PL235847B1 - Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV - Google Patents

Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV Download PDF

Info

Publication number
PL235847B1
PL235847B1 PL407864A PL40786414A PL235847B1 PL 235847 B1 PL235847 B1 PL 235847B1 PL 407864 A PL407864 A PL 407864A PL 40786414 A PL40786414 A PL 40786414A PL 235847 B1 PL235847 B1 PL 235847B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hpv
sequence
test
negative
positive
Prior art date
Application number
PL407864A
Other languages
English (en)
Other versions
PL407864A1 (pl
Inventor
Jacek PODOLSKI
Jacek Podolski
Lucjan WYRWICZ
Lucjan Wyrwicz
Original Assignee
Centrum Onkologii Inst Im Marii Sklodowskiej Curie
Podolski Jacek Niepubliczny Zakl Opieki Zdrowotnej Meditest Diagnostyka Medyczna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centrum Onkologii Inst Im Marii Sklodowskiej Curie, Podolski Jacek Niepubliczny Zakl Opieki Zdrowotnej Meditest Diagnostyka Medyczna filed Critical Centrum Onkologii Inst Im Marii Sklodowskiej Curie
Priority to PL407864A priority Critical patent/PL235847B1/pl
Priority to US15/303,503 priority patent/US20170029908A1/en
Priority to ES15722601.0T priority patent/ES2684746T3/es
Priority to AU2015244506A priority patent/AU2015244506A1/en
Priority to EP15722601.0A priority patent/EP3129512B1/en
Priority to HUE15722601A priority patent/HUE039321T2/hu
Priority to JP2017505038A priority patent/JP2017513522A/ja
Priority to CA2945477A priority patent/CA2945477A1/en
Priority to PCT/PL2015/050007 priority patent/WO2015156693A1/en
Priority to TR2018/09154T priority patent/TR201809154T4/tr
Publication of PL407864A1 publication Critical patent/PL407864A1/pl
Publication of PL235847B1 publication Critical patent/PL235847B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy dziedziny diagnostyki raka szyjki macicy, a w szczególności testu skriningowego na obecność onkogennych wirusów HPV, korzystnie opartego na technologii LNA (locked nucleid acids) i związanego z nim sposobu, jako nowego narzędzia w profilaktyce i wczesnym wykrywaniu raka szyjki macicy.
Rak szyjki macicy jest nowotworem złośliwym, który globalnie ciągle stanowi poważny problem zdrowotny i społeczny. Na świecie w ciągu roku rozpoznaje się około 500 000 przypadków nowych zachorowań, a ponad połowa kobiet umiera z powodu tej choroby. Mimo iż kobiety są wszędzie zagrożone tym nowotworem, to pod względem częstości zachorowania i umieralności notuje się jednak znaczne różnice geograficzne.
Prawie 80% przypadków raka szyjki jest diagnozowanych w państwach rozwijających się, gdzie w porównaniu z innymi nowotworami narządów płciowych, zajmuje on nawet pierwsze miejsce jako przyczyna zgonów wśród kobiet. W tych krajach przewiduje się nawet wzrost liczby zachorowań w kolejnych latach. Tendencje spadkowe zachorowalności na raka szyjki macicy oraz niższą umieralność w krajach rozwiniętych wiąże się z prowadzeniem powszechnej i systematycznej profilaktyki oraz z lepszym dostępem do nowoczesnej opieki zdrowotnej.
Polska należy do krajów o stosunkowo wysokiej zachorowalności i umieralności na raka szyjki macicy. Jest on drugim pod względem częstości występowania nowotworem złośliwym u kobiet do 45 roku życia. Co roku około 3500 Polek dowiaduje się, że ma raka szyjki macicy, z czego około połowa umiera. Liczba zgonów z powodu tego nowotworu stawia Polskę na jednym z pierwszych miejsc w Europie.
Leczenie raka szyjki macicy zależy od stopnia zaawansowania choroby i obejmuje wycięcie miejscowe i radykalny zabieg chirurgiczny we wczesnych stadiach choroby, radykalną radioterapię w połączeniu z brachyterapią i jednoczasową chemioterapią w stadiach zaawansowanych i leczenie paliatywne w przypadku choroby przerzutowej. W ramach chemioterapii stosowana jest najczęściej karboplatyna i paklitaksel. Dodatkowe leki mogą podnosić czas przeżycia pacjenta w przypadkach zaawansowanych. Ostatnie doniesienia wskazują na możliwość stosowania w tym wskazaniu także terapii celowanej (bewacyzumab) - która jednak poprawiając parametry długości życia w leczeniu paliatywnym znacznie wpływa na koszt takiej terapii. W przypadku odporności na platynę, lekiem drugiego wyboru jest topotekan.
W 2006 roku wprowadzono do obrotu szczepionki zapobiegające zakażeniom wirusem HPV główną przyczyną zachorowalności na raka szyjki macicy. Szczepionka o nazwie Gardasil została zatwierdzona do użytku w Stanach Zjednoczonych i na terenie Unii Europejskiej. Kolejną szczepionką przeciw zakażeniom HPV jest Cervarix.
Rak szyjki macicy jest jednym z nielicznych rozrostów złośliwych, któremu można, jednakże, skutecznie zapobiegać poprzez właściwą profilaktykę oraz wczesną diagnostykę stanów chorobowych predysponujących do jego rozwoju (tzw. zmian przedrakowych określanych jako neoplazja śródnabłonkowa). Dotychczas, podstawową i najskuteczniejszą metodą takiej profilaktyki były regularnie wykonywane u kobiety badania cytologiczne wymazów z szyjki macicy mające na celu wykrycie nieprawidłowych komórek nabłonka wielowarstwowego płaskiego lub gruczołowego. Mimo niewątpliwej wartości badań cytologicznych w skriningu populacyjnym raka szyjki macicy, podstawowym ograniczeniem tej metody jest stosunkowo niska czułość, wynosząca ok. 60%. Według wielu opracowań naukowych znacznie efektywniejsze w wykrywaniu zaawansowanych zmian przedrakowych (tzw. CIN2, CIN3, rak in situ) oraz raka szyjki macicy jest skojarzone badanie cytologiczne i molekularno-genetyczne tzw. onkogennych typów wirusów brodawczaka ludzkiego (HPV) - grupy 15 spośród kilkuset znanych typów HPV, bezpośrednio wywołujących proces kancerogenezy w nabłonku szyjki macicy u niektórych z zakażonych kobiet (inaczej określane one są wirusami wysokiego ryzyka, high-risk HPV, HR-HPV). Poza wysoką czułością skojarzonego badania cytologicznego i HPV (dochodzącą do 100%) oraz tylko nieco niższą specyficznością w porównaniu z samą cytologią, metodę tę cechuje także wysoki tzw. wskaźnik NPV (negatywna wartość predykcyjna). Takie skojarzone badania są szczególnie zalecane u kobiet powyżej 30 roku życia. Poza zastosowaniem testów HPV w pierwotnym skriningu raka szyjki macicy jako uzupełnienie diagnostyki cytologicznej, określenie infekcji wirusami z grupy onkogennych HPV jest zalecane także na etapie tzw. pogłębionej diagnostyki u kobiet, u których w badaniu cytologicznym wykryto obecność nieprawidłowych komórek nabłonkowych, zwłaszcza w przypadku rozpoznań określanych jako ASC-US i LSIL (zalecenia Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego i instytucji międzynarodowych). Wykonanie testu w kierunku obecności infekcji onkogennymi typami HPV u kobiet z pewnymi nieprawidłowościami w preparacie cytologicznym pozwala na bardziej ukierunkowaną dalszą diagnostykę i ewentualne leczenie.
PL 235 847 B1
Uzasadnione wydaje się więc powszechne stosowanie testów molekularno-genetycznych wykrywających onkogenne typy HPV jako uzupełnienie populacyjnych programów skriningowych opartych o badania cytologiczne wymazów z szyjki macicy. Niestety, ze względów technologicznych (znaczny stopień skomplikowania testów, w których analizowanych jest jednorazowo kilkanaście typów HPV o niskiej homologii genomowej) oraz koszty dostępnych na rynku testów HPV, takie skojarzone badania profilaktyczne nie są rozpowszechnione w populacyjnych programach skriningowych, zarówno w Polsce, jak i w świecie, a jedynie ograniczone do etapu pogłębionej diagnostyki w przypadku wykrycia w skriningu cytologicznym nieprawidłowych komórek. Kolejnym problemem jest brak jednolitego standardu metodycznego testów HPV.
Za złoty standard w zakresie diagnostyki wirusów HPV uważa się metodę Hybrid-Capture (Digene). Jest to, jednakże, metoda o stosunkowo niskiej czułości diagnostycznej. Ponadto test pozwala na wykrycie tylko części znanych onkogennych typów HPV. Większość testów oferowanych na rynku do diagnostyki HPV opiera się na metodach genotypowania (określania poszczególnych typów HPV), co powoduje wysoki koszt, a także czaso- i pracochłonność analiz oraz zmniejszenie specyficzności metody w wykrywaniu nieprawidłowości morfologicznych szyjki macicy. W ostatnich latach na rynku pojawiło się kilka testów dopuszczonych do zastosowań klinicznych (z certyfikatem CE-IVD) opartych o różne metody molekularno-genetyczne z zastosowaniem technik amplifikacji DNA (np. PCR), wykrywających infekcje wirusami HPV z grupy wysokiego ryzyka rozwoju raka szyjki macicy (bez rozróżnienia typu). Jednakże, na ogół nie obejmują one analizy wszystkich onkogennych typów HPV, a ich wysoka cena uniemożliwia szerokie zastosowanie w skriningu populacyjnym raka szyjki macicy w Polsce.
Technika PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) jest obecnie powszechnie używana w diagnostyce wirusologicznej, jednak wymaga ona indywidualnego podejścia w przypadku każdego badanego mikroorganizmu. Aby wykorzystać tę metodę w diagnostyce, należy odpowiednio dobrać sekwencje tzw. starterów (primerów) i sond molekularnych oraz warunki reakcji, w celu zapewnienia najwyższej wiarygodności klinicznej testu, a zwłaszcza odpowiedniego progu detekcji patogenów i swoistości diagnostycznej. Multipleksowa reakcja korzystnie umożliwia jednoczesną diagnostykę wielu typów wirusów HPV, co jednak jest niezwykle trudnym zadaniem i wymaga uzyskania testu charakteryzującego się wysoką czułością i specyficznością detekcji.
Istnieje ogromne zapotrzebowanie na wykonywanie testu na obecność onkogennych typów HPV w celu wdrożenia właściwego postępowania diagnostyczno-terapeutycznego. Ze względu na znaczne koszty i ograniczoną dostępność do obecnych na rynku testów HPV, przeprowadza się ich stanowczo za mało. Dostarczenie taniego i wiarygodnego klinicznie testu na obecność onkogennych typów HPV znacznie poprawi dostępność do nowoczesnej diagnostyki stanów chorobowych predysponujących do raka szyjki macicy.
