JP2006258673A - 魚類のｉｇｆ−ｉ濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キット - Google Patents

Abstract

【課題】
安全かつ容易に実施できる魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法及び測定キットの提供。
【解決手段】
ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用いた時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法による魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キット。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ビオチン化ＩＧＦ−I（インスリン様成長因子−１）を用いる魚類のＩＧＦ−I濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キットに関する。

従来、ヒラメ、マグロ、タイ等の養殖において、これらの成長に有効な環境条件を検討するために、各環境における魚類の体長の変化をノギス等で測定する数週間の飼育実験が行われてきた。近年、哺乳類等で成長誘導を仲介する成長ホルモンとしてＩＧＦ−Iが知られるようになり、魚類においてもその成長と血中ＩＧＦ−I濃度が高い相関があることが示されている（例えば、非特許文献１参照）。また、魚類へのＩＧＦ−Iの投与により成長が促進されることも示されており（例えば、非特許文献２参照）、魚類の成長に有効な環境条件の検討や、その成長促進のための効率的なＩＧＦ−Iの投与量の決定において、血中ＩＧＦ−I濃度を測定することが有効であると考えられる。

近年では、ＩＧＦ−Iの生理的作用機序の解明等を目的として、様々な生理的状態下にある魚類の血中ＩＧＦ−I濃度の測定が行われている。しかし、この測定には放射性同位元素を用いた方法のみが開発されている。また、放射性同位元素以外にアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素、ユーロピウム等の蛍光物質を用いるという示唆はあるものの、実施には至っていない（例えば、特許文献１参照）。放射性同位元素の使用は、放射性同位元素に曝された使用済みの試験管類の処理コスト、測定者の健康への悪影響、測定場所が専用施設である必要性、放射性元素取扱主任者資格の必要性、定期的な使用状況の検査・報告等について、特別な対策、処置を行うことが法律上の義務として生じるため、容易ではなかった。
そこでこれらの煩雑な対策、処置、測定場所の限定性を解決するために、放射性同位元素を用いず、安全かつ容易に実施できる魚類のＩＧＦ−I濃度の測定方法や測定キットの開発が望まれていた。
特開平８−１４５９９８号公報 Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂ．Ｒ．， Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｋ．Ｄ．， Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ Ｄｉｃｋｈｏｆｆ，Ｗ．Ｗ．（２００１）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａ，１２９，５８５−５９３． ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｓ．Ｄ．， Ｋｅｌｌｙ，Ｋ．Ｍ．， Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．， Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎ，Ｈ．Ａ．（１９９２）Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，８６，３９８−４０６．

上記の状況に鑑み、本発明は、放射性同位元素を用いず、安全かつ容易に実施できる魚類のＩＧＦ−I濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キットの提供を課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、魚類のＩＧＦ−I濃度の測定において、その標識ホルモンとしてビオチン化ＩＧＦ−Iを用い、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンの特異的かつ強力な結合を利用することで、時間分解免疫測定法又は酵素免疫測定法のいずれの測定方法についても実用的な感度で測定ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の測定方法では、放射性同位元素で標識したＩＧＦ−Iを使用せず、ビオチン化ＩＧＦ−Iを用いることで、市販品の抗魚類ＩＧＦ−I抗体やユーロピウム−アビジン複合体又はユーロピウム−ストレプトアビジン複合体、酵素−アビジン複合体等を用い、時間分解蛍光免疫測定法や酵素免疫測定法等により魚類のＩＧＦ−I濃度を測定することができる。さらに、本発明において、魚類のＩＧＦ−I濃度の測定に最適な試薬や抗体等を組合せ、測定キットとすることで、簡単かつ容易に魚類のＩＧＦ−I濃度を測定することができる。

