ES2525233T3 - Identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en tiempo real - Google Patents

Abstract

Un método para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénico que comprende: a) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno o más de los 13 genotipos de VPH de alto riesgo en la muestra; en la que los cebadores usados en la etapa a) tienen las secuencias SEC ID Nº: 1-8; b) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han demostrado ser positivas en la exploración de primera línea: - ensayos de PCR en tiempo Real TaqMan independientes para determinar la presencia de la carga viral de los tipos de VPH oncogénicos más comunes: tipos de VPH: 16, 18, 31, 45, grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 58, 67) en los que los cebadores usados en el ensayo de PCR en Tiempo Real TaqMan tienen las secuencias SEC ID 3, 4, 7, 8, 21-31, - 6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58 en el que los cebadores usados en el ensayo de PCR en tiempo Real de SYBR Green en la etapa b tienen las secuencias SEC ID 9-20.

Description

Identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en tiempo real

La presente invención se refiere a la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en Tiempo Real.

Antecedentes de la invención

En años recientes se ha establecido que la infección por papilomavirus humano oncogénico (VPH) es una condición necesaria para la carcinogénesis del cuello uterino (Zur Hausen, 2002). Los tipos de VPH de alto riesgo más frecuentes son VPH 16, -18, -31, -33, -45 y -58. Se considera que la infección persistente es el verdadero precursor de la progresión neoplásica (Kjaer et al., 2002). En la actualidad, sin embargo, las infecciones por VPH se controlan principalmente por los ensayos de detección de ADN de VPH cuantitativos que son frecuentemente no específicos de tipo y por lo tanto en el tratamiento clínico de los pacientes no distinguen entre infecciones persistentes y transitorias, siendo estas últimas extremadamente frecuentes en mujeres sexualmente activas. La detección viral no específica cualitativa representa por lo tanto un medio ineficaz de identificar mujeres en riesgo de desarrollar cáncer del cuello uterino (Ho et al, 1998; Jacobs et al, 2000). Existe por lo tanto la necesidad de establecer un marcador clínico adecuado capaz de distinguir infección persistente de transitoria para identificar mejor a las mujeres en riesgo de progresión neoplásica. Por lo tanto, la detección de VPH y técnicas de tipificación se han propuesto como un accesorio de, o un reemplazo para, el régimen de exploración citológica actual. Claramente el éxito de dichas estrategias dependerá del desarrollo de métodos de detección de VPH rápidos, fiables, sensibles y específicos aplicables en la situación clínica. Se ha propuesto la carga viral de VPH como un marcador sustituto de infección persistente (Ho et al, 1998) pero su uso en la identificación de mujeres en riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino (CC) sigue siendo controvertido (Josefsson et al, 2000; Lorincz et al, 2002; Dalstein et al, 2003; Gravitt et al, 2003; Moberg et al, 2004).

Se han desarrollado pocos ensayos de PCR cualitativos fiables para la medición de la carga de VPH y esto podría explicar la discrepancia en los resultados obtenidos en estudios previos. La falta de normalización de los métodos usados, particularmente la secuencia de VPH elegida para amplificar y el modo en que se determina el número de células por muestra, puede ser responsable de los resultados controvertidos (Moberg et al. 2004). Hay un gran interés en el uso de ensayos de VPH cuantitativos validados en estudios epidemiológicos para definir mejor la evolución de la infección por VPH y la progresión de la lesión. Se han desarrollado varios ensayos de PCR en tiempo real para medir la carga de ADN de VPH-16 ajustando la señal obtenida para ADN de VPH-16 con la cantidad de ADN celular calculado a partir de la amplificación de un gen humano (Swan et al., 1997, 1999; Josefsson et al., 1999, 2000; Ylitalo et al., 2000; Peitsaro et al., 2002; Nagao et al., 2002; Beskow y Gyllensten, 2002). Además de la carga viral, también se sabe que el estado de integración del genoma de VPH tiene implicaciones profundas para el pronóstico de pacientes. Sin embargo, aún no está claro si la carga viral o el estado de integración del VPH es un factor de riesgo para la progresión del cáncer del cuello uterino debido a resultados conflictivos obtenidos usando diferentes metodologías en estudios previos.

Además, varios estudios han mostrado que en la carcinogénesis del cuello uterino, se requiere la expresión de VPH de transcritos del oncogén E6 y E7 específicos para transformación e inmortalización celular. Además, se ha descubierto que la presencia de E6 y E7 aumenta con el aumento de la gravedad de la enfermedad del cuello uterino (Kraus et al., 2004, Molden et al 2005). En consecuencia, la expresión persistente de estos oncogenes puede actuar como un indicador de progresión a lesiones precursoras neoplásicas y cáncer invasivo (Sotlar et al., 1998). La detección de ARNm de E6 y E7 puede por lo tanto ser una herramienta válida adicional accesoria a la carga de ADN viral para identificar pacientes que tengan más probabilidad de experimentar progresión de enfermedad. Existe en la actualidad un ensayo de VPH disponible en el mercado, PreTect® VPH-Proofer (NorChip), que detecta transcritos de ARNm E6/E7 para VPH 16, 18, 31, 33 y 45 usando el método de NASBA (Molden et al 2007). Los datos iniciales, sobre el valor de pronóstico y especificidad de este método para enfermedad subyacente son prometedores (Kraus et al., 2004, Cuschieri et al., 2004, Molden et al 2005) pero el valor clínico de este método en comparación con la cuantificación de ensayos de ADN de VPH aún debe determinarse.

Se desvela un método de PCR en tiempo real para la determinación cuantitativa y cualitativa de VPH oncogénico para predecir el riesgo de infección por VPH que da como resultado carcinoma del cuello uterino en Gyllesten et al, documento WO 2004/031416 A. El método permite estimar la carga viral para la serie de tipos de VPH más frecuentemente hallados en diferentes grados de neoplasia del cuello uterino y tumores. La determinación de especie individual se realiza usando cebadores específicos para los transcritos de E6/E7 oncogénicos de los tipos de VPH. Se desvela un enfoque de PCR en Tiempo Real múltiple por el que pueden identificarse virus de hepatitis B por medio del colorante Sybr Green I en Sun Zhen et al, Genomics, 89(1), 151-159, 2007.

Finalmente un mejor entendimiento de los genotipos de VPH en circulación en áreas geográficas diferentes se ha vuelto muy importante, particularmente a la vista de la reciente introducción de vacunas de VPH bivalentes (tipos 16 y 18). Será de hecho necesario continuar con programas de exploración particularmente en áreas en las que se ha

descubierto que son prevalentes otros genotipos oncogénicos, ya que la inmunización protegerá solamente contra los tipos de VPH a los que se dirige la vacuna (Roden 2006 revisión).

Descripción de la invención

5 La presente invención proporciona un sistema que permite detectar uno o más genotipos de VPH de alto riesgo en muestras clínicas y determinar la actividad oncogénica viral por medio tanto de carga de ADN específica como de presencia de ARNm de E6/E7.

10 El sistema minimiza el número de reacciones paralelas realizadas para cada muestra y lo hace adecuado para su uso en exploración rutinaria de muestras de ensayo biológicas tales como muestras citológicas del cuello uterino, sangre periférica, orina, biopsias tisulares y similares.

La invención proporciona más particularmente un método para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos 15 de VPH oncogénico por medio de ensayos de PCR en tiempo real que comprenden:

1) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno más de 13 genotipos de VPH de alto riesgo en la muestra;

20 2) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han dado resultado positivo en la exploración de primera línea, incluyendo:

-

5 ensayos de PCR en tiempo Real de TaqMan independientes para determinar la presencia y la carga viral de los tipos de VPH oncogénicos más comunes: 16, 18, 31, 45, grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 25 58, 67). -6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58.