Celem wynalazku jest zatem opracowanie testu diagnostycznego pozwalającego na czułą, specyficzną i tanią detekcję grupy onkogennych typów HPV w wymazie z szyjki macicy pobranym na podłoże płynne (liquid based cytology - LBC).
Nieoczekiwanie, Twórcy wynalazku zrealizowali powyższy cel uzyskując test diagnostyczny na obecność onkogennych wirusów HPV charakteryzujący się wieloma zaletami, takimi jak łatwość wykonania, niski koszt, korzystne parametry: wysoka czułość, efektywność kliniczna, specyficzność i pożądany klinicznie próg detekcji wirusów HPV16/18 i innych onkogennych typów HPV. Ponadto, jak wykazano poniżej, test ten może potencjalnie umożliwić rezygnację z badania cytologicznego w dużej populacji kobiet HR-HPV-ujemnych.
Genom wirusa HPV liczy około 8 tys. nukleotydów, a długość nieprzerwanych sekwencji o pełnej homologii między onkogennymi typami nie przekracza kilkunastu par zasad. Tak ogromne zróżnicowanie wirusów HPV uniemożliwia zaprojektowanie minimalnej ilości sond hybrydyzacyjnych pozwalających na detekcję wszystkich onkogennych wirusów HPV w jednej reakcji. Problem ten może rozwiązać zastosowanie zmodyfikowanych nukleotydów LNA (locked nucleic acids) w sondzie molekularnej. Nukleotydy LNA zawierają dodatkowy mostek metylenowy w obrębie cząsteczki deoksyrybozy, co - poprzez zmianę konformacji i usztywnienie cząsteczki - zwiększa temperaturę topnienia oligomerów zbudowanych z takich nukleotydów i stabilność wiązań pomiędzy komplementarnymi nukleotydami w procesie hybrydyzacji. Zgodnie z wynalazkiem, dzięki użyciu LNA można korzystnie zastosować w reakcji PCR znacznie krótsze, w porównaniu z tradycyjnymi, sondy molekularne typu TaqMan, wysoce specyficznie hybrydyzujące do produktu amplifikacji PCR w temperaturze optymalnej dla przebiegu reakcji. Zastosowanie znacznie krótszych sond LNA-TaqMan o długości 8-10 nukleotydów (w porównaniu z 20-30 nukleotydami w sondach tradycyjnych) umożliwia ich łatwiejsze wpasowanie w krótkie (nawet 10-12 par zasad)
PL 235 847 B1 regiony homologii pomiędzy różnymi typami onkogennych wirusów HPV, a w efekcie opracowanie nowego testu diagnostycznego.
Istnieje wysokie zapotrzebowanie na testy w technologii LNA, które pozwalają na uzyskanie trafnych klinicznie ekspertyz w zakresie profilaktyki i diagnostyki raka szyjki macicy. Również same pacjentki chcą poddawać się nowoczesnym badaniom profilaktycznym o najwyższym stopniu czułości, a jednocześnie dostępnych finansowo.
W związku z powyższym, opracowano test o nazwie HR-HPV, korzystnie w oparciu o technikę multipleksowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (multiplex real-time PCR) w jednej zamkniętej probówce z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych metodami bioinformatycznymi sond molekularnych typu TaqMan. W sondach tych wykorzystano innowacyjną technologię LNA, która dotychczas nie była stosowana w testach na obecność wirusów HPV.
Zmniejszenie długości sond do 8-10 nukleotydów korzystnie pozwoliło znacznie zmniejszyć ich liczbę z 15-16 do zaledwie kilku (optymalnie 2-3). Korzystnie, umożliwiło to także przeprowadzenie multipleksowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym w jednej probówce, a nie jak w większości obecnych na rynku testów - w kilku probówkach. W przykładzie wykonania wynalazku, sondy LNA zostały optymalnie wyznakowane maksymalnie 3 różnymi uniwersalnymi barwnikami fluorescencyjnymi o odmiennych spektrach emisji światła fluorescencyjnego, co umożliwia wykonywanie testów w większości dostępnych na rynku aparatów do reakcji PCR, a nie tylko w urządzeniach przeznaczonych do testu danego producenta.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania wirusa HPV metodą łańcuchowej reakcji polimerazy, znamienny tym, że zawiera:
co najmniej jedną parę starterów wybraną spośród sekwencji oligonukleotydowych:
a) dla wirusa HPV 16 sekwencja nr id. 1 i sekwencja nr id. 14,
b) dla wirusa HPV 18 sekwencja nr id. 2 i sekwencja nr id. 15,
c) dla wirusa HPV 33 sekwencja nr id. 3 i sekwencja nr id. 14,
d) dla wirusa HPV 31 sekwencja nr id. 4 i sekwencja nr id. 14,
e) dla wirusa HPV 35 sekwencja nr id. 5 i sekwencja nr id. 14,
f) dla wirusa HPV 39 sekwencja nr id. 6 i sekwencja nr id. 14,
g) dla wirusa HPV 45 sekwencja nr id. 7 i sekwencja nr id. 15,
h) dla wirusa HPV 51 sekwencja nr id. 8 i sekwencja nr id. 16,
i) dla wirusa HPV 52 sekwencja nr id. 9 i sekwencja nr id. 14,
j) dla wirusa HPV 56/66 sekwencja nr id. 10 i sekwencja nr id. 14,
k) dla wirusa HPV 58 sekwencja nr id. 11 i sekwencja nr id. 14,
l) dla wirusa HPV 59 sekwencja nr id. 12 i sekwencja nr id. 17,
m) dla wirusa HPV 68 sekwencja nr id. 13 i sekwencja nr id. 18.
W korzystnej realizacji, zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera wszystkie oligonukleotydy określone powyżej.
Zestaw według wynalazku zawiera korzystnie dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 25 do 28.
Zestaw według wynalazku korzystnie zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 29 do 32.
Zestaw według wynalazku korzystnie zawiera dodatkowo jako kontrolę wewnętrzną parę starterów o sekwencji oligonukleotydowej wybranej spośród sekwencji nr id.: 23 do 24.
PL 235 847 B1
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wirusa HPV charakteryzujący się tym, że przeprowadza się łańcuchową reakcję polimerazy z użyciem co najmniej jednej pary starterów wybranych spośród sekwencji oligonukleotydowych określonych powyżej, przy czym o obecności wirusa świadczy amplifikacja produktu zawierającego specyficzną dla niego parę starterów.
W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku korzystnie przeprowadza się multipleksową łańcuchową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym z jednoczesnym użyciem wszystkich oligonukleotydów wskazanych powyżej.
W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku korzystnie stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 25 do 28.
W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku korzystnie stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 29 do 32.
W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku korzystnie stosuje się dodatkowo jako kontrolę wewnętrzną parę starterów o sekwencji oligonukleotydowej wybranej spośród sekwencji nr id.: 23 do 24.
W celu realizacji wynalazku, zaprojektowano i dobrano zestaw starterów i sond umożliwiających identyfikację i amplifikację regionów homologii wszystkich onkogennych typów HPV i korzystnie kontroli wewnętrznej, będącej wybraną sekwencją ludzkiego DNA i/lub syntetycznym fragmentem DNA. W realizacji wynalazku reakcję prowadzono korzystnie w jednej probówce i dokonano korzystnie odczytu reakcji w maksymalnie 4 kanałach detekcji stosowanych w większości obecnych na rynku aparatów PCR w czasie rzeczywistym.
Zaprojektowano dwie 10-nukleotydowe sondy LNA-TaqMan pozwalające na wykrycie infekcji HPV wysokiego ryzyka (HR-HPV) w jednej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Pierwsza z nich - HRP jest komplementarna dla wszystkich onkogennych wirusów HPV, druga natomiast - HRP33n - jest komplementarna do zidentyfikowanego wariantu HPV33n zawierającego polimorfizm jednego nukleotydu A/G w miejscu przyłączania sondy. Końce 5’ sond HRP i HRP33n korzystnie wyznakowane zostały barwnikiem fluorescencyjnym FAM (fluoresceina), końce 3’ zaś quencherem BHQ1 (Black Hole Quencher 1). Odczyt reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla sond HRP oraz HRP33n prowadzono przy długości fali 530 nm, w kanale przeznaczonym do odczytu barwnika FAM.
Ponadto korzystnie zaprojektowano kontrolę wewnętrzną testu PCR. Zastosowano system składający się z syntetycznego, krótkiego fragmentu DNA, jako target zaprojektowano oligonukleotyd składający się z 77 par zasad. Do amplifikacji i detekcji syntetycznej kontroli wewnętrznej zaprojektowano układ 4 starterów i 10-nukleotydową sondę LNA-TaqMan (ICP). Wytypowano optymalny układ 2 starterów dla reakcji PCR. Sonda ICP wyznakowana została na końcu 5’ barwnikiem ROX, zaś na końcu 3’ quencherem BHQ2. Odczyt reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla sondy ICP prowadzono przy długości fali 610 nm (kanał barwnika ROX).
Celem badań było zaprojektowanie możliwie małego zestawu starterów, umożliwiającego efektywną amplifikację wszystkich onkogennych typów HPV w próbkach klinicznych z odpowiednią czułością i specyficznością, przy możliwie pełnej eliminacji wszelkich niepożądanych zjawisk, jakie mogą zachodzić podczas reakcji PCR, korzystnie prowadzonej w czasie rzeczywistym, korzystnie w kilku kanałach detekcji.
W wyniku przeprowadzonych badań, opracowano wspólną pulę starterów dla HPV wysokiego ryzyka. Sekwencje dobrano tak, aby ogólna liczba starterów była jak najmniejsza. Zatem, niektóre sekwencje starterów są wspólne dla kilku typów HPV. I tak, wyselekcjonowano wspólny starter odwrotny („reverse”) dla typów 16, 31, 33, 35, 39, 52, 56, 58, 82 oraz wspólny starter odwrotny („reverse”) dla HPV 18 i 45. Ponadto dla typów 56 i 66, oraz typów 33 i 33n wybrano odpowiednio wspólne startery zgodne („forward”).
Zgodnie z realizacją wynalazku, mieszanina końcowa testu HR-HPV według wynalazku korzystnie zawiera 19 starterów (14 zgodnych („forward”) i 5 odwrotnych („reverse”)) i 2 sondy LNA-TaqMan dla detekcji 15 onkogennych typów HPV, 2 startery i 1 sondę LNA-TaqMan dla syntetycznej kontroli wewnętrznej.
Na wyselekcjonowanych próbkach klinicznych wcześniej przebadanych znanym testem PapilloCheck wykrywającym 24 typy HPV (ok. 50 próbek klinicznych zawierających DNA pojedynczego, onkogennego typu HPV, 30 próbek klinicznych zawierających DNA typu nieonkogennego HPV , 50 próbek klinicznych zawierających koinfekcje oraz 30 próbek negatywnych (wolnych od 24 typów HPV, w tym wszystkich onkogennych)) wykazano, że dobrany skład starterów i sond molekularnych według wynalazku pozwala na wykrycie w sposób specyficzny grupy onkogennych typów wirusa HPV (w tym wariantu HPV33n) oraz daje negatywne wyniki w przypadku próbek klinicznych z nieonkogennym typem
PL 235 847 Β1 wirusa i próbek klinicznych negatywnych. Ponadto reakcja z zastosowaniem wyżej wymienionych 21 starterów i 3 sond LNA nie generowała produktów typu starter-dimer oraz innych niespecyficznych produktów amplifikacji PCR.
Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania uwidoczniono na rysunku, na którym na figurze 1 przedstawiono wyniki uzyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla całej grupy onkogennych wirusów HPV z zastosowaniem próbki kontrolnej dodatniej, próbki kontrolnej ujemnej oraz dodatniej i ujemnej próbki klinicznej. Zastosowano kanał detekcji 530 nm.
Na figurze 2 przedstawiono wyniki zyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla typów 16 i 18 wirusa HPV z zastosowaniem próbki kontrolnej dodatniej, próbki kontrolnej ujemnej oraz dodatniej i ujemnej próbki klinicznej. Zastosowano kanał detekcji 560 nm.
Na figurze 3 przedstawiono wyniki zyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla kontroli wewnętrznej (IC) testu z zastosowaniem próbki kontrolnej dodatniej, próbki kontrolnej ujemnej oraz dodatniej i ujemnej próbki klinicznej. Zastosowano kanał detekcji 610 nm.
Poniżej podano przykłady realizacji wynalazku.
Przykład I. Przykład realizacji testu diagnostycznego
W niniejszej realizacji wykrywano obecność wszystkich badanych onkogennych wirusów HPV oraz obecność wirusa HPV typu 16 lub 18 w testowej próbce.
Korzystnie, próbka kontrolna dodatnia wytworzona została z sekwencji nukleotydowej HPV 16 oraz fragmentu sekwencji ludzkiej beta globiny.
Do każdorazowego oznaczenia korzystnie stosowano jedną próbkę kontrolną dodatnią i jedną próbkę kontrolną ujemną. W niniejszej realizacji, próbka kontrolna dodatnia korzystnie wskazuje na poprawność przeprowadzonej reakcji (brak degradacji próbki kontrolnej dodatniej, prawidłowe działanie odczynników, poprawny profil termiczny urządzenia, brak inhibicji reakcji). Próbka kontrolna ujemna korzystnie pozwala na weryfikację, czy w trakcie izolacji DNA oraz przygotowywania reakcji amplifikacji nie doszło do kontaminacji eluatu DNA oraz odczynników materiałem biologicznym zawierającym wirusa HPV lub zamplifikowanym produktem PCR. Jeśli dla próbki kontrolnej ujemnej zostanie wykryty sygnał pozytywny w przynajmniej jednym kanale detekcji, oznacza to, iż doszło do zanieczyszczenia próbki kontrolnej ujemnej lub odczynników.
Ponadto w teście według wynalazku zastosowano korzystnie kontrolę wewnętrzną (IC) zawierającą fragment sekwencji ludzkiej beta globiny, służącą do potwierdzenia, czy w każdej klinicznej próbce badanej znajduje się wystarczająca ilość DNA potrzebna do wykrycia HR HPV. Ponadto sygnał kontroli wewnętrznej świadczy o prawidłowo przeprowadzonej izolacji DNA oraz braku inhibitorów reakcji. Korzystnie, próbka kontrolna dodatnia zawiera sekwencję kontroli wewnętrznej. Próbka kontrolna negatywna powinna być ujemna w trzech kanałach detekcji.
1. Sekwencje zastosowanych starterów, sond i kontroli według wynalazku
a) sekwencja oligonukleotydowa startera na kanał pierwszy FAM 530 nm:
Lp. STARTER ORIENTACJĄ SEKWENCJA STARTERÓW
1 HPV 16 F Zgodna 5’-GCACAGGAAGCAAAACAACATAG-3’
2 HPV 18 F Zgodna 5’-AGGTCCACAATGATGCACAAG-3’
3 HPV 33 F Zgodna 5'-CAGAAGATGAGGATGAAACAGCAG-3’
4 HPV 31 F Zgodna 5’-GAGGAACATGCAGAGGCTGT-3’
5 HPV 35 F Zgodna 5’-ATGCACAGGAGGAGCAAACA-3’
6 HPV 39 F Zgodna 5’-GTGAGACAGCACAGGTACTTTTAC-3’
7 HPV 45 F Zgodna 5'-CCATGCGCAGGAAGTTCAG-3'
8 HPV 51 F Zgodna 5’-ACAAAGAGGCTGTGCATCAG-3’
9 HPV 52 F Zgodna 5’-GAAGGGGAGGATGATTTACATGC-3’
10 HPV 56/66 F Zgodna 5’-GCAAGTACAAACAGCACATGC-3’
11 HPV 58 F Zgodna 5’-AGCCCGAGCGTTGTTTAATG-3’
PL 235 847 Β1 cd. tabeli
12 HPV 59 F Zgodna 5'-GGCCTTGTTTAATGTGCAGGAAG-3’
13 HPV 68 F Zgodna 5’-CAAACAGGTGACACAGTCTCAG-3’
14 HPV16/31/33/35/39/ 52/56/58/66 R Odwrotna 5’-GTATTGCCATACCCGCTGTCT-3’
15 HPV 18/45 R Odwrotna 5'-AACAGCCATAGCCACTATCTGA-3'
16 HPV 51 R Odwrotna 5’ CTGTCCGGATAACTGTCCAGT 3’
17 HPV 59 R Odwrotna 5’-TGTCTGGCACTGTTAKTAACCTTC-3’
18 HPV 68 R Odwrotna 5’-TCCTGTAATGGCGACTTTGCT-3’
przy czym „K” oznacza zmianę zasady G/T
b) sekwencja oligonukleotydowa startera na kanał drugi ΗΕΧ 560 nm:
Lp.' STARTER ORIENTACJA SEKWENCJA STARTERÓW
1 HPV 16 F ΗΕΧ Zgodna 5’-TAATGGATGGTTTTATGTAGAGGCT-3’
2 HPV 16 R ΗΕΧ Odwrotna 5’-CTGCCTGTGTTAAATAATCATTAT-3’
3 HPV 18F ΗΕΧ Zgodna 5’-GGCTGGTTTTATGTACAAGCT-3’
4 HPV 18 R ΗΕΧ Odwrotna 5’-CCTGTTCACAAAATGTTCCTT-3’
c) sekwencja oligonukleotydowa startera na kanał trzeci ROX 610 nm - kontrola wewnętrzna:
Lp STARTER ORIENTACJA SEKWENCJA START ERÓW
1 HBE1 IC F Zgodna 5’-GAGAACTTCAAGGTGAGTTCAGGT-3’
2 HBE1 IC R Odwrotna 5-GAAGTCTGCTGTTCTAACATCAAG-3’
d) sekwencja oligonukleotydowa sondy:
SONDA SEKWENCJE SOND
HR-HPV 5’-6FAM-A+C+T+T+T+C+G+T+TT-BHQ-1-3'
33n 5’-6FAM-A+C+T+T+T+C+G+C+TT-BHQ-1-3'
16/18 5’-HEX-AT+AT+CW+GA+T+G+AC+G+AG-BHQ-1-3’
IC 5' - ROX-TG ACATT AATTG AAG CTC ATA ATCTT ATTG- BH 0-2-3'
przy czym „+” oznacza nukleotyd LNA zawierający dodatkowy mostek metylenowy w obrębie cząsteczki deoksyrybozy; „W” oznacza zmianę zasady A/T.
2. Zastosowane stężenia starterów i sond w mieszaninie reakcyjnej według wynalazku
a) Stężenia końcowe starterów w mieszaninie reakcyjnej na kanał pierwszy FAM 530 nm wynosiły:
Lp STARTER Stężenie końcowe w mieszaninie lUM] Stężenie wyjściowe (PM]
1 HPV 16 F 0,22 4
2 HPV 18 F 0,22 4
3 HPV 31 F 0,22 4
4 HPV 33 F 0,22 4
5 HPV 35 F 0,22 4
6 HPV 39 F 0,22 4
PL 235 847 Β1 cd. tabeli
7 HPV 45 F 0,22 4
8 HPV 51 F 0,22 4
9 HPV 52 F 0,22 4
10 HPV 56/66 F 0,22 4
11 HPV 58 F 0,22 4
12 HPV 59 F 0,22 4
13 HPV 68 F 0,22 4
14 HPV 16/31/3 3/35/39/52/56/58/66 R 0,22 4
15 HPV 18/45 R 0,22 4
16 HPV 51 R 0,22 4
17 HPV 59 R 0,22 4
18 HPV 68 R 0,22 4
b) Stężenia końcowe starterów w mieszaninie reakcyjnej na kanał drugi ΗΕΧ 560 nm HPV 16/18 wynosiły:
końcowe w mieszaninie [μΜ] Stężenie wyjściowe [μΜ]
1 HPV16FHEX 0,06 8
2 HPV 16 R ΗΕΧ 0,06 8
3 HPV18FHEX 0,06 8
4 HPV 18 R ΗΕΧ 0,06 8
c) Stężenia końcowe starterów w mieszaninie reakcyjnej na kanał trzeci ROX 610 nm - kontrola wewnętrzna - wynosiły:
Lp. Stężenie końcowe w mieszaninie [pMj Stężenie wyjściowe [pMl
1 HBE1 IC F 0,2 8
2 HBE1 IC R 0,2 8
d) Stężenia końcowe sond w mieszaninie reakcyjnej wynosiły:
Lp SONDA końcowe w mieszaninie [μΜ] Stężenie wyjściowe
1 HR-HPV 0,36 8
2 33n 0,36 8
3 16/18 0,06 8
4 IC 0,2 3,6
Przygotowano odpowiednie ilości starterów i sond w podanych wyżej stężeniach. Wszystkie składniki przed przygotowaniem mieszaniny zworteksowano i żwirowano. Następnie, podzielono na porcje o odpowiednich ilościach do probówek.
3. Opis analizy Master ΜΙΧ MAbPROBE
Real-Time Master Mix MabProbe jest 2083 x stężoną mieszaniną do reakcji Real-Time PCR. Zawiera polimerazę Tag blokowaną przeciwciałem monoklonalnym orazinne wymagane w reakcji Real-Time
PL 235 847 Β1
PCR składniki. Składniki mieszaniny połączono w odpowiednich proporcjach w końcową mieszaninę, której użycie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia oraz błędów ludzkich. W skład zestawu wchodzą:
• master ΜΙΧ MAbPROBE, • mieszanina sond i starterów, • próbka kontrolna dodatnia, • próbka kontrola ujemna, • woda.
Skład mieszaniny Master ΜΙΧ MAbPROBE:
• polimeraza Run MAb 0,104 U/μΙ, • bufor reakcyjny: Tris-HCI 20,83 mM pH 8,0,
KCI 104 mM,
MgCb - 10,42 mM, • dNTP - 2,75 mM (0,69 mM każdego z dNTP), • stabilizatory reakcji PCR.
Wszystkie składniki testu należy przechowywać w -20°C w ciemnym miejscu. Ponowne rozmrażanie i zamrażanie składników nie wpływa na pogorszenie ich działania. Należy transportować na suchym lodzie.
