JP5647951B2

JP5647951B2 - 安定化された高アルカリ性試薬及び測定方法

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Publication number: JP5647951B2
Application number: JP2011144465A
Authority: JP
Inventors: 洋平齊藤
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2031-06-29
Also published as: JP2013011519A

Description

本発明は、開封後に大気中の炭酸ガスを吸収してｐＨが低下することにより感度が経時的に変化する高アルカリ性試薬の安定化に関する。

体液中因子の定量において、その反応特性から高アルカリ性緩衝液からなる試薬がしばしば用いられる。例えばｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン法（以下、ｏ−ＣＰＣ法と略称する）試薬を用いたカルシウム定量試薬、アルカリホスファターゼ活性測定試薬においてｐＨ９．５以上の緩衝液が用いられている。

これら高アルカリ性緩衝液を用いた試薬は開封後に大気中の二酸化炭素を吸収し、徐々に感度が低下するために検量線保持期限が短く、頻回のキャリブレーションを必要とするという問題点がある。Ｃａ測定試薬においては弱酸性から中性域で測定可能なアルセナゾIII（特許文献１）やクロロホスホナゾIIIを用いた比色法（特許文献２）、あるいはホスホリパーゼＤ（特許文献３）やアミラーゼを用いた酵素法（特許文献４）などが感度の安定な試薬として注目されるようになってきたし、アルカリホスファターゼ測定試薬においても緩衝液濃度を上げることでｐＨ変動を抑える試みがなされている。

アルセナゾIII法やクロロホスホナゾIII法はｏ−ＣＰＣ法の問題点を解決したかに見えたが、アルセナゾIII自体が砒素化合物であり、環境への負荷が問題視されることがあること、クロロホスホナゾIIIにおいては色素の色が濃く、それだけで敬遠される場合もある。臨床検査薬製造業者として、着色が少なく、ブランクの低い色素であるｏ−ＣＰＣで開封後の安定性が確保できれば臨床検査技師に価値のある選択肢を提供することができる。

アルカリホスファターゼ活性測定において、高アルカリ性緩衝液とｐ−ニトロフェニルリン酸基質液の液量比を調節し、緩衝液濃度を増加することで開封後の感度低下を抑える試みもなされている（特許文献５）。しかし緩衝液濃度を増加させたアルカリホスファターゼ試薬は確かに安定性が格段に向上するものの、緩衝液濃度を増加させたことにより粘度も増加し、分注精度不良や混合時後に反応液を均一に分散させるのに時間を要するなどの問題も抱えており、全ての自動分析装置において広く使える技術とは言い難い。

水性試薬と混和しない空気遮断剤を試薬液面に重層させ、試薬を安定化させる方法も複数考案されている（特許文献６）。試薬中に界面活性剤が含まれる場合には空気遮断剤が試薬に溶けだし、効果が得られなくなるという問題点が存在する。様々な目的で界面活性剤を試薬に添加することは一般的に行われており、これも広く使える技術とは言い難い。

特許第４１２３１８１号明細書特許第４１５１０２３号明細書特許第４０４５３１５号明細書特許第２６９９１４７号明細書特許第４０２２５８８号明細書特許第４０９２０１８号明細書

従って、本発明の課題は、上記問題点を解決することのできる、高アルカリ性試薬であっても経時的な測定感度低下を抑える方法、及び経時的な測定感度低下を抑えた試薬を提供することである。

本発明は、
［１］揮発性の水溶性溶媒を含有する高アルカリ性緩衝液試薬を含む、生体物質の測定試薬、
［２］前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランからなる群から選んだ少なくとも一つである、［１］の試薬、
［３］高アルカリ性緩衝液試薬中に前記揮発性の水溶性溶媒を最終濃度５〜２０％含有する、［１］又は［２］の試薬、
［４］前記高アルカリ性緩衝液のｐＨが９〜１２である、［１］〜［３］のいずれかの試薬、
［５］前記生体物質の測定が、ｏ−ＣＰＣ法Ｃａ測定又はアルカリホスファターゼ測定である、［１］〜［４］のいずれかの試薬、
［６］揮発性の水溶性溶媒を含有する高アルカリ性緩衝液を利用することを特徴とする、生体物質測定の安定化方法、
［７］高アルカリ性緩衝液試薬を使用する生体物質測定において、前記高アルカリ性緩衝液試薬に揮発性の水溶性溶媒を添加することを特徴とする、前記測定における経時的な測定感度の変動を抑制する方法、
［８］前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランからなる群から選んだ少なくとも一つである、［６］又は［７］の方法、
［９］前記高アルカリ性緩衝液のｐＨが９〜１２である、［６］〜［８］のいずれかの方法、
［１０］前記生体物質が、カルシウム又はアルカリホスファターゼである、［６］〜［９］のいずれかの方法、
に関する。

