JP3658820B2 - 試料中のリガンド検出法およびそのための試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は高純度であって、安定性がよい新規なアルカリフォスファターゼを標識とする試料中のリガンドを検出する方法およびその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体物質の検出法としては多くの方法が知られており、様々な成分が混在する中で、ある特定の微量の成分を特異的に測定する場合には、生化学的親和性を利用した分析法が用いられている。例えばグルコースや尿酸等、体液中に１０-2ｍｏｌｅ／ｌオーダー以上の濃度で存在する成分に対しては、該成分を基質とする酵素反応を利用する検出法が多く使用され、酵素の基質とならないより高分子量の成分や、より低濃度の成分を測定しようとする場合には、各成分の親和性、例えば抗原−抗体、ホルモン−レセプター、核酸−核酸等、より親和性の高いものを利用することが一般的である。
これらの親和性を利用する検出法では、一方の親和性成分を標識して検出することが多くの場合、必要である。その一つの方法として、標識として放射性物質（ＲＩ）を用いる方法が、検出感度の面で優れており、従来から使用されてきた。しかし、特殊な放射性物質を取り扱う施設や測定装置を必要とすることから、近年は、酵素でもって一方の親和性成分を標識し、親和性により結合した標識もしくは結合しなかった標識の酵素活性を測定することにより、他方の親和性成分を定量する方法が用いられている。
標識酵素の検出に用いる基質を、比色用基質から蛍光法用基質、更には発光用基質と変えることにより飛躍的に検出感度の向上が図られている。
標識用酵素が備える条件として、一般的に高純度、安定性が高い、ターンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持つ、基質に対するＫｍ値が低い、バックグラウンドが低い、検出に適した基質がある等が挙げられる。用いられている酵素の種類としてはアルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム等が挙げられるが、この中でアルカリフォスファターゼがもつ大きな利点は、バックグラウンドが他の酵素より低いことおよび検出に適した基質があることなどである。
【０００３】
上記性質を鑑みて最も汎用されているのは仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼである。
仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼは、比活性３，０００Ｕ／ｍｇ以上を有すこと、糖鎖を有しているため、過ヨウ素酸法で標識できることより、他起源の酵素より優れているとされている。しかし、その一方で、安定性に乏しいこと、および有している糖鎖のためにバックグラウンドが生じることも知られている（Besman,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)、特開昭60-180584 号公報）。
【０００４】
また、大腸菌由来アルカリフォスファターゼは安定性が良く、純度の高い標品を容易に入手できるが、比活性６０Ｕ／ｍｇと低く、標識用酵素に適さず、分子生物学における脱リン酸化用酵素として使用されているに過ぎない（Reid,R.W.,Wilson,I.B. in "The Enzymes", 3rd Ed.373(1971)）。
これらの酵素を改善するため、部位特異的変異により大腸菌アルカリフォスファターゼのアミノ酸を置換し、比活性を向上させる試みがある（特開平4-349881号公報）。しかし、ここで得られた変異アルカリフォスファターゼは、比活性において３．９倍の上昇が得られたのみであり、仔牛小腸由来のものに匹敵しない。
【０００５】
自然界から高い比活性を有するアルカリフォスファターゼを獲得しようとする試みもあり、好アルカリ性バチルス・エスピー（Bacillus sp.）由来の酵素（M,Nomoto et al.,Agric.Biol.Chem.,52(7),1643(1988)）やバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来の酵素に関する報告（Hulett,F.M.,J.Gen.Microbiol.,132,2387(1986)）がある。
しかしながら、前者は比活性１６５０Ｕ／ｍｇであって、仔牛小腸由来酵素の比活性に匹敵するとはいい難い。また後者は比活性２１１５．９Ｕ／ｍｇながら、その酵素活性測定は５５℃においてであり、実用的な３７℃ではその７割以下であると予想されるデータが示されている（Hulett,F.M. et al.,Biochemistry,10(8),1364(1971)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記酵素より高純度、安定性が高く、しかも仔牛小腸由来酵素程度の比活性を有するアルカリフォスファターゼを微生物から得ることが求められていた。
本発明の目的はかかるアルカリフォスファターゼを使用する試料中のリガンドを検出する方法、生体試料中のリガンドの検出方法、そのための試薬、試料中のリガンドを定量する方法、試料中の核酸配列決定法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは検出感度が高く、安定性に優れ、かつバックグラウンドが低いバインディングアッセイ方法およびそれを使用する試薬を安価に作製するために、鋭意研究を重ねた結果、安定性が良く、比活性が高く、かつバックグラウンドの原因と考えられる糖鎖を持たないアルカリフォスファターゼを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中のリガンドを検出する方法である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
【０００９】
また、本発明は(i) 下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで直接的または間接的に標識されたリガンドに対する特異的結合物質または(ii)リガンドに対する特異的結合物質および下記理化学的性質を有するアルカリホスファーゼで標識されたリガンド、および(iii) アルカリホスファターゼ測定試薬を含有する生体試料中のリガンド検出試薬である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
【００１０】
さらに、本発明は(i) アビジン化合物またはビオチン化合物を結合し、リガンドに対して特異的な親和性を有する物質および(ii)ビオチン化合物またはアビジン化合物を結合する下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼおよび(iii) アルカリホスファターゼを測定する物質を含有する生体試料中のリガンド検出試薬である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
【００１１】
本発明は標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中のリガンドを定量する方法である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
【００１２】
本発明は標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の試料中のリガンドを検出する具体な方法は、試料中のリガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用し、該反応により結合した物質に結合するアルカリホスファターゼ活性を測定するか、あるいは結合しなかったアルカリホスファターゼ活性を測定する方法である。
【００１４】
本発明において、試料中のリガンドとしては、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは核酸などが例示される。
リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応としては、抗原抗体反応、ホルモン−ホルモンレセプター反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などがある。
【００１５】
本発明に使用するアルカリフォスファターゼは、上記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼであれば、いずれの起源のものを用いても良い。好適なものとしては、バチルス（Bacillus）属のアルカリフォスファターゼなどがある。例えば、バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＴＥ３４９２、バチルス・バディウスＴＥ３４９３のアルカリフォスファターゼやバチルス・バディウスＴＥ３４９７のアルカリフォスファターゼが例示される。
【００１６】
バチルス・バディウスＴＥ３４９２のアルカリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に作用する。
３．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０
５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
６．至適温度：６０℃以上
７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
９．糖鎖を有さない。
１０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）〕
【００１７】
バチルス・バディウスＴＥ３４９３のアルカリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に作用する。
３．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０
５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
６．至適温度：６０℃以上
７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
９．糖鎖を有さない。
１０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）〕
【００１８】
バチルス・バディウスＴＥ３４９７のアルカリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フォスフォエタノールアミン、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸に作用する３．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
４．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０
５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間）
６．至適温度：６０℃以上
７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
９．糖鎖を有さない。
１０．熱安定性：７０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）〕
【００１９】
これらのアルカリホスファターゼを製造する方法としては、バチルス属に属し、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼ生成能を有する菌株、例えば、バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＴＥ３４９２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８３）、バチルス・バディウスＴＥ３４９３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８４）、バチルス・バディウスＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２０）を培地にて培養し、培養物より該アルカリホスファターゼを採取する方法がある。
アルカリホスファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。またアルカリホスファターゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くしておくことが望ましい。
【００２０】
培地は通常、振盪培養、あるいは通気攪拌培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御するのがよい。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリホスファターゼが生産蓄積される。
【００２１】
本発明の酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよい。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。また、これらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。
【００２２】
次に本発明のアルカリホスファターゼの活性測定法を示す。
まず下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予備加温する。
次に、酵素溶液０．０５ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．０５ｍＭ ＣｏＣｌ2 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、上記同様に操作を行って１分間当たりの吸光度を求めた。上記条件で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００２３】
本発明において、アルカリホスファターゼで標識される物質としては、例えば、抗原としてはタンパク質、核酸などの高分子物質などが挙げられる。最近、良く用いられている抗原のエピトープ部位をデサインしたペプチドも使用することができる。また抗体としては通常、使用されるもの、例えばヤギ、ウサギ、モルモットなどに免疫して得られるポリクローナル抗体、マウス腹水等のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体、更にこれらの抗体をプロテアーゼ処理して得られる抗原結合活性フラグメント（Ｆａｂ’）などを使用することができる。遺伝子組変え技術で得られるＦｖ抗体、一本鎖Ｆｖ抗体等抗原結合活性を有するタンパク質を使用することも可能である。
【００２４】
本発明において、アルカリホスファターゼは、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を有する物質のいずれか一方に結合されていることが好ましい。
【００２５】
アルカリフォスファターゼを上記抗原や抗体などに標識する際に使用する方法としては、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジスルフィド法などを用いることができるが、好ましいのはマレイミド法のように抗原、抗体や酵素の活性を低下させない方法である。
【００２６】
抗体や抗原１分子に導入される標識用酵素としては、通常、１分子以上、好ましくは２分子以上結合した酵素標識体を使用することが望ましい。
【００２７】
本発明の具体例な例としては、試料中のリガンド、例えば抗原または抗体とアルカリホスファターゼを結合した該リガンドに特異的な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原を反応させ、反応生成物と未反応生成物を分離した後、反応生成物に結合したアルカリホスファターゼ活性または未反応生成物のアルカリホスファターゼ活性を測定する。
【００２８】
標識物質としてアリカリホスファターゼを用いる免疫学的測定法は、抗体、抗原のいずれを測定する場合にも、競合法、もしくは非競合法のヘテロジニアス法に使用することができる。いずれの方法においても一次抗体のみならず、二次抗体を用いる方法においても、それらにアルカリホスファターゼを標識することができる。また二次抗体の代わりに、プロテインＡ、プロテインＧのようなＦｃレセプターにアルカリホスファターゼを標識して使用できる。
【００２９】
また、本発明の方法の別な具体例としては、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を有する物質を固相に結合しているリガンドの検出法がある。固相としては、従来既知のものを使用すれば良く、例えばポリスチレンビーズなどが挙げられる。
【００３０】
また、他の具体的な例としては、アビジン化合物またはビオチン化合物がリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原に結合し、アルカリホスファターゼがビオチン化合物またはアビジン化合物に結合して、リガンド、例えば抗原または抗体とリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原との親和性反応と同時に、またはその後にアビジン化合物−ビオチン化合物結合反応を行い、該反応により結合したアルカリホスファターゼ活性または残存するアルカリホスファターゼ活性を測定する試料中のリガンドの検出法がある。ここにアビジン化合物とはビオチン化合物と強く結合する糖タンパク質であり、例えばアビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。また、ビオチン化合物とはビタミンＢ複合体の１つであり、例えばビオチンなどが挙げられる。
【００３１】
アビジン化合物とビオチン化合物、就中アビジンとビオチンの結合定数は、１０15Ｍ-1レベルで非常に高いこと、アビジン化合物、就中アビジンは４つのビオチン結合部位を持つこと、ビオチン化合物を導入することは、例えば抗体などの活性の損失が少ないことによりアビジン化合物−ビオチン化合物系は大きなメリットを有している。
【００３２】
例えば固相サンドウイッチ免疫測定法において、固相に固定化した抗体と試料を反応させ、さらにビオチン化合物を結合した抗体と反応させた後、反応生成物中のビオチン化合物または未反応生成物中のビオチン化合物をアルカリホスファターゼで標識したアビジン化合物により検出する。アビジンおよび類縁物質のストレプトアビジンは分子量５万程度のタンパク質であり、これらはアルカリホスファターゼとグルタルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジスルフィド法などを用いて結合することができる。
【００３３】
一方、ビオチン化合物に代えてアビジン化合物を結合する抗体を使用した場合、抗原抗体反応の後、アビジン化合物とアルカリホスファターゼで標識したビオチン化合物により検出する。アルカリホスファターゼをビオチン化する試薬は市販されており、例えばビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステル、ビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−スルホコハク酸イミドエステル、ビオチノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステルなどを挙げることができる。
【００３４】
本発明の試料中のリガンド検出試薬とは、前記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリガンドに対する特異的結合物質または前記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリガンドおよびアルカリホスファターゼ測定試薬を含有する。アルカリホスファターゼ測定試薬としては、発色基質、蛍光基質、発光基質などが例示される。
【００３５】
発色基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、１−ナフトールフタレインモノリン酸（特公平５−１３９５８号公報）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸およびそれとニトロブルーテトラゾリウムとの組み合わせなどが挙げられる。
また、蛍光基質としては、４−メチルウンベリフェリルリン酸、フェナレノン−６−リン酸とその類縁化合物、ベンズフェナレン−６−リン酸とその類縁化合物（特開昭６２−１９０１９１号公報）などが挙げられる。
さらに、発光基質としては、ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤ等の１，２−ジオキセタン化合物またはそれらの誘導体およびこれらの化合物とエンハンサー、例えば界面活性剤、蛍光性物質またはタンパク質などの混合物などが挙げられる。
【００３６】
本発明のこれら基質の濃度は、０．０１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。本発明の酵素反応は、通常、ｐＨ７〜１１で行うが、至適ｐＨを考慮すると、ｐＨ８〜１１で酵素反応することが望ましい。使用する緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエタノールアミン塩酸緩衝液、トリエタノールアミン塩酸緩衝液、重炭酸緩衝液、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩酸緩衝液、バルビタール緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ−２−メチルプロパノール塩酸緩衝液、アミノアルコール系緩衝液などを例示することができる。これらの緩衝液の濃度は、５〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。
【００３７】
反応生成物に結合する酵素または未反応生成物に結合する酵素の活性は、アルカリホスファタゼ活性をレート法で測定することより実施できるが、上記基質と酵素結合体を一定時間反応させ、反応停止後に該生成物を検出することによっても行うことができる。停止剤として使用できるものとしては、アルカリ溶液、酵素阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、無機リン酸等が使用できる。また反応停止後、強アルカリ条件にすることにより、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ジオキセタン化合物等の基質では、感度を更に上げることができる（特開平２−２７３１９９号公報）。
【００３８】
本発明に使用する緩衝液中にはアルカリフォスファターゼの不活性化を防ぐために金属塩を添加することが望ましい。使用できる金属塩としてはマグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、カルシウム塩が挙げられるが、好ましくはマグネシウム塩とコバルト塩である。好ましいマグネシウム塩の添加濃度は０．０５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸マグネシウム等のマグネシウム錯化合物を使用することができる。好ましいコバルト塩の添加濃度は０．０２〜５ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸コバルト、塩化コバルト、クエン酸コバルト、硫酸コバルト、エチレンジアミン四酢酸コバルト等のコバルト錯化合物を使用することができる。マグネシウム塩とコバルト塩を併用することが望ましいが必須ではない。
【００３９】
本発明の実施に有用な界面活性剤は、アルカリフォスファターゼ活性を大きく阻害しない任意のものを使用することができる。一般に有用な界面活性剤は非イオン性界面活性剤であるが、両性界面活性剤およびイオン性界面活性剤も使用できる。
また本発明には水と混和しうる有機溶媒の併用も可能である。その例としてメタノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ヘキサメチレンホスホアミドなどである。