4. Protokół testu:
a. Wszystkie składniki powinny być umieszczone na lodzie. Startery, sondy i mieszaninę Master Mix MAbPROBE, próbkę kontrolą dodatnią, próbkę kontrolą ujemną należy zworteksować i krótko żwirować.
b. W poniższej tabeli podano ilości składników na jedną reakcję. W celu wykonania większej ilości analiz, należy odpowiednio przeliczyć skład mieszaniny uwzględniając próbki badane, kontrolę dodatnią oraz ujemną. Dodatek enzymu UNG (1 μΙ/U) w rozcieńczeniu 1 :200 jest opcjonalny, można zastąpić go wodą. Odpowiednie ilości poszczególnych składników zmieszać ze sobą w probówce 1,5 ml typu Eppendorf, następnie powstałą mieszaninę zworteksować i krótko żwirować.
SKŁAD MIESZANINY NA JEDNĄ REAKCJĘ W OBJĘTOŚCI 25 μ|
Składniki llosc na jedną reakcję w objętości 25 pl
MASTER ΜΙΧ MAB 12
STARTERY+SON DY 6
HaO lub opcjonalnie * **UNG (1:200) 1
**DNA 6
* Enzym UNG nie jest dostarczony razem z zestawem. Można go nabyć w firmie Fermentas w stężeniu 1 μΙ/U.
** Zalecana ilość matrycy DNA to 10 pg-1 μg. Maksymalna objętość dodawanego eluatu DNA to 6 μΙ. Ilość i objętość dodawanego eluatu DNA jest zależna od izolacji DNA i podlega optymalizacji. W przypadku dodawania ilości mniejszych niż 6 μΙ, brakującą część należy zastąpić wodą.
c. Przełożyć po 19 μΙ mieszaniny do probówek reakcyjnych dedykowanych dla aparatu, na którym będzie wykonywana reakcja.
d. Następnie, kolejno dodać po 6 μΙ badanego DNA, kontrolę dodatnią, kontrolę ujemną kilkukrotnie przepipetowując. Przygotowaną mieszaninę należy krótko odwirować.
e. Wstawić próbki do termocyklera.
PL 235 847 Β1
Program termocyklera:
' Czas Temperatura C llosc cykli
Hydroliza UŃG .....1............Lj.....-J: 20 minut 37°C 1
Denatu racja 15 minut 95°C 1
Ampiifikacja ' ' - > 1 > ξ . 20 sekund 75 sekund 95DC 60°C 40-50* *llość cykli powinna zostać zoptymalizowana
Chłodzenie 30 sekund 37°C 1
Działanie testu sprawdzono na poniższych aparatach:
LightCycler Roche 2.0, LightCycler Roche 96, LightCycler Roche 480, Biorad CFXTouch. Do urządzeń, które wymagają kompensacji koloru, producent testu dostarcza plik w odpowiednim formacie lub komplet barwników do samodzielnego wykonania kompensacji.
5. Interpretacja wyników
Zgodnie z wynalazkiem, o obecności wirusa w badanej próbce świadczy amplifikacja produktu zawierającego specyficzną dla niego parę starterów.
W niniejszym przykładzie realizacji, produkt reakcji, świadczący o obecności wirusa HPV, zidentyfikowano poprzez analizę krzywej logarytmicznego wzrostu powstałej na skutek odnotowanej zmiany fluorescencji badanej próbki. Próbki dodatnie charakteryzowały się logarytmicznym wzrostem poziomu fluorescencji względem relatywnie stałego poziomu fluorescencji w próbach negatywnych. Korzystnie, analizę przeprowadzono z odpowiednimi kontrolami: ujemną, dodatnią oraz wewnętrzną. Uzyskane obrazy przedstawiono na fig. 1-3.
Na fig. 1 przedstawiono wyniki reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla wszystkich badanych onkogennych typów wirusa HPV, korzystnie z zastosowaniem próbki kontrolnej dodatniej, próbki kontrolnej ujemnej oraz dodatniej i ujemnej próbki klinicznej. Zgodnie z realizacją wynalazku, w kanale detekcji 530 nm odczytywać należy obecność lub brak obecności onkogennego wirusa HPV w badanych próbkach. Logarytmiczny przyrost produktu PCR w próbce klinicznej dodatniej wskazuje na obecność przynajmniej jednego spośród grupy wszystkich badanych onkogennych typów wirusa HPV. Brak logarytmicznego przyrostu produktu PCR w próbce klinicznej ujemnej świadczy o braku obecności onkogennych wirusów HPV. W kanale detekcji 530 nm zastosowano korzystnie próbkę kontrolną dodatnią i ujemną. W celu ułatwienia interpretacji wyników korzystne jest przyrównanie próbki kontrolnej do klinicznych prób badanych.
Na fig. 2 przedstawiono wyniki reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla typów 16 i 18 wirusa HPV korzystnie z zastosowaniem próbki kontrolnej dodatniej, próbki kontrolnej ujemnej oraz dodatniej i ujemnej próbki klinicznej. Zgodnie z realizacją wynalazku, w kanale detekcji 560 nm odczytuje się obecność lub brak obecności onkogennego wirusa HPV typu 16 lub 18 w próbkach badanych. Logarytmiczny przyrost produktu PCR w próbce klinicznej dodatniej wskazuje na obecność przynajmniej jednego spośród onkogennych wirusów HPV typu 16 i 18. Brak logarytmicznego przyrostu produktu PCR w próbce klinicznej ujemnej świadczy o braku obecności onkogennych wirusów HPV typu 16 i 18. W kanale detekcji 560 nm zastosowano korzystnie próbkę kontrolną dodatnią i ujemną. W celu ułatwienia interpretacji wyników korzystne jest przyrównanie próbki kontrolnej do klinicznych prób badanych.
Na fig. 3 przedstawiano wyniki reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla kontroli wewnętrznej (IC) testu korzystnie z zastosowaniem próbki kontrolnej dodatniej, próbki kontrolnej ujemnej oraz dodatniej i ujemnej próbki klinicznej. Zgodnie z realizacją wynalazku, w kanale detekcji 610 nm odczytywać należy obecność lub brak obecności kontroli wewnętrznej (IC) w próbkach badanych. Logarytmiczny przyrost produktu PCR w próbce kontrolnej dodatniej oraz w próbkach klinicznych dodatniej i ujemnej wskazuje na obecność fragmentu sekwencji ludzkiej beta globiny i świadczy o prawidłowym przebiegu reakcji oraz o odpowiedniej ilości DNA, potrzebnej do wykrycia wszystkich badanych onkogennych
PL 235 847 Β1 typów wirusa HPV. Należy spodziewać się braku logarytmicznego przyrostu produktu PCR w próbce klinicznej ujemnej, co świadczy o braku zanieczyszczenia ludzkim DNA lub zamplifikowanym produktem PCR. W celu ułatwienia interpretacji wyników, korzystne jest przyrównanie próbki kontrolnej do klinicznych prób badanych.
Niniejszy przykład wykonania nie jest przykładem ograniczającym zakres wynalazku. Produkt reakcji może być identyfikowany dowolną metodą znaną specjaliście w dziedzinie.
Korzystnie, może on zostać zsekwencjonowany w celu identyfikacji konkretnej sekwencji wirusa obecnego w badanej próbce.
Poniżej przedstawiono przykładowy produkt PCR uzyskany z pary starterów HPV 16 F oraz HPV16/31/33/35/39/52/56/58/66R.
HPY16F
5’ GCACAGGAAGCAAAACAACATAGAGATGCAGTACAGGTTCTAAAACGAAAGTATTTGGGTAGTCC
ACTTAGTGATATTAGTGGATGTGTAGACAATAATATTAGTCCTAGATTAAAAGCTATATGTATAGAA
AAACAAAGTAGAGCTGCAAAAAGGAGATTATTTGAAAGCGAAGACAGCGGGTATGGCAATAC 3’
HPV16/31 /33/35/39/52/56/58/66R
Przykład II. Ocena efektywności różnych zestawów starterów i sond molekularnych w wykrywaniu onkogennych typów HPV
W pierwszym etapie, zmodyfikowano skład starterów (primerów) i sond molekularnych opisanych powyżej, tak aby wydzielić dodatkowy kanał detekcji dla wirusów HPV16/18. Według danych epidemiologicznych, wirusy HPV16 i HPV18 cechują się najwyższym potencjałem onkogennym i ryzykiem rozwoju raka szyjki macicy u zakażonych kobiet. Stąd, rekomendowane jest, aby testy HPV stosowane do celów klinicznych, zwłaszcza dla skriningu populacyjnego, pozwalały nie tylko na określenie infekcji grupą onkogennych wirusów HPV, ale także na oznaczenie obecności HPV16/18 w badanej próbce. Zaprojektowano zatem dodatkowy układ starterów i jednej sondy molekularnej pozwalających na dyskryminację HPV16/18 w jednej reakcji z układem dla grupy wszystkich onkogennych typów HPV i kontroli wewnętrznej. W wyniku przeprowadzonych prac, otrzymano 4 startery dla HPV16 i HPV18 i wspólną krótką sondę TaqMan-LNA wyznakowaną barwnikiem fluorescencyjnym ΗΕΧ, pozwalającą na detekcję amplikonów w kanale 560 nm. Jako sekwencje docelowe dla starterów i wspólnej sondy LNA wybrano region L1 genomu HPV, ale w oddaleniu około 700 pz od regionu konsensusowego wszystkich onkogennych typów HPV. W tym przypadku zmodyfikowano układ kontroli wewnętrznej korzystnie dla reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Zrezygnowano z syntetycznego oligonukleotydu na korzyść referencyjnego genu ludzkiego dla beta-globiny. Do jednoczasowej amplifikacji tego genu wraz z potencjalnie występującymi w próbce cząstkami HPV zaprojektowano 2 startery i sondę TaqMan wyznakowaną barwnikiem ROX (kanał detekcji 610 nm). W efekcie, docelowa mieszanina reakcyjna zawierała 26 starterów i 4 sondy molekularne. W wyniku przeprowadzenia testu na wcześniej zgenotypowanych próbkach cytologicznych, nie odnotowano produktów typu starter-dimer oraz innych niespecyficznych produktów amplifikacji PCR.
Celem analizy było potwierdzenie, że wybrana konfiguracja starterów i sond LNA-TaqMan cechuje się najwyższą efektywnością w wykrywaniu onkogennych typów HPV w klinicznym materiale cytologicznym. Przeprowadzono analizy porównawcze nowego testu zawierającego potencjalnie optymalny układ starterów i sond, poddając ocenie takie parametry jak czułość i specyficzność w wykrywaniu onkogennych typów HPV, próg detekcji poszczególnych typów wirusów HPV, w tym wszystkich typów onkogennych oraz zgodność uzyskiwanych wyników z klinicznie zwalidowanym testem HPV PapilloCheck (Greiner Bio-One), który posiada certyfikat do zastosowań klinicznych CE-IVD.
