JP2006258673A - 魚類のigf−i濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キット - Google Patents
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Abstract
安全かつ容易に実施できる魚類のIGF−I濃度の測定方法及び測定キットの提供。
【解決手段】
ビオチン化IGF−Iを用いた時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法による魚類のIGF−I濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キット。
【選択図】 図1
Description
そこでこれらの煩雑な対策、処置、測定場所の限定性を解決するために、放射性同位元素を用いず、安全かつ容易に実施できる魚類のIGF−I濃度の測定方法や測定キットの開発が望まれていた。
本発明の測定方法では、放射性同位元素で標識したIGF−Iを使用せず、ビオチン化IGF−Iを用いることで、市販品の抗魚類IGF−I抗体やユーロピウム−アビジン複合体又はユーロピウム−ストレプトアビジン複合体、酵素−アビジン複合体等を用い、時間分解蛍光免疫測定法や酵素免疫測定法等により魚類のIGF−I濃度を測定することができる。さらに、本発明において、魚類のIGF−I濃度の測定に最適な試薬や抗体等を組合せ、測定キットとすることで、簡単かつ容易に魚類のIGF−I濃度を測定することができる。
(1)ビオチン化IGF−Iを用いることを特徴とする魚類のIGF−I濃度の測定方法。
(2)ビオチン化IGF−IをHPLC(高速液体クロマトグラフィー)で分離し、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を使用する上記(1)に記載の測定方法。
(3)測定方法が時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法のいずれかである上記(1)又は(2)に記載の測定方法。
(4)ビオチン化IGF−Iにユーロピウム−アビジン複合体を作用させて、ユーロピウムの蛍光強度を測定することによる時間分解蛍光免疫測定法を用いる上記(3)に記載の測定方法。
(5)ビオチン化IGF−Iに酵素−アビジン複合体を作用させて、酵素の活性を蛍光基質を用いることにより測定することによる酵素免疫測定法を用いる上記(3)に記載の測定方法。
(6)上記(1)から(5)のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類のビオチン化IGF−I。
(7)上記(1)から(5)のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類のIGF−I濃度の測定キット。
ビオチン化IGF−Iを用いて魚類のIGF−I濃度を測定するには、魚類のビオチン化IGF−Iを用いることが特に好ましい。
ビオチン化IGF−Iの作製において、IGF−Iの1分子あたりビオチンが0−3個結合した混合物が得られる。この混合物は、そのまま測定に用いることもできるが、高い検出感度を安定して得るためには、さらにHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により精製することが好ましい。
精製によりIGF−Iの1分子あたりビオチンが1−3個結合したビオチン化IGF−Iを分離し、それぞれの分画について抗体と結合させ、この状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を選別し、その分画を高い検出感度を有するビオチン化IGF−Iとして、測定に用いることが好ましい。
従って、放射免疫測定法は時間分解蛍光免疫測定や酵素免疫測定法に比較して、作業ステップが少ないという利点はあるが、放射性同位元素を使用するため、測定実施に際し、多くの法的・施設的制限がかかるという問題点がある。
本発明の方法は、免疫測定法の分類では競合法と呼ばれる測定原理に基づいたものであり、本発明の測定方法においてユーロピウムの時間分解蛍光強度はサンプル中のIGF−I濃度上昇に依存して減少する。これにより、サンプル中のIGF−I濃度を容易に調べることができる。
本発明の「時間分解蛍光免疫測定法」に用いるユーロピウムは希土類元素の一つで紫外線をあてると赤い蛍光を長時間にわたって発することが知られており、高感度で特異的な測定が可能となる。この方法は、放射免疫測定法と比較して一段階多い作業ステップを必要とするが、非放射性でありかつ毒性もないことから、人体及び環境に対して安全であり、使用にあたり制限がない。
この方法で検出に用いる酵素にはペルオキシダーゼ等を用いることができる。この方法も放射免疫測定法と比較して2段階多い作業ステップを必要とするが、非放射性であることから、安全であり、時間分解蛍光免疫測定法と同様に使用にあたり制限がない。本発明のこれらの測定方法を用いることにより、魚類におけるサンプル中の1〜100ng/mlのIGF−I濃度を十分に検出することができる。