Descripción detallada de la invención

30 La invención proporciona un método para identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénico que comprende:

a) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I

35 independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno o más de 13 genotipos de VPH de alto riesgo en muestras clínicas; b) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han dado resultado positivo a la exploración de primera línea, incluyendo:

40 i) 5 ensayos de PCR en tiempo Real de TaqMan independientes para determinar la presencia y la carga viral de los tipos de VPH oncogénico más comunes: 16, 18, 31, 45 y grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 58, 67). ii) 6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58.

45 Se conocen ensayos de PCR en Tiempo Real en virología y se revisan por ejemplo en Mackay et al., 2002, Nucleic Acid Research, 30(6), 1292-1305.

Puede usarse cualquier muestra de ensayo clínica que puede obtenerse de tejidos, órganos o fluidos humanos en el 50 método de la invención.

Los cebadores para el primer ensayo de PCR en Tiempo Real de SYBR Green I (etapa a) se indican a continuación.

TABLA 1

GENOTIPO DIRECTO INVERSO VPH de alto CGTCCAAAAGGAAACTGAGC (SEC ID Nº: 1) GCACAGGGACATAACAATGG (SEC ID Nº: 2) riesgo

VPH-16 CGAAAGTATTTGGGTAGTCCACTTA (SEC ID CAGCTCTACTTTGTTTTTCTATAC ATATGG Nº: 3) (SEC ID Nº: 4)

VPH-18/45 TTTGAAAGGACATGGTCCAGAT (SEC ID Nº: CGTTCCGAAAGGGTTTCC (SEC ID Nº: 6) 5)

VPH-31 CCACCACATCGAATTCCAA (SEC ID Nº: 7) CGCCGCACACCTTCAC (SEC ID Nº: 8)

Los cebadores preferidos para PCR en tiempo Real (método de SYBR Green I) para la determinación de transcritos oncogénicos E6/E7 (etapa b-ii) se indican a continuación:

TABLA 2 GENOTIPO DIRECTO INVERSO

VPH 16 CAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATA (SEC ID GTTAATACACCTCACGTCGCAGTA (SEC ID Nº: 9) Nº: 10)

VPH 18 TTACAGAGGTGCCTGCGGT (SEC ID Nº: 11) TCTAAGTTTTTCTGCTGGATTCAAC (SEC ID Nº: 12)

VPH 31 CATTGGAAATACCCTACGATGAA (SEC ID Nº: 13) TTGACACGTTATACACCTTTGCAG (SEC ID Nº: 14)

VPH 33 TTGAACTACAGTGCGTGGAATG (SEC ID Nº: 15) CAGCGCCCTCAGATCGTT (SEC ID Nº: 16)

VPH 45 ACAAGACGTATCTATTGCCTGTG TATAT (SEC ID CCGCAGGCACCTCTGTG (SEC ID Nº: 18) Nº: 17) VPH 58 ATCGAATTGAAATGCGTTGAA (SEC ID Nº: 19) GCACAGCGCCCTCAGAT (SEC ID Nº: 20)

Finalmente, los cebadores preferidos para los ensayos de PCR en Tiempo Real TaqMan (etapa b-i) se indican en la tabla 3 de las Sección Experimental Nº 1 a continuación.

Sección experimental Nº 1

Materiales y métodos

Preparación de muestras del cuello uterino

Se raspó un material citológico del cuello uterino del endocervix usando un movimiento rotatorio con un Cytobrusch (Digene Cervical sampler, Digene Corp., Gaithersburg, MD, Estados Unidos) y después se introdujo en dispositivos de recogida y se aclaró en un vial que contenía 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). Se refrigeraron las muestras de ensayo y se transportaron al laboratorio de microbiología y virología en un periodo de 1 hora en hielo húmedo donde se centrifugaron a 1800 rpm durante 10 minutos, y se almacenaron como sedimentos celulares divididos a -70 ºC antes de la extracción de ácido nucleico y detección de VPH. Se compararon en este estudio dos métodos de extracción diferentes (manual y automático). El método manual incluye extracción orgánica (fenol-cloroformo) de las muestras. Brevemente, los sedimentos celulares se resuspendieron en 450 µl de solución de lisis que contenía KCI 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 2,5 mM, Tween 20 0,5 % (vol/vol), y Nonidet P-40 0,5 % (vol/vol). Las muestras se incubaron a 95 ºC durante 30 minutos, se mezclaron durante 2 minutos y se digirieron con 50 µl de proteinasa K (20 µg/ml). Después de incubación durante una noche a 56 ºC, las muestras se calentaron a 95 ºC durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. Se realizó extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con isopropanol de alta salinidad como se ha descrito previamente (18), y se resuspendió el material purificado en un volumen final de 200 µl de tampón AE (Tris-HCl 5 mM -EDTA 0,5 mM). Se usó un método automático, un kit comercial para extracción de ADN basado en la unión de ácido nucleico con membrana de sílice (kit de sangre 96 robótico de Nucleospin Macherey-Nagel). El formato de placa de 96 pocillos del kit de Nucleospin Macherey-Nagel disponible en el mercado permite la integración en la estación de trabajo de un manipulador de líquidos robótico (Biomeck 2000, Beckman). Para permitir una automatización adicional del procedimiento se extrajo un conjunto de 48 muestras citológicas del cuello uterino congeladas previamente ensayadas con respecto a VPH16 (24 muestras VPH-16 positivas y 24 VPH-16 negativas), cada uno dividido en dos sedimentos de alícuotas iguales, por los dos métodos.

Brevemente, se añadieron 200 µl del sedimento celular resuspendido, 25 µl de proteinasa K y 200 µl de tampón de lisis de Nucleospin BQ1 entre sí y se agitaron vorticialmente durante 30 segundos.

Para maximizar la recuperación de ADN de muestras difíciles (es decir muestras que contienen mucha hemoglobina) la muestra se incubó después durante al menos 1 hora a 56 ºC. Después de incubación, se añadieron 200 µl de etanol del 96 al 100 % a cada muestra y las mezclas se volvieron a agitar vorticialmente.

La placa de Nucleospin se colocó sobre el colector de vacío, y las muestras se distribuyeron a los pocillos apropiados. Se aplicó un vacío de 40 kPa durante 5 minutos o hasta que las muestras se habían extraído completamente a través del filtro. Cada pocillo se lavó añadiendo 300 µl de tampón de lavado de Nucleospin B5. Se aplicó después un vacío de 40 kPa durante 5 minutos, y se descartó el flujo continuo. Después se añadieron 600 µl de tampón de Nucleospin B5 a cada pocillo, y el vacío se aplicó a 40 kPa durante 3 minutos. El vacío se aplicó a 60 kPa durante 10 minutos adicionales para retirar cualquier etanol residual. El ADN se eluyó añadiendo 200 µl de tampón de elución de Nucleospin BE directamente a la membrana de sílice en cada pocillo. La placa se incubó con esta solución a temperatura ambiente durante 5 minutos, y después se aplicó un vacío de 40 kPa durante 10 minutos para eluir el ADN.

Cuantificación de ADN de VPH por ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real

Se prepararon plásmidos que contenían secuencias de VPH-16, -18, -31, -33, -45, -52, -58 y -67 clonando a partir de productos de PCR de muestras clínicas y se preparó una curva patrón para cada ensayo. Se clonaron productos de PCR en el plásmido pCRII usando el kit de clonación TOPO-TA (Invitrogen Corp., San Diego, Calif.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos con VPH integrados se purificaron con el kit Maxiprep de plásmidos Qiagen (Qiagen, Inc.), se secuenciaron y se usaron para cuantificar el ADN de VPH-16, -18, -31, -33, -45, -52, -58 y -67.