即ち、本発明は次の（１）〜（６）に関する。
（１）ビオチン化ＩＧＦ−Iを用いることを特徴とする魚類のＩＧＦ−I濃度の測定方法。
（２）ビオチン化ＩＧＦ−IをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離し、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を使用する上記（１）に記載の測定方法。
（３）測定方法が時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法のいずれかである上記（１）又は（２）に記載の測定方法。
（４）ビオチン化ＩＧＦ−Iにユーロピウム−アビジン複合体を作用させて、ユーロピウムの蛍光強度を測定することによる時間分解蛍光免疫測定法を用いる上記（３）に記載の測定方法。
（５）ビオチン化ＩＧＦ−Iに酵素−アビジン複合体を作用させて、酵素の活性を蛍光基質を用いることにより測定することによる酵素免疫測定法を用いる上記（３）に記載の測定方法。
（６）上記（１）から（５）のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類のビオチン化ＩＧＦ−I。
（７）上記（１）から（５）のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類のＩＧＦ−I濃度の測定キット。

本発明のビオチン化ＩＧＦ−Iを用いる魚類のＩＧＦ−I濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キットは、放射性同位元素を用いないため、時間分解蛍光測定装置あるいは蛍光プレートリーダーさえあれば、特別な制限なく、容易に魚類のＩＧＦ−I濃度の測定が可能となる。本発明により、魚類のＩＧＦ−I濃度を測定することで、魚類の成長の度合いの調査や、魚類の成長促進のためのＩＧＦ−Iの投与量の決定に有効に利用することができる。

なお、放射性元素は高額である上に使用期限は数ヶ月程度である。例えばＭｏｒｉｙａｍａらのサケＩＧＦ−I用放射免疫測定法（Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｓ．， Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｐ．， Ｎｉｓｈｉｉ，Ｍ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．， Ｋａｗａｕｃｈｉ，Ｈ．， Ｄｉｃｋｈｏｆｆ，Ｗ．Ｗ．， Ｐｌｉｓｅｔｓｋａｙａ，Ｅ．Ｍ．（１９９４）Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９６，１４９−１６１．）では、標識ＩＧＦ−Iは１ヶ月間使用可能と記述されている。これに対して、ビオチン化ＩＧＦ−Iはかなり安定的で冷蔵すれば数年間は使用可能であり、冷凍状態では半永久的に保存できる。本発明の方法は、魚類のＩＧＦ−I濃度をこのように低コストかつ低労力で測定することができる。

本発明の、「ビオチン化ＩＧＦ−I」とは、ビオチンを結合させたＩＧＦ−Iのことをいい、ユーロピウム−アビジン複合体及び酵素−アビジン複合体のいずれにも結合することができるビオチン化ＩＧＦ−Iであれば、時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法のいずれの測定方法にも用いることができるため、より好ましい。
ビオチン化ＩＧＦ−Iを用いて魚類のＩＧＦ−I濃度を測定するには、魚類のビオチン化ＩＧＦ−Iを用いることが特に好ましい。

本発明の「魚類のビオチン化ＩＧＦ−I」とは、ビオチンを結合させた魚類のＩＧＦ−Iのことをいう。魚類のビオチン化ＩＧＦ−Iは、測定の対象魚の種類に応じて、例えばＧｒｏＰｅｐ社製のような市販の魚類のＩＧＦ−Iに、例えばＰｉｅｒｃｅ社製のＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎのような市販のビオチン化試薬を用いて、ビオチンを結合させたものを用いることができる。

本発明の「抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画」とは、ビオチン化ＩＧＦ−I作製において、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画のことをいい、高い検出感度を有するビオチン化ＩＧＦ−Ｉとして用いることができる。
ビオチン化ＩＧＦ−Ｉの作製において、ＩＧＦ−Iの１分子あたりビオチンが０−３個結合した混合物が得られる。この混合物は、そのまま測定に用いることもできるが、高い検出感度を安定して得るためには、さらにＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製することが好ましい。
精製によりＩＧＦ−Ｉの１分子あたりビオチンが１−３個結合したビオチン化ＩＧＦ−Ｉを分離し、それぞれの分画について抗体と結合させ、この状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を選別し、その分画を高い検出感度を有するビオチン化ＩＧＦ−Ｉとして、測定に用いることが好ましい。