さらに、時間分解蛍光免疫測定法及び酵素免疫測定法では、測定可能上限を超える場合にはサンプルを希釈して測定することができる。以下、本発明の詳細を試験例及び実施例によって示すが、本発明はこれらによって制限されない。
1.魚類のIGF−I濃度測定用試薬の調製
(1)ビオチン化IGF−Iの作製
20μgのヒラメのIGF−I(GroPep社製)と3μgのEZ−link Sulfo−LC−biotin(Pierce社製)を500μLのリン酸緩衝液(pH8.8、150mM NaClを含む)で2時間、室温で反応させた後、さらに76mgのグリシンを加え、過剰のEZ−link Sulfo−LC−biotinをグリシンと3時間以上反応させた。
この反応物に、0.8μLのトリフルオロ酢酸を加えて酸性化し、この溶液100μLを0.1%トリフルオロ酢酸と70%アセトニトリルを用いたHPLCにかけ、ヒラメのビオチン化IGF−Iを精製・分離した。カラムには逆相液体クロマトグラフィー用C18担体を充填したカラム(ワイエムシー社製、ODS−AM 粒子径3μm、2.1mm×150mm)を用い、カラム温度は30℃、流速は100μL/分に設定した。分画採取を50μLずつの定容量分画として行った。
上記(1)により分離したヒラメのビオチン化IGF−Iを含む分画をサンプルとして、抗体交差性を調べ、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られるビオチン化IGF−I分画を選別した。
96穴マイクロプレート(ヌンク社製)に抗ウサギIgG溶液(ロックランド社製)を各ウェルに200μL分注し、2時間以上、静置することにより抗ウサギIgG抗体でマイクロプレートをコーティングした。これを洗浄液(パーキンエルマー社製)を用いて3回洗浄後、競合反応用溶液からビオチン化IGF−Iを除いたものを100μLずつ各ウェルに分注し、さらにこの溶液で10倍に希釈した上記(1)で得られた分画を1μLずつ各ウェルに分注した。そして、抗IGF−I抗血清溶液を各ウェルに8μLずつ分注し、室温で一晩静置した。
96穴マイクロプレート(ヌンク社製)に抗ウサギIgG溶液を各ウェルに200μL分注し、2時間以上、室温で静置することにより抗ウサギIgGでマイクロプレートをコーティングした。このマイクロプレートを洗浄液を用いて3回洗浄後、競合反応用溶液を各ウェルに100μLずつ分注し、さらに10μLのサンプルを分注した。
次にIGF−I抗血清溶液を各ウェルに8μL分注し、一晩室温で静置した。この段階でビオチン化IGF−Iとサンプル中のIGF−I間で抗IGF−I抗血清溶液中の抗体をめぐって競合反応が行われ、さらに抗IGF−I抗体はビオチン化IGF−Iあるいはサンプル中のIGF−Iを結合した状態でマイクロプレート上の抗ウサギIgGにトラップされた。
これを洗浄液を用いて4回洗浄後、増強試薬を各ウェルに100μLずつ分注し、5分間撹拌した後、時間分解蛍光測定装置で蛍光強度を測定することによりユーロピウム濃度を計算し、濃度既知の標準品系列から計算される標準曲線からIGF−I濃度を決定した。
[試験例1]
実施例1に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、ヒラメIGF−I(マグロIGF−Iと同一物質)(GroPep社製)を標準曲線として、タイIGF−I(GroPep社製)、IGF−Iと生体内物質の中で最も構造が類似するウシのインスリン(Sigma社)及び本発明者らの方法(Andoh,T.and Nagasawa, H.(1998) Zoological Science, 15, 939−943.)に従って精製したマツカワのインスリン−II、ヒトIGF−I(Sigma社製)及びIGF−II(Sigma社製)との結合活性の違いを検討した。
マツカワのインスリン−IIの精製は、具体的には、次の工程により行った。マツカワの膵臓に塩酸エタノールを加えてすりつぶしてよく混合し、溶液中にインスリンを溶解させ、これから遠心分離により上清を得て、次にアンモニア水を加えて中和し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のpHを調整すると共にインスリンを含むペプチドをエーテルとエタノールを加えることにより沈殿させ、このペプチドの混合物を酢酸水溶液に溶解し、逆相クロマトグラフィーでインスリンと他のペプチドを分離した。逆相クロマトグラフィーの分離溶液には0.1%トリフルオロ酢酸と0.1%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリルを使用した。表2は試験に用いる各サンプルのホルモンの濃度を示した表である。
図3において、ヒラメIGF−IとタイIGF−Iの時間分解蛍光強度を示す曲線はどちらも濃度依存的に減少し、完全に一致することが示された。このことから両者のIGF−I濃度を本発明により測定できることが確認できた。
