JP2009531433A - HPV感染処置のためのdsRNA組成物および方法 - Google Patents
HPV感染処置のためのdsRNA組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009531433A JP2009531433A JP2009502885A JP2009502885A JP2009531433A JP 2009531433 A JP2009531433 A JP 2009531433A JP 2009502885 A JP2009502885 A JP 2009502885A JP 2009502885 A JP2009502885 A JP 2009502885A JP 2009531433 A JP2009531433 A JP 2009531433A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dsrna
- e6ap
- sequence
- nucleotides
- hpv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- LISPLLOJPJBYRE-VWRUCJMGSA-N CC(C)CCCC(C)[C@@H](CC1)[C@@](C)(CC2)C1C1C2[C@@](C)(CC[C@@H](C2)OC(NCCCCCC(N(CC3COC(c4ccccc4)(c(cc4)ccc4OC)c(cc4)ccc4OC)CC3O)=O)=O)C2=CC1 Chemical compound CC(C)CCCC(C)[C@@H](CC1)[C@@](C)(CC2)C1C1C2[C@@](C)(CC[C@@H](C2)OC(NCCCCCC(N(CC3COC(c4ccccc4)(c(cc4)ccc4OC)c(cc4)ccc4OC)CC3O)=O)=O)C2=CC1 LISPLLOJPJBYRE-VWRUCJMGSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/31—Combination therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、二本鎖リボ核酸(dsRNA)、およびヒトパピローマウイルス(HPV)感染が仲介する病理学的過程、例えば子宮頚部癌、肛門癌、HPV関連前癌病変、および性器疣贅を処置するためのRNA干渉の仲介におけるその使用に関する。
パピローマウイルス(PV)は、上皮の過増殖性病巣を誘発する無エンベロープDNAウイルスである。パピローマウイルスは、天然に広く存在し、高級脊椎動物において認識されている。ウイルスは、とりわけ、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマ、およびイヌから特徴付けされている。最初のパピローマウイルスは、1933年に、ワタウサギパピローマウイルス(CRPV)として記載された。それ以来、ワタウサギならびに1型ウシパピローマウイルス(BPV−1)が、パピローマウイルスの試験のための実験的プロトタイプとして役立っている。ほとんどの動物パピローマウイルスは、純粋に上皮性増殖性病巣と関連しており、そして動物におけるほとんどの病巣は皮膚である。ヒトにおいて、100種を超えるパピローマウイルス(HPV)が同定されており、それらは感染部位:皮膚上皮および粘膜上皮(経口および性器粘膜)により分類されている。皮膚関連疾患は、扁平疣贅、足底疣贅などを含む。粘膜関連疾患は、喉頭パピローマおよび子宮頚部癌腫を含む肛門性器疾患を含む(Fields, 1996, Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Pub., Philadelphia, N.Y.;Bernard, H-U., 2005. J. Clin. Virol. 328:S1-S6)。
本発明は、HPV増殖に必須の遺伝子発現を沈黙させるための二本鎖リボ核酸(dsRNA)の使用による、HPV感染と関連する疾患の処置の問題の解決を提供する。E6APは、HPVが増殖のために必要とするヒト宿主種の保存遺伝子である。
(a) 細胞に、互いに相補的である少なくとも2個の配列を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)を導入する。本dsRNAは、第一配列を含むセンス鎖および第二配列を含むアンチセンス鎖を含む。本アンチセンス鎖は、E6APをコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補性であり、ここで、該相補性領域は30ヌクレオチド長未満、一般に19−24ヌクレオチド長であり、ここで、該dsRNAは、E6APを発現する細胞との接触により、E6AP遺伝子の発現を、少なくとも40%阻害し;そして
(b) 工程(a)で製造した細胞E6AP遺伝子のmRNAトランスクリプトの分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞でのE6AP遺伝子の発現を阻害する。
図面はない。
本発明は、HPV増殖に必須の遺伝子発現を沈黙させるための二本鎖リボ核酸(dsRNA)の使用による、HPV感染と関連する疾患の処置の問題の解決を提供する。特に、本発明のdsRNAは、HPVの増殖に必要なヒト宿主種の保存遺伝子であるHPV遺伝子E1またはE6またはヒトE6APを沈黙させる。ここで、これらの遺伝子を、集合的にHPV標的遺伝子と呼ぶこともある。
ヒト宿主の細胞性ユビキチンリガーゼE6APは、HPV、特に組み込み(非エピソーム)型のHPVの複製に、そのウイルスのE6タンパク質との複合体化を介して関与する。E6は、細胞増殖経路を制御する多くのタンパク質に結合し、しばしばそれらの分解を引き起こす(Chakrabarti, O. and Krishna, S. 2003. J. Biosci. 28:337-348)。E6はE6APと複合体形成して、分解について腫瘍サプレッサーp53を標的とする(Scheffner, M. et al., 1990. Cell. 63:1129-1136;およびScheffner, M. et al., 1993. Cell 75:495-505)。p53を不活性化することにより、本ウイルスは感染細胞のp53仲介アポトーシスを防止し(Chakrabarti and Krishna, 2003)、そしてそうでなければp53により遮断されているそのDNAの複製を促進するだけでなく(Lepik, D. et al. 1998. J. Virol. 72:6822-6831)、ゲノム完全性に対するp53仲介制御の低下により、発癌も助ける(Thomas, M. et al. 1999. Oncogene. 18:7690-7700)。