本発明の測定方法は、マグロ、ヒラメ、タイ、ティラピア、スズキ、カレイ、マツカワ（カレイ科）等のＩＧＦ−Ｉ濃度を測定するために、例えば、ＧｒｏＰｅｐ社製のような市販されている抗魚類ＩＧＦ−Ｉ抗体を用いることができる。市販されている抗体以外にも、測定の対象魚に合わせて作製された抗ＩＧＦ−Ｉ抗血清、抗ＩＧＦ−Ｉ抗体を用いることができる。また、当該抗体の対象種であればどのような魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度であっても測定することができる。

本発明の測定方法では、時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法により測定を行うことができる。時間分解蛍光免疫測定法には「ユーロピウム−アビジン複合体」を用いるが、ユーロピウム−アビジン複合体とは、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを検出できる程度のユーロピウムがアビジンやストレプトアビジンに結合して複合体を形成しているもののことであり、例えば、パーキンエルマー社製のユーロピウム−ストレプトアビジン複合体等を用いることができる。

また、酵素免疫測定法には「酵素−アビジン複合体」を用いるが、酵素−アビジン複合体とは、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを検出できる程度のペルオキシダーゼ等の酵素がアビジンやストレプトアビジンに結合して複合体を形成しているもののことである。酵素−アビジン複合体としては、例えば、ＤＡＫＯ社製のペルオキシダーゼ−アビジン複合体等の市販のものを用いることができる。

また、本発明における、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉ及び、ユーロピウム又は酵素が結合したアビジン複合体と、測定に最適な試薬や抗体、洗浄液、マイクロウェルプレート等を組み合わせることによりキットとすることもできる。洗浄液は例えば、パーキンエルマー社製の市販のものを用いても良いが、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）等を用いても良い。参考として本発明の実施例及び試験例に用いる試薬溶液類の組成を表１に示した。

従来の放射性同位元素を用いた放射免疫測定法は、例えば競合法に基づく場合では、濃度が既知の放射性同位元素を結合させたホルモン（標識ホルモン）とサンプル中のホルモンを、ホルモン特異抗体をめぐって競合させた後、洗浄操作を行い、抗体と結合した標識ホルモンのみを分離し、その放射線量を測定することで標識ホルモンの量を調べ、この量との比較により、サンプル中のホルモン濃度を調べる方法である。

図１は免疫測定法の概略図であり、図１において、ａ）は時間分解蛍光免疫測定法を、ｂ）は酵素免疫測定法を示している。また、ｃ）は放射免疫測定法を示している。この図に示すように、図１ａ）・ｂ）の方法はサンプル中のＩＧＦ−Ｉとビオチン化ＩＧＦ−Ｉを競合させて抗魚類ＩＧＦ−Ｉ抗体に結合させた後、さらにａ）ではユーロピウム−アビジン複合体を作用させ、ｂ）では酵素−アビジン複合体を作用させるステップを必要とする。一方、図１ｃ）の方法はサンプル中のＩＧＦ−Ｉと放射性同位元素標識ＩＧＦ−Iを競合させて抗魚類ＩＧＦ−Ｉ抗体に結合させた後、結合した放射性同位元素標識ＩＧＦ−Ｉの放射線量を測定することでサンプル中に含まれるＩＧＦ−Ｉ濃度を測定することができる。
従って、放射免疫測定法は時間分解蛍光免疫測定や酵素免疫測定法に比較して、作業ステップが少ないという利点はあるが、放射性同位元素を使用するため、測定実施に際し、多くの法的・施設的制限がかかるという問題点がある。