【００４０】
さらに、本発明の試薬には酵素反応を円滑に行わせるため、あるいはその構成成分の活性を維持するため、他の化合物を添加してもよい。このような化合物として、例えば安定化剤、賦形剤が挙げられる。またバックグラウンドや非特異反応の低減にアルカリフォスファターゼの不活化型酵素を添加することは有効である。
【００４１】
本発明は上記固相サンドウイッチ免疫測定法のみならず、ホルモン−レセプター親和性を利用したホルモンやそのレセプターの測定、核酸−核酸親和性、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ反応またはＤＮＡ−ＲＮＡ反応などを利用した測定などにも用いることができる。
【００４２】
本発明の核酸を検出する具体的な例としては、捕捉オリゴヌクレオチドを固定した部材に核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料を作用させ、次いでアルカリホスファターゼを標識した検出オリゴヌクレオチドを作用させて、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した核酸と標識した検出オリゴヌクレオチドとの核酸ハイブリダイゼーションを行い、未反応の検出オリゴヌクレオチドを分離した後、核酸ハイブリダイゼーションされた結合体のアルカリホスファターゼ活性を測定することにより、試料中の核酸を検出する方法がある。
【００４３】
試料中の核酸としては、ＤＮＡまたはＲＮＡなど、１本鎖または２本鎖核酸が例示される。試料としては、血清、尿、リンパ液などの体液、各種組織などの材料が例示される。
【００４４】
本発明のアルカリホスファターゼとＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体の作製は、例えば M.Renz and C.Kurz,Nucleic Acids Res.,12(8),3435(1984)に記載の方法を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼとポリエチレンイミンを架橋して、コンジュゲートを作製した後、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドをグルタルアルデヒドにより架橋させ、標識核酸を得る。
またオリゴヌクレオチドを合成する場合、その５’末端や任意の鎖にスペーサーアームを介して、直接、アミノ基やチオール基を導入する試薬が市販されており、これらの試薬とアルカリホスファターゼをグルタルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、コハク酸イミドエステル法、ピリジン−ジスルフィド法により結合して、オリゴヌクレオチドにアルカリホスファターゼを導入することもできる。
【００４５】
試料としてはＤＮＡが例示され、ＤＮＡを鋳型として伸長反応を行う際、ビオチン化プライマーもしくはビオチン化ターミネーター等を利用して、ビオチンをＤＮＡ断片に取り込ませる。
次に電気泳動により断片を展開した後、アビジン化アルカリホスファターゼもしくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファターゼと反応させて、上記断片を検出する。
【００４６】
更には、本発明は試料中の核酸を取り出して、核酸ハイブリダイゼーションを行う方法に代えて、細胞中で核酸ハイブリダイゼーションを行うin situ ハイブリダイゼーションにも使用可能である。
【００４７】
本発明の他の具体例としては、標識として、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法がある。配列決定にはジデオキシターミネーション法、マキサム−ギルバート法など公知の手法を選択することができる。例えば、ジデオキシターミネーション法を用いる場合、以下の方法が例示される。
まず配列を決定すべき核酸（一本鎖もしくはアルカリ変性した２本鎖）にビオチン化プライマーをハイブリダイズさせ、さらに１種のジデオキシリボヌクレオチド（例えばｄｄＡＴＰ）を４種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）および核酸合成酵素（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素、Ｔ７ポリメラーゼ等）とともに加え、伸長反応と停止反応を同時に行わせる。他の３種のジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴｐ）についても同様に反応をおこなわせ、得られる４種の反応液をそれぞれシークエンスゲル上の電気泳動に付した後、アビジン化アルカリフォスファターゼもしくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファターゼを反応させ、発色基質等を用いて種々の伸長断片を検出、各レーンを比較対照することにより核酸配列を決定する。
上記アルカリホスファターゼ標識核酸を用いる核酸配列決定用試薬としては、該酵素を直接的または間接的に結合するＤＮＡまたはＲＮＡとアルカリホスファターゼ測定試薬を包含する。
【００４８】
【本発明の効果】
本発明で特定されるアルカリホスファターゼを使用するバインディングアッセイ用試薬、それによる試料中のリガンド検出法は、高感度であって、長期保存性に優れる。しかも目的物質の検出にあたり、バックグラウンドの少ない良好な結果を与えることができる。
【００４９】
【実施例】
以下、参考例、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
参考例１
３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、バチルス・バディウムＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２０）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌに移し、３００ｒｐｍ，通気量２１／分、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロールクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比活性２，３００Ｕ／ｍｇにまで精製した。
【００５０】
得られたアルカリホスファターゼは下記特性を有していた。
１．下記の反応を触媒した。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性
【００５１】
【表１】
【００５２】
３．Ｋｍ値
ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は０．２８ｍＭであった。
４．至適ｐＨ
０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）中での酵素活性を測定した。至適ｐＨは９．５〜１０であった。
５．安定ｐＨ
グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１０）で２６℃、１６時間保存して、その残存活性を測定した。安定ｐＨはｐＨ６〜１１であった。
６．至適温度
各温度における酵素活性を測定した。至適温度は６０℃以上であった。
７．熱安定性
本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。７０℃まで安定であった（但し、８０％以上の残存活性がある場合を安定であると定義する）。
８．活性化および安定化剤
Ｍｇ2+およびＣｏ2+が必須であった。
９．分子量
１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法）
６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
１０．糖含量
糖は検出されなかった。
【００５３】
実施例１
（１）アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧの作製
参考例１のアルカリフォスファターゼ５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む）２．５ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液３５μｌを加え、２５℃で５０分間インキュベートした。次に、２．５ｍｇのヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を含む０．５ｍｌ ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を加え、２５℃で更に７５分間インキュベートした。次に２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．７を１５０μｌ添加後、４℃で３０分間撹拌し、１５０ｍｇのＮａＢＨ4 を含む水溶液を１５０μｌ添加後、４℃で１５時間インキュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグラフィー（溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ ＮａＮ3 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を使用）で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得した。
【００５４】
（２）ヒトＣＲＰの検量線
ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個にヒトＣＲＰ ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した（図１）。
【００５５】
比較例１
仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）５ｍｇを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２．５ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液１５０μｌを加え、実施例１と同様に操作を行い、酵素標識抗体を取得した。
上記酵素標識抗体を用い、実施例１と同様にヒトＣＲＰについての検量線を作製した（図１）。特異発色（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本発明のアルカリフォスファターゼ１２．５に対して、ＣＩＡＰは５．１３であり、本発明のアルカリフォスファターゼの方が非特異吸着が小さかった。
【００５６】
実施例２
（１）アルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆａｂ’の作製
ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆ（ａｂ’）2 （バインディングサイト社）５ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０ １ｍｌに０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０ １００ｍｌを加え、３７℃、９０分間インキュベートした。該混合液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。一方、本発明のアルカリフォスファターゼ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む）５００μｌに０．１ｍｇ Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを含むジメチルホルムアミド１０μｌを加え、３０℃で３０分間インキュベートした。得られた液は１ｍＭＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。
