CN114867737A

CN114867737A - 用于潜伏型弓形虫病的新血清学标志物

Info

Publication number: CN114867737A
Application number: CN202080089061.3A
Authority: CN
Inventors: C·达德; M-A·哈基米; H·佩劳克斯; M-P·布雷涅尔-平查特; C·斯瓦勒
Original assignee: Grenoble university central hospital; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Grenoble Alpes
Current assignee: Grenoble university central hospital; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Grenoble Alpes
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-08-05
Also published as: WO2021094308A1; US20220390449A1; EP4058469A1; JP2023500954A

Abstract

在本发明中，发明人报道了BCLA(脑包囊负载相关抗原)的特征，BCLA是一种在寄生虫的裂殖子阶段唯一表达的蛋白质。在从小鼠脑中直接纯化的包囊中，蛋白质分布在包囊内部和表面。使用血清学反应性BCLA肽和重组表达的c端结构域(rBCLA)的组合的ELISA抗体捕获构成具有高灵敏度的潜伏性感染的有效血清学标记，其与小鼠脑中包囊的存在明确且唯一地相关。已经在人患者中检测到抗BCLA抗原的抗体。在鉴定为Sag1或速殖子相关抗原血清阳性的患者中检测富集滴度。人中抗BCLA IgG合成和包囊之间的进一步相关性是由与存在包囊强烈相关的病理学组中显著更强的记录滴度带来的。此外，当与其母亲相比时，具有确认的先天性弓形虫病的新生婴儿在出生时显示出显著更高的抗BCLA IgG，表明这种IgG的特异性宫内新合成。因此，本发明涉及一种新的刚地弓形虫蛋白，下文称为BCLA，它是一种新的血清学标记物，其表达限于潜伏型弓形虫病(裂殖子/包囊)。该特异性蛋白及其抗原片段可用于检测患者血清中的自身抗体，用于诊断潜伏型弓形虫病。本发明还涉及通过BCLA免疫产生的特异结合该新蛋白的衍生抗体。

Description

用于潜伏型弓形虫病的新血清学标志物

技术领域

本发明涉及新的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)蛋白，下文称为BCLA(脑包囊负载相关抗原)，它是一种新的血清学标志物，其表达限于潜伏型弓形虫病(裂殖子/包囊)。本发明还涉及特异性结合这种新蛋白的抗体。该特异性蛋白及其抗原片段可用于检测患者血清中的自身抗体，用于诊断潜伏型弓形虫病。

背景技术

古老的顶复门类(Apicomplexa)包括许多世界上流行的原生动物病原体。对人类最致命的是疟原虫(Plasmodium)，疟疾的病原体，其每年杀死近50万人。刚地弓形虫是弓形虫病的病原体，其是家畜、野生动物和伴侣动物中最普遍的原生动物寄生虫之一。弓形虫病是人中普遍的食源性感染，其造成严重的公共卫生问题，在美国被认为是食源性死亡的主要原因(Scallan et al.,2015)。弓形虫病在免疫活性人中通常是轻度疾病，其可转为经历危及生命的脑、肺、心脏或播散性病状的免疫受损患者的主要威胁。经胎盘感染可导致不同程度临床表现的先天性感染，从先天性异常(如脑积水、小头畸形、颅内钙化)到流产。

形成包囊的肠球菌寄生虫刚地弓形虫通过交替的两宿主生命周期传递，所述两宿主生命周期依赖于猫科动物确定性宿主进行有性传递，而在多种可选宿主包括啮齿动物和人中经历无性传递。长期居住在非猫科动物的温血后生动物中，刚地弓形虫启动复杂的发育程序以响应环境因素，包括宿主先天防御和对不同宿主的适应。在中间宿主的初始感染期间，寄生虫作为速殖子复制，其在散布到体内的许多组织之前在数量上显著扩增。尽管初始感染通常受导致大量速殖子群体大规模破坏的有效Th1介导的促炎宿主反应控制，但速殖子的较小亚群体分化为缓慢生长的裂殖子阶段，其在宿主的生命期中持续存在于寄居于长寿命细胞(包括神经元和骨骼肌细胞)中的组织包囊内(Dubey,1997)。猫科动物确定的宿主摄取组织包囊完成了该周期，导致卵囊脱落，后者具有高度感染性(Dubey,2001)。