簡便のために、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用するある用語および句の意味を、以下に提供する。本明細書の他の部分でのこれらの用語の使用とこの章で提供するその定義の間に明らかな矛盾がある場合、この章の定義が優先する。
として、HPV標的遺伝子サイレンシングは、構成的であれゲノム工学によるものであれ標的を発現する細胞で、何らかの適当なアッセイで決定できる。しかしながら、あるdsRNAが、一定の程度でHPV標的遺伝子を阻害し、それ故に本発明に含まれるかどうかを決定するために対照が必要である場合には、後記の実施例で提供されるアッセイが、このような対照となる。
一つの態様において、本発明は、細胞または哺乳動物でのHPV標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を提供し、ここで該dsRNAが、HPV標的遺伝子の発現において形成されるmRNAの少なくとも一部と相補性である相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、そして該相補性の領域が30ヌクレオチド長未満、一般に19−24ヌクレオチド長であり、ここで、該dsRNAが、該HPV標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、該HPV標的遺伝子の発現を少なくとも10%、25%、または40%阻害する。
本発明のdsRNAは、細胞内のインビボで組み換えウイルスベクターからも発現できる。本発明の組み換えウイルスベクターは、本発明のdsRNAをコードする配列およびdsRNA配列を発現するための何らかの適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは、例えば、U6またはH1 RNA pol IIIプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は、当分野の技術範囲内である。本発明の組み換えウイルスベクターはまた、特定の組織または特定の細胞内環境でのdsRNAの発現のための誘導性または調節可能プロモーターも含み得る。本発明のdsRNAをインビボで細胞に送達するための組み換えウイルスベクターは、下記にさらに詳しく述べる。
一つの態様において、本発明は、ここに記載のdsRNAおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。dsRNA含有医薬組成物は、HPV感染が仲介する病理学的過程のようなHPV標的遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害の処置に有用である。そのような医薬組成物は、送達の形態に基づき製剤する。一例は、子宮頚への局所投与または非経腸送達を介する全身投与のいずれか用に製剤された組成物である。
E1から:ND−9072;ND−9142;ND−9092;ND−9162;ND−9097;ND−9167;ND−9066;ND−9123;AL−DP−8082;AL−DP−8095;
E6から:ND−8903;ND−8991;ND−8914;ND−9002;ND−8906;ND−8994;ND−8943;ND−9031;ND−9032;ND−8920;ND−8952;ND−8951;ND−9008;ND−9040;ND−9039;AL−DP−7783;AL−DP−7784;
E6APから:AL−DP−7365;AL−DP−7371;AL−DP−7499;AL−DP−7545;AL−DP−7492;AL−DP−7473;AL−DP−7478;AL−DP−7554;AL−DP−7514;AL−DP−7397、ND−9300。
ここに記載の方法および組成物は、臨床的または無症状性パピローマウイルス感染の結果であり得る、ヒトパピローマウイルスが原因の疾患および状態の処置に使用できる。“HPV関連障害”または“HPV感染が仲介する病理学的過程”とここで呼ぶこともあるこのような疾患および状態は、例えば、上皮性悪性物、皮膚癌(非黒色腫または黒色腫)、子宮頚部癌のような肛門性器悪性物、HPV関連前癌病変(LSILまたはHSIL子宮頚部組織を含む)、肛門癌腫、悪性病巣、良性病巣、パピローマ癌腫、乳頭腺嚢腫、パピローマ神経障害(neuropathicum)、乳頭腫、皮膚および粘膜パピローマ、コンジローマ、線維芽細胞腫瘍、およびパピローマウイルスと関連する他の病的状態を含む。
さらに他の局面において、本発明は、哺乳動物におけるE6AP遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、標的E6AP遺伝子の発現が沈黙するように、哺乳動物に本発明の表1の組成物を投与することを含む。それらの高い特異性のため、このような本発明のdsRNAは、標的E6AP遺伝子のRNA(一次または加工)を特異的に標的とする。このようなdsRNAを使用したこれらのE6AP遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書に記載の通り実施できる。
siRNA設計を、ヒトユビキチンタンパク質リガーゼE3A(ube3A、E6APとも呼ぶ)を標的とするsiRNAを同定するために行った。種々のアイソフォーム(NM_130838.1、NM_130839.1、NM_000462.2)を表すE6APに対するヒトmRNA配列を使用した。
1) 鎖(シード領域)の2〜9位(5'から3'に計数)における標的遺伝子への相補性は、その鎖と、標的遺伝子から転写されるmRNAの相互作用および続く下方制御に十分である(Jackson AL, et al. Nat Biotechnol. 2003 Jun;21(6):635-7)
2) 各鎖の1位および19位はオフターゲット相互作用に無関係である