本発明によれば、高ｐＨ（高アルカリ性）緩衝液の使用が必須である測定方法において、その測定感度の経時的な低下を抑えることができる。そのため、特にＣａ測定においては、長年にわたって使用実績のある安価な比色法であるｏ−ＣＰＣ法に本発明を利用することにより、これを安定な試薬として簡便に使用可能であり、また、アルカリホスファターゼ活性測定試薬においても、本発明を利用することにより、これを粘度の問題が生ずること無く簡便に使用することができ、臨床検査において非常に有用である。

アルカリホスファターゼ測定において、高アルカリ性の第一試薬中にメタノールを添加したことによる試薬開封後の安定化効果を示すグラフである。アルカリホスファターゼ測定において、高アルカリ性の第一試薬中にエタノールを添加したことによる試薬開封後の安定化効果を示すグラフである。ｏ−ＣＰＣ法を用いるＣａ測定において、高アルカリ性の第一試薬中にエタノールを添加したことによる試薬開封後の安定化効果を示すグラフである。

本発明は、測定に使用する溶液に高ｐＨ（高アルカリ性）緩衝液を使用する方法に用いることができるが、例えば、カルシウムを測定するためのｏ−ＣＰＣ法やＭＸＢ法、また、アルカリホスファターゼ活性測定、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）活性測定などが挙げられる。特に、ｏ−ＣＰＣ法やアルカリホスファターゼ活性測定においては、課題となっていた安定性の低下を大幅に改善できるので好ましい。

本発明は、少なくとも高アルカリ性緩衝液に揮発性の水溶性溶媒を含有させることで開封後の感度低下を抑えることができる。
本発明で用いる揮発性の水溶性溶媒としては、当業者であれば、公知の溶媒を適宜使用することができるが、少なくとも極性があり、沸点が１００℃以下で水溶性であって、容易に揮発するものであれば良く、例えば、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランが挙げられる。特に、エタノール、メタノールが好ましい。また、これらを単独で含有させても、２つ以上組み合わせて含有させても良い。

本発明における揮発性の水溶性溶媒の添加量は、当業者であれば、適宜設定することができるが、高アルカリ性緩衝液としても揮発性を有し、測定対象物（生体物質）の測定に影響を与えない量であれば良い。具体的には、揮発性の水溶性溶媒の濃度は５〜２０％が好ましく、更に好ましくは１０〜２０％である。濃度が不十分であると十分に感度低下を抑えることができないし、濃度が過剰であると揮発が作業環境に悪影響を及ぼしたり、長期的には保存容器を劣化させ、試薬中に樹脂成分を溶出させるリスクがあり、正確な測定の障害となる。当業者であれば、測定対象、測定試薬に合わせて、好適な条件を設定することができる。

本発明の測定方法は、測定対象物（生体物質）と試薬との反応の際に、上記揮発性の水溶性溶媒を含有した高アルカリ性緩衝液を使用すること以外は、公知の測定方法と同様に実施することができる。以下、ｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定、及びアルカリホスファターゼ活性測定を例として、具体的に説明する。

カルシウムとｏ−ＣＰＣとを反応させる場合、反応系のｐＨは、通常、ｐＨ１０〜１２である。また、アルカリホスファターゼ活性測定試薬における反応系のｐＨは通常９．５〜１１．０である。
一般的なｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定試薬は、反応時のｐＨを保つための第一試薬（高アルカリ性緩衝液）と、基質としてｏ−ＣＰＣを含む第二試薬（酸性〜中性）とから構成されている。また、同様に、アルカリホスファターゼ測定試薬は、反応時のｐＨを保つための第一試薬（高アルカリ性緩衝液）と、リン酸エステルの人工基質からなる第二試薬（酸性〜中性）から構成されるものや、リン酸エステルの人工基質からなる第一試薬（酸性〜中性）と反応時のｐＨを保つための第二試薬（高アルカリ性緩衝液）から構成されている。
測定手順は、測定対象物（生体物質）を含む試料を、第一試薬と反応させて生じた発色を測定し、次いで、第二試薬と反応させて再度生じた発色を測定し、それらの変化から、測定対象物（生体物質）の有無や量を決定することによる。前記反応に基づく発色は、適宜、測定に好適な波長を設定し、測定できる。また、測定は、汎用の自動分析装置（例えば、日立７１８０型）を使用可能である。

