JP2017513522A - 発癌性hpvウイルスの存在を検出するためのスクリーニング検査 - Google Patents
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Abstract
Description
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記pan-HPVプローブは配列ACTTTCGTTT(配列番号25)またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする。
a)HPV16に関して配列番号1および配列番号14
b)HPV18に関して配列番号2および配列番号15
c)HPV33/33nに関して配列番号3および配列番号14
d)HPV31に関して配列番号4および配列番号14
e)HPV35に関して配列番号5および配列番号14
f)HPV39に関して配列番号6および配列番号14
g)HPV45に関して配列番号7および配列番号15
h)HPV51に関して配列番号8および配列番号16
i)HPV52に関して配列番号9および配列番号14
j)HPV56/66に関して配列番号10および配列番号14
k)HPV58に関して配列番号11および配列番号14
l)HPV59に関して配列番号12および配列番号17
m)HPV68に関して配列番号13および配列番号18。
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出し、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68についての検査で陽性であることを結論付けること
を含みうる。
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出せず、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68についての検査で陰性であることを結論付けること
を含みうる。
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブおよび/または前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
をさらに含むことができ、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記33nプローブは配列ACTTTCGCTT(配列番号26)またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする。
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG(配列番号27)またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする。
a)HPV16に関して配列番号19および配列番号20
b)HPV18に関して配列番号21および配列番号22。
前記試料を、前記試料中に存在する対照DNA配列のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、および前記対照DNA配列の増幅に基づいて信号を発することができる標識された対照プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される。
以下のオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対:
a)HPV16に関して:配列番号1および配列番号14
b)HPV18に関して:配列番号2および配列番号15
c)HPV33/33nに関して:配列番号3および配列番号14
d)HPV31に関して:配列番号4および配列番号14
e)HPV35に関して:配列番号5および配列番号14
f)HPV39に関して:配列番号6および配列番号14
g)HPV45に関して:配列番号7および配列番号15
h)HPV51に関して:配列番号8および配列番号16
i)HPV52に関して:配列番号9および配列番号14
j)HPV56/66に関して:配列番号10および配列番号14
k)HPV58に関して:配列番号11および配列番号14
l)HPV59に関して:配列番号12および配列番号17
m)HPV68に関して:配列番号13および配列番号18。
全ての発癌性HPV型および、好ましくは、内部対照における相同領域の同定および増幅を可能にするプライマーおよびプローブのキットを設計し適合させた。本発明の一実施形態では、好ましくは、前記反応を単一の試験管内で実施し、好ましくは、前記反応の読み出しは市場に存在するリアルタイムPCR装置の大部分で使用される最大4検出チャネルで行った。
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のためのプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示される。
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブまたは前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含んでいてもよく、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示される。
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のためのプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含んでいてもよく、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示される。
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含むことになり、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される。
実施例I. 診断検査の実施形態
本実施形態では、全ての研究した発癌性HPVウイルスの存在および16と18のHPV型の存在を検査試料中で判定した。
Real-Time Master MIX MabProbeは、リアルタイムPCR用の2.083倍濃縮混合物である。それには、モノクローナル抗体でブロックされたTaqポリメラーゼおよびリアルタイムPCRのために必要な他の成分が含まれる。前記混合物の成分は最終混合物に適切な部分で組み合わされ、その最終混合物を使用することにより汚染および人的エラーのリスクが低減した。前記キットは、以下を含む:
-Master MIX MabPROBE
-プローブおよびプライマーの混合物
-陽性対照試料
-陰性対照試料
-水
前記Master MIX MabPROBE混合物の組成:
-Run MAbポリメラーゼ0.104 U/μl
-反応緩衝液:トリス塩酸20.83mM pH8.0、
KC1 104nM
MgCl2 - 10.42mM
-dNTP - 2.75mM(0.69mMの各dNTP)
-PCR安定剤
前記検査の全構成成分は暗所にて20℃で保存されている。再融解および構成成分の再凍結により、それらの活性の劣化は引き起こされない。それらはドライアイス上での輸送を要する。
a.全ての成分を氷上に置く。プライマー、プローブおよび前記Master MIX MabPROBE混合物、陽性対照試料および陰性対照試料をボルテックスし、短時間遠心分離する。
ライトサイクラー(Light Cycler)2.0、ライトサイクラー・ロシュ96、ライトサイクラー・ロシュ480、バイオラッドCFXTouch。色補正を必要とする装置は、正しい形式でのファイルを伴う検査または自己実行補正のための色素キットの製造元が提供している。