3) シード領域は、配列の残りよりもよりオフターゲット潜在性に関与し得る
4) 鎖の開裂部位領域10位および11位(5'から3'に計数)は、開裂部位への配列3'(非シード領域)よりもオフターゲット潜在性に関与し得るが、シード領域ほどではない
5) オフターゲットコアは、仮説1〜4を考慮しながら、siRNA鎖配列の遺伝子の配列への相補性およびミスマッチ位置に基づいて各遺伝子および各鎖で計算できる
6) 導入された内部修飾によりセンス鎖活性が無くなる可能性を考慮して、アンチセンス鎖のオフターゲット潜在性のみが関連する
7) siRNAのオフターゲット潜在性は、我々の基準で最高の相同性を示す遺伝子(最良オフターゲット遺伝子)から推論でき、故に、それぞれの遺伝子のオフターゲットコアにより示すことができる
シード領域中のミスマッチ数
非シード領域中のミスマッチの数
開裂部位領域中のミスマッチの数
(シードミスマッチ数×10)+(開裂部位ミスマッチ数×1.2)+非シードミスマッチ数
最低オフターゲットコアを、各インプット19量体配列について抽出し、インプット19量体配列に対応する全siRNAについてのオフターゲットコアのリストをもたらすアウトプットファイルに連続的に書き出した。
試薬供給源
ここで試薬の供給源を具体的に記載していないとき、このような試薬は、分子生物学における適用に標準的なる品質/純度での分子生物学用の試薬の任意の供給者から得ることができる。
一本鎖RNAを、1μmole規模で、Expedite 8909合成装置(Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany)および固体支持体として制御された多孔性ガラス(CPG, 500Å, Prオリゴ Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)を使用して、固相合成により製造した。RNAおよび2'−O−メチルヌクレオチド含有RNAを、各々対応するホスホラミダイトおよび2'−O−メチルホスホラミダイトを用いる固相合成により製造した(Prオリゴ Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)。これらの構成要素を、 Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のような標準ヌクレオシドホスホラミダイト化学を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に導入した。ホスホロチオエート結合を、ヨウ素酸化剤溶液を、Beaucage試薬(Chruachem Ltd, Glasgow, UK)のアセトニトリル(1%)溶液に置き換えることにより導入した。さらに、補助試薬をMallinckrodt Baker(Griesheim, Germany)から得た。
ジエチル−2−アザブタン−1,4−ジカルボキシレートAA
本発明の他の局面において、E6AP遺伝子発現活性を調節するE6AP特異的dsRNA分子は、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写単位から発現される(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10;Skillern, A., et al.、国際PCT公報WO00/22113、Conrad、国際PCT公報WO00/22114、およびConrad、米国特許6,054,299参照)。これらの導入遺伝子は、直鎖状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入でき、これは、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子として、組み込まれ遺伝し得る。導入遺伝子はまたそれが染色体外プラスミドとして遺伝されるようにも構築できる(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995)92:1292)。
HCT−116細胞をDSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (Braunschweig, Germany, cat. No. ACC 581)から得て、10%ウシ胎児血清(FCS)、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/mlおよび2mM L−グルタミンを含むように補ったMcCoys(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. F1015)で、37℃で5%CO2の雰囲気中、加湿インキュベーターで培養した。
化学修飾したdsRNAを、細胞におけるE6APをコードするmRNAの発現レベルを低下させる関連能力を同定するために試験した。HCT−116細胞について上記のアッセイ条件を用いた。あるE6AP特異的siRNA二本鎖の活性を、コントロールsiRNA二本鎖で処理した細胞におけるE6AP mRNA濃度に対する処理細胞におけるE6AP mRNA濃度%として示した。
以下の表3は、本発明のdsRNA組成物を示す。この表において、未修飾配列の後に、1個以上のヌクレオチド修飾を含む同じ配列に続く。
表5は、本発明のdsRNA組成物を示す。
非修飾および化学修飾したdsRNAを、細胞におけるHPV E1遺伝子をコードするmRNAの発現レベルを低下させる関連能力を同定するために試験した。
用いたアッセイ条件は以下の通りであった:C33A細胞をATCCから得た。HPV16 E6およびE1をコードする配列を、YFP融合トランスクリプトとしての発現のために、pNAS−055ベクター(Husken et al,. Nucleic Acids Research, 31:e102, 2003)にクローン化した。得られたプラスミドを、C33A細胞にトランスフェクトし、これらの融合トランスクリプトを発現する安定な株を、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従い、ゼオシンにより誘導させた。HPV16 E6またはHPV16 E1に対するsiRNAでのトランスフェクションのために、各細胞を、96ウェルプレートに2.0×104細胞/ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。製造者の指示に従ってsiRNAのトランスフェクション(示す通り30nM、3nMまたは300pm)を、一用量としてリポフェクタミン2000(登録商標)(Invitrogen)と共に行った。