調製したヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆａｂ’にマレイミド化アルカリフォスファターゼを加え、４℃、２０時間インキュベートした。次に１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミン ５０μｌを加え、２５℃で２０分間インキュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得した。
【００５７】
（２）ヒトＣＲＰの検量線 ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（株式会社日本バイオテスト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個に、ヒトＣＲＰ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した（図２）。
【００５８】
比較例２
ＣＩＡＰ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2 、３Ｍ ＮａＣｌを含む）５００μｌについて実施例２と同様の操作を行い、酵素標識抗体を取得した。
上記酵素標識抗体を用い、実施例１同様ヒトＣＲＰについての検量線を作成した（図２）。特異発色（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本発明のアルカリフォスファターゼ５５．２に対して、ＣＩＡＰは３４．８であり、本発明のアルカリフォスファターゼの方が非特異吸着が小さかった。
【００５９】
実施例３ （１）ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼの作製 ストレプトアビジン４ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５ ６００μｌに０．１ｍｇ Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンハイドライドを含むジメチルホルムアミド１０μｌを添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。次に０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０ ２０μｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０ １２０μｌ、１Ｍ塩酸ハイドロキシルアミン１２０μｌを添加し、３０℃で５分間インキュベートし、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、６００μｌに濃縮した。実施例２で作製したマレイミド化アルカリフォスファターゼ溶液１００μｌに作製したメルカプトスクシニル化ストレプトアビジン１００μｌを加え、４℃、２０時間インキュベート後、得られた混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素標識ストレプトアビジンとした。
【００６０】
比較例３
ＣＩＡＰについて実施例３と同様な方法で酵素標識ストレプトアビジンを作製した。
常法に従い、イモビロン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、本発明の酵素標識ストレプトアビジン及びＣＩＡＰ標識ストレプトアビジン０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間インキュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に０．５ｎｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出することができた。
次に本発明の酵素標識ストレプトアビジンおよびＣＩＡＰ標識ストレプトアビジンを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で４０℃に７日間保存して、アルカリフォスファターゼ活性を比較した。結果を図３に示すが、本発明の酵素標識ストレプトアビジンの方が安定であった（図３）。
【００６１】
実施例４
（１）ビオチニル化アルカリフォスファターゼの作製
本発明のアルカリフォスファターゼ６ｍｇを含む３０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ２を含む）６００μｌに０．１２８ｍｇ Ｄ−ビオチニン−ε−アミノカプリン酸−Ｎ−ハイドロキシスクシイミドエステルを含むジメチルホルムアミド２０μｌを加え、２５℃で３時間撹拌した後、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ＮａＮ3 を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に対して透析した。
【００６２】
比較例４
ＣＩＡＰについて実施例４と同様の方法でビオチニル化アルカリフォスファタを作製した。
常法に従い、イモビロン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、１μｇ／ｍｌの本発明のビオチニル化アルカリフォスファターゼ及びビオチニル化ＣＩＡＰ０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間インキュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に５０ｐｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出することができた。
次に本発明のビオチニル化アルカリフォスファターゼおよびビオチニル化ＣＩＡＰを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で熱アルカリフォスファターゼ活性の熱安定性を比較した。結果を図４に示すが、本発明のビオチニル化アルカリフォスファターゼの方が安定であった。
【００６３】
実施例５
（１）アルカリフォスファターゼ標識プローブ
Ｕｎｉ−ＬｉｎｋTMＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ（クローンテック社製）を５’端に組み込んだ下記配列のオリゴヌクレオチドを通常の方法で合成し、精製した。
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴ−３’
上記プローブ１０ｎｍｏｌｅを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １０μｌにジスクシミジルスベリン酸溶液（１０ｍｇ／ｍｌ−ＤＭＳＯ）５０μｌ加え、攪拌後、２５℃１５分間反応させ、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過し、最初のオリゴヌクレオチドを含むピークを分取した。該ピークを１００μｌに濃縮し、本発明のアルカリフォスファターゼ１．５ｍｇを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ４０μｌを加え、２５℃で一晩反応した。
該混合物に約５００μｌの１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０を加えた後、ＭｏｎｏＱ（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグラフィー（溶出液Ａ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、溶出液Ｂ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で精製した。
【００６４】
比較例５
ＣＩＡＰについて実施例５の方法で、ＣＩＡＰ標識プローブを作製した。
本発明の酵素標識プローブおよびＣＩＡＰ標識プローブを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳで７０℃で２時間処理して、アルカリフォスファターゼ活性を比較した。結果は図５に示すように、本発明の酵素標識プローブの方が安定であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧを用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を示す。
【図２】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヒツジ抗ヒトＣＲＰＦａｂ’を用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を示す。
【図３】ストレプトアビジンによる本発明の酵素標識体とＣＩＡＰ標識体の保存安定性の比較を示す。
【図４】ビオチンによる本発明の酵素標識体とＣＩＡＰ標識体の熱安定性の比較を示す。
【図５】本発明の酵素およびＣＩＡＰ標識プローブの熱安定性を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は高純度であって、安定性がよい新規なアルカリフォスファターゼを標識とする試料中のリガンドを検出する方法およびその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体物質の検出法としては多くの方法が知られており、様々な成分が混在する中で、ある特定の微量の成分を特異的に測定する場合には、生化学的親和性を利用した分析法が用いられている。例えばグルコースや尿酸等、体液中に１０-2ｍｏｌｅ／ｌオーダー以上の濃度で存在する成分に対しては、該成分を基質とする酵素反応を利用する検出法が多く使用され、酵素の基質とならないより高分子量の成分や、より低濃度の成分を測定しようとする場合には、各成分の親和性、例えば抗原−抗体、ホルモン−レセプター、核酸−核酸等、より親和性の高いものを利用することが一般的である。
これらの親和性を利用する検出法では、一方の親和性成分を標識して検出することが多くの場合、必要である。その一つの方法として、標識として放射性物質（ＲＩ）を用いる方法が、検出感度の面で優れており、従来から使用されてきた。しかし、特殊な放射性物質を取り扱う施設や測定装置を必要とすることから、近年は、酵素でもって一方の親和性成分を標識し、親和性により結合した標識もしくは結合しなかった標識の酵素活性を測定することにより、他方の親和性成分を定量する方法が用いられている。
標識酵素の検出に用いる基質を、比色用基質から蛍光法用基質、更には発光用基質と変えることにより飛躍的に検出感度の向上が図られている。
標識用酵素が備える条件として、一般的に高純度、安定性が高い、ターンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持つ、基質に対するＫｍ値が低い、バックグラウンドが低い、検出に適した基質がある等が挙げられる。用いられている酵素の種類としてはアルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム等が挙げられるが、この中でアルカリフォスファターゼがもつ大きな利点は、バックグラウンドが他の酵素より低いことおよび検出に適した基質があることなどである。
【０００３】
上記性質を鑑みて最も汎用されているのは仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼである。
仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼは、比活性３，０００Ｕ／ｍｇ以上を有すこと、糖鎖を有しているため、過ヨウ素酸法で標識できることより、他起源の酵素より優れているとされている。しかし、その一方で、安定性に乏しいこと、および有している糖鎖のためにバックグラウンドが生じることも知られている（Besman,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)、特開昭60-180584 号公報）。
【０００４】
また、大腸菌由来アルカリフォスファターゼは安定性が良く、純度の高い標品を容易に入手できるが、比活性６０Ｕ／ｍｇと低く、標識用酵素に適さず、分子生物学における脱リン酸化用酵素として使用されているに過ぎない（Reid,R.W.,Wilson,I.B. in "The Enzymes", 3rd Ed.373(1971)）。