W analizie uwzględniono 1256 par wyników nowego testu na obecność onkogennych typów HPV (hrHPV) oraz zwalidowanego testu PapilloCheck. Zbadano materiał pochodzący od kobiet z województwa zachodniopomorskiego i wielkopolskiego zgłaszających się na rutynowe profilaktyczne badania cytologiczne, w tym od 720 (57,3%) pacjentek z prawidłowym wynikiem cytologii oraz od 536 (42,7%) wyselekcjonowanych kobiet, u których w badaniu cytologicznym stwierdzono obecność nieprawidłowych komórek nabłonkowych - kategorie rozpoznań ASC-US (n = 249; 19,8%), ASC-H (n = 20; 1,6%), L-SIL (n = 232; 18,5%) i H-SIL (n = 34; 2,7%) oraz L-SIL/H-SIL (n = 1; 0,1%). Średni wiek badanych kobiet wyniósł 33,4 ±9,6 lat (zakres: 16-66 lat). DNA do analiz PCR w czasie rzeczywistym izolowano
PL 235 847 B1 z próbek cytologicznych (wymazów z szyjki macicy) pobranych na podłoże płynne SurePath (Becton Dickinson) przy pomocy szczoteczki Cervex Brush Combi (Rovers). Izolację DNA przeprowadzano automatycznie przy użyciu kulek magnetycznych w aparacie NucliSense EasyMAG (Biomerieux). Amplifikację DNA przeprowadzano w aparacie Light Cycler 96 (Roche). Cienkowarstwowe preparaty cytologiczne wykonywane przy użyciu robota PrepStain (Becton Dickinson) oceniał doświadczony zespół cytomorfologów i lekarzy patomorfologów, z wykorzystaniem komputerowo wspomaganego skriningu (system Focal Point GS, Becton Dickinson). Wyniki badań cytologicznych i molekularno-genetycznych przeprowadzonych przy użyciu testów hrHPV i PapilloCheck poddano analizie statystycznej. Określono próg detekcji wybranych wirusów HPV (minimalna ilość kopii cząstek/genomów wirusowych) w zaprojektowanym teście hrHPV. W tym celu, zakupiono materiały referencyjne HPV16 oraz HPV18 ze znaną liczbą kopii wymienionych wirusów (1 st WHO International Standard for Human Papillomavirus, National Institute for Biological Standards and Control, UK).
Wykonano 11 seryjnych rozcieńczeń standardów HPV16 i HPV i techniką PCR w czasie rzeczywistym wyznaczając krzywe standardowe w 3 seriach powtórzeń określono następujące minimalne progi detekcji:
Standard HPV16: kanał HR-HPV (FAM) - rozcieńczenie kontroli 1 : 128 - 2 x 104 kopii wirusa kanał 16/18 HPV (HEX) - rozcieńczenie kontroli 1 : 2048 - 3,33 x 103 kopii wirusa;
Standard HPV18: kanał HR-HPV (FAM) - rozcieńczenie kontroli 1 : 128 - 5 x 104 kopii wirusa kanał 16/18 HPV (HEX) - rozcieńczenie kontroli 1 : 2048 - 1,92 x 103 kopii wirusa.
Warto zauważyć, że próg detekcji dla wirusów HPV16/18 w drugim kanale detekcji jest niższy niż dla grupy wszystkich onkogennych HPV w pierwszym kanale detekcji, co wydaje się być zjawiskiem korzystnym w kategoriach efektywności klinicznej testu (ukierunkowanie na typy HPV o większym potencjale onkogennym). Należy również podkreślić, że biorąc pod uwagę opisane poniżej współczynniki poziomu zgodności nowego z testem referencyjnym PapilloCheck, można wnioskować, że próg detekcji grupy onkogennych typów HPV jest w obu testach zbliżony.
Dokonano również oceny ewentualnych reakcji krzyżowych elementów składowych testu hrHPV z innymi mikroorganizmami. W tym celu, na podstawie przeglądu dostępnej literatury (m.in.: P.Gajer et al.: Temporal dynamics of the Human vaginal microbiota, Science Translational Medicine 2012, 4, 132ra52; S.S. Witkin, W.J. Ledger: Complexities of the uniquely human vagina. Science Translational Medicine 2012, 4, 132fs11) dokonano wyboru 42 szczepów bakterii najczęściej bytujących fizjologicznie w drogach rodnych kobiet oraz patogenów wywołujących najczęstsze infekcje dróg moczowo-płciowych. Szczepy wzorcowe wyselekcjonowanych bakterii zostały zakupione w ATCC The Global Bioresource Center: Escherichia coli ATCC 11775, Escherichia coli ATCC 8739, Proteus vulgaris ATCC 6380, Proteus mirabilis ATCC 7002, Staphylococcus epidermidis ATCC 49461, Streptococcus agalactiae (B) ATCC 12386, Listeria monocytogenes (4e) ATCC 19118, Listeria monocytogenes (4e) ATCC 19118, Listeria innocua (6a) ATCC 33090, Lactobacillus gasseri ATCC 19992, Lactococcus lactis ATCC 19435, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Candida albicans ATCC 10231, Corynebacterium urealyticum ATCC 43044, Oligella urethralis ATCC 17960, Aerococcus viridans ATCC 700406, Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226, Gardnerella vaginalis ATCC 14018, Veillonella parvula ATCC 10790, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586, Gemella morbillorum ATCC 27824, Actinomyces odontolyticus ATCC 17929, Peptostreptococcus anaerobius ATCC 27337, Parvimonas micra ATCC 33270, Ureaplasma parvum ATCC 27813, Peptoniphilus asaccharolyticus ATCC 14963, Finegoldia magna ATCC 29328, Porphyromonas levii ATCC 29147, Prevotella loescheii ATCC 15930.
W toku przeprowadzonych eksperymentów nie uzyskano reakcji krzyżowych pomiędzy zaprojektowanym układem starterów i sond w teście hrHPV a wyżej wymienionymi mikroorganizmami.
Podsumowując: W wyniku badań opracowano optymalny zestaw starterów i mieszaniny reakcyjnej korzystnie do reakcji jednoczasowej amplifikacji grupy onkogennych typów HPV, HPV16/18 i kontroli wewnętrznej w trzech kanałach detekcji.
Przeprowadzono badania porównawcze zgodności wyników nowego testu z wynikami testu referencyjnego (PapilloCheck) w grupie 1256 kobiet w celu dalszych analiz statystycznych. Uzyskano pożądany klinicznie próg detekcji wirusów HPV16/18 i innych onkogennych typów HPV zbliżony do testu referencyjnego.
Nie stwierdzono reakcji krzyżowych nowego testu z innymi drobnoustrojami występującymi w drogach rodnych kobiet, co świadczy o wysokiej swoistości testu.
PL 235 847 Β1
Przykład III. Opracowanie wyników i analiza statystyczna efektywności nowego testu HR-HPV w wykrywaniu onkogennych wirusów HPV
W celu określenia wartości diagnostycznej nowego testu na obecność HR-HPV określono jego czułość i swoistość względem zwalidowanego testu PapilloCheck (Greiner Bio-One). Założono, że ten ostatni test cechuje się optymalną trafnością diagnostyczną w stosunku do zakażeń HR-HPV, w tym HPV16/18, dobrze opisaną w literaturze. W związku z tym wykorzystano go jako referencyjny dla nowego testu. Ponadto określono współczynniki zgodności wyników obu testów. Jest to standardowy schemat postępowania w przypadku walidacji testów jakościowych, pozwalający na ustalenie, czy aktualnie stosowany złoty standard mógłby zostać zastąpiony nowym narzędziem. Analizy dokonano na podstawie wyników badań cytologicznych i molekularno-genetycznych uzyskanych przez NZOZ Meditest.
Poziom zgodności wyników nowego testu z wynikami testu referencyjnego oceniano w oparciu o wartości współczynnika zgodności tau b Kendalla. Czułość i swoistość nowego testu w stosunku do testu referencyjnego, rozumiane odpowiednio jako odsetek wyników prawdziwie dodatnich i prawdziwie ujemnych, oceniono na podstawie analizy ROC. Wszystkie obliczenia statystyczne wykonano przy pomocy pakietu Statistica 10 (StatSoft, Tulsa OK, Stany Zjednoczone).
Detekcja HR-HPV w całej badanej grupie
Ogółem przeanalizowano wyniki 1256 par testów. Nowy test dał 630 (50,2%) wyników dodatnich i 626 (49,8%) wyników ujemnych. Test referencyjny dał 647 (51,5%) wyników dodatnich i 609 (48,5%) wyników ujemnych.
Test/wynik Test referencyjny wynik dodatni Test referencyjny wynik ujemny Razem
Nowy test - wynik 612 18 630
dodatni Nowy test - wynik 35 591 626
ujemny Razem 647 609 1256
W przypadku 18 (2,9%) wyników dodatnich nowego testu, test referencyjny dał wynik ujemny. W przypadku 35 (5,6%) wyników ujemnych nowego testu, test referencyjny dał wynik dodatni. Współczynnik zgodności wyników obu testów tau b Kendalla wyniósł b = 0,9159327.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 94,6% czułością i 97,0% swoistością w stosunku do testu referencyjnego.
Detekcja HPV16/18 w całej badanej grupie
Ogółem przeanalizowano wyniki 1256 par testów. Nowy test dał 230 (18,3%) wyników dodatnich i 1026 (81,7%) wyników ujemnych. Test referencyjny dał 238 (18,9%) wyników dodatnich i 1018 (81,1%) wyników ujemnych.
Test/wynik Test referencyjny wynik dodatni Test referencyjny wynik ujemny Razem
Nowy test-wynik dodatni 223 7 230
Nowy test-wynik ujemny 15 1011 1026
Razem 238 1018 1256
W przypadku 7 (3,0%) wyników dodatnich nowego testu, test referencyjny dał wynik ujemny. W przypadku 15 (1,5%) wyników ujemnych nowego testu, test referencyjny dał wynik dodatni. Współczynnik zgodności wyników obu testów tau b Kendalla wyniósł b = 0,9424401.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 93,7% czułością i 99,3% swoistością w stosunku do testu referencyjnego.
PL 235 847 Β1
Detekcja HR-HPV w grupie z prawidłowym wynikiem badania cytologicznego
Ogółem przeanalizowano wyniki 720 par testów. Nowy test dał 154 (21,4%) wyniki dodatnie i 566 (78,6%) wyników ujemnych. Test referencyjny dał 165 (22,9%) wyników dodatnich i 555 (77,1%) wyników ujemnych.
Test/wynik Test referencyjny wynik dodatni Test referencyjny wynik ujemny Razem
Nowy test - wynik dodatni 145 9 154
Nowy test - wynik ujemny 20 546 566
Razem 165 555 720
W przypadku 9 (5,8%) wyników dodatnich nowego testu, test referencyjny dał wynik ujemny. W przypadku 20 (3,5%) wyników ujemnych nowego testu, test referencyjny dał wynik dodatni. Współczynnik zgodności wyników obu testów tau b Kendalla wyniósł b = 0,8841279.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 87,9% czułością i 98,4% swoistością w stosunku do testu referencyjnego.