図１ａ）に示すように、本発明の「時間分解蛍光免疫測定法」は、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用い、さらにビオチンと特異的かつ強力に結合するアビジンにユーロピウムを結合させたユーロピウム−アビジン複合体を用い、両者を結合させ、洗浄操作の後、ユーロピウムを時間分解蛍光測定法で測定することにより、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉの抗体との結合量を測定し、サンプル中のＩＧＦ−Ｉ濃度を決定する方法である。
本発明の方法は、免疫測定法の分類では競合法と呼ばれる測定原理に基づいたものであり、本発明の測定方法においてユーロピウムの時間分解蛍光強度はサンプル中のＩＧＦ−Ｉ濃度上昇に依存して減少する。これにより、サンプル中のＩＧＦ−Ｉ濃度を容易に調べることができる。
本発明の「時間分解蛍光免疫測定法」に用いるユーロピウムは希土類元素の一つで紫外線をあてると赤い蛍光を長時間にわたって発することが知られており、高感度で特異的な測定が可能となる。この方法は、放射免疫測定法と比較して一段階多い作業ステップを必要とするが、非放射性でありかつ毒性もないことから、人体及び環境に対して安全であり、使用にあたり制限がない。

また、図１ｂ）に示すように、本発明の「酵素免疫測定法」は、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用い、さらにビオチンと特異的かつ強力に結合するアビジンに酵素を結合させた酵素−アビジン複合体を用い、両者を結合させることにより、サンプル中のＩＧＦ−Ｉ濃度を酵素活性の測定によって調べる方法である。
この方法で検出に用いる酵素にはペルオキシダーゼ等を用いることができる。この方法も放射免疫測定法と比較して２段階多い作業ステップを必要とするが、非放射性であることから、安全であり、時間分解蛍光免疫測定法と同様に使用にあたり制限がない。本発明のこれらの測定方法を用いることにより、魚類におけるサンプル中の１〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ濃度を十分に検出することができる。
さらに、時間分解蛍光免疫測定法及び酵素免疫測定法では、測定可能上限を超える場合にはサンプルを希釈して測定することができる。以下、本発明の詳細を試験例及び実施例によって示すが、本発明はこれらによって制限されない。

＜時間分解蛍光免疫測定法＞
１．魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度測定用試薬の調製
（１）ビオチン化ＩＧＦ−Ｉの作製
２０μｇのヒラメのＩＧＦ−Ｉ（ＧｒｏＰｅｐ社製）と３μｇのＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を５００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ８．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）で２時間、室温で反応させた後、さらに７６ｍｇのグリシンを加え、過剰のＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎをグリシンと３時間以上反応させた。
この反応物に、０．８μＬのトリフルオロ酢酸を加えて酸性化し、この溶液１００μＬを０．１％トリフルオロ酢酸と７０％アセトニトリルを用いたＨＰＬＣにかけ、ヒラメのビオチン化ＩＧＦ−Ｉを精製・分離した。カラムには逆相液体クロマトグラフィー用Ｃ１８担体を充填したカラム（ワイエムシー社製、ＯＤＳ−ＡＭ 粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）を用い、カラム温度は３０℃、流速は１００μＬ／分に設定した。分画採取を５０μＬずつの定容量分画として行った。

（２）ビオチン化ＩＧＦ−Ｉの抗体交差性測定
上記（１）により分離したヒラメのビオチン化ＩＧＦ−Ｉを含む分画をサンプルとして、抗体交差性を調べ、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られるビオチン化ＩＧＦ−Ｉ分画を選別した。
９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に抗ウサギＩｇＧ溶液（ロックランド社製）を各ウェルに２００μＬ分注し、２時間以上、静置することにより抗ウサギＩｇＧ抗体でマイクロプレートをコーティングした。これを洗浄液（パーキンエルマー社製）を用いて３回洗浄後、競合反応用溶液からビオチン化ＩＧＦ−Ｉを除いたものを１００μＬずつ各ウェルに分注し、さらにこの溶液で１０倍に希釈した上記（１）で得られた分画を１μＬずつ各ウェルに分注した。そして、抗ＩＧＦ−Ｉ抗血清溶液を各ウェルに８μＬずつ分注し、室温で一晩静置した。