本発明のカルシウム測定試薬やアルカリホスファターゼ測定試薬は、高アルカリ性緩衝液である第一試薬や第二試薬に、本発明の揮発性の水溶性溶媒を含有させれば良い。これらの試薬は、通常、数十回から数百回分の測定が可能な量が一つの試薬瓶に入って提供される。また、輸送や保存のために厳重にキャッピングされていることが多い。しかし、一度、蓋が取られてしまうと、酸化が進みｐＨが低下する原因となる。よって、これらの高アルカリ性緩衝液に、予め本発明の揮発性の水溶性溶媒を含有させた方が好ましい。このようにすることで、開封後直ぐの測定値と開封後数日後の測定値を一定にすることができるので、測定者が容易に測定を実施することができる。

本発明で使用する高アルカリ性緩衝液は、緩衝液、上記水溶性揮発性溶媒に加え、必要により、例えば、金属マスキング剤（例えば、８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノリン５−スルホン酸、ＥＤＴＡ等）、塩類（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等）、及び／又は各種界面活性剤などを適宜添加することができる。
本発明で使用する生体試料としては、全血、血漿、血清、リンパ液、髄液、唾液、尿などが挙げられる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ＪＳＣＣ標準化対応アルカリホスファターゼ試薬中における揮発性の水溶性溶媒の効果》
アルカリホスファターゼ測定試薬は、高アルカリ性緩衝液からなる第一試薬と基質液からなる第二試薬で構成されている。高アルカリ性緩衝液は大気中の炭酸ガスを吸収し、経時的にｐＨが低下するため、ｐＨ１０近傍に反応至適条件のあるアルカリホスファターゼ測定試薬において、高アルカリ性緩衝液試薬ボトル開封後から経時的な感度低下が起こる。本発明者らは揮発性の溶媒をアルカリ試薬に添加し、経時的に揮発させることで見かけ上の感度低下を抑えることができるのではないかと考えた。本実施例では、エタノール、メタノールをアルカリホスファターゼ試薬の第一試薬に添加し、その効果を確認した。

試料
生理食塩水
ＡＬＰ標準液（酵素キャリブレータープラス、シスメックス株式会社）
コントロール血清（ＱＡＰトロール１Ｘ、シスメックス株式会社）
試薬
第一試薬
ｐＨ１０．０
１．２７ｍｏｌ／Ｌエチルアミノエタノール（関東化学株式会社）
０．６３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム（和光純薬工業株式会社）
第一試薬に最終濃度、０％あるいは１０％のエタノール、またはメタノールを添加した。
第二試薬
７５.８ｍｍｏｌ／Ｌｐ−ニトロフェニルリン酸（和光純薬工業株式会社）

測定
測定は、以下の手順で行った。自動分析装置（日立７１７０Ｓ型）を用い、試料２．０μＬと第一試薬１６０μＬとを３７℃にて５分間保温し、第二試薬４０μＬを添加してさらに５分間保温した。主波長７００ｎｍ／副波長８００ｎｍでの第二試薬混合後の吸光度変化速度からアルカリホスファターゼ活性の定量を行った。生理食塩水と標準液を用いてキャリブレーション後は試薬ボトルのフタを開けたまま自動分析装置試薬庫に静置し、０日（開封時）、１日後、２日後、５日後の経時的な管理血清の測定値の変動を確認した。結果を図１、図２に示す。

図１、図２に示すように、エタノール、メタノールの添加において有意な安定性向上効果が認められた。また、エタノールは測定に何らかの影響を与え、メタノールに比べ、測定値の変化が認められたため、メタノールを用いる方が望ましいことが示唆された。

《実施例２：ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ＣＰＣ）を用いるカルシウム測定系におけるエタノールの効果》
ｏ−ＣＰＣ法Ｃａ測定試薬においても高アルカリ性緩衝液に起因する経時的な感度変動が起こる。アルカリホスファターゼ試薬同様、揮発性の水溶性溶媒であるエタノールの添加によりカルシウム測定値の経時変動を抑えることができるかどうかを確認した。