Cinco ensayos de PCR de TaqMan cuantitativa en tiempo real: VPH-16, 18, 31, 45 y grupo 33 (los genotipos 33, 52, 58 y 67 son indistinguibles entre sí). Para normalizar la carga viral de VPH con respecto al número de células en la muestra, también se usó un sistema de detección cuantitativo, un gen de CCR5 humano de una única copia (Broccolo et al., 2005). Las muestras del cuello uterino difieren ampliamente en la cantidad de ADN presente. El ADN de las muestras de cuello uterino se consideró adecuado para la determinación de la carga viral de VPH si el número de copias de CCR5 humano para la reacción era mayor de 2 x 103 (correspondiente a 103 células para la reacción). Se realizó amplificación y detección usando tecnología TaqMan y un dispositivo ABI Prism (7900 SDS; Applied Biosystems, Forster City, CA). Todas las reacciones se optimizaron para obtener la mejor cinética de amplificación en las mismas condiciones de ciclación (2 minutos a 50 ºC, 15 minutos a 95 ºC y 40 ciclos de 15 segundos a 95 ºC y 1 minuto por ciclo a 60 ºC) y composición de la mezcla de reacción. Todas las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 µl que contenía dATP, dCTP y dGTP 100 mM (cada uno); dUTP 200 mM; MgCl2 4 mM; tampón A de TaqMan 1 X (Applied Biosystems Foster City, Calif); 0,625 U de AmpliTaq Gold, 0,25 U de uracil-N-glucosilasa; y 10 µl de molde de ADN. Se usaron tubos, que contenían todos los componentes de PCR pero sin ADN molde (reacción de NTC indicada), para asegurar que la mezcla de reactivos estuviera sin contaminación. Se usaron cebadores y sondas específicos de diana a las concentraciones finales de 300 y 200 nM, respectivamente. Los resultados del experimento usando estas condiciones se muestran para VPH-16, VPH-33 y 58 en la figura 1 y 2, respectivamente. El principio de la PCR en tiempo real se ha descrito en otra parte (Heid, et al. 1996). Brevemente, la señal de fluorescencia (Rn) generada por la degradación de la sonda hibridada se calcula automáticamente por un algoritmo informático que normaliza la señal de emisión indicadora en primer lugar; dividiéndola por la emisión de un colorante de control (ROX) presente en la mezcla de PCR y después restando todas las señales de fondo generadas en los primeros 15 ciclos de PCR. Después, el algoritmo calcula el ciclo de umbral (Ct) al que cada amplificación de PCR alcanza un valor umbral (habitualmente establecido en 10 veces la desviación típica de la señal de línea basal) que es inversamente proporcional al número logarítmico de copias diana presentes en la muestra. Se dibujó una curva patrón usando diluciones en serie de copias de diana de entrada conocidas (eje x) frente a los valores de Ct correspondientes (eje y) usando el método de ajuste de mínimos cuadráticos.

Diseño de cebadores y sondas

Las secuencias diana para el grupo de VPH-16 y 33 están en la fase abierta de lectura E1 (ORF); las secuencias para VPH-18 y 45 están en la ORF E6, mientras que las secuencias para VPH-31 está en la ORF E2. Los cebadores y sondas de TaqMan (Tabla 3) se diseñaron usando software Primer Express (PE Biosystem, Foster City, Calif.).

TABLA 3. Cebadores y sondas de hibridación marcadas con fluorescencia usados para la cuantificación de ADN de VPH-16, -18, -31, -33, -45, -52, -58 y -67 por PCR en tiempo Real.

Diana (Número de Referencia)

Secuencia (5’ a 3’) Marcadores (5’, 3’) Fluoróforo

VPH-16 (NC_001526)

F16 (SEC ID Nº: 3) R16 (SEC ID Nº: 4) Sondaa 16 (SEC ID Nº: 21): 5’-AGTGAATGTGTAGACAATAA-3’ VIC, ninguno

VPH-18 (AY863183)

F18 (SEC ID Nº: 22): 5’-ttttgctgtgcaaccgatt-3’ R18 (SEC ID Nº: 23): 5’agtgccagcgtactgtattgtg-3’, Sondaa 18 (SEC ID Nº: 24): 5’-CGGTTGCCTTTGGCTT-3’ FAM, ninguno

VPH-31 (J04353)

F31 (SEC ID Nº: 7) R31 (SEC ID Nº: 8) Sondab 31 (SEC ID Nº: 25): 5’-CCTGCGCCTTGGGCACC-3’ VIC, TAMRA

VPH-45 (EF202167)

F45 (SEC ID Nº: 26): 5’-CAGTACCGAGGGCAGTGTAA-3’ R45 (SEC ID Nº: 27): 5’-cgtctgcgaagtctttcttg-3’ Sondaa 45 (SEC ID Nº: 28): 5’acatgttgtgaccaggc-3’ VIC, ninguno

VPH-33/52/58/-67 (M12732)

Grupo F 33 (SEC ID Nº: 29) 5’-GGACGTGGTGCAAATTAGATTT-3’ grupo R 33 (SEC ID Nº: 30) 5’-GTGCTGATATTTCCTCCATGGT-3’ Sondaa grupo 33 (SEC ID Nº: 31) 5’-AGGAAGAGGACAAGGAA-3’ FAM, ninguno

aSonda MGB: unión con el surco menor; bsonda TAMRA

Como se muestra en la tabla 3, se utilizaron dos tipos de sondas de hibridación fluorogénicas: una sonda con doble marcaje (en el ensayo para cuantificar VPH-31) y cuatro sondas con marcajes individuales (en los ensayos para cuantificar el grupo de VPH-16, 18, 45 y 33). Las sondas con marcaje individual tienen un agente de unión en el

surco menor (MGB) y un interruptor no fluorescente en el extremo 3’ de la secuencia de ADN mientras que las sondas con marcaje doble tienen un interruptor fluorescente (TAMRA) en el extremo 3’ de la secuencia de ADN. Las sondas de VPH-18 y grupo 33 se marcaron en el extremo 5’ de la secuencia de ADN con un fluoróforo 5’ (FAM), mientras que los VPH-16, 31 y 45 con el fluoróforo 5’ (VIC). Finalmente, todas las secuencias halladas en GenBank para cada genotipo de VPH estudiado se alinearon y se eligieron cebadores y sondas para evitar el desapareamiento entre variantes; el alineamiento se realizó para seleccionar una región altamente conservada para cada virus. Cada cebador y sonda seleccionados se comprobó frente al alineamiento para asegurar que cada cebador y sonda se dirigía a una región conservada en los alineamientos respectivos.

Tipificación de VPH por el sistema de GP+-PCR y análisis de INNO-LIPA

Se ensayó un total de 296 muestras con respecto a la presencia de VPH usando dos conjuntos de cebadores de PCR GP5+/GP6+ (GP+-PCR); el límite de sensibilidad para todos los genotipos estudiados fue de 104 copias por reacción (datos no mostrados). Los tipos de VPH detectados usando cebadores consenso se identificaron secuenciando el producto de PCR usando un kit de terminador de didesoxi marcado con fluorescencia (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido). Las secuencias generadas se compararon con secuencias de VPH en GeneBank usando el programa Fasta (manual del programa para el paquete de Wisconsin; Genetics Computer Group, Madison, Wis.). A continuación, también se ensayó un total de 15 muestras que quedaban dentro del intervalo de sensibilidad del sistema GP+-PCR pero que se detectaron solamente por ensayos de PCR en tiempo real, por PCR usando los conjuntos de cebadores consenso MY09/MY11 (MY-PCR); las condiciones de los sistemas de GP+-PCR y MY-PCR se realizaron como se ha descrito previamente (Jacobs et al., 1995; de Roda Husman et al., 1995; Qu et al., 1997). Posteriormente, las muestras MY-PCR positivas se identificaron secuenciando el producto de PCR. Se ensayó otro conjunto de 31 muestras con respecto a la presencia de VPH usando el ensayo de Genotipificación de VPH INNO-LiPA v2 test (Innogenetics, Gante, Bélgica), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo de Genotipificación de VPH INNO-LiPA VPH v2 permite la detección específica de 24 tipos de VPH, concretamente los tipos -6, -11, -16, -18, -31, -33, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -56, -58, 59, -66, -68, -70 y -74, incluyendo múltiples combinaciones. El ensayo se basa en la amplificación por PCR de un fragmento de 65 pb dentro de la región L1 del genoma de VPH usando los cebadores biotinilados de SPF10 de amplio espectro. Se hibridaron posteriormente amplicones biotinilados con sondas oligonucleotídicas específicas de tipo de VPH que se inmovilizan como líneas paralelas en tiras de membrana. Después de hibridación y lavado riguroso, se añadió fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina y se unió con cualquier híbrido biotinilado formado. La incubación con cromógeno de BCIP/NBT produce un precipitado púrpura y los resultados pueden interpretarse visualmente (Kleter et al., 1999).