表6は、本発明のE1 dsRNAの結果を示す。
非修飾および化学修飾したdsRNAを、細胞におけるHPV E6遺伝子をコードするmRNAの発現レベルを低下させる関連能力を同定するために試験した。
用いたアッセイ条件は以下の通りであった:C33A細胞をATCCから得た。HPV16 E6およびE1をコードする配列を、YFP融合トランスクリプトとしての発現のために、pNAS−055ベクター(Husken et al,. Nucleic Acids Research, 31:e102, 2003)にクローン化した。得られたプラスミドを、C33A細胞にトランスフェクトし、これらの融合トランスクリプトを発現する安定な株を、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従い、ゼオシンにより誘導させた。HPV16 E6またはHPV16 E1に対するsiRNAでのトランスフェクションのために、各細胞を、96ウェルプレートに2.0×104細胞/ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。製造者の指示に従ってsiRNAのトランスフェクション(示す通り30nM、3nMまたは300pm)を、一用量としてリポフェクタミン2000(登録商標)(Invitrogen)と共に行った。
表8は本発明のE6 dsRNAの結果を示す。
Claims (36)
- 細胞でのヒトE6AP遺伝子発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、該dsRNAは、互いに相補的である少なくとも2個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はE6APをコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、ここで、該dsRNAは、該E6APを発現する細胞と接触すると、該E6AP遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、dsRNA。
- 該第一配列が表1を構成する群から選択され、そして該第二配列が表1を構成する群から選択される、請求項1に記載のdsRNA。
- 少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載のdsRNA。
- 少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項2に記載のdsRNA。
- 該修飾ヌクレオチドが:2'−O−メチル修飾ヌクレオチド、5'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項3または4に記載のdsRNA。
- 該修飾ヌクレオチドが:2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾ヌクレオチド、2'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定化(locked)ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'−アミノ−修飾ヌクレオチド、2'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項3または4に記載のdsRNA。
- 該第一配列が表1を構成する群から選択され、そして該第二配列が表1を構成する群から選択される、請求項3または4に記載のdsRNA。
- 該第一配列が表1を構成する群から選択され、そして該第二配列が表1を構成する群から選択される、請求項6または7に記載のdsRNA。
- 請求項1に記載のdsRNAを含む、細胞。
- 生物におけるE6AP遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、dsRNAおよび薬学的に許容される担体を含み、ここで、該dsRNAは互いに相補的である少なくとも2個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はE6APをコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、ここで、該dsRNAは、該E6APを発現する細胞と接触すると、該E6AP遺伝子を少なくとも20%阻害する、医薬組成物。
- 該dsRNAの該第一配列が表1を構成する群から選択され、そして該dsRNAの該第二配列が表1を構成する群から選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
- 該dsRNAの該第一配列が表1を構成する群から選択され、そして該dsRNAの該第二配列が表1を構成する群から選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
- 細胞におけるE6AP遺伝子の発現を阻害する方法であって:
(a) 細胞に二本鎖リボ核酸(dsRNA)を導入し、ここで、該dsRNAは、互いに相補的である少なくとも2個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はE6APをコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、ここで、該dsRNAは、該E6APを発現する細胞と接触すると、該E6AP遺伝子の発現を少なくとも40%阻害し;そして