一方で、IGF−Iと生体内物質の中で最も構造が類似するウシのインスリン及びマツカワのインスリン−IIは濃度依存的な時間分解蛍光強度の減少傾向を示さなかった。よって、本測定方法はヒラメIGF−I及びタイIGF−Iに対し、高い特異性を有することが示された。
また、ヒトのIGF−I及びIGF−IIとも濃度依存的減少傾向を示したが、ヒラメIGF−Iと比較して100倍以上の結合活性の違いが認められた。このことにより、ヒトのIGF−I及びIGF−II濃度の測定にもこの測定方法を使用できることが示唆された。しかしながら、ヒラメIGF−Iと比較してビオチン化IGF−Iの置換に2桁ほど多量の濃度が必要とされることから、応用範囲は限定的であることが示唆された。
[試験例2]
実施例1に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、マツカワの血漿(A,Bの2個体)を倍ずつ希釈してヒラメIGF−Iの各濃度における標準曲線との平行性を検討した。
なお、血漿からのIGF−Iの抽出法はShimizuらの酸エタノール抽出法に従った。具体的には、18.75μLの血漿に75μLの酸−エタノール溶液(100%エタノールと2規定塩酸を体積比87.5:12.5の割合で混合したもの)を加え、十分に撹拌した後、室温で1時間静置し、その後、遠心分離により(15000g、10分間、4度)沈殿を除去し、62.5μLの上清と25μLのTris水溶液(0.855M)を混合した。次に冷凍庫で冷凍した後、前述の遠心操作により沈殿を除去し、測定用サンプルとした(Shimizu,M., Swanson,P., Fukada,H., Hara,A.,and Dickhoff,W.W.(2000) General and Comparative Endocrinology,119,26−36.)。
ここで希釈したマツカワの血漿がこの標準曲線と平行性を示せば、この測定方法がマツカワの血漿IGF−I濃度の測定に使用できることを示す。これは血漿中に存在するIGF−I以外の物質は抗体と結合しないか、結合係数が低いため、仮に蛍光強度の濃度依存的減少が認められても測定値から得られる曲線はIGF−Iの標準曲線とは平行性を示さないことによる。図4において、マツカワの希釈血漿は濃度依存的に減少すると共にヒラメIGF−Iと十分な平行性を示したことから、本測定方法がマツカワの血漿IGF−I濃度の測定に使用できることが示された。
[試験例3]
実施例1に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、マツカワの血漿に濃度既知のヒラメIGF−Iを加え、IGF−I濃度に応じた測定値が得られるかどうかを検討した。これにより、血漿に他種類かつ多量に含まれた物質による測定値の影響の有無を調べることができる。なお、血漿からIGF−Iの抽出は試験例2と同様の方法により行った。
表3は、魚類のIGF−I濃度の時間分解蛍光免疫測定法における添加回収試験の結果として、血漿1〜3に対するヒラメIGF−Iの濃度におけるそれぞれの測定値と回収率を示している。
表3に示したように、結果は平均で90%程度の回収率が得られ、他の測定方法に比較して十分なものであった。他の測定方法における添加回収率を参考として表5に挙げた。表5では、公知の文献におけるアッセイ内及びアッセイ間での変動係数及び添加回収率を示している。
実施例1に記載の時間分解蛍光免疫測定法における測定値の正確性を、変動係数(100×標準偏差/平均値)を求めることで検討した。表4はアッセイ内及びアッセイ間での各濃度における測定値の変動係数を示している。
表4に示すように、1回のアッセイ内、及び異なるアッセイ間における変動係数を調べた。本発明の測定方法は他の測定方法に比較して変動係数は十分に小さいものだった。他の測定方法における変動係数を参考として表5に挙げた。
1.測定用試薬の調製
(1)ビオチン化IGF−Iの作製
ヒラメIGF−I(GroPep社製)とEZ−link Sulfo−LC−biotin(Pierce社製)を用い、実施例1の(1)と同様の方法により、ビオチン化IGF−Iを作製した。
(1)により分離したビオチン化IGF−Iを含む分画をサンプルとして、実施例1の(2)と同様の方法で抗体交差性を調べ、最も活性が高いビオチン化IGF−I分画を選別した。測定結果より、このうち結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画をIGF−I濃度の測定方法に用いた。測定に用いるIGF−Iの濃度は表2に示した。