Análisis estadístico

La precisión, definida como el nivel de aproximación de un valor medido a un valor de referencia tomado como un “patrón oro”, se estimó calculando las diferencias aritméticas entre el número de copias de ADN evaluado por el ensayo de PCR en tiempo real y el número teórico inferido a partir de la espectroscopia de UV. La importancia de los desplazamientos sistemáticos se evaluó por un ensayo de t de Student de muestras relacionadas y se ajustó por análisis de covarianza, cuando fue necesario. La repetibilidad y reproducibilidad se estimaron calculando el coeficiente de variación (CV) (la relación entre la desviación típica y la media de mediciones repetidas) en condiciones diferentes. La repetibilidad y producibilidad de los ensayos de TaqMan se evaluaron calculando los CV de los números de copias determinados experimentalmente (180 mediciones para cada ADN de referencia). La diferencia entre las curvas de referencia se evaluó por análisis de covarianza. La normalización de la carga viral específica de tipo de VPH se calculó como:

en la que VL es el número de genomas de VPH por cada 104 células (correspondiente a 2 x 104 copias de CCR5), CnVPH es el número de genomas de VPH y (CnCCR5/2) es el número de células (correspondiente al número de copias de CCR5 x 2).

Se realizó un análisis estadístico usando el paquete estadístico SPSS (SPSS, Inc., Chicago, III.). El estadístico kappa se calculó para evaluar el acuerdo entre las tasas de positividad de VPH. Estadísticos kappa menores de 0,4 representan un acuerdo demasiado escaso, los valores de 0,4 a 0,8 representan acuerdo de moderado a bueno, y los valores de más de 0,8 representan un acuerdo excelente.

Resultados

Fundamento y diseño del sistema de tipificación

El presente sistema de tipificación se diseñó para permitir la cuantificación de la carga viral para los genotipos de VPH de alto riesgo más frecuentemente asociados con el carcinoma y neoplasia intraepitelial del cuello uterino. Aunque la prevalencia de los tipos de VPH oncogénicos varía entre estudios, en el diseño de este sistema de tipificación los inventores se han centrado en los VPH-16, -18, -31, -33, -45, -52, -58 y -67. Se diseñaron cinco reacciones de exonucleasa 5’ fluorescentes por PCR cuantitativa independientes y se optimizaron usando cuatro alícuotas separas de la misma muestra de ensayo de ADN. Las posiciones de los cebadores y sondas seleccionados para estos ensayos se muestran en la Tabla 3.

Estrategias en el diseño de sondas y cebadores

Para maximizar la sensibilidad, las dianas de ADN para amplificaciones por PCR en tiempo real fueron <100 pb y la secuencia de la sonda se eligió para que estuviera cerca del cebador directo 3’ (a no más de 5 nt). Para reducir el número de ensayos, los cebadores y sondas se eligieron para cuantificar en el mismo tubo de reacción VPH-33, y 52, -58 y -67 (ensayo de TaqMan de VPH-33/-52/-58/-67); se eligió la secuencia del genotipo VPH-33 como referencia para el ensayo usado para amplificar VPH-33 y -52, -58, -67 (tabla 4). Por lo tanto, el ensayo de TaqMan del grupo de VPH-33 permite la cuantificación de VPH-33, -52, -58, -67 o combinaciones de estos. Se seleccionaron sondas de MGB más cortas para la detección de VPH-33 y/o -52, -58, -67 así como para VPH-16, 18, 31 y 45. Se descubrió que esto era necesario para evitar la presencia de desapareamientos entre las secuencias de VPH-33/52/-58/-67 así como polimorfismos dentro de secuencias de diferentes variantes de VPH-16, 18, 31 y grupo 33. Por el contrario, para VPH-31 también se eligió una sonda con marcaje doble más larga ya que no se descubrió ningún desapareamiento en la sonda entre los subtipos de VPH-31 presentes en GenBank. La presencia y localización de desapareamientos en el ensayo usado para amplificar VPH-33, -52, -58, -67 se presentan en la tabla 4. Además, se tuvo especial atención en la elección de secuencias cuando se descubrió que estaban presentes uno o más desapareamientos; en particular se evitó tener tanto en sondas como en cebadores polimorfismos cerca dentro la misma secuencia y polimorfismos en el extremo 5’.

Tabla 4. Localización de desapareamientos para VPH-52/-58/-67 usando VPH-33 como secuencia de referencia

Genotipos

Presencia de desapareamientos

Cebador directo

sonda Cebador inverso

VPH-33 frente a -52

- - 1

VPH-33 frente a -58

2 - 1

VPH-33 frente a -67

1 - 0

Rango dinámico y sensibilidad y especificidad analítica

Para generar curvas de referencia para la determinación de cargas virales de VPH-16, -18, -31, -33, -45, -52, -58 y 67 (cuantificación), se cuantificaron plásmidos por espectroscopia de UV. A continuación, se prepararon tres conjuntos distintos de diluciones 10 veces para cada construcción y se amplificaron por PCR en el mismo ciclo del sistema detector de secuencia 7900 ABI Prism. Un rango dinámico amplio caracterizó ambos ensayos, diferenciando entre 100 y 106 equivalentes de genoma de VPH/reacción. Para todos los sistemas generados, se obtuvo una relación lineal fuerte entre el logaritmo del número de copias de partida y los valores de Ct (r2 = 0,99) (Figura 1).

Para imitar mejor la situación en la que se extrae ADN de células, los inventores realizaron algunos experimentos añadiendo ADN genómico negativo para VPH humano (100 ng de ADN de células del cuello uterino correspondiente a 15.000 equivalentes de genoma celular) a una amplia serie de ADN molde de VPH-16 (100 a 106 equivalentes de copias de ADN). Como se muestra en la tabla 1, la sensibilidad y el rendimiento del ensayo no se vieron afectados por la presencia de 100 ng de ADN genómico humano. Se construyeron curvas patrón que variaban de 101 a 106 copias por muestra para cada uno de los tipos de VPH, o grupos de tipos de VPH, basándose en 12 mediciones independientes para cada número de copias de VPH. Se obtuvieron resultados similares para todas las otras amplificaciones (datos no mostrados). Por el contrario, los inventores observaron que la sensibilidad se veía afectada cuando se añadía un exceso de ADN genómico negativo para VPH humano (1 µg de ADN de células del cuello uterino correspondiente a 150.000 equivalentes de genoma celular) a cada patrón de referencia (101 a 103 equivalentes de copia de ADN). Para resolver este problema los inventores aumentaron en 5 segundos por etapas cada etapa de hibridación/extensión para todos los ciclos (tabla 5). Sin embargo, cuando la concentración de ADN genómico humano fue mayor (>1 µg) la muestra se diluyó para tener una concentración final no mayor (igual o menor que) 1 µg/reacción (no mayor de 1 µg para reacción).