(b) 工程(a)で製造した細胞をE6AP遺伝子のmRNAトランスクリプトの分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞でのE6AP遺伝子の発現を阻害する、方法。 - ヒトパピローマウイルス(HPV)感染が仲介する病理学的過程を処置、予防または管理する方法であって、そのような処置、予防または管理を必要とする患者に、治療的または予防的有効量のdsRNAを投与することを含み、ここで、該dsRNAは互いに相補的である少なくとも2個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はE6APをコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、ここで、該dsRNAは、該E6APを発現する細胞と接触すると、該E6AP遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、方法。
- 細胞でのE6AP遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターは、dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結した制御配列を含み、ここで、該dsRNAの鎖の一方が、E6APをコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補性であり、そして、該dsRNAが30塩基対長未満であり、そして、該dsRNAは、該E6APを発現する細胞と接触すると、該E6AP遺伝子の発現を少なくとも40%阻害する、ベクター。
- 請求項15に記載のベクターを含む、細胞。
- 細胞でのヒトE6AP遺伝子の発現レベルを低下させるための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、ここで、該dsRNAは互いに相補的である少なくとも2個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はE6APをコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該dsRNAは、該E6APを発現する細胞と接触すると、該E6AP遺伝子の発現レベルを低下させる、dsRNA。
- 該接触が、該E6AP遺伝子の発現レベルを少なくとも40%低下させる、請求項17に記載のdsRNA。
- 該接触を、インビトロで30nM以下で行う、請求項17に記載のdsRNA。
- 請求項17に記載のdsRNAおよび薬学的に許容される担体を含む、生物でE6AP遺伝子の発現レベルを低下させるための医薬組成物。
- HPV関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項17に記載のdsRNAを投与することを含む、方法。
- E6AP関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項17に記載のdsRNAを投与することを含む、方法。
- 表3に記載のものから選択される、dsRNA。
- 請求項23に記載のdsRNAを含む、医薬組成物。
- HPV関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項23に記載のdsRNAを投与することを含む、方法。
- 表5に記載のものから選択される、dsRNA。
- 請求項26に記載のdsRNAを含む、医薬組成物。
- HPV関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項26に記載のdsRNAを投与することを含む、方法。
- 表7に記載のものから選択される、dsRNA。
- 請求項29に記載のdsRNAを含む、医薬組成物。
- HPV関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項29に記載のdsRNAを投与することを含む、方法。
- 請求項2、23、26および29に記載のものから選択される少なくとも2個のdsRNAを含む、医薬組成物。
- HPV関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項32に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項26または29に記載のdsRNA。
- 該修飾ヌクレオチドが:2'−O−メチル修飾ヌクレオチド、5'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項34に記載のdsRNA。
- 該修飾ヌクレオチドが:2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾ヌクレオチド、2'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定化(locked)ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'−アミノ−修飾ヌクレオチド、2'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項34に記載のdsRNA。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78583706P | 2006-03-24 | 2006-03-24 | |
US82578206P | 2006-09-15 | 2006-09-15 | |
PCT/US2007/007241 WO2007111998A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-03-23 | Dsrna compositions and methods for treating hpv infection |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009531433A true JP2009531433A (ja) | 2009-09-03 |
JP2009531433A5 JP2009531433A5 (ja) | 2010-05-20 |
Family
ID=38541679
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009502885A Withdrawn JP2009531433A (ja) | 2006-03-24 | 2007-03-23 | HPV感染処置のためのdsRNA組成物および方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7956177B2 (ja) |