Detekcja HPV16/18 w grupie z prawidłowym wynikiem badania cytologicznego
Ogółem przeanalizowano wyniki 720 par testów. Nowy test dał 52 (7,2%) wyniki dodatnie i 668 (92,8%) wyników ujemnych. Test referencyjny dał 53 (7,4%) wyniki dodatnie i 667 (92,6%) wyników ujemnych.
Test/wynik Test referencyjnywynik dodatni Test referencyjnywynik ujemny Razem
Nowy test - wynik dodatni 49 3 52
Nowy test - wynik ujemny 4 664 668
Razem 53 667 720
W przypadku 3 (5,8%) wyników dodatnich nowego testu, test referencyjny dał wynik ujemny. W przypadku 4 (0,6%) wyników ujemnych nowego testu, test referencyjny dał wynik dodatni. Współczynnik zgodności wyników obu testów tau b Kendalla wyniósł b = 0,9281394.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 92,5% czułością i 99,6% swoistością w stosunku do testu referencyjnego.
Detekcja HR-HPV w grupie z nieprawidłowym wynikiem badania cytologicznego (minimum ASC-US)
Ogółem przeanalizowano wyniki 536 par testów. Nowy test dał 476 (88,8%) wyników dodatnich i 60 (11,2%) wyników ujemnych. Test referencyjny dał 482 (89,9%) wyniki dodatnie i 54 (10,1%) wyniki ujemne.
Test/wynik Test referencyjny wynik dodatni Test referencyjny wynik ujemny Razem
Nowy test-wynik dodatni 467 9 476
Nowy test-wynik ujemny 15 45 60
Razem 482 54 536
PL 235 847 Β1
W przypadku 9 (1,9%) wyników dodatnich nowego testu, test referencyjny dał wynik ujemny. W przypadku 15 (25,0%) wyników ujemnych nowego testu, test referencyjny dał wynik dodatni. Współczynnik zgodności wyników obu testów tau b Kendalla wyniósł b = 0,7658275.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 96,9% czułością i 83,3% swoistością w stosunku do testu referencyjnego.
Detekcja HPV16/18 w grupie z nieprawidłowym wynikiem badania cytologicznego (minimum ASC-US)
Ogółem przeanalizowano wyniki 536 par testów. Nowy test dał 178 (33,2%) wyników dodatnich i 358 (66,8%) wyników ujemnych. Test referencyjny dał 185 (34,5%) wyników dodatnich i 351 (65,5%) wyników ujemnych.
Test/wynik Test referencyjny wynik dodatni Test referencyjny wynik ujemny Razem
Nowy test-wynik dodatni 174 4 178
Nowy test - wynik ujemny 11 347 358
Razem 185 351 536
W przypadku 4 (2,2%) wyników dodatnich nowego testu, test referencyjny dał wynik ujemny. W przypadku 11 (3,1%) wyników ujemnych nowego testu, test referencyjny dał wynik dodatni. Współczynnik zgodności wyników obu testów tau b Kendalla wyniósł b = 0,9379317.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 94,1 % czułością i 98,9% swoistością w stosunku do testu referencyjnego.
Wnioski
Analiza współczynników tau b Kendalla wykazała, że wyniki nowego testu cechują się bardzo wysoką zgodnością z rezultatami testu referencyjnego PapilloCheck w zakresie detekcji HR-HPV, mieszczącą się w zakresie od 76,6% do 91,5%. Jeszcze wyższy poziom zgodności, bliski idealnego progu 95% (od 92,8% do 94,2%), uzyskano w odniesieniu do detekcji HPV16/18.
Potwierdzeniem wysokiej trafności diagnostycznej nowego testu jest jego wysoka czułość (od 87,9% do 96,9% dla hrHPV i od 92,5% do 94,1% dla HPV16/18) i swoistość (od 83,3% do 98,4% dla HR-HPV i od 98,9 do 99,3% dla HPV16/18). Na szczególną uwagę zasługuje bardzo wysoka swoistość nowego testu w zakresie wykrywania HPV16/18 - uzyskane wartości dowodzą, że ujemny wynik testu z niemal 100% prawdopodobieństwem wyklucza obecność zakażenia HPV16 lub HPV18. Fakt, że wysoki poziom zgodności, czułości i swoistości nowego testu stwierdzono zarówno w podgrupach pacjentek z prawidłowymi, jak i nieprawidłowymi wynikami badania cytologicznego, potwierdza wszechstronność tego narzędzia.
Podsumowując: W wyniku przeprowadzonych badań uzyskano wysoką zgodność wyników testu hrHPV według wynalazku z wynikami dobrze zwalidowanego, klinicznie komercyjnego testu referencyjnego (PapilloCheck) oraz potwierdzono wysoką czułość i specyficzność testu hrHPV według wynalazku w stosunku do testu referencyjnego (PapilloCheck).
Określenie efektywności klinicznej nowego testu HR-HPV w wykrywaniu zmian przed nowotworowych i raka szyjki macicy
Przeprowadzono kliniczne badania populacyjne u 5000 kobiet z użyciem nowego testu hrHPV w próbkach cytologicznych z szyjki macicy pobranych na podłoże płynne SurePath w celu dalszych analiz statystycznych korelacji z obrazem mikroskopowym i określenia efektywności klinicznej nowego testu.
Analiza miała na celu określenie klinicznej użyteczności nowego testu hrHPV w badaniach profilaktycznych oraz diagnostyce stanów przedrakowych i raka szyjki macicy. W celu określenia efektywności diagnostycznej nowego testu zbadano dużą grupę kobiet, które poddały się rutynowym badaniom cytologicznym w ramach profilaktyki raka szyjki macicy. Określono korelację uzyskanych wyników molekularno-genetycznych z obrazem mikroskopowym preparatów cytologicznych na podłożu płynnym wykonanych wystandaryzowaną metodą SurePath firmy Becton Dickinson i ocenionych przez wykwalifikowanych cytomorfologów i lekarzy patomorfologów zgodnie z systemem klasyfikacji Bethesda 2001.
PL 235 847 Β1
W celu większej obiektywizacji oceny mikroskopowej, preparaty zostały dodatkowo ocenione przy użyciu komputerowo wspomaganego automatycznego skriningu (system FocalPoint firmy Becton Dickinson).
W analizie uwzględniono 5000 par wyników nowego testu na obecność HR-HPV oraz wyników badań cytologicznych na podłożu płynnym. Materiał pochodził od kolejnych kobiet z województwa zachodniopomorskiego i wielkopolskiego zgłaszających się na rutynowe badania cytologiczne. Z analizy wykluczono pacjentki, w przypadku których wykonanie testu na obecność HR-HPV zostało zlecone przez lekarza prowadzącego oraz kobiety z obciążającym wywiadem ginekologiczno-onkologicznym. Średni wiek badanych pacjentek wyniósł 34,6 ±10,1 lat (zakres: 16-67 lat). Wśród wyników badania cytologicznego znalazło się 4825 (96,5%) preparatów prawidłowych (brak nieprawidłowych komórek nabłonkowych), 77 (1,55%) preparatów ze zmianami odpowiadającymi ASC-US, 6 (0,1%) preparatów ze zmianami odpowiadającymi ASC-H, 77 (1,55%) preparatów ze zmianami odpowiadającymi L-SIL i 15 (0,3%) preparatów ze zmianami odpowiadającymi H-SIL.
Podobnie jak opisano powyżej, DNA do analiz PCR w czasie rzeczywistym izolowano z próbek cytologicznych (wymazów z szyjki macicy) pobranych na podłoże płynne SurePath (Becton Dickinson) przy pomocy szczoteczki Cervex Brush Combi (Rovers). Izolację DNA przeprowadzano automatycznie przy użyciu kulek magnetycznych w aparacie NucliSense EasyMAG (Biomerieux). Reakcję PCR przygotowywano przy użyciu automatycznej stacji pipetującej PIRO (Dornier LTF). Amplifikację DNA przeprowadzano w aparacie Light Cycler 96 (Roche). Jak wspomniano powyżej, cienkowarstwowe preparaty cytologiczne wykonywane przy użyciu robota PrepStain (Becton Dickinson) oceniał doświadczony zespół cytomorfologów i lekarzy patomorfologów, z wykorzystaniem komputerowo wspomaganego skriningu (system Focal Point GS, Becton Dickinson). Wyniki badań cytologicznych i molekularno-genetycznych poddano analizie statystycznej.
Opracowanie wyników i analiza statystyczna efektywności klinicznej nowego testu HR-HPV w wykrywaniu zmian przednowotworowych i raka szyjki macicy
W celu określenia przydatności klinicznej nowego testu na obecność HR-HPV posłużono się wartościami dodatniej (PPV) i ujemnej wartości predykcyjnej (NPV) względem badania cytologicznego na podłożu płynnym (SurePath, Becton Dickinson). Tym samym, określono prawdopodobieństwo uzyskania nieprawidłowego wyniku badania cytologicznego u pacjentek z dodatnim wynikiem nowego testu oraz prawidłowego wyniku badania cytologicznego przy ujemnym wyniku testu na obecność HR-HPV. W przypadku potwierdzenia wysokiej ujemnej wartości predykcyjnej nowego testu, jego wynik ujemny umożliwiałby rezygnację z wykonania badania cytologicznego, a wynik dodatni mógłby stanowić kryterium kwalifikacji do jego przeprowadzenia.
Poziom zgodności wyników nowego testu hrHPV z wynikami badania cytologicznego oceniano w oparciu o wartości współczynnika zgodności tau b Kendalla. Dodatnią wartość predykcyjną (PPV, prawdopodobieństwo wystąpienia nieprawidłowego wyniku badania cytologicznego u osoby z dodatnim wynikiem testu na obecność HR-HPV) i ujemną wartość predykcyjną (NPV, prawdopodobieństwo wystąpienia prawidłowego wyniku badania cytologicznego u osoby z ujemnym wynikiem testu na obecność HR-HPV), oceniono na podstawie analizy ROC. Wszystkie obliczenia statystyczne wykonano przy pomocy pakietu Statistica 10 (StatSoft, Tulsa OK, Stany Zjednoczone).
Detekcja HR-HPV a nieprawidłowy wynik badania cytologicznego (minimum ASCUS)
Ogółem, przeanalizowano wyniki 5000 par wyników testów hrHPV i badań cytologicznych. Nowy test dał 403 (8,1%) wyniki dodatnie i 4597 (91,9%) wyników ujemnych. Wśród wyników badania cytologicznego było 175 (3,5%) preparatów nieprawidłowych i 4825 (96,5%) preparatów prawidłowych.
Test/wynik Nieprawidłowa cytologia (min. ASCUS) Prawidłowa cytologia Razem
Nowy test-wynik 168 235 403
dodatni Nowy test-wynik 7 4590 4597
ujemny Razem 175 4825 5000
PL 235 847 Β1
W przypadku 235 (58,3%) pacjentek z dodatnim wynikiem nowego testu wynik badania cytologicznego był prawidłowy. W przypadku 7 (0,2%) pacjentek z ujemnym wynikiem nowego testu stwierdzono nieprawidłowy wynik badania cytologicznego. Współczynnik zgodności tau b Kendalla wyniku testu na obecność HR-HPV i wyniku badania cytologicznego wyniósł b = 0,6152294.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 41,7% dodatnią wartością predykcyjną (PPV) i 99,8% ujemną wartością predykcyjną (NPV) w stosunku do wyniku badania cytologicznego.