Tabla 5. Sensibilidad para cada patrón de referencia en presencia y ausencia de ADN genómico

Ensayos de PCR TaqMan

En ausencia de aumento de la hibridación/extensión En presencia de aumento de la hibridación/extensión

Patrón de referencia

Plásmido en ausencia de ADN humano Plásmido diluido en 100 ng de ADN humano Plásmido diluido en 1 µg de ADN humano Plásmido diluido en 100 ng de ADN humano Plásmido diluido en 1 µg de ADN humano

Nº de copias/reacción

Ct Media Ct Media

Ensayo TaqMan para VPH-16

101

36,41 36,58 39,86 36,51 36,70

102

33,10 33,18 34,05 33,15 33,38

103 Ensayo TaqMan para VPH-18

29,80 29,86 30,15 29,81 29,85

101

35,53 35,65 39,95 36,55 35,89

102

32,20 32,26 34,05 33,21 32,48

103 Ensayo TaqMan para VPH-45

28,90 28,98 30,15 29,92 29,85

101

36,60 36,82 40,00 36,81 36,82

102

33,28 33,31 30,84 33,30 33,15

103 Ensayo TaqMan para VPH-31: VPH-31

29,98 30,05 31,02 29,96 29,91

101

36,41 36,81 39,86 36,75 36,92

102

32,73 33,52 34,05 33,50 33,58

103 Ensayo TaqMan para grupo VPH33: VPH-33

29,32 30,11 30,15 30,10 30,15

101

35,63 35,98 39,86 36,00 35,98

102

32,29 32,36 34,05 32,35 32,45

103 VPH-52

29,01 29,12 30,15 29,08 29,15

101

35,72 36,01 39,91 35,81 36,02

102

32,40 32,54 34,15 33,45 32,68

103 VPH-58

29,02 29,12 30,25 29,11 29,23

101

36,63 36,91 40,00 36,68 36,82

102

33,38 33,62 34,85 32,89 33,08

103 VPH-67

30,01 30,23 31,38 29,46 29,75

101

35,63 36,81 39,96 35,63 36,81

102

32,29 33,32 34,21 32,29 33,32

103

29,01 30,11 30,36 29,01 30,11

La especificidad se ensayó determinando la capacidad de las combinaciones de sondas y cebadores para diferenciar plásmidos con diferentes tipos de VPH. No se observó ninguna señal específica para los ensayos de

5 PCR en tiempo real independientes (datos no mostrados). Además, se comparó el perfil cinético de los ensayos para la amplificación de los genotipos de VPH-18 y -45; no se encontraron diferencias significativas entre las representaciones generadas para las dos construcciones (F = 1,30 [P = 0,23] y 1,35 [P = 0,22] para la ordenada en el origen y la pendiente de las representaciones, respectivamente) (Figura 2A); se obtuvieron resultados similares para la amplificación de los genotipos de VPH-33, -52, -58 y -67 (Figura 2B).

Precisión, repetibilidad y reproducibilidad

A continuación, los inventores midieron el error de precisión, la variabilidad intra e interexperimental para cada ensayo de PCR de TaqMan (tabla 6). En la tabla 6, los inventores mostraron los datos obtenidos solamente con el patrón de referencia de VPH-16, -18,-31 y -33; sin embargo, se obtuvieron resultados similares para el patrón de referencia que contenía otros genotipos de VPH detectados por dos ensayos (VPH-45 y VPH-52, -58 y -67).

Extracción de ácido nucleico automática por Biomeck 2000

Para permitir la automatización adicional del procedimiento se extrajo un conjunto de 48 muestras de ensayo citológicas del cuello uterino congeladas (cada una dividida en dos sedimentos obtenidos después de centrifugación de dos volúmenes iguales de muestra), por dos métodos diferentes: extracción manual (protocolo de fenolcloroformo) y extracción automática (usando un kit de extracción integrado en una estación de trabajo de un manipulador de líquidos robótico). Todas las etapas (mezcla de reactivos, incubación, lavado y elución) excluyendo la carga de la muestra y la lisis del sedimento se realizaron por una estación automática (instrumento Biomeck 2000).

Se llevaron a cabo ensayos de PCR en tiempo real para comparar la calidad del ADN obtenido por el método de extracción de Machery Nagel con el recuperado por la extracción de fenol-cloroformo clásica. La cinética de las representaciones de amplificación no mostró pruebas de la presencia de inhibidores en el ADN extraído por ambos métodos (datos no mostrados). Se cargaron veinticuatro muestras fuertemente positivas para VPH-16 y 24 negativas para VPH en el instrumento Biomeck 2000.

Después de PCR en tiempo real para VPH-16, ninguna de las 24 muestras negativas proporcionó una señal positiva, mientras que las 24 muestras positivas proporcionaron buenos resultados de representación de amplificación lo que indica que no ha tenido lugar ninguna contaminación cruzada durante el procedimiento automático (datos no mostrados).

Ensayos de PCR en tiempo real comparados con el sistema de secuenciación/GP+-PCR y Genotipificación de VPH por INNO-LiPA.

Se ensayó un total de 296 muestras en paralelo usando el sistema de GP+-PCR y de secuenciación y ensayos de TaqMan. De estas, 250 tuvieron resultado negativo para GP+-PCR y 46 positivo para GP+-PCR. Es importante que para evitar problemas asociados con el límite de la sensibilidad solamente se consideraron muestras que eran TaqMan positivas con >104 copias/reacción. Además, se extrajo ADN por el método manual y los ensayos de PCR n tiempo real se realizaron en una configuración de doble tubo. En general, de las 46 muestras positivas por sistema de GP+-PCR y secuenciación, 2 muestras de ensayo (una de VPH-18 y una de VPH-31) no se confirmaron como negativas por ensayos de PCR tiempo Real (Tabla 7).

Tabla 7. Comparación de resultados obtenidos por sistema de GP+-PCR/secuenciación e INNO-LiPA con ensayos de PCR en tiempo Real

Método utilizado (nº de muestras analizadas) Tipos de VPH identificados VPH-16 VPH-31 VPH-18/-45 Grupo de VPH-33

GP+-PCR y secuenciación (46)a 22 10 6 8

INNO-LiPA (31) 10 10 3 8

Nº de casos no confirmados por ensayo de TaqMan 0/32 (0) 2/20b 1/9c 1/16d

a

Para la comparación con el ensayo de TaqMan se consideraron solo las muestras con resultados de >104 copias/reacción; buna de 10 muestras VPH-31 positivas por GP+-PCR y de 10 muestras VPH-31 positivas por INNO-LiPA no se confirmaron por ensayo de TaqMan; cuna de las cinco muestras VPH-18 positivas por GP+-PCR no se confirmaron por ensayo de TaqMan; duna de las cuatro muestras VPH-58 positivas por INNO-LiPA no se confirmaron por ensayo de TaqMan.

Además, 15 de las 250 muestras negativas para GP+-PCR fueron positivas por el ensayo de TaqMan con una carga viral > 103 copias/reacción. De estas, seis muestras (una para VPH-16, una para VPH-31 y cuatro para el grupo de VPH-33) dieron resultados positivos por el ensayo de TaqMan con una carga viral > 104 copias/reacción (hasta el límite de sensibilidad de la GP+-PCR) y nueve muestras (cinco para VPH-16, dos para VPH-18, una para VPH-31 y tres para el grupo de VPH-33) con una carga viral de 103 a 104 copias/reacción. Todas las muestras negativas para GP+-PCR que resultaron positivas por los ensayos de TaqMan con una carga viral > 104 copias/reacción se conformaron por PCR con conjuntos de cebadores MY09/MY11, como se muestra en la tabla 8.

Tabla 8. Visión de conjunto de casos discordantes confirmados por MY-PCR

Nº de Muestra GP+-PCR MY-PCR Carga viral por ensayos de PCR en tiempo Real

VPH-16 VPH-31 VPH-18/-45 Grupo de VPH-33

Nº 1

- + (16) 10.050 0 0 0

Nº 2

- + (31) 10.120 0 0 0

Nº 3

- + (52) 0 10.120 0 0

Nº 4

- + (52) 0 0 0 46.000

Nº 5

- + (52) 0 0 0 37.800

11

Nº de Muestra GP+-PCR MY-PCR Carga viral por ensayos de PCR en tiempo Real

Nº6 -+(58) 0 0 0 12.650

En general, de las 296 muestras de ensayo ensayadas en paralelo usando -GP+-PCR y sistema de secuenciación y ensayos de TaqMan, 288 de 296 ((97,3 %), = 0,91, IC 95 % = 0,86 a 0,96) generaron resultados concordantes con respecto a la presencia o ausencia de VPH oncogénico por los dos ensayos. Los inventores descubrieron un grado

5 excelente de acuerdo para VPH-16 (solamente un caso discordante) entre los resultados revelados por la PCR en tiempo real y los determinados por la PCR convencional.

