pneumonia causing bacteria investigated whether be quantitatively detected. 増幅部位は図1に示す通りである。 Amplification sites are shown in Figure 1.
各肺炎原因菌10菌種のゲノムをそれぞれ終濃度10 、10 、10 、10 、10 10 6コピーとなるように混合して調整し、それぞれに1mMデオキシリボヌクレオチド(Pharmacia社製)、4ユニットのDNA依存性DNAポリメラーゼ(タカラ社製)、上記0.025μMの各フォワードキメラプライマーとリバースキメラプライマー、1μMのユニバーサルプライマー、1000pgのCYBER Green、を混合した。 Prepared by mixing the pneumonia causing bacteria 10 bacteria species genome a final concentration of 10 1 each, 10 2, 10 3, 10 4, so that 10 5 10 6 copies, 1mM deoxyribonucleotides respectively (Pharmacia Ltd.) (manufactured by Takara) 4 units of DNA-dependent DNA polymerase and each forward chimeric primer and a reverse chimeric primer of the 0.025 uM, universal primers 1 [mu] M, 1000 pg of CYBER Green, were mixed.
その後、実施例4と同様にPCRを行い、電気泳動した後、蛍光を観察した。 Then, PCR was performed similarly to Example 4, after electrophoresis to observe the fluorescence.
この結果を図7に示す。 The results are shown in Figure 7.
図7は、M. 7, M. catarrhalis、Legionella spp. catarrhalis, Legionella spp. 、MRSAのmecA、M. , Of MRSA mecA, M. pneumoniae、S. pneumoniae, S. aureusのspaA、S. aureus of spaA, S. pneumoniae、P. pneumoniae, P. aeruginosae、H. aeruginosae, H. influenzae、C. influenzae, C. pneumoniae、及びK. pneumoniae, and K. pneumoniaeに対するキメラプライマーとユニバーサルプライマーとを用いてPCRを行った結果であり、それぞれ順に、PCR産物の塩基数は129塩基対(図中<1>)、146塩基対(図中<2>)、208塩基対(図中<3>)、222塩基対(図中<4>)、281塩基対(図中<5>)、388塩基対(図中<6>)、409塩基対(図中<7>)、416塩基対(図中<8>)、474塩基対(図中<9>)、547塩基対(図中<10>)となっている。 The result of PCR was performed using the chimeric primer and universal primer for pneumoniae, in order respectively, bases of the PCR product 129 bp (in FIG. <1>), 146 bp (in the figure <2>), 208 base pairs (in FIG. <3>), 222 bp (in FIG. <4>), 281 bp (in the drawing <5>), 388 bp (in the drawing <6>), 409 bp (figure <7>), 416 bp (in the figure <8>), 474 bp (in the figure <9>), has a 547 base pair (in the drawing <10>). なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。 The nucleotide number described above, shows the measured values ​​at the time of electrophoresis.
図7において、鋳型となる核酸のコピー数の増加に伴い、蛍光強度(FU)の増加が観察された。 7, with an increase in the number of copies of the nucleic acid as a template, the increase in fluorescence intensity (FU) was observed.