EP (1) | EP1999260A2 (ja) |
JP (1) | JP2009531433A (ja) |
KR (1) | KR20080106554A (ja) |
AU (1) | AU2007230995B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0709147A2 (ja) |
CA (1) | CA2644621A1 (ja) |
MX (1) | MX2008012173A (ja) |
RU (1) | RU2008141977A (ja) |
WO (1) | WO2007111998A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015529654A (ja) * | 2012-08-02 | 2015-10-08 | アビオン インコーポレーテッド | Hpv感染に係わる癌の治療用組成物 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PE20090064A1 (es) * | 2007-03-26 | 2009-03-02 | Novartis Ag | Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende |
WO2010123365A1 (en) * | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Increasing the immunogenicity of epithelial cells infected with human papilloma virus (hpv) |
AU2009222562A1 (en) * | 2009-10-01 | 2011-04-21 | Peter Maccallum Cancer Institute | Cancer therapy |
WO2012016139A2 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | Sirnaomics, Inc. | Sirna compositions and methods for treatment of hpv and other infections |
PL235847B1 (pl) * | 2014-04-11 | 2020-11-02 | Centrum Onkologii Inst Im Marii Sklodowskiej Curie | Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV |
WO2022261274A1 (en) * | 2021-06-09 | 2022-12-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Materials and methods for measuring hpv ctdna |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5858987A (en) | 1995-05-05 | 1999-01-12 | Mitotix, Inc. | E6AP antisense constructs and methods of use |
WO2002081628A2 (en) * | 2001-04-05 | 2002-10-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies |
US8202979B2 (en) * | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
ES2728168T3 (es) * | 2000-12-01 | 2019-10-22 | Max Planck Gesellschaft | Moléculas pequeñas de ARN que median en la interferencia de ARN |
US20030170891A1 (en) * | 2001-06-06 | 2003-09-11 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
CA2452653A1 (en) * | 2001-07-17 | 2003-01-30 | Anne Josephine Milner | Silencing of gene expression by sirna |
US7923547B2 (en) * | 2002-09-05 | 2011-04-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
AU2003295600A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-06-15 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional sirna |
DE10302421A1 (de) * | 2003-01-21 | 2004-07-29 | Ribopharma Ag | Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit |
JP2008537551A (ja) * | 2005-03-31 | 2008-09-18 | カランド ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット2の阻害剤およびその使用 |
NZ571568A (en) * | 2006-03-31 | 2010-11-26 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Double-stranded RNA molecule compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene |
US8598333B2 (en) * | 2006-05-26 | 2013-12-03 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | SiRNA silencing of genes expressed in cancer |
PE20090064A1 (es) | 2007-03-26 | 2009-03-02 | Novartis Ag | Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende |
-
2007
- 2007-03-23 BR BRPI0709147-8A patent/BRPI0709147A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-03-23 AU AU2007230995A patent/AU2007230995B2/en active Active
- 2007-03-23 JP JP2009502885A patent/JP2009531433A/ja not_active Withdrawn
- 2007-03-23 MX MX2008012173A patent/MX2008012173A/es active IP Right Grant
- 2007-03-23 US US12/294,388 patent/US7956177B2/en active Active
- 2007-03-23 KR KR1020087023178A patent/KR20080106554A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-03-23 WO PCT/US2007/007241 patent/WO2007111998A2/en active Application Filing
- 2007-03-23 EP EP07753837A patent/EP1999260A2/en not_active Withdrawn
- 2007-03-23 CA CA002644621A patent/CA2644621A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-23 RU RU2008141977/13A patent/RU2008141977A/ru not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-05-26 US US13/116,947 patent/US20110230546A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015529654A (ja) * | 2012-08-02 | 2015-10-08 | アビオン インコーポレーテッド | Hpv感染に係わる癌の治療用組成物 |
JP2016190845A (ja) * | 2012-08-02 | 2016-11-10 | アビオン インコーポレーテッド | Hpv感染に係わる癌の治療用組成物 |
US10221418B2 (en) | 2012-08-02 | 2019-03-05 | EnhancedBio Inc. | Composition for treating cancer associated with HPV infection |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2007230995A1 (en) | 2007-10-04 |
US20110230546A1 (en) | 2011-09-22 |
US20090247607A1 (en) | 2009-10-01 |
US7956177B2 (en) | 2011-06-07 |
EP1999260A2 (en) | 2008-12-10 |
CA2644621A1 (en) | 2007-10-04 |
RU2008141977A (ru) | 2010-05-27 |
AU2007230995B2 (en) | 2011-08-11 |
WO2007111998A3 (en) | 2008-05-29 |
KR20080106554A (ko) | 2008-12-08 |
WO2007111998A2 (en) | 2007-10-04 |
MX2008012173A (es) | 2008-10-03 |
BRPI0709147A2 (pt) | 2011-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010522547A (ja) | HPV感染を処置するためのdsDNA組成物および方法 | |
US10273482B2 (en) | dsRNA for treating viral infection | |
KR20090016021A (ko) | Pcsk9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 | |
US20110230546A1 (en) | dsRNA COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HPV INFECTION | |
CN101410518A (zh) | 治疗HPV感染的dsRNA组合物和方法 | |
US20100183704A1 (en) | dsRNA FOR TREATING VIRAL INFECTION | |
AU2012202689A1 (en) | dsRNA for treating viral infection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100319 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100319 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20101221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20101221 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20120604 |