本発明によれば、特定の試料中のウイルスの存在は、その特定のプライマー対を含む産物の増幅によって証明される。
HPV16 F
5’GCACAGGAAGCAAAACAACATAGAGATGCAGTACAGGTTCTAAAACGAAAGT ATTTGGGTAGTCCACTTAGTGATATTAGTGGATGTGTAGACAATAATATTAGTCC TAGATTAAAAGCTATATGTATAGAAAAACAAAGTAGAGCTGCAAAAAGGAGATT ATTTGAAAGCGAAGACAGCGGGTATGGCAATAC3’
HPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66R
第一のステップには、16/18HPVに関する追加の検出チャネルを分離するために、前述のプライマーおよび分子プローブの組成の改変が含まれた。疫学的データによれば、HPV16およびHPV18は、感染女性における最も高い発癌性と子宮頸癌の発症のリスクによって特徴付けられる。したがって、臨床目的のために、具体的には、集団ベースのスクリーニング検査のために使用されるHPV検査にとって、発癌性HPVの感染を識別するだけでなく、前記の調査した試料中のHPV16/18の存在を判定することも可能にすることが推奨される。したがって、全ての発癌性HPV型のグループおよび内部対照のための系を用いる単一反応においてHPV16/18の区別を可能にする複数のプライマーと1つの分子プローブの追加キットを設計した。実施した研究の結果、HPV16およびHPV18に関する4つのプライマーと、560nmでのチャネルにおけるアンプリコンの検出を可能にする、HEX蛍光色素で標識された1つの短いプローブTaqMan-LNAをえた。全ての発癌性HPV型についての共通領域から約700bpの距離に位置する、HPVゲノムのE1領域を、プライマーおよび共通LNAプローブのための標的配列として選択した。この場合、前記内部対照系をリアルタイムPCRのために好ましく改変した。βグロビンについての参照ヒト遺伝子の方を選んで前記合成ヌクレオチドを排除した。2つのプライマーおよびROX色素(610nmでの検出チャネル)で標識したTaqManプローブを、前記試料中に潜在的に存在する、HPV粒子と一緒にこの遺伝子の一段増幅(single-stage amplification)のために設計した。その結果、標的反応混合物は26のプライマーと4つの分子プローブを含んだ。以前に遺伝子型決定の細胞学的試料の検査を行った結果として、プライマーダイマー型の生成物も、他の非特異的なPCR増幅産物のいずれも観察されなかった。
HPV16標準:HR-HPV(FAM)チャネル-対照希釈 1:128-ウイルスの2×104コピー
16/18HPVチャネル(HEX)-対照希釈 1:2048-ウイルスの3.33×103のコピー
HPV18標準:HR-HPVチャネル(FAM)-対照希釈 1:128-ウイルスの5×104のコピー
16/18HPVチャネル(HEX)-対照希釈 1:2048-ウイルスの1.92×103のコピー
HR-HPVのための新規検査の診断価値を決定するために、検証されたPapilloCheck検査(グライナーバイオワン)に関連するその感度と特異性を測定した。後者の検査は、文献に詳細に記載されている、HPV16/18を含む、HR-HPV感染症のための最適な診断精度によって特徴付けられると仮定された。したがって、それを前記新規検査のための参照として使用した。また、両検査の相関係数を求めた。これは定性試験の検証の場合に適用する標準的な手順であり、これにより、現在使用されているゴールドスタンダードを新規ツールと置き換えることができるかどうかの決定が可能になる。前記分析はNZOZ Meditestによりえられた細胞学的および分子遺伝学的試験の結果に基づいて行われた。
1256対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は630(50.2%)の陽性結果と626(49.8%)の陰性結果をもたらした。前記参照検査は647(51.5%)の陽性結果と609(48.5%)の陰性結果をもたらした。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して94.6%の感度と97.0%の特異性によって特徴付けられることが示された。
1256対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は230(18.3%)の陽性結果と1026(81.7%)の陰性結果をもたらした。前記参照検査は238(18.9%)の陽性結果と1018(81.1%)の陰性結果をもたらした。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して93.7%の感度と99.3%の特異性によって特徴付けられることが示された。
720対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は154(21.4%))の陽性結果と566(78.6%)の陰性結果をもたらした。前記参照検査は165(22.9%)の陽性結果と555(77.1%)の陰性結果をもたらした。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して87.9%の感度および98.4%の特異性によって特徴付けられることが示された。
720対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は52(7.2%))の陽性結果と668(92.8%)の陰性結果をもたらした。前記参照検査は53(7.4%)の陽性結果と667(92.6%)の陰性結果をもたらした。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して92.5%の感度および99.6%の特異性によって特徴付けられることが示された。
536対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は476(88.8%)の陽性結果と60(11.2%)の陰性結果をもたらした。前記参照検査は482(89.9%)の陽性結果と54(10.1%)の陰性結果をもたらした。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して96.9%の感度と83.3%の特異性によって特徴付けられることが示された。
536対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は178(33.2%)の陽性結果と358(66.8%)の陰性結果をもたらした。前記参照検査は185(34.5%)の陽性結果と351(65.5%)の陰性結果をもたらした。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して94.1%の感度および98.9%の特異性によって特徴付けられることが示された。
ケンドールのタウb係数の分析により、前記新規検査の結果は76.6%から91.5%までに及ぶHR-HPV検出の範囲内で前記参照PapilloCheck検査の結果との非常に高い相関によって特徴付けられることが明らかとなった。95%の理想的な閾値に近い(92.8%〜94.2%の)、より高いレベルの相関がHPV16/18の検出に関してえられた。
顕微鏡像との相関のさらなる統計的分析および前記新規検査の臨床的有効性の判断のためにシュアパス液状媒体上に収集した子宮頸部由来の細胞診試料において前記新規hrHPV検査を用いて、5000人の女性が関わる臨床的な集団ベースの研究を実施した。