試料
（Ａ）生理食塩水
（Ｂ）Ｃａ標準液（生化学マルチキャリブレーター、三菱化学メディエンス株式会社）
（Ｃ）コントロール血清（イアトロセーラＣＣ−Ｉ、三菱化学メディエンス株式会社）
第一試薬
ｐＨ１１．０
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ２−アミノエタノール（和光純薬工業株式会社）
０．１ｍｍｏｌ／Ｌほう酸（和光純薬工業株式会社）
第一試薬に最終濃度０％、１０％、１５％、２０％のエタノール、またはメタノールを添加した。
第二試薬
ｐＨ４．２
０．４ｍｍｏｌ／Ｌｏ−ＣＰＣ（株式会社同仁化学研究所）
１５％エタノール（和光純薬工業株式会社）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ８−ヒドロキシキノリン（株式会社同仁化学研究所）
０．１２５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２（和光純薬工業）

測定は、以下の手順で行った。自動分析装置（日立７１８０型）を用い、試料３．０μＬと第一試薬１６０μＬ、第二試薬４０μＬとを３７℃にて５分間保温し、第二試薬８０μＬを添加してさらに５分間保温した。試料と試薬混合して５分後と１０分後の主波長５７０ｎｍ／副波長６６０ｎｍでの吸光度変化量を求めた。生理食塩水と標準液を用いてキャリブレーション後は試薬ボトルのフタを開けたまま自動分析装置試薬庫に静置し、経時的な管理血清測定値の変動を確認した（０日（開封時）、１日後、５日後、８日後、１１日後、１３日後、１５日後、１８日後、１９日後、２０日後、２２日後、２６日後、２８日後、３２日後、３６日後）。各測定ごとに生理食塩水を用いてブランク補正のみを行い、管理血清の測定を行った。

エタノールを添加した場合の結果を図３に示す。図３より、高アルカリ性の第一試薬へのエタノールの添加により、感度変動が有意に抑えられ、ブランク補正実施によって、１週間前後であれば、１０％〜２０％の添加で測定値の変動は見られず、特に１５％〜２０％の添加では２週間以上測定値の変動は見られなかった。なお、ｏ−ＣＰＣ法Ｃａ測定試薬において、Ｍｇ隠蔽剤である８−ヒドロキシキノリンを溶解するために１５％のエタノールが添加されている。このことは基質液にエタノールが添加されていても効果はなく、高アルカリ性緩衝液からなる第一試薬にエタノールを添加されたことが安定性向上において重要であったことを示唆している。

本発明は、臨床検査診断試薬分野におけるカルシウム測定あるいはアルカリホスファターゼの用途に適用することができる。本発明によれば、試薬に頻回のキャリブレーション無く開封後も安定的に測定することが可能であり、臨床検査診断試薬分野で極めて有用である。

Claims

沸点が１００℃以下の揮発性の水溶性溶媒を最終濃度として５〜２０％含有する高アルカリ性緩衝液試薬を含む、生体物質の測定試薬であって、
前記生体物質の測定が、ｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定、ＭＸＢ法によるカルシウム測定、アルカリホスファターゼ測定、乳酸脱水素酵素測定からなる群から選んだ一つであり、
前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランからなる群から選んだ少なくとも一つである、前記試薬。
前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール又はメタノールである、請求項１に記載の試薬。
前記高アルカリ性緩衝液のｐＨが９〜１２である、請求項１又は２に記載の試薬。
前記生体物質の測定が、ｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定又はアルカリホスファターゼ測定である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の試薬。
沸点が１００℃以下の揮発性の水溶性溶媒を最終濃度として５〜２０％含有する高アルカリ性緩衝液を利用する、生体物質測定の安定化方法であって、
前記生体物質測定が、ｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定、ＭＸＢ法によるカルシウム測定、アルカリホスファターゼ測定、乳酸脱水素酵素測定からなる群から選んだ一つであり、
前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランからなる群から選んだ少なくとも一つである、前記方法。
高アルカリ性緩衝液試薬を使用する生体物質測定において、前記高アルカリ性緩衝液試薬に、沸点が１００℃以下の揮発性の水溶性溶媒を最終濃度として５〜２０％添加する、前記測定における経時的な測定感度の変動を抑制する方法であって、
前記生体物質測定が、ｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定、ＭＸＢ法によるカルシウム測定、アルカリホスファターゼ測定、乳酸脱水素酵素測定からなる群から選んだ一つであり、
前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランからなる群から選んだ少なくとも一つである、前記方法。
前記揮発性の水溶性溶媒が、エタノール又はメタノールである、請求項５又は６に記載の方法。
前記高アルカリ性緩衝液のｐＨが９〜１２である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記生体物質測定が、ｏ−ＣＰＣ法によるカルシウム測定又はアルカリホスファターゼ測定である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。