これを洗浄液を用いて３回洗浄後、ユーロピウム−ストレプトアビジン複合体溶液（パーキンエルマー社製）を０．０４％にアッセイ緩衝液（パーキンエルマー社製）で希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注し、１−２時間室温で静置した。さらに、これを洗浄液を用いて４回洗浄し、増強試薬（パーキンエルマー社製）を各ウェルに１００μＬずつ分注し、５分間撹拌した後、時間分解蛍光測定装置（パーキンエルマー社製）でユーロピウム濃度を測定した。測定結果を図２に示した。

図２は、横軸に各分画の溶出時間を示し、縦軸に分画に用いたアセトニトリルの濃度と、ＩＧＦ−Ｉ量を示す紫外線（２１４ｎｍ）の吸光度と各分画におけるユーロピウム−ストレプトアビジン複合体との結合の程度を示す蛍光強度を示している。このうち抗体と結合させた状態で最も蛍光強度が高い分画（図２、溶出時間５０．０−５０．５分の分画）をＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法に用いた。図２ではビオチン化ＩＧＦ−Ｉの相対的濃度を示す紫外線吸光度と時間分解蛍光強度が一致しておらず、時間分解蛍光強度をインディケーターにして使用に最適なビオチン化ＩＧＦ−Ｉ分画を選択することの重要性が示されている。

２．魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定
９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に抗ウサギＩｇＧ溶液を各ウェルに２００μＬ分注し、２時間以上、室温で静置することにより抗ウサギＩｇＧでマイクロプレートをコーティングした。このマイクロプレートを洗浄液を用いて３回洗浄後、競合反応用溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、さらに１０μＬのサンプルを分注した。
次にＩＧＦ−Ｉ抗血清溶液を各ウェルに８μＬ分注し、一晩室温で静置した。この段階でビオチン化ＩＧＦ−Ｉとサンプル中のＩＧＦ−Ｉ間で抗ＩＧＦ−Ｉ抗血清溶液中の抗体をめぐって競合反応が行われ、さらに抗ＩＧＦ−Ｉ抗体はビオチン化ＩＧＦ−Ｉあるいはサンプル中のＩＧＦ−Ｉを結合した状態でマイクロプレート上の抗ウサギＩｇＧにトラップされた。

このマイクロプレートを洗浄液を用いて３回洗浄後、ユーロピウム−ストレプトアビジン複合体溶液を１００μＬずつ各ウェルに分注し、１〜２時間室温で静置した。
これを洗浄液を用いて４回洗浄後、増強試薬を各ウェルに１００μＬずつ分注し、５分間撹拌した後、時間分解蛍光測定装置で蛍光強度を測定することによりユーロピウム濃度を計算し、濃度既知の標準品系列から計算される標準曲線からＩＧＦ−Ｉ濃度を決定した。
［試験例１］

＜各魚類のＩＧＦ−Ｉ、インスリンとの結合活性＞
実施例１に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、ヒラメＩＧＦ−Ｉ（マグロＩＧＦ−Ｉと同一物質）（ＧｒｏＰｅｐ社製）を標準曲線として、タイＩＧＦ−Ｉ（ＧｒｏＰｅｐ社製）、ＩＧＦ−Ｉと生体内物質の中で最も構造が類似するウシのインスリン（Ｓｉｇｍａ社）及び本発明者らの方法（Ａｎｄｏｈ，Ｔ．ａｎｄ Ｎａｇａｓａｗａ， Ｈ．（１９９８） Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５， ９３９−９４３．）に従って精製したマツカワのインスリン−II、ヒトＩＧＦ−I（Ｓｉｇｍａ社製）及びＩＧＦ−II（Ｓｉｇｍａ社製）との結合活性の違いを検討した。
マツカワのインスリン−IIの精製は、具体的には、次の工程により行った。マツカワの膵臓に塩酸エタノールを加えてすりつぶしてよく混合し、溶液中にインスリンを溶解させ、これから遠心分離により上清を得て、次にアンモニア水を加えて中和し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを調整すると共にインスリンを含むペプチドをエーテルとエタノールを加えることにより沈殿させ、このペプチドの混合物を酢酸水溶液に溶解し、逆相クロマトグラフィーでインスリンと他のペプチドを分離した。逆相クロマトグラフィーの分離溶液には０．１％トリフルオロ酢酸と０．１％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリルを使用した。表２は試験に用いる各サンプルのホルモンの濃度を示した表である。