Finalmente, de 31 muestras positivas por INNO-LiPA positivas solamente dos muestras (una VPH-31 y una VPH-58) no se confirmaron por el ensayo de TaqMan (tabla 8). En general, solamente un total de 4 (5 %) de 77 con 10 resultados positivos por GP+-PCR o análisis de INNO-LiPA no se confirmaron por ensayos de PCR en tiempo real.

Sección experimental Nº 2

MATERIAL Y MÉTODOS 15

Pacientes y muestras clínicas

El estudio se realizó en un total de 597 pacientes. De estas 472 mujeres fueron atendidas en la clínica ambulatoria ginecológica en el Hospital San Gerardo, Monza y tenían lesiones cancerosas o precancerosas del cuello uterino 20 patológicamente demostradas: 105 células escamosas atípicas de importancia indeterminada (ASCUS), 200 lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo (L-SIL), 152 de grado alto (H-SIL) y 15 cáncer del cuello uterino (CC). La edad de estas pacientes variaba entre 19 y 76 años (mediana 37). Se descubrió que 125 muestras del cuello uterino, obtenidas de mujeres de edad entre 20 y 65 años (mediana 50), tenían citología normal. Todas las muestras de ensayo se recogieron entre febrero de 2005 y diciembre de 2006. Las mujeres participantes

25 proporcionaron el consentimiento informado y el estudio se aprobó por el comité de ética local.

Examen citológico e histológico de las muestras

Se realizó un ensayo de Pap en todas las participantes de la cohorte durante la investigación clínica. Los frotis se

30 clasificaron en cinco categorías ordenadas (negativo, ASCUS, L-SIL, H-SIL o CC). Se llevó a cabo una colposcopia en pacientes con un frotis de Pap patológico y se tomó una biopsia de perforación de áreas sospechosas del cuello uterino. Todas las evaluaciones histológicas se realizaron por un patólogo experto. Si los hallazgos de la colposcopia eran normales, no se tomaba ninguna biopsia y el caso se clasificaba como ausencia de neoplasia intraepitelial del cuello uterino (CIN). Cuando hubo discrepancias entre los hallazgos histológicos y citológicos, el peor resultado se

35 consideraba el diagnóstico final.

Procesamiento de muestras y extracción de ADN

Se realizó un procesamiento de muestras como se describe en el material y métodos de la sección experimental Nº

40 1. La extracción de ADN se realizó por un kit comercial para extracción de ADN basado en la unión de ácido nucleico con una membrana de sílice (kit de sangre de robot de Nucleospin 96 de Macherey-Nagel). El formato de placa de 96 pocillos del kit de Nucleospin de Macherey-Nagel disponible en el mercado permite la integración en la estación de trabajo de un manipulador de líquidos robótico (Biomeck 2000, Beckman) como se indica en el material y métodos de la sección experimental Nº 1.

Cuantificación de ADN de VPH por ensayos de PCR cuantitativa en tiempo Real

Se cuantificaron cargas de ADN de VPH de alto riesgo mediante el uso de cinco ensayos de PCR de TaqMan cuantitativos en tiempo real independientes: VPH-16, 18, 31, 45 y grupo 33. Se describen detalles acerca de estos

50 ensayos en la sección Nº 1. También se usó un sistema de detección cuantitativo de CCR5 para cuantificar el ADN genómico humano en cada muestra y normalizar la carga viral (Broccolo et al., 2005). La carga viral se expresa como número de copias para 104 células.

Análisis estadístico

55 Se usó el ensayo de Tendencia de Cochran-Armitage para detectar una tendencia creciente en la proporción de muestras positivas para VPH de mujeres con citología normal con respecto a las de CC. Se usó el ensayo de χ2 para analizar la significación de la diferente prevalencia de genotipos de VPH en muestras del cuello uterino de pacientes y controles.

60 Se realizaron después análisis estadísticos adicionales para evaluar: i) la diferencia en la carga viral de VPH oncogénico entre mujeres con citología normal y mujeres con lesiones precancerosas y cancerosas del cuello

uterino; ii) la asociación entre la carga viral de VPH y la gravedad de las lesiones del cuello uterino; iii) la asociación de la carga de VPH con el riesgo de desarrollar lesiones cancerosas; iv) la relación entre la carga viral y la gravedad de la enfermedad con respecto a sensibilidad y especificidad para displasia de alto grado.

Se usó el ensayo de t de Student de dos colas para evaluar la importancia de las diferencias en la carga de VPH oncogénico entre mujeres con citología normal (grupo de referencia) y mujeres con lesiones precancerosas y cancerosas del cuello uterino (grupo de ensayo). Se calculó para cada mujer la carga viral total, definida como la suma de la carga viral para cada tipo de virus cuando se descubrió que estaban presentes múltiples virus.

Se usó un índice de cograduación (índice γ de Goodman y Kruskall) para variables ordinales. Este ensayo también se aplicó para medir el grado de asociación (cograduación) entre los niveles de ADN para cada genotipo y la gravedad de las lesiones. El índice de Goodman y Kruskall (γ) menor de 0,3 representa una asociación de normal a escasa, valores de más de 0,3 representan una buena asociación. El nivel de significación estadística se estableció en 0,05 y se usó SPSS versión 13 para todos los análisis.

Para determinar la asociación entre el riesgo de enfermedad del cuello uterino y carga viral de VPH, se estimaron las relaciones de probabilidad ajustadas con respecto a la edad (AOR) por regresión logística politómica. Los umbrales de carga viral específicos de tipo se definieron usando los valores medianos de la carga viral. Estos valores se usaron posteriormente para determinar la AOR y los intervalos de confianza (IC) al 95 %. La AOR y los IC 95 % se estimaron para categorías de citología del cuello uterino, ajustando con respecto a los factores de confusión potenciales de la edad.

Se generó una curva de características operativas del receptor (ROC) no paramétrica para cada estado histológico usando Stata7. Se calcularon la sensibilidad y especificidad clínicas en cada punto de corte así como el porcentaje de sujetos con clasificación correcta. Se comparó el método de clasificación ordinal, basado en la carga viral categórica, con el método de clasificación dicotómico mediante un ensayo con respecto a la igualdad de las áreas bajo las curvas de ROC. Se consideraron tanto la carga viral total como la carga viral de VPH específico. Para cada observación, se establecieron los hallazgos histológicos y citológicos como normales o positivos y se compararon con el valor de clasificación de 0= “negativo”, 1= “Baja carga viral” y 2= “Alta carga viral” considerando como puntos de corte la ausencia de genomas de VPH, una carga viral equivalente de genomas de VPH por célula menor o mayor que la mediana del valor, respectivamente.

Los valores de carga viral de VPH obtenidos de los ensayos por duplicado se promediaron para los cálculos. La normalización de la carga viral específica de tipo de VPH se calculó como:

en la que VL es el número de genomas de VPH por cada 104 células (correspondiente a 2 x 104 copias de CCR5, CnVPH es el número de genomas de VPH y CnCCR5/2 es el número de células.