组织包囊是人经由食虫感染的主要来源，并且因此是人疾病中的关键促成因素，因为弓形虫病的并发症在分化回复制性速殖子阶段的同时加强为裂殖子引起不可逆损伤的能力。事实上，尽管无症状的寄生物在免疫感受态宿主中提供终身平衡和保护，但已知持续的免疫功能障碍破坏寄生虫休眠，促进裂殖子至速殖子的转变和进一步的速殖子群扩增。这些组合过程最终在免疫受损个体中导致脑炎、肺炎、视网膜脉络膜炎或甚至播散性弓形虫病作为主要结果(Dard et al.,2018)。因此，刚地弓形虫作为专性细胞内寄生物的策略基于对无毒性的寻求，即减弱但不完全抵消宿主对感染的先天免疫应答的能力，从而确保等待传播所需的永久寄居。

尽管刚地弓形虫的生命周期中组织包囊的重要性及其作为免疫受损宿主中弓形虫病再活化的贮库的关键作用，对它们形成的裂殖子和包囊的生物学了解甚少。包囊被认为随时间而生长并传播以维持慢性感染，不通过中间速殖子阶段，而通过游离的裂殖子的迁移和裂殖子包囊的分裂(Dzierszinski et al.,2004；Frenkel and Escajadillo,1987)。组织包囊内的裂殖子是休眠实体的观点最近受到了令人信服的证据的挑战，这些证据表明裂殖子通过异步复制在体内组织包囊内表现出周期性、间歇性生长(Watts et al.,2015)，同时使用内生殖和内复生殖(Dzierszinski et al.,2004)。

从速殖子到裂殖子的发育转变是双向的，并且其特征在于寄生虫基因表达的急剧改变，导致代谢的主要变化，阶段特异性表面抗原的限制性表达的寄生虫表面的重塑和囊壁的形成。后者被认为能保护裂殖子免受恶劣的胃肠环境条件，并可能为宿主免疫防御提供物理屏障。刚地弓形虫的分化一直难以研究，因为阶段转变受复杂且仍未知的发育遗传程序控制，但也受宿主细胞生理学的影响(Lueder和Rahman,2017)。在实验室中，在体外缺乏宿主免疫的情况下，可以通过外源性应激(例如，碱性应激、营养剥夺和药物)触发速殖子向裂殖子的转化。

转录调节明确地在裂殖子发育中起关键作用，如显示阶段特异性基因表达的许多研究所证明。如何在分子水平上调节这些变化在很大程度上仍然是未知的，然而我们和其他人带来了表观遗传变化是寄生虫分化的驱动力的强大证据。早期证据来自这样的观察结果，即在体内感染期间从小鼠中迅速恢复的速殖子特别易于分化，并且随时间逐渐丧失这种“启动”状态。因此，速殖子在组织培养中的长期传代极大地削弱了II型菌株在体内产生高包囊载量的能力。因此，通过促进发育可塑性的表观遗传机制(即来自相同基因组的多种表型的表现)可允许寄生虫适应数千种潜在的中间宿主并响应于显著不同的免疫系统。

刚地弓形虫已经进化了复杂的方式来促进表观遗传改变，例如组蛋白标志物和染色质重塑中的活性变化，其与它们感染的细胞所采用的策略竞争，并且为殖子提供了响应于环境因素或作为发育程序的一部分经历阶段分化的显著能力。我们早期关注组蛋白翻译后修饰(PTM)特异性乙酰化(Saksouk et al.,2005)，其导致我们表明阶段特异性基因附近组蛋白H4乙酰化速率的改变是驱动寄生虫分化的表观遗传分子马达之一(Bougdour etal.,2009)。核心组蛋白的乙酰化由组蛋白乙酰转移酶(HAT)介导，并且在许多情况下，导致染色质结构的松弛和相关基因的转录激活。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)通过催化从组蛋白尾部的赖氨酸残基去除乙酰基部分来抵消HAT活性，从而诱导染色质凝聚和转录抑制(Kurdistani和Grunstein,2003)。