HR-HPVに関する前記新規検査の臨床的有用性を判断するために、液状媒体(シュアパス、ベクトン・ディッキンソン)での細胞学的試験に関連した陽性予測値(PPV)および陰性予測値(NPV)の値を用いた。このように、HR-HPVの存在について前記新規検査の陽性結果を示す患者において細胞学的試験の異常な結果および前記検査の陰性結果を伴う細胞学的試験の正常な結果がえられる確率を決定した。前記新規検査の高い陰性予測値が確認された場合には、その陰性結果により細胞学的試験から外すことが可能となり、その陽性結果はその実行のための基準となる可能性がある。
5000対のhrHPV検査と細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は403(8.1%)の陽性結果と4597(91.9%)の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は175(3.5%)の異常スライドと4825(96.5%)の正常スライドを含んでいた。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、41.7%の陽性予測値(PPV)と99.8%の陰性予測値(NPV)によって特徴付けられることが示された。
5000対のhrHPV検査と細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は403(8.1%)の陽性結果と4597(91.9%)の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は15(0.3%)のH-SILに対応する病変を伴うスライドと4985(99.7%)の正常スライドまたはH-SILよりも低い強度のスライドを含んでいた。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、3.7%の陽性予測値(PPV)と100.0%の陰性予測値(NPV)によって特徴付けられることが示された。
5000対の検査と細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は169(3.4%)の陽性結果と4831(96.6%)の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は175(3.5%)の異常スライドと4825(96.5%)、正常スライドを含んでいた。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、42.0%の陽性予測値(PPV)と97.8%の陰性予測値(NPV)によって特徴付けられることが示された。
5000対の検査および細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は169(3.4%)陽性結果と4831(96.6%)の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は15(0.3%)のH-SILに対応する病変を伴うスライドと4985(99.7%)の正常スライドまたはH-SILよりも低い強度のスライドを含んでいた。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、5.9%の陽性予測値(PPV)と99.9%の陰性予測値(NPV)によって特徴付けられることが示された。
前記新規検査の臨床的価値の分析により、それが液状媒体上の細胞学的試験の結果と比較すると、最適な陰性予測値(97.8%から100%まで)によって特徴付けられることが明らかとなった。特に高いNPV値(HR-HPVについて陰性結果は100%、HPV16/18について陰性結果は99.9%)は前癌性病変(H-SIL)に関してえられた。特にASC-USとASC-H型の細胞学的診断のグループにおいて、必ずしも全ての細胞学的異常が、活動性HPV感染に付随して起こるとは限らないことを考慮すると、より低いレベルの前記陽性予測値を完全に理解できる。従来の細胞診に比べて前記hrHPV検査に関する予測値のより一層好ましい係数が達成できることが期待され、これは液状媒体上の細胞学的方法(液体ベースの細胞診、LBC)と比較して異常な子宮頸部の上皮細胞を検出する際の有効性がより低いことを特徴とする。
Claims (38)
- 試料が発癌性ヒトパピローマウイルス(HPV)についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記pan-HPVプローブは配列ACTTTCGTTT(配列番号25)、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする、方法。 - 前記pan-HPVプローブはACTTTCGTTT(配列番号25)、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記pan-HPVプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマーはHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68のいずれかの標的領域の増幅のためのプライマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68の全ての標的領域の増幅のための複数のプライマーの組み合わせと組み合わせることを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記プライマーは以下のプライマー対の一対または複数対を含む、
a)HPV16に関して配列番号1および配列番号14
b)HPV18に関して配列番号2および配列番号15
c)HPV33/33nに関して配列番号3および配列番号14
d)HPV31に関して配列番号4および配列番号14
e)HPV35に関して配列番号5および配列番号14
f)HPV39に関して配列番号6および配列番号14
g)HPV45に関して配列番号7および配列番号15
h)HPV51に関して配列番号8および配列番号16
i)HPV52に関して配列番号9および配列番号14
j)HPV56/66に関して配列番号10および配列番号14
k)HPV58に関して配列番号11および配列番号14
l)HPV59に関して配列番号12および配列番号17
m)HPV68に関して配列番号13および配列番号18
先行する請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記プライマーは前記プライマー対(a)から(m)の全てを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出し、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68についての検査で陽性であることを結論付けること
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出せず、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68についての検査で陰性であることを結論付けること
を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 前記試料を、HPV33nの標的領域の増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された33nプローブと組み合わせ、前記33nプローブと前記pan-HPVプローブは同一標識を担持し、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブまたは前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