(実施例7) (Example 7)
マルチプレックスPCRを利用した複数種類の肺炎原因菌の定量的な検出 図8〜図11はリアルタイムPCRによって蛍光強度を経時的に観察したものである。 Quantitative detection view of a plurality of types of pneumonia causing bacteria using multiplex PCR. 8 to 11 are those observed over time the fluorescence intensity by real-time PCR. M. M. catarrhalis、Legionella spp. catarrhalis, Legionella spp. 、M. , M. pneumoniae、S. pneumoniae, S. aureusのspaA、P. aureus of spaA, P. aeruginosae、C. aeruginosae, C. pneumoniae、及びK. pneumoniae, and K. pneumoniaeのゲノムをそれぞれ終濃度10 、10 、10 、10 、10 、10 6コピーとなるように混合して調整し、また、S. Genomic each final concentration 10 1 pneumoniae, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 prepared by mixing so that the copy, also, S. pneumoniae及びH. pneumoniae and H. influenzaeに関しては、ゲノムをそれぞれ終濃度10 、10 、10 、10 、10 コピーとなるように混合して調整し、MRSAに関しては、ゲノムをそれぞれ終濃度10 10 10 となるように混合して調整し、ゲノム溶液を作製した。 Regarding influenzae, genome adjustments are mixed to a final concentration of 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 copies, for MRSA, and the genomic each final concentration of 10 6 10 7 10 8 mixed and adjusted to, to prepare a genome solution. それぞれのゲノム溶液に、1mMデオキシリボヌクレオチド(Pharmacia社製)、4ユニットのDNA依存性DNAポリメラーゼ(タカラ社製)、表2に記載の0.025μMの各フォワードキメラプライマーとリバースキメラプライマー、1μMのユニバーサルプライマー、1000pgのCYBER Green、を混合した。 The respective genomes solution (manufactured by Pharmacia Co.) 1 mM deoxyribonucleotide, 4 units (manufactured by Takara) DNA-dependent DNA polymerase, each forward chimeric primer and a reverse chimeric primer 0.025μM described in Table 2, Universal 1μM primer, 1000pg of CYBER Green, were mixed. その後、リアルタイムPCRを行い、蛍光を観察した。 Thereafter, the real-time PCR, fluorescence was observed. PCRの反応条件は、実施例1と同様である。 The reaction conditions for PCR were the same as in Example 1.
この結果を図8〜図11に示す。 The results are shown in Figures 8-11. 図8〜図11より、サイクル数が増加していったとき、鋳型の量に依存した蛍光強度の増加が観察された。 From 8 to 11, when the number of cycles began to increase, increase in fluorescence intensity depending on the amount of template was observed.
よって、本発明のキメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いることで、マルチプレックスPCRにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量的に検出できることが観察された。 Therefore, by using a chimeric primer and universal primer of the present invention, the multiplex PCR, it was observed that a plurality of types of pneumonia causing bacteria can be quantitatively detected simultaneously.

本発明を用いることにより、複数種類の肺炎原因菌を一度に検出することができる。 By using the present invention, it is possible to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria at a time. また、定量的な検出が可能であるので、微量でも肺炎を起こす原因菌の検出や、感染量により病症が異なる原因菌の検出に有効である。 Further, since it is possible quantitative detection, detection of causative bacteria causing pneumonia in trace amounts, Disease infection amount is effective for the detection of different causative bacteria.
本発明のプライマーセットを用いた肺炎原因菌の検出システムは、クラミジアやリッケッチアなど培養困難な病原微生物、薬剤耐性菌など院内感染原因菌に対して適切な治療法選択のための臨床診断用簡易検査試薬として利用可能である。 Detection systems pneumonia causing bacteria using the primer set of the present invention, a clinical diagnostic simple test for chlamydia and cultured difficult pathogenic microorganisms such Rikketchia, appropriate treatment chosen for nosocomial infection-causing bacteria, such as drug-resistant bacteria it is available as a reagent. 更に、本発明では基板に合成樹脂を用いており、取り扱いが簡便で検出用機器に合わせた加工が可能な汎用性の高いシステムを提供することが可能となる。 Furthermore, the present invention uses a synthetic resin substrate, it is possible to provide a capable versatile system processing tailored to the detection device is simple to handle.