组蛋白乙酰化对于控制分化的重要性由以下发现强调：用低剂量的化合物FR235222化学抑制TgHDAC3体外诱导速殖子至裂殖子阶段的转化(Bougdour et al.,2009；Maubon et al.,2010)。用对该化合物具有抗性的TgHDAC3等位基因转染的重组菌株不表现出这些作用，证实了该化合物的TgHDAC3特异性，并表明TgHDAC3的活性主动防止裂殖子分化(Bougdour et al.,2009)。体外转化伴随着>350个基因的上游区域的超乙酰化，其三分之一是特异于裂殖子的(Bougdour et al.,2009)。TgHDAC3似乎主要对抗HAT TgGCN5b的作用，其通过ChIP定位于活性基因的启动子，而TgHDAC3通过ChIP定位于裂殖子基因的启动子(Saksouk et al.,2005)。尽管这些数据代表理解刚地弓形虫中组蛋白乙酰化和基因表达之间因果关系的一步，并指出了TgHDAC3在阶段转换中的关键作用，但它们仅在实验室小鼠中不易形成组织包囊或潜伏性感染的强毒RH菌株中进行。最后，仍然需要继续开发潜伏型弓形虫病的新诊断。

在该研究中，发明人重新考察了FR235222使用在体内易于形成包囊的II型来源的菌株刺激体外速殖子向裂殖子转化的能力。定量分析刚地弓形虫蛋白质组对FR235222的应答揭示了许多先前被鉴定为阶段特异性蛋白质的蛋白质，包括那些被认为仅限于裂殖子的蛋白质。由于它们对寄生虫生物学的可能的重要性(Hakimi et al.,2017)，发明人选择将我们的注意力集中在预测待分泌的新蛋白质上。通过该方法鉴定了～200个推定的FR235222响应性裂殖子分泌的效应物。选择一个候选物BCLA(脑包囊负载相关抗原)用于进一步研究。BCLA仅在FR 235222处理后表达，并且在其在液泡空间中分泌后，显示蛋白质在寄生泡膜(PVM)处积聚。在体内条件下，BCLA位于包囊的基质空间以及囊壁，后者被认为在潜伏期来源于PVM。在评估其功能时，发明人发现BCLA缺陷影响从慢性感染小鼠分离的脑包囊的完整性，然而至少在我们的慢性弓形虫病小鼠模型中，蛋白对于适当的包囊功能是非必要的。

考虑到裂殖子对BCLA的限制性表达及其在囊壁的位置，发明人接下来尝试研究其在血清学诊断中的潜在应用。在此，发明人发现通过重组技术产生的BCLA的C端肽是强抗原性的并且构成用于检测慢性感染小鼠中的抗刚地弓形虫IgG的极好的抗原候选物。发明人提供了强大数据，表明慢性感染小鼠脑中包囊的存在与血清中抗原BCLA的检测之间的明确相关性。用人血清进行的阳性测定证实了BCLA的抗原特征，并为将该抗原用于具有在慢性感染宿主中血清学检测包囊载量的感兴趣观点的抗弓形虫诊断铺平了道路。