結合活性の違いは図３に示した。図３は、縦軸に蛍光強度を示し、横軸にサンプルに含まれるホルモンの濃度（ｐｇ／ウェル）を示しており、本発明で測定が可能なホルモンについては量が多くなるに従って、蛍光強度が下がることを示している。
図３において、ヒラメＩＧＦ−ＩとタイＩＧＦ−Ｉの時間分解蛍光強度を示す曲線はどちらも濃度依存的に減少し、完全に一致することが示された。このことから両者のＩＧＦ−Ｉ濃度を本発明により測定できることが確認できた。
一方で、ＩＧＦ−Ｉと生体内物質の中で最も構造が類似するウシのインスリン及びマツカワのインスリン−IIは濃度依存的な時間分解蛍光強度の減少傾向を示さなかった。よって、本測定方法はヒラメＩＧＦ−Ｉ及びタイＩＧＦ−Ｉに対し、高い特異性を有することが示された。
また、ヒトのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩとも濃度依存的減少傾向を示したが、ヒラメＩＧＦ−Ｉと比較して１００倍以上の結合活性の違いが認められた。このことにより、ヒトのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ濃度の測定にもこの測定方法を使用できることが示唆された。しかしながら、ヒラメＩＧＦ−Ｉと比較してビオチン化ＩＧＦ−Ｉの置換に２桁ほど多量の濃度が必要とされることから、応用範囲は限定的であることが示唆された。
［試験例２］

＜希釈マツカワ血漿の標準曲線との平行性＞
実施例１に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、マツカワの血漿（Ａ，Ｂの２個体）を倍ずつ希釈してヒラメＩＧＦ−Ｉの各濃度における標準曲線との平行性を検討した。
なお、血漿からのＩＧＦ−Ｉの抽出法はＳｈｉｍｉｚｕらの酸エタノール抽出法に従った。具体的には、１８．７５μＬの血漿に７５μＬの酸−エタノール溶液（１００％エタノールと２規定塩酸を体積比８７．５：１２．５の割合で混合したもの）を加え、十分に撹拌した後、室温で１時間静置し、その後、遠心分離により（１５０００ｇ、１０分間、４度）沈殿を除去し、６２．５μＬの上清と２５μＬのＴｒｉｓ水溶液（０．８５５Ｍ）を混合した。次に冷凍庫で冷凍した後、前述の遠心操作により沈殿を除去し、測定用サンプルとした（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．， Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｐ．， Ｆｕｋａｄａ，Ｈ．， Ｈａｒａ，Ａ．，ａｎｄ Ｄｉｃｋｈｏｆｆ，Ｗ．Ｗ．（２０００） Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１９，２６−３６．）。

標準曲線の平行性は図４に示した。図４は、縦軸に蛍光強度を示しており、ホルモンの濃度上昇に伴い、時間分解蛍光強度が低下することを示し、ヒラメＩＧＦ−Ｉの標準曲線は典型的な右下がりの曲線を呈した。
ここで希釈したマツカワの血漿がこの標準曲線と平行性を示せば、この測定方法がマツカワの血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度の測定に使用できることを示す。これは血漿中に存在するＩＧＦ−Ｉ以外の物質は抗体と結合しないか、結合係数が低いため、仮に蛍光強度の濃度依存的減少が認められても測定値から得られる曲線はＩＧＦ−Ｉの標準曲線とは平行性を示さないことによる。図４において、マツカワの希釈血漿は濃度依存的に減少すると共にヒラメＩＧＦ−Ｉと十分な平行性を示したことから、本測定方法がマツカワの血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度の測定に使用できることが示された。
［試験例３］