核酸増幅による16SrRNA遺伝子内の増幅範囲を示した模式図である。 It is a schematic diagram showing the amplification range of the 16SrRNA gene by nucleic acid amplification. 基板上で、肺炎原因菌の検出を行った図である。 On the substrate, a diagram was detected pneumonia causing bacteria. マルチプレックスPCRによって肺炎原因菌2菌種の検出を基板で測定した図である。 By Multiplex PCR is a diagram obtained by measuring the detection of pneumonia causing bacteria 2 species in the substrate. マルチプレックスPCRによって他の肺炎原因菌2菌種の検出を基板で測定した図である。 By Multiplex PCR is a diagram measured at a substrate other pneumonia causing bacteria 2 species detection. マルチプレックスPCRによる肺炎原因菌5菌種を検出した図である。 Is a diagram of detection pneumonia causing bacteria 5 bacteria species by multiplex PCR. マルチプレックスPCRによる肺炎原因菌他の5菌種を検出した図である。 Is a diagram of detection pneumonia causing bacteria other 5 species according to the multiplex PCR. マルチプレックスPCRによる肺炎原因菌10菌種を検出した図である。 Is a diagram of detection pneumonia causing bacteria 10 bacteria species by multiplex PCR. キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスPCRにより、肺炎原因菌であるS. The multiplex PCR using chimeric primers and universal primers, S. a pneumonia-causing bacteria pneumoniae、H. pneumoniae, H. influenzae、及びMRSAを検出した図である。 influenzae, and a diagram obtained by detecting MRSA. キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスPCRにより、肺炎原因菌であるM. The multiplex PCR using chimeric primers and universal primers, M. a pneumonia-causing bacteria pneumoniae、C. pneumoniae, C. pneumoniae、及びLegionella spp. pneumoniae, and Legionella spp. を定量的に検出した図である。 The diagrams were quantitatively detected. キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスPCRにより、肺炎原因菌であるK. The multiplex PCR using chimeric primers and universal primers, K. a pneumonia-causing bacteria pneumoniae、P. pneumoniae, P. aeruginosae、及びM. aeruginosae, and M. catarrahalisを定量的に検出した図である。 Is a diagram quantitatively detect Catarrahalis. キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスPCRにより、肺炎原因菌であるS. The multiplex PCR using chimeric primers and universal primers, S. a pneumonia-causing bacteria aureusを定量的に検出した図である。 Is a diagram quantitatively detect aureus.

Claims (15)

  1. 複数種類の肺炎原因菌の検出に用いられるプライマーセットであって、 A primer set used to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria,
    配列番号1の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号3の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号4の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号12の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号13の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、 A forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a reverse primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, and a reverse primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 has,
    前記各プライマー 5´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とするプライマーセット。 The primer set, wherein the promoter sequence 5'-side of each primer are both the same promoter sequence.
  2. 更に、配列番号5の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号6の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号7の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号8の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号9の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号10の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号14の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からな Furthermore, a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of the promoter sequence was added to the 5 'side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 When a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, the forward primer consisting of the nucleotide sequence of the promoter sequence was added to the 5 'side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 When a forward primer comprising the base sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of the promoter sequence was added to the 5 'side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 When, it the nucleotide sequence promoter sequence is added to the 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 リバースプライマーと、配列番号15の塩基配列の5´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、 Has a reverse primer, 5'-side of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer promoter sequence consists added in the nucleotide sequence,
    前記各プライマー 5´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする請求項1に記載のプライマーセット。 The primer set according to claim 1 in which the promoter sequence 5'-side of each primer and wherein the both are identical promoter sequences.
  3. 前記プロモーター配列が、T7RNA合成酵素のプロモーター配列であることを特徴とする請求項1又は2に記載のプライマーセット。 Said promoter sequence, the primer set according to claim 1 or 2, characterized in that the promoter sequence of T7RNA synthase.
  4. 肺炎原因菌検出用キットであって、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットと、DNAポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを有することを特徴とする肺炎原因菌検出用キット。 A pneumonia-causing bacteria detection kit, and primer set according to any one of claims 1 to 3, and DNA polymerase, nucleotides, pneumonia-causing bacteria detection and having a nucleic acid amplification buffer use kit.
  5. 肺炎原因菌の検出方法であって、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする肺炎原因菌の検出方法。 The detection process of pneumonia causing bacteria, the detection method of pneumonia causing bacteria, which comprises using a primer set according to any one of claims 1 to 3.