发明概述

本发明提供了分离的刚地弓形虫多肽，下文称为BCLA(脑包囊负载相关抗原)，其包含氨基酸SEQ ID NO：1和免疫原性肽片段。

本发明还涉及针对本发明的分离的多肽产生的抗体。

本发明还涉及用于检测根据本发明的刚地弓形虫多肽，和/或评估其在生物样品中，尤其是在固体样品中的量的方法。

本发明还涉及使用根据本发明的多肽来诊断潜伏型弓形虫病的方法，以检测生物样品，尤其是流体样品中的抗BCLA抗体。

发明详述

通过使用表观药物调节速殖子基因组表达，发明人能够鉴定其表达限于裂殖子的基因。在本发明中，发明人报道了蛋白质BCLA(脑包囊负载相关抗原)的表征，当在裂殖子诱导的条件下表达时，其在体外在寄生泡膜上积聚。在小鼠脑中，蛋白质分散在包囊内和包囊表面。基因的缺失导致小鼠中脑包囊载量的减少，剩余的包囊的特征在于它们从圆度的丧失到特殊的出芽表型的壁表面的变形。最后，当作为重组蛋白合成时，BCLA构成具有高灵敏度的潜在感染的有效血清学标志物，其与小鼠脑包囊的存在明确且唯一地相关。利用本发明人开发的第一ELISA BCLA测试，已经在强烈怀疑或证实为眼部弓形虫病的人患者中检测到针对BCLA抗原的抗体，其仅在血清中或在血清和房水中检测到。长期以来，血清学测定一直是证实刚地弓形虫感染的一线测试，而当前的血清学诊断并不总是区分急性、潜伏和再活化疾病状态。此外，当前的血清学不评估组织中的包囊载量和血清阳性免疫受损患者中弓形虫病再活化的后续风险。现在可以通过作为用于慢性感染宿主中包囊的血清学检测的重要抗原候选物的BCLA的发现克服这些限制中的一些。

优化第一ELISA测试以检测BCLA免疫原性肽。首先，使用肽斑点印迹筛选，筛选使用BCLAC-末端结构域和最保守的内部肽重复序列TgR4(图12a)设计的肽微阵列的高分辨率BCLA表位作图(图12b和图12c)。与小鼠相反，所有阳性人血清显示对来自内部重复序列的肽的强反应性，一旦被添加至rBCLA，其显著增加测试灵敏度。因此，基于最敏感的肽和多肽组合定制BCLAE LISA，并且其被证明对于被诊断患有眼弓形虫病或经证实的既往免疫(past-immunity)的人之间的高置信度区分是优化的(图13)。ELISA测试还检测到来自经历《无症状》或有症状的慢性弓形虫病发作的免疫受损患者的血清中显著量的循环抗BCLA抗体(图13)。

分离的肽

本发明涉及分离的刚地弓形虫多肽，称为BCLA(脑包囊负载相关抗原)，其包含氨基酸SEQ ID NO：1。

本发明还提供选自下组的分离的刚地弓形虫多肽：

(i)由刚地弓形虫多肽BCLA(SEQ ID NO：1)组成的氨基酸序列；

(ii)由C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275，称为rBCLA)组成的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；

(iii)由选自下组的BCLA的内部重复结构域组成的氨基酸序列：TgR1(SEQ ID NO:4)、TgR2(SEQ ID NO:5)、TgR3(SEQ ID NO:6)、TgR4(SEQ ID NO:7)、TgR5(SEQ ID NO:8)、TgR6(SEQ ID NO:9)、TgR7(SEQ ID NO:10)、TgR8(SEQ ID NO:11)、TgR9(SEQ ID NO:12)、tgR10(SEQ ID NO:13)、TgR11(SEQ ID NO:14)、TgR12(SEQ ID NO:15)和TgR13(SEQ ID NO:16)；

(iv)与(i)-(iii)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)-(iii)的序列至少80％相同的氨基酸序列；

(v)(i)-(iv)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

使用肽斑点印迹筛选(参见图12)允许在BCLA的C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275，称为rBCLA)以及在称为TgR1至TgR13(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：16)的BCLA的内部重复结构域(残基304-924)中鉴定最有效的BCLA免疫原性肽。

因此，在一个具体实施方案中，从rBCLA多肽分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)GELQPAEAEEARLLVADLKAV(SEQ ID N°32)

(ii)VRVEGEAFFRASVDLYEA(SEQ ID N°33)

(iii)KLRPLTKGELVDVVRQ(SEQ ID N°34)