＜魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法の添加回収試験＞
実施例１に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、マツカワの血漿に濃度既知のヒラメＩＧＦ−Ｉを加え、ＩＧＦ−Ｉ濃度に応じた測定値が得られるかどうかを検討した。これにより、血漿に他種類かつ多量に含まれた物質による測定値の影響の有無を調べることができる。なお、血漿からＩＧＦ−Ｉの抽出は試験例２と同様の方法により行った。
表３は、魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の時間分解蛍光免疫測定法における添加回収試験の結果として、血漿１〜３に対するヒラメＩＧＦ−Ｉの濃度におけるそれぞれの測定値と回収率を示している。
表３に示したように、結果は平均で９０％程度の回収率が得られ、他の測定方法に比較して十分なものであった。他の測定方法における添加回収率を参考として表５に挙げた。表５では、公知の文献におけるアッセイ内及びアッセイ間での変動係数及び添加回収率を示している。

［試験例４］

＜魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法の測定値の正確性の検討＞
実施例１に記載の時間分解蛍光免疫測定法における測定値の正確性を、変動係数（１００×標準偏差／平均値）を求めることで検討した。表４はアッセイ内及びアッセイ間での各濃度における測定値の変動係数を示している。
表４に示すように、１回のアッセイ内、及び異なるアッセイ間における変動係数を調べた。本発明の測定方法は他の測定方法に比較して変動係数は十分に小さいものだった。他の測定方法における変動係数を参考として表５に挙げた。

＜酵素免疫測定法＞
１．測定用試薬の調製
（１）ビオチン化ＩＧＦ−Ｉの作製
ヒラメＩＧＦ−I（ＧｒｏＰｅｐ社製）とＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、実施例１の（１）と同様の方法により、ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを作製した。

（２）ビオチン化ＩＧＦ−Ｉの抗体交差性測定
（１）により分離したビオチン化ＩＧＦ−Ｉを含む分画をサンプルとして、実施例１の（２）と同様の方法で抗体交差性を調べ、最も活性が高いビオチン化ＩＧＦ−Ｉ分画を選別した。測定結果より、このうち結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画をＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法に用いた。測定に用いるＩＧＦ−Ｉの濃度は表２に示した。

２．魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定
検出感度を高めるために、マイクロプレートとして、グライナー社製のイミュロン６００処理ずみブラックプレートを用い、各ウェルに抗ウサギＩｇＧ溶液を２００μＬずつ分注し、一晩室温で静置した後、洗浄液を用いて３回洗浄した。次に実施例１の２．と同様にサンプルとビオチン化ＩＧＦ−Ｉの抗ＩＧＦ−Ｉ抗体をめぐる競合反応を行った。洗浄液により３回洗浄後、ペルオキシダーゼ−アビジン複合体溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、砕氷中に２時間静置した。これを洗浄液により４回洗浄後、各ウェルにペルオキダーゼ発色溶液を７５μＬ、過酸化水素水溶液を１５μＬずつ分注し、室温で９０分間静置した。その後、ペルオキシダーゼ発色停止溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、発色反応を停止させ、蛍光強度の測定を行った。測定には、蛍光測定装置として蛍光マイクロプレートリーダー（ラボシステム社製；フルオロスキャン）を使用し、励起波長３２０ｎｍ、測定波長４０５ｎｍとした。酵素免疫測定法によって得られたヒラメＩＧＦ−Ｉ溶液の標準曲線を図５に示した。図５は、縦軸に蛍光強度を示し、横軸にサンプルに含まれるホルモンの濃度（ｐｇ／ウェル）を示しており、ホルモンの量が多くなるにつれ、蛍光強度が下がることを示している。
図５において酵素免疫測定法を用いた場合でも時間分解蛍光免疫測定法と同様にＩＧＦ−Ｉ濃度依存的に蛍光強度が減少する曲線が得られることが示され、本発明のビオチン化ＩＧＦ−Ｉは、酵素免疫測定法でも十分に利用できることが示された。