これらの酵素を改善するため、部位特異的変異により大腸菌アルカリフォスファターゼのアミノ酸を置換し、比活性を向上させる試みがある（特開平4-349881号公報）。しかし、ここで得られた変異アルカリフォスファターゼは、比活性において３．９倍の上昇が得られたのみであり、仔牛小腸由来のものに匹敵しない。
【０００５】
自然界から高い比活性を有するアルカリフォスファターゼを獲得しようとする試みもあり、好アルカリ性バチルス・エスピー（Bacillus sp.）由来の酵素（M,Nomoto et al.,Agric.Biol.Chem.,52(7),1643(1988)）やバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）由来の酵素に関する報告（Hulett,F.M.,J.Gen.Microbiol.,132,2387(1986)）がある。
しかしながら、前者は比活性１６５０Ｕ／ｍｇであって、仔牛小腸由来酵素の比活性に匹敵するとはいい難い。また後者は比活性２１１５．９Ｕ／ｍｇながら、その酵素活性測定は５５℃においてであり、実用的な３７℃ではその７割以下であると予想されるデータが示されている（Hulett,F.M. et al.,Biochemistry,10(8),1364(1971)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記酵素より高純度、安定性が高く、しかも仔牛小腸由来酵素程度の比活性を有するアルカリフォスファターゼを微生物から得ることが求められていた。
本発明の目的はかかるアルカリフォスファターゼを使用する試料中のリガンドを検出する方法、生体試料中のリガンドの検出方法、そのための試薬、試料中のリガンドを定量する方法、試料中の核酸配列決定法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは検出感度が高く、安定性に優れ、かつバックグラウンドが低いバインディングアッセイ方法およびそれを使用する試薬を安価に作製するために、鋭意研究を重ねた結果、安定性が良く、比活性が高く、かつバックグラウンドの原因と考えられる糖鎖を持たないアルカリフォスファターゼを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中のリガンドを検出する方法である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
また、本発明は(i) 下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで直接的または間接的に標識されたリガンドに対する特異的結合物質または(ii)リガンドに対する特異的結合物質および下記理化学的性質を有するアルカリホスファーゼで標識されたリガンド、および(iii) アルカリホスファターゼ測定試薬を含有する生体試料中のリガンド検出試薬である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
さらに、本発明は(i) アビジン化合物またはビオチン化合物を結合し、リガンドに対して特異的な親和性を有する物質および(ii)ビオチン化合物またはアビジン化合物を結合する下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼおよび(iii) アルカリホスファターゼを測定する物質を含有する生体試料中のリガンド検出試薬である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
本発明は標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中のリガンドを定量する方法である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
本発明は標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法である。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
【発明の実施の形態】
本発明の試料中のリガンドを検出する具体な方法は、試料中のリガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用し、該反応により結合した物質に結合するアルカリホスファターゼ活性を測定するか、あるいは結合しなかったアルカリホスファターゼ活性を測定する方法である。
【００１４】
本発明において、試料中のリガンドとしては、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは核酸などが例示される。
リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応としては、抗原抗体反応、ホルモン−ホルモンレセプター反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などがある。
【００１５】
本発明に使用するアルカリフォスファターゼは、上記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼであれば、いずれの起源のものを用いても良い。好適なものとしては、バチルス（Bacillus）属のアルカリフォスファターゼなどがある。例えば、バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＴＥ３４９２、バチルス・バディウスＴＥ３４９３のアルカリフォスファターゼやバチルス・バディウスＴＥ３４９７のアルカリフォスファターゼが例示される。
【００１６】
バチルス・バディウスＴＥ３４９２のアルカリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に作用する。
３．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０
５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
６．至適温度：６０℃以上
７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
９．糖鎖を有さない。
１０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）〕
バチルス・バディウスＴＥ３４９３のアルカリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に作用する。
３．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０
５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）
６．至適温度：６０℃以上
７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
９．糖鎖を有さない。
１０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）〕
バチルス・バディウスＴＥ３４９７のアルカリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りである。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリセロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フォスフォエタノールアミン、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸に作用する３．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する）
４．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０
５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間）
６．至適温度：６０℃以上
７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
９．糖鎖を有さない。
１０．熱安定性：７０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）〕
これらのアルカリホスファターゼを製造する方法としては、バチルス属に属し、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼ生成能を有する菌株、例えば、バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＴＥ３４９２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８３）、バチルス・バディウスＴＥ３４９３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８４）、バチルス・バディウスＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２０）を培地にて培養し、培養物より該アルカリホスファターゼを採取する方法がある。
アルカリホスファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。またアルカリホスファターゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くしておくことが望ましい。
【００２０】
培地は通常、振盪培養、あるいは通気攪拌培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御するのがよい。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリホスファターゼが生産蓄積される。
【００２１】
本発明の酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよい。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。また、これらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。
【００２２】
次に本発明のアルカリホスファターゼの活性測定法を示す。
まず下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予備加温する。
【００２３】
本発明において、アルカリホスファターゼで標識される物質としては、例えば、抗原としてはタンパク質、核酸などの高分子物質などが挙げられる。最近、良く用いられている抗原のエピトープ部位をデサインしたペプチドも使用することができる。また抗体としては通常、使用されるもの、例えばヤギ、ウサギ、モルモットなどに免疫して得られるポリクローナル抗体、マウス腹水等のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体、更にこれらの抗体をプロテアーゼ処理して得られる抗原結合活性フラグメント（Ｆａｂ’）などを使用することができる。遺伝子組変え技術で得られるＦｖ抗体、一本鎖Ｆｖ抗体等抗原結合活性を有するタンパク質を使用することも可能である。
【００２４】
本発明において、アルカリホスファターゼは、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を有する物質のいずれか一方に結合されていることが好ましい。
【００２５】
アルカリフォスファターゼを上記抗原や抗体などに標識する際に使用する方法としては、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジスルフィド法などを用いることができるが、好ましいのはマレイミド法のように抗原、抗体や酵素の活性を低下させない方法である。
【００２６】
抗体や抗原１分子に導入される標識用酵素としては、通常、１分子以上、好ましくは２分子以上結合した酵素標識体を使用することが望ましい。