(iv)TQIFVQDRASAFLRV(rBCLA的肽36)(SEQ ID N°35)

(v)AAEQMKAVFAMVEEG(rBCLA的肽44)(SEQ ID N°36)

(vi)与(i)-(v)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)-(v)的序列至少95％相同的氨基酸序列；

(vii)(i)-(vi)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

在更具体的实施方案中，从rBCLA多肽分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)GELQPAEAEEARLLV(rBCLA的肽12)(SEQ ID N°37)；

(ii)QPAEAEEARLLVADL(rBCLA的肽13)(SEQ ID N°38),

(iii)EAEEARLLVADLKAV(rBCLA的肽14)(SEQ ID N°39),

(iv)VRVEGEAFFRASVDL(rBCLA的肽21)(SEQ ID N°40),

(v)EGEAFFRASVDLYEA(rBCLA的肽22)(SEQ ID N°41)；

(vi)AFFRASVDLYEAVKN(rBCLA的肽23)(SEQ ID N°42),

(vii)KLRPLTKGELVDVVR(rBCLA的肽30)(SEQ ID N°43)

(viii)与(i)-(vii)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)-(vii)的序列至少95％相同的氨基酸序列；

(vii)(i)-(viii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

因此，在一个具体实施方案中，从BCLA的内部重复结构域分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)由TgR4的内部重复结构域组成的氨基酸序列，MERPAAGSMEKEKPVLPGEGEGHVLPKHETKPALTDEKRTKPGGPRTE(SEQ ID NO：7)；

(ii)与(i)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)的序列至少80％相同的氨基酸序列；

(iii)(i)-(ii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段.

在更具体的实施方案中，从BCLA的内部重复结构域分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)AAGSMEKEKPVLPGEGEGH(TgR4的结构域A)；(SEQ ID N°44)

(ii)VLPKHETKPALTDEKRTKPGGP(TgR4的结构域B),(SEQ ID N°45)

(iii)与(i)-(ii)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)-(ii)的序列至少95％相同的氨基酸序列；

(iv)(i)-(iii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

(i)AAGSMEKEKPVLPGE(TgR4的肽3)；(SEQ ID N°46)

(ii)GSMEKEKPVLPGEGE(TgR4的肽4)(SEQ ID N°47)

(iii)MEKEKPVLPGEGEGH(TgR4的肽5)(SEQ ID N°48)

(iv)KEKPVLPGEGEGHVL(TgR4的肽6)(SEQ ID N°49)

(v)KPVLPGEGEGHVLPG(TgR4的肽7)(SEQ ID N°50)

(vi)HVLPKHETKPALTDEK(TgR4的肽13),(SEQ ID N°51)

(vii)PKHETKPALTDEKRT(TgR4的肽14),(SEQ ID N°52)

(viii)HETKPALTDEKRTKP(TgR4的肽15)(SEQ ID N°53)

(ix)TKPALTDEKRTKPGG(TgR4的肽16)(SEQ ID N°54)

(x)与(i)-(ix)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)-(ix)的序列至少95％相同的氨基酸序列；

(xi)(i)-(x)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

由于BCLA多肽贯穿不同结构域(尤其是在rBCLA中以及在BCLA TgR1-TgR13的内部重复结构域中)具有大量表位，因此组合本发明的BCLA免疫原性肽片段可以是有利的。

因此，在另一个实施方案中，本发明的分离的多肽是根据本发明的两个肽片段之间的融合体。

关于改进的ELISA测定，以下BCLA肽(具有至少一种结合2个内部重复肽的融合肽)与全长重组BCLA多肽(SEQ ID N°1)组合使用。

肽AB_F:MERPAAGSMEKEKPVLPGEGEGLPKHETKPALTDEKRTKPGGP(来自Tgr4/Trg12/Tgr13中存在的重复基序和Tgr3/Trg4/Tgr5/Tgr6/Tgr9中存在的重复基序的肽片段的融合体)(SEQ ID N°55)