  6. 請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いた核酸増幅により、複数種類の肺炎原因菌を検出することを特徴とする請求項5に記載の肺炎原因菌の検出方法。 The nucleic acid amplification using the primer set according to any one of claims 1 to 3, the detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 5, characterized in that to detect a plurality of types of pneumonia causing bacteria.
  7. 核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、 The detection process of pneumonia causing bacteria by nucleic acid amplification,
    (1)請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程、 (1) step of performing nucleic acid amplification using the primer set according to any one of claims 1 to 3,
    (2)工程(1)で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、プロモーター配列と相同的な配列からなるユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅を行う工程、 (2) a nucleic acid amplification product obtained in step (1) as a template, performing nucleic acid amplification using the universal primers consisting of promoter sequences homologous to sequences process,
    (3)工程(2)で得られた核酸増幅産物を検出する工程、 (3) detecting the resulting nucleic acid amplification products in step (2),
    を少なくとも含むことを特徴とする肺炎原因菌の検出方法。 Pneumonia caused method for detecting bacteria which comprises at least a.
  8. 核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、 The detection process of pneumonia causing bacteria by nucleic acid amplification,
    前記工程(3)の検出方法が、 Detection method of the step (3) is,
    前記工程(2)で得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性する工程、 Step of denatured into single-stranded nucleic acid amplification product obtained in the step (2),
    基板に固定された配列番号1〜10の塩基配列からなるプライマーの群からなる1以上のフォワードプライマーと該一本鎖DNAとをハイブリダイズさせることにより二本鎖DNAを形成する工程、 Forming a double-stranded DNA by allowing one or more forward primer and the said single-stranded DNA consisting of the group of primer consisting of fixed SEQ ID NO: 1 to 10 in the nucleotide sequence on the substrate is hybridized,
    及び該二本鎖DNAを標識試薬を用いて検出する工程、 And a step of detected using a labeled reagent the double-stranded DNA,
    を少なくとも有することを特徴とする請求項7に記載の肺炎原因菌の検出方法。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 7, characterized in that it comprises at least a.
  9. マルチプレックスPCRを用いることを特徴とする請求項6〜8のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to any one of claims 6-8, characterized by using a multiplex PCR.
  10. 前記ユニバーサルプライマーの濃度が、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセットのプライマーの濃度の10倍以上であることを特徴とする請求項7〜9のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。 The concentration of the universal primer, according to any one of claims 7-9, characterized in that at least 10 times the concentration of primers in the primer set according to any one of claims 1 to 3 the detection method of the pneumonia-causing bacteria.
  11. 前記基板が平板状またはチューブ状であって、前記プライマーが前記基板表面に固定されていることを特徴とする請求項8〜10のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。 Wherein a substrate is a flat plate-like or tubular, the detection method of pneumonia causing bacteria according to any one of claims 8-10, wherein the primer is characterized in that it is fixed to the substrate surface.
  12. 前記基板が平板状で、かつ、複数の凹部を有し、前記プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする請求項8〜11のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。 In the substrate tabular, and has a plurality of recesses, the detection method of pneumonia causing bacteria according to any one of claims 8 to 11 wherein the primer is characterized in that it is fixed to the recess .
  13. 前記基板上に設けられた複数の前記凹部を、全て覆うことが可能な透明なカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする、請求項12に記載の肺炎原因菌の検出方法。 A plurality of said recesses provided on the substrate, with a transparent cover that can cover all, and introducing into the recess of the reaction solution by surface tension, pneumonia according to claim 12 method of detecting the causative bacteria.
  14. 前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする請求項8〜13のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。 Detection method of pneumonia causing bacteria according to any one of claims 8 to 13 wherein the labeling reagent is characterized in that it is a fluorescent dye.
  15. 前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする請求項14に記載の肺炎原因菌の検出方法。 Wherein the amount of fluorescence of the fluorescent dye, the detection method of pneumonia causing bacteria according to claim 14, characterized in that measured over time.
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