Resultados

Prevalencia de los seis genotipos oncogénicos en muestras del cuello uterino patológicas y normales

Se usaron ensayos de cualificación de PCR en tiempo real para investigar la frecuencia de la infección por VPH específica de tipo en un área del norte de Italia. Se descubrieron resultados positivos para uno o más de los ocho genotipos de VPH oncogénicos estudiados en 288 (61 %) de 472 y en 32 (26 %) de 125 respectivamente de las muestras de cuello uterino patológicas y normales analizadas (Tabla 9). En muestras patológicas la prevalencia general de VPH-16, -31, -18, -45 y grupo -33 (incluyendo 33, 52, 58, 67) fue de 24 %, 23 %, 12 %, 1 %, 29 %, respectivamente. Como se esperaba la prevalencia de los tipos de VPH estudiados fuer notablemente menor en muestras normales con respecto a cada categoría patológica analizada (p< 0,05) (Tabla 9). La presencia de genotipos de VPH estudiados fue progresivamente mayor en pacientes con ASCUS, L-SIL, H-SIL y CC en comparación con mujeres con citología normal para todos los genotipos (tendencia de P <0,05) excepto para tipos pertenecientes al grupo de VPH-33 (Tabla 7). En general, se detectaron 417 ensayos positivos para ADN de VPH oncogénico en pacientes con lesiones precancerosas y cancerosas; de estos 115 (27,6 %) eran positivos para VPH16, 55 (13,2 %) para VPH-18, 108 (25,9 %) para VPH-31, 3 (1,2 %) para VPH-45 y 134 (32,6 %) para grupo de VPH33 (tabla 9).

TABLA 9. Frecuencia de VPH-16, -18, -45, -31, -33 y /o 52, -58, -67 en muestras del cuello uterino de pacientes con diagnóstico de ASCUS, LSIL, HSIL, carcinoma de cuello uterino y mujeres con citología normal Diagnósticoa Nº de Nº de casos de ADN de VPH positivos para (%): Nº de Pd

pacientes pacientes

positivos para uno o más genotipos (%)

VPH-16 VPH-18 VPH-31 VPH-45 Grupo de VPH-33 Normal 125 9 (7) 3 (2) 17(14) 0 (0) 19 (15) 32 (26) 0,003 ASCUS 105 17 (16) 12 (11) 19 (18) 0 (0) 35 (33) 59 (56) 0,006

LSIL 200 34 (17) 22 (11) 47 (24) 2 (1) 57 (28) 99 (50) 0,006

HSIL 152 58 (38) 21 (14) 38 (25) 2 (1) 39 (26) 118 (78) 0,006

CC 15 6 (40) 0 (0) 4 (27) 1 (7) 3 (20) 12 (80) 0,006

P valor de <0,0001 0,002 0,0060 0,1299 <0,0001 ensayo de Tendencia de Cochran-Armitagec

aASCUS, células escamosas atípicas de células de significación indeterminada; L-o H-SIL, lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo o alto; CC, cáncer cervical; bla presencia de uno o más genotipos de VPH fue significativamente mayor en pacientes con ASCUS, LSIL, HSIL y CC en comparación con mujeres con citología normal; csi es estadísticamente significativo, el ensayo de Tendencia de Cochran-Armitage detecta una tendencia creciente en la proporción de VPH positivo frente a Normal para CC; dse usó ensayo de χ2 para analizar la significación de la prevalencia de los diferentes genotipos de VPH en muestras del cuello uterino de pacientes y controles.

Infecciones por VPH con múltiples tipos

Los ensayos de PCR en tiempo real también pudieron determinar la presencia de múltiples infecciones, por los genotipos de VPH de alto riesgo estudiados, que en general se descubrió que estaban presentes en el 22 % de los pacientes con patología del cuello uterino (39 % en ASCUS, 43 % en L-SIL, 35 % en H-SIL y 7 % en CC) y en 25 % de las mujeres con citología normal. Además, se descubrió que la prevalencia de múltiples infecciones con los genotipos de VPH oncogénicos era significativamente mayor en pacientes con hallazgos patológicos con respecto a mujeres normales (102 (22 %) de 472 frente a 8 (6 %) de 125; P=0,006). La presencia de cada tipo de VPH, solo y/o en combinación con otros, en pacientes con categorías normales y patológicas se muestra en la Figura 3.

Carga viral de VPH específica de tipo asociada con los diferentes diagnósticos citológicos/histológicos

Las cargas virales para tipos de VPH oncogénicos estudiados se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10. Carga viral de VPH específica de tipo (número de copias/104 células)

Tipo de VPH n Percentil Media Mediana Percentil 75 intervalo 25 16 124 4,4x102 4,3x106 2,1x104 1,9x105

1 -3,5x108 18 58 1,3x102 5,8x105 9,3x102 1,05x105 10-1,9x107 31 125 14 4,1x106 80 2,4x103 3-1,9x107 grupo33 153 50 2,3x106 2,9x102 4,2x103 11-2,9x107 45 5 1,1x102 3,2x105 7,1x102 1x105 10-1,3x107 Carga viral 115 80 6,9 x 105 2,2 x 103 1,08 x 105 1 -3,5 x 108

totala aCarga viral total definida como la suma de la carga viral para cada tipo de virus analizado cuando se descubrió que estaban presentes múltiples virus

No se observaron diferencias significativas en los valores de carga viral medios de los diferentes tipos de VPH considerados (datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 4, hubo un aumento lineal en las medianas de los valores de las cargas virales totales para los genotipos de VPH estudiados con progresión de enfermedad.

En general, se descubrió que había una buena asociación entre las cargas virales totales de VPH y la gravedad de los hallazgos citopatológicos/histológicos (γ=0,46). Cuando se analizó la carga viral para cada ensayo individual se descubrió que había una carga de ADN significativamente mayor para los genotipos de VPH-16 y -31 en pacientes con CC en comparación con mujeres con citología normal (P <0,05); por el contrario no se descubrieron diferencias

estadísticamente significativas para VPH-18, -45 y grupo -33 (figura 2). Se observó una asociación superior significativa entre la carga viral y la gravedad de enfermedad para VPH-31 y VPH-16 (γ=0,49 y 0,41 respectivamente); se descubrió una asociación menos significativa en el caso de VPH-18 y grupo 33 (γ=0,19 y 0,02 respectivamente). Finalmente, es interesante observar que en 4 (12,5 %) de las 32 mujeres positivas para VPH con citología normal, se descubrió que la carga de ADN viral era mayor de 104 copias/104 células.

La AOR entre la carga viral de VPH y el estado histológico se indica en la tabla 11.

El análisis se realizó tanto para cada nivel categórico específico de VPH de carga viral como para la carga viral total independientemente del tipo de VPH. En general, los niveles bajos y altos de carga viral se asociaron con el riesgo de citología anómala. En particular, para niveles bajos y altos de carga viral total, la AOR para ASCUS, L-SIL, H-SIL y CC fue 2,7 (IC 95 %: 1,4-5,2) y 2,6 (IC 95 %: 1,0-6,5), 2,2 (IC 95 %: 1,2-4,2) y 4,5 (IC 95 %: 2,0-10,5), 4,0 (IC 95 %: 2,0-8,1) y 14,6 (IC 95 %: 5,6-38,3), 2,2 (IC 95 %: 0,3-14,9) y 15,7 (IC 95 %: 3,8-65,4), respectivamente (tendencia de P <0,01). En el caso del nivel categórico específico de VPH de la carga viral, se asociaron fuertemente altos niveles de carga viral de VPH-16 con el riesgo de ASCUS, L-SIL, H-SIL y CC, que variaba del 4,1 al 45,4 con una tendencia significativa (P<0,05) entre todos los niveles categóricos de la carga viral. De forma similar, también se observó un riesgo aumentado de citología anómala para carga viral alta de VPH-18, con una fuerte asociación entre H-SIL y alta carga viral (AOR: 8,0; IC 95 %: 1,3-48,2). También se observó una asociación significativa entre la carga viral baja de VPH-33 y ASCUS, L-SIL y H-SIL (AOR: 4,6, 5,5, 4,0; IC 95 % 1,6-13,2, 1,9-15,7, 1,4-11,4, respectivamente).

Finalmente, cuando se considera la carga viral total, las áreas bajo la curva de ROC no paramétrica aumentan con la clasificación del estado histológico, que varía de 0,624 (IC 95 %: 0,560-0,688) para ASCUS hasta 0,778 (IC 95 %: 0,638-0,918) para CC (Tabla 12).