Detekcja HR-HPV a nieprawidłowy wynik badania cytologicznego (H-SIL)
Ogółem, przeanalizowano wyniki 5000 par wyników testów i badań cytologicznych. Nowy test dał 403 (8,1%) wyniki dodatnie i 4597 (91,9%) wyników ujemnych. Wśród wyników badania cytologicznego było 15 (0,3%) preparatów ze zmianami odpowiadającymi H-SIL i 4985 (99,7%) preparatów prawidłowych lub ze zmianami o nasileniu mniejszym niż H-SIL.
Test/wynik Nieprawidłowa cytologia (H-SIL) Prawidłowa cytologia lub H-SIL(-) Razem
Nowy test - wynik dodatni 15 388 403
Nowy test - wynik ujemny 0 4597 4597
Razem 15 4985 5000
W przypadku 388 (96,3%) pacjentek z dodatnim wynikiem nowego testu w badaniu cytologicznym nie stwierdzono zmian odpowiadających H-SIL. U żadnej z pacjentek z ujemnym wynikiem nowego testu w badaniu cytologicznym nie stwierdzono zmian odpowiadających H-SIL. Współczynnik zgodności tau b Kendalla wyniku testu na obecność HR-HPV i wyniku badania cytologicznego wyniósł b = 0,1852669.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 3,7% dodatnią wartością predykcyjną (PPV) i 100,0% ujemną wartością predykcyjną (NPV) w stosunku do wyniku badania cytologicznego.
Detekcja HPV16/18 a nieprawidłowy wynik badania cytologicznego (minimum ASCUS)
Ogółem, przeanalizowano wyniki 5000 par wyników testów i badań cytologicznych. Nowy test dał 169 (3,4%) wyników dodatnich i 4831 (96,6%) wyników ujemnych. Wśród wyników badania cytologicznego było 175 (3,5%) preparatów nieprawidłowych i 4825 (96,5%) preparatów prawidłowych.
Test/wynik Nieprawidłowa cytologia (min. ASCUS) Prawidłowa cytologia Razem
Nowy test - wynik dodatni 71 98 169
Nowy test - wynik ujemny 104 4727 4831
Razem 175 4825 5000
W przypadku 98 (58,0%) pacjentek z dodatnim wynikiem nowego testu wynik badania cytologicznego był prawidłowy. W przypadku 104 (2,2%) pacjentek z ujemnym wynikiem nowego testu stwierdzono nieprawidłowy wynik badania cytologicznego. Współczynnik zgodności tau b Kendalla wyniku testu na obecność HPV16/18 i wyniku badania cytologicznego wyniósł b = 0,3919416.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 42,0% dodatnią wartością predykcyjną (PPV) i 97,8% ujemną wartością predykcyjną (NPV) w stosunku do wyniku badania cytologicznego.
Detekcja HPV16/18 a nieprawidłowy wynik badania cytologicznego (H-SIL)
Ogółem przeanalizowano wyniki 5000 par wyników testów i badań cytologicznych. Nowy test dał 169 (3,4%) wyników dodatnich i 4831 (96,6%) wyników ujemnych. Wśród wyników badania cytologicznego było 15 (0,3%) preparatów ze zmianami odpowiadającymi H-SIL i 4985 (99,7%) preparatów prawidłowych lub ze zmianami o nasileniu mniejszym niż H-SIL.
PL 235 847 Β1
Test/wynik Nieprawidłowa cytologia (H-SIL) Prawidłowa cytologia lub H-SIL(-) Razem
Nowy test - wynik dodatni 10 159 169
Nowy test — wynik ujemny 5 4826 4831
Razem 15 4985 5000
W przypadku 159 (94,1%) pacjentek z dodatnim wynikiem nowego testu w badaniu cytologicznym nie stwierdzono zmian odpowiadających H-SIL. U 5 (0,1%) pacjentek z ujemnym wynikiem nowego testu w badaniu cytologicznym stwierdzono zmiany odpowiadające H-SIL. Współczynnik zgodności tau b Kendalla wyniku testu na obecność HPV16/18 i wyniku badania cytologicznego wyniósł b=0,1921027.
Analiza ROC wykazała, że nowy test cechuje się 5,9% dodatnią wartością predykcyjną (PPV) i 99,9% ujemną wartością predykcyjną (NPV) w stosunku do wyniku badania cytologicznego.
Wnioski
Analiza wartości klinicznej nowego testu wykazała, że cechuje się on optymalną ujemną wartością predykcyjną (od 97,8% do 100%) w stosunku do wyniku badania cytologicznego na podłożu płynnym. Szczególnie wysokie wartości NPV (100% dla wyniku ujemnego w kierunku HR-HPV i 99,9% dla wyniku ujemnego w kierunku HPV16/18) uzyskano w odniesieniu do zmian przedrakowych (H-SIL). Niższy poziom dodatniej wartości predykcyjnej jest w pełni zrozumiały zważywszy, że nie każdej nieprawidłowości cytologicznej musi towarzyszyć aktywne zakażenie HPV, szczególnie w grupie rozpoznań cytologicznych typu ASC-US i ASC-H. Należy się spodziewać, że jeszcze korzystniejsze wskaźniki wartości predykcyjnej testu hrHPV można uzyskać w stosunku do cytologii konwencjonalnej, która charakteryzuje się udokumentowaną mniejszą efektywnością w wykrywaniu nieprawidłowych komórek nabłonkowych szyjki macicy niż metody cytologii na podłożu płynnym (liquid based cytology, LBC).
Uzyskane wyniki wskazują, że w przypadku ujemnego wyniku nowego testu nie ma konieczności wykonania badania cytologicznego. Zatem, zastosowanie nowego testu mogłoby potencjalnie umożliwić rezygnację z badania cytologicznego w dużej populacji kobiet HPV-ujemnych, co wiązałoby się ze znacznymi oszczędnościami.
Natomiast, z uwagi na mniejszą dodatnią wartość predykcyjną testu, każdy jego wynik dodatni powinien stanowić wskazanie do wykonania cytologii. Wtym kontekście należy podkreślić kolejną zaletę nowego testu - fakt, że jest on wykonywany na tym samym materiale, który wykorzystuje się do badania cytologicznego na podłożu płynnym. W związku z powyższym, w przypadku dodatniego wyniku testu hrHPV badanie cytologiczne może zostać wykonane na tym samym materiale, bez konieczności pobierania od pacjentki dodatkowych wymazów. Skraca to znaczenie czas postępowania diagnostycznego oraz istotnie obniża jego koszt.
Podsumowując: w wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że test hrHPV według wynalazku cechuje się optymalną ujemną wartością predykcyjną (od 97,8% do 100%) w stosunku do wyniku badania cytologicznego na podłożu płynnym (Surę Path) i zastosowanie nowego testu hrHPV o wysokiej efektywności klinicznej może potencjalnie umożliwić rezygnację z badania cytologicznego w dużej populacji kobiet HR-HPV-ujemnych.
Niniejszy wynalazek pozwala na uzyskanie innowacyjnego narzędzia diagnostycznego, jakim jest test łączący cechy badania cytologicznego i HPV. Wdrożenie testu według wynalazku do programów profilaktycznych powinno znacząco zwiększyć skuteczność skrinigu raka szyjki macicy i zracjonalizować koszty dalszej diagnostyki i leczenia. Ponadto zastosowanie prostego testu HPV korzystnie bazującego na technice PCR w czasie rzeczywistym w materiale z cytologii na podłożu płynnym (LBC) potencjalnie pozwoli na większą automatyzację i moce przerobowe procesu diagnostycznego w laboratoriach uczestniczących w programach profilaktycznych. Zastosowanie testu pozwoli określić, z jakim ryzykiem raka szyjki macicy mamy do czynienia i jakie zastosować leczenie. Ponadto nowatorskie zastosowanie technologii LNA, dotąd niestosowanej w diagnostyce HPV, pozwala na uzyskanie szerokiego dostępu do diagnostyki na najwyższym poziomie klinicznym.