肽A3_B:AAGSMEKDKLVLPGE(来自Tgr3/Tgr5/Tgr6/Tgr7/Trg10/Tgr11中存在的重复基序的肽片段)(SEQ ID N°56)。

因此，从BCLA的内部重复结构域分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)MERPAAGSMEKEKPVLPGEGEGLPKHETKPALTDEKRTKPGGP(来自Tgr4/Trg12/Tgr13中存在的重复基序和Tgr3/Trg4/Tgr5/Tgr6/Tgr9中存在的重复基序的肽片段的融合体)(SEQID N°55),

(ii)AAGSMEKDKLVLPGE(来自Tgr3/Tgr5/Tgr6/Tgr7/Trg10/Tgr11中存在的重复基序的肽片段)(SEQ ID N°56)，

(iii)与(i)-(ii)的序列基本上同源的氨基酸序列，优选与(i)-(ii)的序列至少95％相同的氨基酸序列，

(iv)(i)-(iii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

因为BCLA多肽贯穿BCLA的不同内部重复结构域(TgR1-TgR13)具有大量表位，所以其有利于组合BCLA的内部重复结构域的氨基酸残基。

因此，本发明还涉及BCLA多肽，其包含具有以下序列的BCLA内部重复结构域(TgRx)：

M-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5–Xaa6–Xaa7-M-E-Xaa8–Xaa9-K-Xaa10-V-Xaa11-P-G-E-G-Xaa12–Xaa13-H-Xaa14-Xaa15-P-K-Xaa16-E-Xaa17-Xaa18-L-T-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-T-Xaa23-P-Xaa24-Xaa25-P-Xaa26-Xaa27-Xaa28(SEQ ID N°64)

其中Xaa1是谷氨酸(E)或无氨基酸残基

其中Xaa2是精氨酸(R)或丝氨酸(S)

其中Xaa3是脯氨酸(P)或甘氨酸(G)

其中Xaa4是丙氨酸(A)或甘氨酸(G)

其中Xaa5是丙氨酸(A)或无氨基酸残基

其中Xaa6是甘氨酸(G)或精氨酸(R)

其中Xaa7是丝氨酸(S)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)

其中Xaa8是赖氨酸(K)或谷氨酸(E)

其中Xaa9是赖氨酸(K)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)

其中Xaa10为脯氨酸(P)或亮氨酸(L)

其中Xaa11为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)

其中Xaa12是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)

其中Xaa13是甘氨酸(G)或精氨酸(R)

其中Xaa14为缬氨酸(V)或丙氨酸(A)

其中Xaa15为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)

其中Xaa16是组氨酸(H)、天冬氨酸(D)或丙氨酸(A)

其中Xaa17是苏氨酸(T)、精氨酸(R)、甲硫氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)

其中Xaa18是脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)

其中Xaa19是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)

其中Xaa20是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)

其中Xaa21是赖氨酸(K)、甘氨酸(G)或谷氨酸(E)

其中Xaa22是精氨酸(R)或缬氨酸(V)

其中Xaa23是赖氨酸(K)、谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)

其中Xaa24是甘氨酸(G)、缬氨酸或异亮氨酸(I)

其中Xaa25是甘氨酸(G)或谷氨酸(E)

其中Xaa26是精氨酸(R)或脯氨酸(P)

其中Xaa27是苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、赖氨酸(K)或蛋氨酸(M)

其中Xaa28是谷氨酸(E)或丙氨酸(A)

和序列SEQ ID N°64的至少9个连续氨基酸的片段。

本文所用的术语“氨基酸”是指手性氨基酸的D和L立体异构体中的天然或非天然氨基酸。应理解为是指氨基酸和相应的氨基酸残基，例如存在于肽基结构中。天然和非天然氨基酸是本领域熟知的。常见的天然氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。不常见和非天然氨基酸包括但不限于烯丙基甘氨酸(AllylGly)、正亮氨酸、正缬氨酸、联苯基丙氨酸(Bip)、瓜氨酸(Cit)，4-胍基苯丙氨酸(Phe(Gu))、高精氨酸(hArg)、高赖氨酸(hLys)、2-萘基丙氨酸(2-nal)、鸟氨酸(Orn)和五氟苯丙氨酸。