Tabla 12. Curvas de características operativas del receptor (ROC) no paramétricas para la carga viral total por clasificación del estado histológico

Estado histológico

Área de ROC Erro Típico Normal Asintomático [Intervalo de Confianza

al 95 %]

ASCUS

0,624 0,033 0,560 0,724

L-SIL

0,652 0,027 0,688 0,827

H-SIL

0,775 0,026 0,599 0,638

CC

0,778 0,071 0,705 0,918

En el caso de CC, la sensibilidad y especificidad resultantes para el punto de corte 2 (Alta carga viral) fueron de 60 % y 92 %, respectivamente, con 88,6 % de sujetos clasificados correctamente (datos no mostrados). Este porcentaje aumentó hasta el 91,4 % cuando se usó solamente carga viral de VPH-16 categórica como un punto de corte de clasificación. El método de clasificación de carga viral categórica difirió significativamente del dicotómico tanto para L-SIL como para H-SIL (P <0,0001) (Figura 5). Aunque las áreas bajo las curvas de ROC del método de clasificación de carga viral categórico también fueron mayores para ASCUS y CC en comparación con el método dicotómico, los ensayos de chi cuadrado produjeron una probabilidad de significación mayor de 0,05.

Descripción de las figuras

Figura 1. Curva patrón y representación de amplificación para VPH-16 (A y B) y -31 (C y D). Se realizaron series de diluciones con plásmidos que contenían 100 a 106 copias de VPH-16 y VPH-31. El número de ciclos de umbral (Ct) se representa frente al número de copias de VPH-16. Figura 2. Comparación de las curvas de referencia para los ensayos de TaqMan de VPH-18 y -45 (A) y para VPH-33, -52/-58/-67 (B). El número de las moléculas plasmídicas que contienen VPH se indica en el eje x, y el ciclo de umbral (Ct) se indica en el eje y; triángulos abiertos, para ensayos de TaqMan de VPH-18 (A) y VPH-33 (B); rombos abiertos, para VPH-45 (A) y VPH-52 (B); círculos abiertos, para VPH-58 (B); cuadrados abiertos, para VPH-67. Las ecuaciones para las construcciones de VPH-18 y VPH-45 fueron y =38,83 -3,32 log (x) e y =39,89 – 3,48 log (x), respectivamente. Las ecuaciones para las construcciones de VPH-33 y VPH-52,-58,-67 fueron y =38,93 -3,34 log (x) e y =39,02 – 3,41 log (x), y =39,42 – 3,45 log (x), y =39,12 – 3,36 log (x), respectivamente. Figura 3. Prevalencia de VPH oncogénico solo y en combinación con otros genotipos. Figura 4. Distribución de la carga viral de VPH, de acuerdo con el grado de lesión del cuello uterino o hallazgo citológico (normal, ASCUS, L-SIL, H-SIL y CC). Cada caja indica el intervalo intercuartil. Las líneas que se extienden desde cada caja indican los extremos de los valores (los bigotes representan los valores extremos), y la línea cruzada de cada caja indica la mediana. La carga viral se expresó en una escala logarítmica. Se mostró una buena asociación entre la carga viral de VPH oncogénicos totales y el grado de lesión (γ=0,46; figura A) así como para VPH-16 (γ=0,41; B) y VPH-31 (γ=0,49; C); por el contrario se halló escasa o ninguna asociación para VPH18 o 45 (γ=0,19; D) y VPH-33 o 58 (γ=0,02; E). Figura 5. Comparación entre las curvas de ROC para H-SIL mediante carga viral dicotómica y politómica.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> UniversitS degli Studi di Milano-Bicocca 55

<120> Identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos

<130> PCT/EP2008/004277

<150> EP 07109454.4

<151>

<160> 31

<170> PatentIn versión 3.3 65

<210> 1

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

5 <220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 1 cgtccaaaag gaaactgagc 20

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 2 gcacagggac ataacaatgg 20

<210> 3

<211> 25

<212> ADN 25 <213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 3 cgaaagtatt tgggtagtcc actta 25

<210> 4

<211> 30 35 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 4 cagctctact ttgtttttct atacatatgg 30

<210> 5 45 <211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 5 tttgaaagga catggtccag at 22

55 <210> 6

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido sintético

<400> 6 cgttccgaaa gggtttcc 18 65

<210> 7

<211> 19 <212> ADN <213> Artificial

5

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 7 ccaccacatc gaattccaa

19

15

<210> 8 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 8 cgccgcacac cttcac

16

25

<210> 9 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 9 cagagctgca aacaactata catgatata

29

35

<210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 10 gttaatacac ctcacgtcgc agta

24

45

<210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 11 ttacagaggt gcctgcggt

19

55

<210> 12 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

65

<400> 12 tctaagtttt tctgctggat tcaac <210> 13 25

<211> 23 <212> ADN <213> Artificial

5

<220> <223> oligonucleótido sintético

10 15

<400> 13 cattggaaat accctacgat gaa <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético 23

20

<400> 14 ttgacacgtt atacaccttt gcag 24

25

<210> 15 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

30

<220> <223> oligonucleótido sintético <400> 15 ttgaactaca gtgcgtggaa tg 22

35

<210> 16 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

40

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 16 cagcgccctc agatcgtt

18

45

<210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

50

<220> <223> oligonucleótido sintético

55 60

<400> 17 acaagacgta tctattgcct gtgtatat 27 <210> 18 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético

65

<400> 18 ccgcaggcac ctctgtg 17

5

<210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético

10

<400> 19 atcgaattga aatgcgttga a 21

15

<210> 20 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

20

<400> 20 gcacagcgcc ctcagat 17

25

<210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

30

<220> <223> oligonucleótido sintético <400> 21 agtgaatgtg tagacaataa 20

35

<210> 22 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

40

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 22 ttttgctgtg caaccgatt

18

45

<210> 23 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

50

<220> <223> oligonucleótido sintético

55 60

<400> 23 agtgccagcg tactgtattg tg <210> 24 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético 22

65

<400> 24 cggttgcctt tggctt 16

5

<210> 25 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético

10

<400> 25 cctgcgcctt gggcacc 17

15

<210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

20

<400> 26 cagtaccgag ggcagtgtaa

20

25

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

30

<220> <223> oligonucleótido sintético <400> 27 cgtctgcgaa gtctttcttg 20

35

<210> 28 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

40

<220> <223> oligonucleótido sintético

<400> 28 acatgttgtg accaggc

17

45

<210> 29 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

50

<220> <223> oligonucleótido sintético

55 60

<400> 29 ggacgtggtg caaattagat tt <210> 30 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético 22

65

<400> 30 gtgctgatat ttcctccatg gt 22

<210> 31

5

<211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucleótido sintético

10

<400> 31 aggaagagga caaggaa 17

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénico que comprende:

   5 a) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno o más de los 13 genotipos de VPH de alto riesgo en la muestra; en la que los cebadores usados en la etapa a) tienen las secuencias SEC ID Nº: 1-8; b) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han demostrado ser positivas en la exploración de

   10 primera línea:

   -

   5 ensayos de PCR en tiempo Real TaqMan independientes para determinar la presencia de la carga viral de los tipos de VPH oncogénicos más comunes:

   15 tipos de VPH: 16, 18, 31, 45, grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 58, 67) en los que los cebadores usados en el ensayo de PCR en Tiempo Real TaqMan tienen las secuencias SEC ID 3, 4, 7, 8, 21-31,

   -

   6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la 20 muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58

   en el que los cebadores usados en el ensayo de PCR en tiempo Real de SYBR Green en la etapa b tienen las secuencias SEC ID 9-20.

   25 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicha muestra puede ser cualquier muestra de ensayo biológica tal como muestras citológicas del cuello uterino, sangre periférica, orina, biopsias tisulares y similares.
2. 3. Un kit para realizar los métodos de las reivindicaciones 1 o 2 que incluye los cebadores de la reivindicación 1 y

   tampones, sondas y marcadores adecuados. 30