【００２７】
本発明の具体例な例としては、試料中のリガンド、例えば抗原または抗体とアルカリホスファターゼを結合した該リガンドに特異的な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原を反応させ、反応生成物と未反応生成物を分離した後、反応生成物に結合したアルカリホスファターゼ活性または未反応生成物のアルカリホスファターゼ活性を測定する。
【００２８】
標識物質としてアリカリホスファターゼを用いる免疫学的測定法は、抗体、抗原のいずれを測定する場合にも、競合法、もしくは非競合法のヘテロジニアス法に使用することができる。いずれの方法においても一次抗体のみならず、二次抗体を用いる方法においても、それらにアルカリホスファターゼを標識することができる。また二次抗体の代わりに、プロテインＡ、プロテインＧのようなＦｃレセプターにアルカリホスファターゼを標識して使用できる。
【００２９】
また、本発明の方法の別な具体例としては、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を有する物質を固相に結合しているリガンドの検出法がある。固相としては、従来既知のものを使用すれば良く、例えばポリスチレンビーズなどが挙げられる。
【００３０】
また、他の具体的な例としては、アビジン化合物またはビオチン化合物がリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原に結合し、アルカリホスファターゼがビオチン化合物またはアビジン化合物に結合して、リガンド、例えば抗原または抗体とリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原との親和性反応と同時に、またはその後にアビジン化合物−ビオチン化合物結合反応を行い、該反応により結合したアルカリホスファターゼ活性または残存するアルカリホスファターゼ活性を測定する試料中のリガンドの検出法がある。ここにアビジン化合物とはビオチン化合物と強く結合する糖タンパク質であり、例えばアビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。また、ビオチン化合物とはビタミンＢ複合体の１つであり、例えばビオチンなどが挙げられる。
【００３１】
アビジン化合物とビオチン化合物、就中アビジンとビオチンの結合定数は、１０15Ｍ-1レベルで非常に高いこと、アビジン化合物、就中アビジンは４つのビオチン結合部位を持つこと、ビオチン化合物を導入することは、例えば抗体などの活性の損失が少ないことによりアビジン化合物−ビオチン化合物系は大きなメリットを有している。
【００３２】
例えば固相サンドウイッチ免疫測定法において、固相に固定化した抗体と試料を反応させ、さらにビオチン化合物を結合した抗体と反応させた後、反応生成物中のビオチン化合物または未反応生成物中のビオチン化合物をアルカリホスファターゼで標識したアビジン化合物により検出する。アビジンおよび類縁物質のストレプトアビジンは分子量５万程度のタンパク質であり、これらはアルカリホスファターゼとグルタルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジスルフィド法などを用いて結合することができる。
【００３３】
一方、ビオチン化合物に代えてアビジン化合物を結合する抗体を使用した場合、抗原抗体反応の後、アビジン化合物とアルカリホスファターゼで標識したビオチン化合物により検出する。アルカリホスファターゼをビオチン化する試薬は市販されており、例えばビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステル、ビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−スルホコハク酸イミドエステル、ビオチノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステルなどを挙げることができる。
【００３４】
本発明の試料中のリガンド検出試薬とは、前記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリガンドに対する特異的結合物質または前記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリガンドおよびアルカリホスファターゼ測定試薬を含有する。アルカリホスファターゼ測定試薬としては、発色基質、蛍光基質、発光基質などが例示される。
【００３５】
発色基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、１−ナフトールフタレインモノリン酸（特公平５−１３９５８号公報）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸およびそれとニトロブルーテトラゾリウムとの組み合わせなどが挙げられる。
また、蛍光基質としては、４−メチルウンベリフェリルリン酸、フェナレノン−６−リン酸とその類縁化合物、ベンズフェナレン−６−リン酸とその類縁化合物（特開昭６２−１９０１９１号公報）などが挙げられる。
さらに、発光基質としては、ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤ等の１，２−ジオキセタン化合物またはそれらの誘導体およびこれらの化合物とエンハンサー、例えば界面活性剤、蛍光性物質またはタンパク質などの混合物などが挙げられる。
【００３６】
本発明のこれら基質の濃度は、０．０１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。本発明の酵素反応は、通常、ｐＨ７〜１１で行うが、至適ｐＨを考慮すると、ｐＨ８〜１１で酵素反応することが望ましい。使用する緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエタノールアミン塩酸緩衝液、トリエタノールアミン塩酸緩衝液、重炭酸緩衝液、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩酸緩衝液、バルビタール緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ−２−メチルプロパノール塩酸緩衝液、アミノアルコール系緩衝液などを例示することができる。これらの緩衝液の濃度は、５〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。
【００３７】
反応生成物に結合する酵素または未反応生成物に結合する酵素の活性は、アルカリホスファタゼ活性をレート法で測定することより実施できるが、上記基質と酵素結合体を一定時間反応させ、反応停止後に該生成物を検出することによっても行うことができる。停止剤として使用できるものとしては、アルカリ溶液、酵素阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、無機リン酸等が使用できる。また反応停止後、強アルカリ条件にすることにより、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ジオキセタン化合物等の基質では、感度を更に上げることができる（特開平２−２７３１９９号公報）。
【００３８】
本発明に使用する緩衝液中にはアルカリフォスファターゼの不活性化を防ぐために金属塩を添加することが望ましい。使用できる金属塩としてはマグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、カルシウム塩が挙げられるが、好ましくはマグネシウム塩とコバルト塩である。好ましいマグネシウム塩の添加濃度は０．０５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸マグネシウム等のマグネシウム錯化合物を使用することができる。好ましいコバルト塩の添加濃度は０．０２〜５ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸コバルト、塩化コバルト、クエン酸コバルト、硫酸コバルト、エチレンジアミン四酢酸コバルト等のコバルト錯化合物を使用することができる。マグネシウム塩とコバルト塩を併用することが望ましいが必須ではない。
【００３９】
本発明の実施に有用な界面活性剤は、アルカリフォスファターゼ活性を大きく阻害しない任意のものを使用することができる。一般に有用な界面活性剤は非イオン性界面活性剤であるが、両性界面活性剤およびイオン性界面活性剤も使用できる。
また本発明には水と混和しうる有機溶媒の併用も可能である。その例としてメタノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ヘキサメチレンホスホアミドなどである。
【００４０】
さらに、本発明の試薬には酵素反応を円滑に行わせるため、あるいはその構成成分の活性を維持するため、他の化合物を添加してもよい。このような化合物として、例えば安定化剤、賦形剤が挙げられる。またバックグラウンドや非特異反応の低減にアルカリフォスファターゼの不活化型酵素を添加することは有効である。
【００４１】
本発明は上記固相サンドウイッチ免疫測定法のみならず、ホルモン−レセプター親和性を利用したホルモンやそのレセプターの測定、核酸−核酸親和性、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ反応またはＤＮＡ−ＲＮＡ反応などを利用した測定などにも用いることができる。
【００４２】
本発明の核酸を検出する具体的な例としては、捕捉オリゴヌクレオチドを固定した部材に核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料を作用させ、次いでアルカリホスファターゼを標識した検出オリゴヌクレオチドを作用させて、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した核酸と標識した検出オリゴヌクレオチドとの核酸ハイブリダイゼーションを行い、未反応の検出オリゴヌクレオチドを分離した後、核酸ハイブリダイゼーションされた結合体のアルカリホスファターゼ活性を測定することにより、試料中の核酸を検出する方法がある。
【００４３】
試料中の核酸としては、ＤＮＡまたはＲＮＡなど、１本鎖または２本鎖核酸が例示される。試料としては、血清、尿、リンパ液などの体液、各種組織などの材料が例示される。
【００４４】
本発明のアルカリホスファターゼとＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体の作製は、例えば M.Renz and C.Kurz,Nucleic Acids Res.,12(8),3435(1984)に記載の方法を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼとポリエチレンイミンを架橋して、コンジュゲートを作製した後、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドをグルタルアルデヒドにより架橋させ、標識核酸を得る。
またオリゴヌクレオチドを合成する場合、その５’末端や任意の鎖にスペーサーアームを介して、直接、アミノ基やチオール基を導入する試薬が市販されており、これらの試薬とアルカリホスファターゼをグルタルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、コハク酸イミドエステル法、ピリジン−ジスルフィド法により結合して、オリゴヌクレオチドにアルカリホスファターゼを導入することもできる。
【００４５】
試料としてはＤＮＡが例示され、ＤＮＡを鋳型として伸長反応を行う際、ビオチン化プライマーもしくはビオチン化ターミネーター等を利用して、ビオチンをＤＮＡ断片に取り込ませる。
次に電気泳動により断片を展開した後、アビジン化アルカリホスファターゼもしくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファターゼと反応させて、上記断片を検出する。
【００４６】
更には、本発明は試料中の核酸を取り出して、核酸ハイブリダイゼーションを行う方法に代えて、細胞中で核酸ハイブリダイゼーションを行うin situ ハイブリダイゼーションにも使用可能である。