をさらに含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記33nプローブは配列ACTTTCGCTT(配列番号26)、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記33nプローブはACTTTCGCTT(配列番号26)、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子である、請求項10に記載の方法。
- 前記pan-HPVプローブおよび前記33nプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そしてそれらのそれぞれの標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は同一波長の蛍光である、請求項11に記載の方法。
- 前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定することをさらに含む方法であって、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG(配列番号27)を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。 - 試料が発癌性ヒトパピローマウイルス(HPV)HPV16および/またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG(配列番号27)、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸(LNA)分子であることを特徴とする、方法。 - 前記16/18プローブはATATCWGATGACGAG(配列番号27)、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された15-ヌクレオチド分子である、請求項13または14に記載の方法。
- 前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブとは異なる標識を担持する、請求項13または請求項15に記載の方法。
- 前記16/18プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である、請求項13〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブの波長とは異なる波長で蛍光信号を発する、請求項16または17に記載の方法。
- 前記プライマーは以下のプライマー対の両方または一方を含む、
a)HPV16に関して配列番号19および配列番号20
b)HPV18に関して配列番号21および配列番号22、
請求項13〜18のいずれかに記載の方法。 - 前記リアルタイムPCRに関して陽性対照試験を実施することをさらに含む方法であって、
前記試料を、前記試料中に存在する対照DNA配列のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、および前記対照DNA配列の増幅に基づいて信号を発することができる標識された対照プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記対照DNA配列はヒトDNAである、請求項20に記載の方法。
- 前記試料はヒト頸管スミア由来の液体ベースの細胞学的試料である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
- ヌクレオチド配列ACTTTCGTTT(配列番号25)またはその逆相補鎖配列と検出可能な標識とを含む標識された核酸プローブを含む組成物。
- 前記プローブはLNAヌクレオチドを含む、請求項23に記載の組成物。
- 前記プローブは蛍光色素分子およびクエンチャーで標識されたACTTTCGTTT(配列番号25)またはその逆相補鎖配列からなる配列の10-ヌクレオチド分子である、請求項23または請求項24に記載の組成物。
- 前記プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識される、請求項23〜25のいずれかに記載の組成物。
- HPVの検出のためにリアルタイムPCRを行う際の請求項23〜26のいずれかに記載の組成物の使用。
- 配列番号1〜32から選択される配列によって特徴付けられるオリゴヌクレオチド。
- 以下を含むことを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応の方法によって発癌性HPVを検出するためのキット、
以下のオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対:
a)HPV16に関して
配列番号1および配列番号14
b)HPV18に関して
配列番号2および配列番号15
c)HPV33/33nに関して
配列番号3および配列番号14
d)HPV31に関して
配列番号4および配列番号14
e)HPV35に関して
配列番号5および配列番号14
f)HPV39に関して
配列番号6および配列番号14
g)HPV45に関して
配列番号7および配列番号15
h)HPV51に関して
配列番号8および配列番号16
i)HPV52に関して
配列番号9および配列番号14
j)HPV56/66に関して
配列番号10および配列番号14
k)HPV58に関して
配列番号11および配列番号14
l)HPV59に関して
配列番号12および配列番号17
m)HPV68に関して
配列番号13および配列番号18。 - 請求項29で定義される全てのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項29に記載の、キット。
- 配列番号25〜28から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項29または30に記載の、キット。
- 配列番号29〜32から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項29〜31に記載の、キット。
- 配列番号23〜24から選択されるオリゴヌクレオチド配列を有する、内部対照としての、一対のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項29〜32に記載の、キット。
- 請求項29で定義されるオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施し、その特定のプライマー対を含む産物の増幅によりウイルスの存在が証明されることを特徴とする、発癌性HPVを検出するための方法。
- 請求項29に示した全てのオリゴヌクレオチドを同時に用いたマルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施することを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 配列番号25〜28から選択される配列を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プローブの使用をさらに含むことを特徴とする、請求項34または35に記載の方法。
- 配列番号29〜32から選択される配列を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プローブの使用をさらに含むことを特徴とする、請求項34〜36のいずれかに一項に記載の、方法。
- 配列番号23〜24から選択されるオリゴヌクレオチド配列を有する、内部対照としての、一対のプライマーの対の使用をさらに含むことを特徴とする、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
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