氨基酸典型地根据其侧链分为一个或多个类别，包括极性、疏水性、酸性、碱性和芳族。极性氨基酸的实例包括具有侧链官能团(如羟基、巯基和酰胺)的那些，以及酸性和碱性氨基酸。极性氨基酸包括但不限于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。疏水性或非极性氨基酸的实例包括具有非极性脂族侧链的残基的那些，例如但不限于亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸。碱性氨基酸残基的实例包括具有碱性侧链(例如氨基或胍基)的那些。碱性氨基酸残基包括但不限于精氨酸、高赖氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸残基的实例包括具有酸性侧链官能团(如羧基)的那些。酸性氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸和谷氨酸。芳族氨基酸包括具有芳族侧链基团的那些。芳族氨基酸的实例包括但不限于联苯基丙氨酸、组氨酸、2-萘基丙氨酸、五氟苯丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。应注意，一些氨基酸被分类为不止一组，例如组氨酸、色氨酸和酪氨酸被分类为极性和芳族氨基酸两者。氨基酸可进一步分类为不带电荷或带电荷(带正电荷或带负电荷)的氨基酸。带正电荷的氨基酸的实例包括但不限于赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的氨基酸的实例包括但不限于谷氨酸和天冬氨酸。在上述各组中分类的其它氨基酸是本领域普通技术人员已知的。

与参考肽“基本同源”的肽可通过一个或多个保守取代衍生自参考序列。当一个或多个氨基酸残基被生物学上相似的残基取代时，或当大于80％的氨基酸相同，或大于约90％，优选大于约95％相似(功能相同)时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，使用例如GCG(遗传学计算机组，GCG Package的程序手册，第7版，Madison，Wisconsin)堆积程序或本领域已知的任何程序(BLAST、CLUSTAL、FASTA等)通过比对鉴定相似、相同或同源的序列。可以通过基于Needleman-Wunsch比对算法进行成对全局比对，例如使用Needle，并使用具有10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分的BLOSUM62矩阵来计算同一性百分比，以发现两个序列沿其全长的最佳比对(包括空位)。

如本文所用的术语“保守取代”表示氨基酸残基被另一个取代，而不改变肽的总体构象和功能，包括但不限于用具有类似性质(例如极性、氢键势、酸性、碱性、形状、疏水、芳族等)的氨基酸取代。具有相似性质的氨基酸是本领域熟知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性碱性氨基酸并且可以互换。类似地，异亮氨酸，一种疏水性氨基酸，可以被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸取代。可彼此取代的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。

通过“取代的”或“修饰的”，本发明包括已经从天然存在的氨基酸改变或修饰的那些氨基酸。

因此，应当理解，在本发明的上下文中，保守取代在本领域中被认为是用一个氨基酸取代具有相似性质的另一个氨基酸。

根据本发明，与第二氨基酸序列具有至少80％同一性的第一氨基酸序列是指第一序列与第二氨基酸序列具有80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98或99％的同一性。氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数如BLASTP(Karlin和Altschul，1990)测定。