【００４７】
本発明の他の具体例としては、標識として、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法がある。配列決定にはジデオキシターミネーション法、マキサム−ギルバート法など公知の手法を選択することができる。例えば、ジデオキシターミネーション法を用いる場合、以下の方法が例示される。
まず配列を決定すべき核酸（一本鎖もしくはアルカリ変性した２本鎖）にビオチン化プライマーをハイブリダイズさせ、さらに１種のジデオキシリボヌクレオチド（例えばｄｄＡＴＰ）を４種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）および核酸合成酵素（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素、Ｔ７ポリメラーゼ等）とともに加え、伸長反応と停止反応を同時に行わせる。他の３種のジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴｐ）についても同様に反応をおこなわせ、得られる４種の反応液をそれぞれシークエンスゲル上の電気泳動に付した後、アビジン化アルカリフォスファターゼもしくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファターゼを反応させ、発色基質等を用いて種々の伸長断片を検出、各レーンを比較対照することにより核酸配列を決定する。
上記アルカリホスファターゼ標識核酸を用いる核酸配列決定用試薬としては、該酵素を直接的または間接的に結合するＤＮＡまたはＲＮＡとアルカリホスファターゼ測定試薬を包含する。
【００４８】
【本発明の効果】
本発明で特定されるアルカリホスファターゼを使用するバインディングアッセイ用試薬、それによる試料中のリガンド検出法は、高感度であって、長期保存性に優れる。しかも目的物質の検出にあたり、バックグラウンドの少ない良好な結果を与えることができる。
【００４９】
【実施例】
以下、参考例、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
参考例１
３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌として、バチルス・バディウムＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２０）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌに移し、３００ｒｐｍ，通気量２１／分、３０℃で２０時間培養した。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロールクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比活性２，３００Ｕ／ｍｇにまで精製した。
【００５０】
得られたアルカリホスファターゼは下記特性を有していた。
１．下記の反応を触媒した。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．基質特異性
【００５１】
【表１】
３．Ｋｍ値
ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は０．２８ｍＭであった。
４．至適ｐＨ
０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）中での酵素活性を測定した。至適ｐＨは９．５〜１０であった。
５．安定ｐＨ
グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１０）で２６℃、１６時間保存して、その残存活性を測定した。安定ｐＨはｐＨ６〜１１であった。
６．至適温度
各温度における酵素活性を測定した。至適温度は６０℃以上であった。
７．熱安定性
本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。７０℃まで安定であった（但し、８０％以上の残存活性がある場合を安定であると定義する）。
８．活性化および安定化剤
Ｍｇ2+およびＣｏ2+が必須であった。
９．分子量
１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法）
６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
１０．糖含量
糖は検出されなかった。
【００５３】
実施例１
（１）アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧの作製
参考例１のアルカリフォスファターゼ５ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む）２．５ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液３５μｌを加え、２５℃で５０分間インキュベートした。次に、２．５ｍｇのヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を含む０．５ｍｌ ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を加え、２５℃で更に７５分間インキュベートした。次に２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．７を１５０μｌ添加後、４℃で３０分間撹拌し、１５０ｍｇのＮａＢＨ4 を含む水溶液を１５０μｌ添加後、４℃で１５時間インキュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグラフィー（溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ ＮａＮ3 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を使用）で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得した。
【００５４】
（２）ヒトＣＲＰの検量線
ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個にヒトＣＲＰ ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した（図１）。
【００５５】
比較例１
仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）５ｍｇを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２．５ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液１５０μｌを加え、実施例１と同様に操作を行い、酵素標識抗体を取得した。
上記酵素標識抗体を用い、実施例１と同様にヒトＣＲＰについての検量線を作製した（図１）。特異発色（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本発明のアルカリフォスファターゼ１２．５に対して、ＣＩＡＰは５．１３であり、本発明のアルカリフォスファターゼの方が非特異吸着が小さかった。
【００５６】
実施例２
（１）アルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆａｂ’の作製
ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆ（ａｂ’）2 （バインディングサイト社）５ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０ １ｍｌに０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０ １００ｍｌを加え、３７℃、９０分間インキュベートした。該混合液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。一方、本発明のアルカリフォスファターゼ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む）５００μｌに０．１ｍｇ Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを含むジメチルホルムアミド１０μｌを加え、３０℃で３０分間インキュベートした。得られた液は１ｍＭＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。
調製したヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆａｂ’にマレイミド化アルカリフォスファターゼを加え、４℃、２０時間インキュベートした。次に１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミン ５０μｌを加え、２５℃で２０分間インキュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得した。
【００５７】
（２）ヒトＣＲＰの検量線 ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（株式会社日本バイオテスト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個に、ヒトＣＲＰ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した（図２）。
【００５８】
比較例２
ＣＩＡＰ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ2 、３Ｍ ＮａＣｌを含む）５００μｌについて実施例２と同様の操作を行い、酵素標識抗体を取得した。
上記酵素標識抗体を用い、実施例１同様ヒトＣＲＰについての検量線を作成した（図２）。特異発色（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本発明のアルカリフォスファターゼ５５．２に対して、ＣＩＡＰは３４．８であり、本発明のアルカリフォスファターゼの方が非特異吸着が小さかった。
【００５９】
実施例３ （１）ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼの作製 ストレプトアビジン４ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５ ６００μｌに０．１ｍｇ Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンハイドライドを含むジメチルホルムアミド１０μｌを添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。次に０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０ ２０μｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０ １２０μｌ、１Ｍ塩酸ハイドロキシルアミン１２０μｌを添加し、３０℃で５分間インキュベートし、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、６００μｌに濃縮した。実施例２で作製したマレイミド化アルカリフォスファターゼ溶液１００μｌに作製したメルカプトスクシニル化ストレプトアビジン１００μｌを加え、４℃、２０時間インキュベート後、得られた混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素標識ストレプトアビジンとした。
【００６０】
比較例３
ＣＩＡＰについて実施例３と同様な方法で酵素標識ストレプトアビジンを作製した。
常法に従い、イモビロン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、本発明の酵素標識ストレプトアビジン及びＣＩＡＰ標識ストレプトアビジン０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間インキュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に０．５ｎｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出することができた。