PL 235 847 Β1
Wykaz sekwencji
Sekwencja nr id. 1
Opis: starter HPV 16 F
5’-GCACAGGAAGCAAAACAACATAG-3’
Sekwencja nr id. 2
Opis: starter HPV 18 F
5’-AGGTCCACAATGATGCACAAG-3’
Sekwencja nr id. 3
Opis: starter HPV 33 F
5’-CAGAAGATGAGGATGAAACAGCAG-3’
Sekwencja nr id. 4
Opis: starter HPV 31 F
5’-GAGGAACATGCAGAGGCTGT-3'
Sekwencja nr id. 5
Opis: starter HPV 35 F
5’-ATGCACAGGAGGAGCAAACA-3'
Sekwencja nr id. 6
Opis: starter HPV 39 F
5’-GTGAGACAGCACAGGTACTTTTAC-3’
PL 235 847 Β1
Sekwencja nr id. 7
Opis: starter HPV 45 F
5’-CCATGCGCAGGAAGTTCAG-3’
Sekwencja nr id. 8
Opis: starter HPV 51 F
5’-ACAAAGAGGCTGTGCATCAG-3’
Sekwencja nr id. 9
Opis: starter HPV 52 F
5’-GAAGGGGAGGATGATTTACATGC-3’
Sekwencja nr id. 10
Opis: starter HPV 56/66 F
5’-GCAAGTACAAACAGCACATGC-3’
Sekwencja nr id. 11
Opis: starter HPV 58 F
5’-AGCCCGAGCGTTGTTTAATG-3’
Sekwencja nr id. 12
Opis: starter HPV 59 F
5’-GGCCTTGTTTAATGTGCAGGAAG-3’
Sekwencja nr id. 13
Opis: starter HPV 68 F
5’-CAAACAGGTGACACAGTCTCAG-3’
PL 235 847 Β1
Sekwencja nr id. 14
Opis: starter HPV 16/31/33/35/39/52/56/58/66 R
5’-GTATTGCCATAGCCGCTGTCT-3’
Sekwencja nr id. 15
Opis: starter HPV 18/45 R
5’-AACAGCCATAGCCACTATCTGA-3’
Sekwencja nr id. 16
Opis: starter HPV 51 R
5’-CTGTCCGGATAACTGTCCAGT-3’
Sekwencja nr id. 17
Opis: starter HPV 59 R
5’-TGTCTGGCACTGTTAKTAACCTTC-3’
Sekwencja nr id. 18
Opis: starter HPV 68 R
5’-TCCTGTAATGGCGACTTTGCT-3’
Sekwencja nr id. 19
Opis: starter HPV 16 F ΗΕΧ
5’-TAATGGATGGTTTTATGTAGAGGOT-3’
PL 235 847 Β1
Sekwencja nr id. 20
Opis: starter HPV 16 R ΗΕΧ
5’-CTGCCTGTGTTAAATAATCATTAT-3’
Sekwencja nr id. 21
Opis: starter HPV 18 FHEX
5’-GGCTGGTTTTATGTACAAGCT-3’
Sekwencja nr id. 22
Opis: starter HPV 18 R ΗΕΧ
5’-CCTGTTCACAAAATGTTCCTT-3’
Sekwencja nr id. 23
Opis: starter HBE1 IC F
5’-GAGAACTTCAAGGTGAGTTCAGGT-3’
Sekwencja nr id. 24
Opis: starter HBE1 IC R
5’-GAAGTCTGCTGTTCTAACATCAAG-3'
Sekwencja nr id. 25
Opis: sekwencja HR-HPV
5’-ACTTTCGTTT-3'
Sekwencja nr id. 26
Opis: sekwencja HPV 33n
5'-ACTTTCGCTT-3'
PL 235 847 Β1
Sekwencja nr id. 27
Opis: sekwencja HPV 16/18
5’-ATATCWGATGACGAG-3'
Sekwencja nr id. 28
Opis: sekwencja HBE1
5’-TGACATTAATTGAAGCTCATAATCTTATTG-3'
Sekwencja nr id. 29
Opis: sonda HR-HPV
5'-6FAM-A+C+T+T+T+C+G+T+TT-BHQ1 -3'
Sekwencja nr id. 30
Opis: sonda 33n
5'-6FAM-A+C+T+T+T+C+G+C+TT-BHQ1-3'
Sekwencja nr id. 31
Opis: sonda 16/18
5’ ΗΕΧ AT+AT+CW+GA+T+G+AC+G+AG BHQ1 3'
Sekwencja nr id. 32
Opis: sonda IC
5’-ROX-TGACATTAATTGAAGCTCATAATCTTATTG-BHQ2-3'

Claims (10)

1. Zestaw do wykrywania onkogennego wirusa HPV metodą łańcuchowej reakcji polimerazy, znamienny tym, że zawiera:
co najmniej jedną parę starterów wybraną spośród sekwencji oligonukleotydowych:
a) dla wirusa HPV 16 sekwencja nr id. 1 i sekwencja nr id. 14,
b) dla wirusa HPV 18 sekwencja nr id. 2 i sekwencja nr id. 15,
c) dla wirusa HPV 33 sekwencja nr id. 3 i sekwencja nr id. 14,
d) dla wirusa HPV 31 sekwencja nr id. 4 i sekwencja nr id. 14,
e) dla wirusa HPV 35 sekwencja nr id. 5 i sekwencja nr id. 14,
f) dla wirusa HPV 39 sekwencja nr id. 6 i sekwencja nr id. 14,
g) dla wirusa HPV 45 sekwencja nr id. 7 i sekwencja nr id. 15,
h) dla wirusa HPV 51 sekwencja nr id. 8 i sekwencja nr id. 16,
i) dla wirusa HPV 52 sekwencja nr id. 9 i sekwencja nr id. 14,
j) dla wirusa HPV 56/66 sekwencja nr id. 10 i sekwencja nr id. 14,
k) dla wirusa HPV 58 sekwencja nr id. 11 i sekwencja nr id. 14,
l) dla wirusa HPV 59 sekwencja nr id. 12 i sekwencja nr id. 17,
m) dla wirusa HPV 68 sekwencja nr id. 13 i sekwencja nr id. 18.
2. Zestaw według zastrz, 1, znamienny tym, że zawiera wszystkie oligonukleotydy określone w zastrz. 1.
3. Zestaw według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 25 do 28.
4. Zestaw według zastrz 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 29 do 32.
5. Zestaw według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera dodatkowo jako kontrolę wewnętrzną parę starterów o sekwencji oligonukleotydowej wybranej spośród sekwencji nr id.: 23 do 24.
6. Sposób wykrywania onkogennego wirusa HPV, znamienny tym, że przeprowadza się łańcuchową reakcję polimerazy z użyciem co najmniej jednej pary starterów wybranych spośród sekwencji oligonukleotydowych określonych w zastrz. 2, przy czym o obecności wirusa świadczy amplifikacja produktu zawierającego specyficzną dla niego parę starterów.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że przeprowadza się multipleksową łańcuchową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym z jednoczesnym użyciem wszystkich oligonukleotydów wskazanych w zastrz. 2.
8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 25 do 28.
9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 29 do 32.
10. Sposób według zastrz. 8 albo 7, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo jako kontrolę wewnętrzną parę starterów o sekwencji oligonukleotydowej wybranej spośród sekwencji nr id.: 23 do 24.
PL407864A 2014-04-11 2014-04-11 Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV PL235847B1 (pl)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL407864A PL235847B1 (pl) 2014-04-11 2014-04-11 Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV
US15/303,503 US20170029908A1 (en) 2014-04-11 2015-04-11 Screening test for detecting the presence of oncogenic hpv viruses
ES15722601.0T ES2684746T3 (es) 2014-04-11 2015-04-11 Prueba de cribado para detectar la presencia de virus VPH oncogénicos
AU2015244506A AU2015244506A1 (en) 2014-04-11 2015-04-11 Screening test for detecting the presence of oncogenic HPV viruses
EP15722601.0A EP3129512B1 (en) 2014-04-11 2015-04-11 Screening test for detecting the presence of oncogenic hpv viruses
HUE15722601A HUE039321T2 (hu) 2014-04-11 2015-04-11 Szûrõvizsgálat onkogén HPV vírusok jelenlétének kimutatására
JP2017505038A JP2017513522A (ja) 2014-04-11 2015-04-11 発癌性ｈｐｖウイルスの存在を検出するためのスクリーニング検査
CA2945477A CA2945477A1 (en) 2014-04-11 2015-04-11 Screening test for detecting the presence of oncogenic hpv viruses
PCT/PL2015/050007 WO2015156693A1 (en) 2014-04-11 2015-04-11 Screening test for detecting the presence of oncogenic hpv viruses
TR2018/09154T TR201809154T4 (tr) 2014-04-11 2015-04-11 Onkojeni̇k hpv vi̇rüsleri̇ni̇n varliğinin beli̇rlenmesi̇ i̇çi̇n tarama testi̇.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL407864A PL235847B1 (pl) 2014-04-11 2014-04-11 Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL407864A1 PL407864A1 (pl) 2015-10-12
PL235847B1 true PL235847B1 (pl) 2020-11-02

Family

ID=53177861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL407864A PL235847B1 (pl) 2014-04-11 2014-04-11 Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20170029908A1 (pl)
EP (1) EP3129512B1 (pl)
JP (1) JP2017513522A (pl)
AU (1) AU2015244506A1 (pl)
CA (1) CA2945477A1 (pl)
ES (1) ES2684746T3 (pl)
HU (1) HUE039321T2 (pl)
PL (1) PL235847B1 (pl)
TR (1) TR201809154T4 (pl)
WO (1) WO2015156693A1 (pl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3279337A1 (en) * 2016-08-04 2018-02-07 Servizo Galego de Saúde (SERGAS) Use of short probes between 8 and 9 nucleotides in multiplex assays
CN110699472A (zh) * 2019-11-21 2020-01-17 四川大学华西第二医院 一种用于鉴定hpv高危人群的标志物及其引物和检测方法
CN112195277B (zh) * 2020-10-29 2022-07-26 北京康美天鸿生物科技有限公司 基于实时荧光定量pcr检测人乳头瘤病毒的引物探针组以及试剂盒
WO2025057766A1 (ja) * 2023-09-15 2025-03-20 株式会社カネカ 核酸検出方法、試薬及びキット

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2629458B2 (fr) * 1987-07-31 1991-08-09 Ire Celltarg Sa Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain
BE1006179A3 (fr) * 1992-09-22 1994-05-31 Lambdatech S A Conjugue destine a la detection et/ou au dosage d'un compose biologique.
KR20080106554A (ko) * 2006-03-24 2008-12-08 노파르티스 아게 Ｈｐｖ 감염을 치료하기 위한 ｄｓｒｎａ 조성물 및 방법
EP1997914A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 Università Degli Studi Di Milano - Bicocca Identification and quantification of oncogenic HPV nucleic acids by means of real-time PCR assays
CA2726396C (en) * 2008-04-17 2019-03-19 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions, methods, and kits using synthetic probes for determining the presence of a target nucleic acid
AU2011210734B2 (en) * 2010-01-29 2017-02-09 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
CA2828224A1 (en) * 2011-02-24 2012-08-30 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015156693A1 (en) 2015-10-15
ES2684746T3 (es) 2018-10-04
TR201809154T4 (tr) 2018-07-23
AU2015244506A1 (en) 2016-11-03
HUE039321T2 (hu) 2018-12-28
US20170029908A1 (en) 2017-02-02
EP3129512B1 (en) 2018-03-28
JP2017513522A (ja) 2017-06-01
PL407864A1 (pl) 2015-10-12
EP3129512A1 (en) 2017-02-15
CA2945477A1 (en) 2015-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Oura et al. Virological diagnosis of African swine fever—comparative study of available tests
JP6574703B2 (ja) 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリｄｎａを検出するための方法
Ozaki et al. Analytical performance of newly developed multiplex human papillomavirus genotyping assay using Luminex xMAP™ technology (Mebgen™ HPV Kit)
Xiu et al. Simultaneous detection of eleven sexually transmitted agents using multiplexed PCR coupled with MALDI-TOF analysis
Samra et al. Direct simultaneous detection of 6 sexually transmitted pathogens from clinical specimens by multiplex polymerase chain reaction and auto-capillary electrophoresis
Shipitsyna et al. Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia
CN111910017A (zh) 一种检测呼吸道病原体多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
PL235847B1 (pl) Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV
Kim et al. Loop-mediated isothermal amplification of vanA gene enables a rapid and naked-eye detection of vancomycin-resistant enterococci infection
CN110628953B (zh) 一种用于人乳头瘤病毒分型检测的试剂盒
Chen et al. Development of a duplex real‐time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Theileria equi and Babesia caballi
Groch et al. A novel real-time PCR to detect Cetacean morbillivirus in Atlantic cetaceans
Yu et al. A modified loop-mediated isothermal amplification method for detecting avian infectious laryngotracheitis virus
Yi et al. A new PCR-based mass spectrometry system for high-risk HPV, part I: methods
CN103333903A (zh) 检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒
Oliveira et al. Human papillomavirus status and cervical abnormalities in women from public and private health care in Rio de Janeiro State, Brazil
BR112017006905B1 (pt) Conjunto de oligonucleotídeos, método para detectar e discriminar alvos htlv1/2 e kit para diagnóstico e discriminação da infecção pelo htlv1/2
CN111926114A (zh) 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
EP1997914A1 (en) Identification and quantification of oncogenic HPV nucleic acids by means of real-time PCR assays
CN116802322A (zh) 检测牛呼吸系统疾病综合征相关病原体的测定工具、试剂盒和方法
CN111944923B (zh) 一种检测呼吸道病原体多重荧光pcr试剂盒、方法和应用
Mudhigeti et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detection and typing of human papilloma virus 16 and 18 from endocervical samples
CN114790490A (zh) 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法
CN116121439B (zh) 一种多重定量pcr检测真菌的方法以及试剂盒
Halfon et al. Evaluation of the clinical performance of the Abbott RealTime High-Risk HPV for carcinogenic HPV detection