検出感度を高めるために、マイクロプレートとして、グライナー社製のイミュロン600処理ずみブラックプレートを用い、各ウェルに抗ウサギIgG溶液を200μLずつ分注し、一晩室温で静置した後、洗浄液を用いて3回洗浄した。次に実施例1の2.と同様にサンプルとビオチン化IGF−Iの抗IGF−I抗体をめぐる競合反応を行った。洗浄液により3回洗浄後、ペルオキシダーゼ−アビジン複合体溶液を各ウェルに100μLずつ分注し、砕氷中に2時間静置した。これを洗浄液により4回洗浄後、各ウェルにペルオキダーゼ発色溶液を75μL、過酸化水素水溶液を15μLずつ分注し、室温で90分間静置した。その後、ペルオキシダーゼ発色停止溶液を各ウェルに100μLずつ分注し、発色反応を停止させ、蛍光強度の測定を行った。測定には、蛍光測定装置として蛍光マイクロプレートリーダー(ラボシステム社製;フルオロスキャン)を使用し、励起波長320nm、測定波長405nmとした。酵素免疫測定法によって得られたヒラメIGF−I溶液の標準曲線を図5に示した。図5は、縦軸に蛍光強度を示し、横軸にサンプルに含まれるホルモンの濃度(pg/ウェル)を示しており、ホルモンの量が多くなるにつれ、蛍光強度が下がることを示している。
図5において酵素免疫測定法を用いた場合でも時間分解蛍光免疫測定法と同様にIGF−I濃度依存的に蛍光強度が減少する曲線が得られることが示され、本発明のビオチン化IGF−Iは、酵素免疫測定法でも十分に利用できることが示された。
実施例1に記載の時間分解蛍光免疫測定法を用い、それぞれが8個体のマツカワから構成される3実験区(無処理群、対照群、成長ホルモン注射群)を設定し、血漿IGF−I濃度を測定した。実験に用いたマツカワは48時間絶食した。無処理群は実験開始の時に特に処理を行わなかった群、対照群は0.9%生理食塩水に0.1%ウシ血清アルブミンを溶解させたものをグラム体重あたり10μL腹腔内に注射した群、成長ホルモン投与群は対照群に注射した溶液にグラム体重あたり0.05IUのブタ成長ホルモン(Sigma社)を加えて注射した群である。血漿は無処理群から実験開始時に、対照群及び成長ホルモン注射群から注射24時間後に採取した。なお、血漿からIGF−Iの抽出は試験例2と同様の方法により行った。
なお、実験期間中、飼育水温は17度に保ち、給餌を行わなかった。各実験群の体長の平均値はそれぞれ94.6mm、94.1mm、93.0mmだった。
測定結果を表6に示した。表6は実験前のマツカワと成長ホルモンを注射したマツカワの血漿IGF−I濃度の変化を示している。成長ホルモンは脊椎動物においてIGF−Iの分泌を促すことが知られている。従って、成長ホルモンをマツカワに投与すると血漿IGF−I濃度が上昇することが予想され、分散分析(ANOVA、Fisher’s PLSD)を行ったところ予想通り成長ホルモン投与群(アルブミン+成長ホルモン)に実験前及び対照群(アルブミンのみ注射)に比較して血漿IGF−I濃度の有意な上昇が認められた(P<0.005)。また、マツカワにおける生理的変化に対応する血漿IGF−I濃度の変化を捉える目的にこの測定方法が十分有効であることが示された。なお、無処理群と対照群間に統計的有意差は認められなかった。
Claims (7)
- ビオチン化IGF−Iを用いることを特徴とする魚類のIGF−I濃度の測定方法。
- ビオチン化IGF−IをHPLC(高速液体クロマトグラフィー)で分離し、抗体と結合させた状態で最も高い蛍光強度が得られる分画を使用する請求項1に記載の測定方法。
- 測定方法が時間分解蛍光免疫測定法又は酵素免疫測定法のいずれかである請求項1又は2に記載の測定方法。
- ビオチン化IGF−Iにユーロピウム−アビジン複合体を作用させて、ユーロピウムの蛍光強度を測定することによる時間分解蛍光免疫測定法を用いる請求項3に記載の測定方法。
- ビオチン化IGF−Iに酵素−アビジン複合体を作用させて、酵素の活性を蛍光基質を用いることにより測定することによる酵素免疫測定法を用いる請求項3に記載の測定方法。
- 請求項1から5のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類のビオチン化IGF−I。
- 請求項1から5のいずれかに記載の測定方法に用いる魚類IGF−I濃度の測定キット。
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CN105861732A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种检测鲤IGF2b基因单核苷酸多态性的方法及引物 |
CN105925704A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-09-07 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法及引物 |
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JP2004256541A (ja) * | 1988-03-22 | 2004-09-16 | Genentech Inc | インスリン様成長因子結合タンパク質とその組成物 |
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2005
- 2005-03-18 JP JP2005078307A patent/JP2006258673A/ja active Pending
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