＜マツカワへの成長ホルモン投与による血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度上昇変化の測定＞
実施例１に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、それぞれが８個体のマツカワから構成される３実験区（無処理群、対照群、成長ホルモン注射群）を設定し、血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度を測定した。実験に用いたマツカワは４８時間絶食した。無処理群は実験開始の時に特に処理を行わなかった群、対照群は０．９％生理食塩水に０．１％ウシ血清アルブミンを溶解させたものをグラム体重あたり１０μＬ腹腔内に注射した群、成長ホルモン投与群は対照群に注射した溶液にグラム体重あたり０．０５ＩＵのブタ成長ホルモン（Ｓｉｇｍａ社）を加えて注射した群である。血漿は無処理群から実験開始時に、対照群及び成長ホルモン注射群から注射２４時間後に採取した。なお、血漿からＩＧＦ−Ｉの抽出は試験例２と同様の方法により行った。
なお、実験期間中、飼育水温は１７度に保ち、給餌を行わなかった。各実験群の体長の平均値はそれぞれ９４．６ｍｍ、９４．１ｍｍ、９３．０ｍｍだった。
測定結果を表６に示した。表６は実験前のマツカワと成長ホルモンを注射したマツカワの血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度の変化を示している。成長ホルモンは脊椎動物においてＩＧＦ−Ｉの分泌を促すことが知られている。従って、成長ホルモンをマツカワに投与すると血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度が上昇することが予想され、分散分析（ＡＮＯＶＡ、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ）を行ったところ予想通り成長ホルモン投与群（アルブミン＋成長ホルモン）に実験前及び対照群（アルブミンのみ注射）に比較して血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度の有意な上昇が認められた（Ｐ＜０．００５）。また、マツカワにおける生理的変化に対応する血漿ＩＧＦ−Ｉ濃度の変化を捉える目的にこの測定方法が十分有効であることが示された。なお、無処理群と対照群間に統計的有意差は認められなかった。

本発明の魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法及びその方法を行うための測定キットを用いることにより、容易かつ安全に血液中ＩＧＦ−Ｉ濃度を測定することで成長の適否等の特定の生理状態にある魚類を選別したり、その生理的状態を把握したりすることができる。

ａ．時間分解蛍光免疫測定法、ｂ．酵素免疫測定法、ｃ．放射免疫測定法の概要を示した図である。 ＨＰＬＣで分離したヒラメビオチン化ＩＧＦ−Ｉの各分画における抗魚類ＩＧＦ−Ｉ抗体と結合させた状態における蛍光強度（カウント）を示した図である（実施例１）。 時間分解蛍光免疫測定法におけるヒラメＩＧＦ−Ｉの標準曲線と各魚類のＩＧＦ−Ｉ、インスリンとの結合活性を示した図である（試験例１）。 時間分解蛍光免疫測定法における希釈マツカワ血漿の標準曲線との平行性を示した図である（試験例２）。 酵素免疫測定法におけるヒラメＩＧＦ−Ｉの標準曲線を示した図である（実施例２）。

Claims (7)

1. ビオチン化ＩＧＦ−Ｉを用いることを特徴とする魚類のＩＧＦ−Ｉ濃度の測定方法。
2. ビオチン化ＩＧＦ−ＩをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離し、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を使用する請求項１に記載の測定方法。
3. 測定方法が時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法のいずれかである請求項１又は２に記載の測定方法。
4. ビオチン化ＩＧＦ−Ｉにユーロピウム−アビジン複合体を作用させて、ユーロピウムの蛍光強度を測定することによる時間分解蛍光免疫測定法を用いる請求項３に記載の測定方法。
5. ビオチン化ＩＧＦ−Ｉに酵素−アビジン複合体を作用させて、酵素の活性を蛍光基質を用いることにより測定することによる酵素免疫測定法を用いる請求項３に記載の測定方法。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類のビオチン化ＩＧＦ−Ｉ。
7. 請求項１から５のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類ＩＧＦ−Ｉ濃度の測定キット。