次に本発明の酵素標識ストレプトアビジンおよびＣＩＡＰ標識ストレプトアビジンを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で４０℃に７日間保存して、アルカリフォスファターゼ活性を比較した。結果を図３に示すが、本発明の酵素標識ストレプトアビジンの方が安定であった（図３）。
【００６１】
実施例４
（１）ビオチニル化アルカリフォスファターゼの作製
本発明のアルカリフォスファターゼ６ｍｇを含む３０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ２を含む）６００μｌに０．１２８ｍｇ Ｄ−ビオチニン−ε−アミノカプリン酸−Ｎ−ハイドロキシスクシイミドエステルを含むジメチルホルムアミド２０μｌを加え、２５℃で３時間撹拌した後、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ＮａＮ3 を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に対して透析した。
【００６２】
比較例４
ＣＩＡＰについて実施例４と同様の方法でビオチニル化アルカリフォスファタを作製した。
常法に従い、イモビロン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、１μｇ／ｍｌの本発明のビオチニル化アルカリフォスファターゼ及びビオチニル化ＣＩＡＰ０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間インキュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に５０ｐｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出することができた。
次に本発明のビオチニル化アルカリフォスファターゼおよびビオチニル化ＣＩＡＰを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で熱アルカリフォスファターゼ活性の熱安定性を比較した。結果を図４に示すが、本発明のビオチニル化アルカリフォスファターゼの方が安定であった。
【００６３】
実施例５
（１）アルカリフォスファターゼ標識プローブ
Ｕｎｉ−ＬｉｎｋTMＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ（クローンテック社製）を５’端に組み込んだ下記配列のオリゴヌクレオチドを通常の方法で合成し、精製した。
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴ−３’
上記プローブ１０ｎｍｏｌｅを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １０μｌにジスクシミジルスベリン酸溶液（１０ｍｇ／ｍｌ−ＤＭＳＯ）５０μｌ加え、攪拌後、２５℃１５分間反応させ、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過し、最初のオリゴヌクレオチドを含むピークを分取した。該ピークを１００μｌに濃縮し、本発明のアルカリフォスファターゼ１．５ｍｇを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ４０μｌを加え、２５℃で一晩反応した。
該混合物に約５００μｌの１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０を加えた後、ＭｏｎｏＱ（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグラフィー（溶出液Ａ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、溶出液Ｂ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で精製した。
【００６４】
比較例５
ＣＩＡＰについて実施例５の方法で、ＣＩＡＰ標識プローブを作製した。
本発明の酵素標識プローブおよびＣＩＡＰ標識プローブを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含むＰＢＳで７０℃で２時間処理して、アルカリフォスファターゼ活性を比較した。結果は図５に示すように、本発明の酵素標識プローブの方が安定であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧを用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を示す。
【図２】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヒツジ抗ヒトＣＲＰＦａｂ’を用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を示す。
【図３】ストレプトアビジンによる本発明の酵素標識体とＣＩＡＰ標識体の保存安定性の比較を示す。
【図４】ビオチンによる本発明の酵素標識体とＣＩＡＰ標識体の熱安定性の比較を示す。
【図５】本発明の酵素およびＣＩＡＰ標識プローブの熱安定性を示す。
Claims (20)
- 標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中のリガンドを検出する方法。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
- 試料中のリガンドを検出する方法が、試料中のリガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、該反応により結合した物質に結合するアルカリホスファターゼ活性を測定するか、あるいは結合しなかったアルカリホスファターゼ活性を測定する方法である請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、アルカリホスファターゼがリガンドに対して特異的な親和性を有する物質に直接的または間接的に結合する請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、アルカリホスファターゼがリガンドに直接的または間接的に結合する請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- アビジン化合物またはビオチン化合物が結合したリガンドに対して特異的な親和性を有する物質と、アルカリホスファターゼとビオチン化合物またはアビジン化合物との結合とを、リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応と同時に、またはその後にアビジン化合物−ビオチン化合物結合反応に付し、該反応により結合したアルカリホスファターゼ活性または残存するアルカリホスファターゼ活性を測定する請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドが抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは核酸である請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、該親和反応が抗原抗体反応である請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、該親和反応がホルモン−ホルモンレセプター反応である請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、該親和反応が核酸ハイブリダイゼーション反応である請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであり、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を有する物質のいずれか一方が固相に結合している請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。
- 下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリガンドに対する特異的結合物質または下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識されたリガンドおよびアルカリホスファターゼ測定試薬を含有する生体試料中のリガンド検出試薬。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
- (i) アビジン化合物またはビオチン化合物を結合するリガンドに対して特異的な親和性を有する物質および(ii)ビオチン化合物またはアビジン化合物を結合する下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼおよび(iii) アルカリホスファターゼを測定する物質を含有する生体試料中のリガンド検出試薬。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
- アルカリホスファターゼ測定試薬が１，２−ジオキセタン化合物またはこの誘導体、フェナレノン−６−リン酸、ベンズフェナレン−６−リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、１−ナフトールフタレインリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸またはこれらの化合物の誘導体である請求項１１または１２記載の生体試料中のリガンド検出試薬。
- リガンドが抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは核酸である請求項１１または１２記載の試料中のリガンド検出試薬。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質とが親和性反応性であって、親和性反応が抗原抗体反応である請求項１１または１２記載の試料中のリガンド検出試薬。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応性であって、親和性反応がホルモン−ホルモンレセプター反応である請求項１１または１２記載の試料中のリガンド検出試薬。
- リガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有する物質との親和性反応性であって、親和性反応が核酸ハイブリダイゼーション反応である請求項１１または１２記載の試料中のリガンド検出試薬。
- リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を有する物質のいずれか一方が固相に結合している請求項１１または１２記載の試料中のリガンドの検出試薬。
- 標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中のリガンドを定量する方法。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
- 標識として、下記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法。
１．次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸
２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義する）
３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも３０分間安定である。
４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ
５．糖鎖を有さない。
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