在一些实施方案中，本发明的分离的肽包含至多1275个氨基酸(和至少9个)。在一些实施方案中，本发明的多肽包含1275,1270,1265,1260,1255,1250,1245,1240,1235,1230,1225,1220,1215,1210；1205,1200,1199,1198,1197,1196,1195,1194,1193,1192,1191,1190,1189,1188,1187,1186,1185,1184,1183,1182,1181,1180,1179,1175,1174,1173,1172,1171,1170,1169,1168,1167,1166,1165,1164,1163,1162,1161,1160,1159,1158,1157,1156,1155,1154,1153,1152,1151,1150,1149,1148,1147,1146,1145,1144,1143,1142,1141,1140,1139,1138,1137,1136,1135,1134,1133,1132,1131,1130,1129,1128,1127,1126,1125,1124,1123,1122,1121,1120,1119,1118,1117,1116,1115,1114,1113,1112,1111,1110,1109,1108,1107,1106,1105,1104,1103,1102,1101,1100,1099,1098,1097,1096,1095,1094,1093,1092,1091,1090,1089,1088,1087,1086,1085,1084,1083,1082,1081,1080,1079,1078,1077,1076,1075,1074,1073,1072,1071,1070,1069,1068,1067,1066,1065,1064,1063,10162,1061,1060,1059,1058,1057,1056,1055,1054,1053,1052,1051,1050,1049,1048,1047,1046,1045,1044,1043,1042,1041,1040,1039,1038,1037,1036,1035,1034,1033,1032,1031,1030,1029,1028,1027,1026,1025,1024,1023,1022,1021,1020,1019,1018,1017,1016,1115,1014,1013,1012,1011,1010,1009,1008,1007,1006,1005,1004,1003,1002,1001,1000,999,(…),800,799,798,797,796,795,794,793,792,791,790,789,788,787,786,785,784,783,782,781,780,779,778,777,766,765,764,763,762,761,760,759,758,757,756,755,754,753,752,751,750,749,748,747,746,745,744,743,742,741,740,739,738,737,736,735,734,733,732,731,730,729,728,727,726,725,724,723,722,721,720,719,718,717,716,715,714,713,712,711,710,709,708,707,706,705,704,703,702,701,700,699,698,697,696,695,694,693,692,691,690,689,688,687,686,685,684,683,682,681,680,679,678,677,676,675,674,673,672,671,670,669,668,667,666,665,664,663,662,661,660,659,658,657,656,655,654,653,652,651,650,649,648,647,646,645,644,643,642,641,640,639,638,637,636,635,634,633,632,631,630,629,628,627,626,625,624,623,622,621,620,619,618,617,616,615,614,613,612,611,610,609,608,607,606,605,604,603,602,601,600,599,598,597,596,595,594,593,592,591,590,589,588,587,586,585,584,583,582,581,580,579,578,577,576,575,574,573,572,571,570,569,568,567,566,565,564,563,562,561,560,,559 558,557,556,555,554,553,552,551,550,549,548,547,546,545,544,543,542,541,540,539,538,537,536,535,534,533,532,531,530,529,528,527,526,525,524,523,522,521,520,519,518,517,516,515,514,513,512,511,510,509,508,507,506,505,504,503,502,501,500,499,498,497,496,495,494,493,492,491,490,489,488,487,486,485,484,483,482,481,480,479,478,477,476,475,474,473,472,471,470,469,468,467,466,465,464,463,462,461,460,459,458,457,456,455,454,453,452,451,450,449,448,447,446,445,444,443；442,441,440,439,438,437,436,435,434,433,432,431,430,429,428,427,426,425,424,423,422,421,420,419,418,417,416,415,414,413,412,411,410,409,408,407,406,405,404,403,402,401,400,399,398,397,396,395,394,393,392,391,390,389,388,387,386,385,384,383,382,381,380,379,378,377,376,375,374,373,372,371,370,369,368,367,366,365,364,363,362,361,360,359,358,357,356,355,354,353,352,351,350,349,348,347,346,345,344,343,342,341,340,339,338,337,336,335,334,333,332,331,330,329,328,327,326,325,324,323,322,321,320,319,318,317,316,315,314,313,312,311,310,309,308,307,306,305,304,303,302,301,300,299,298,297,296,295,294,293,292,291,290,289,288,287,286,285,284,283,282,,281,280,279,278,277,276,275,274,,273272,271,270,269,268,267,266,265,264 263,262,261,260,259,258,257,256,255,254,253,,252,251,250,249,248,247,246,245,244,243,242,,241,240,239,238,237,236,235,234,233,232,231,230,229,228,227,226,225,224,223,222,221,220,219,218,217,216,215,214,213,212,211,210,209,208,207,206,205,204,203,202,201,200,199,198,197,196,195,194,193,192,191,190,189,188,187,186,185,184,183,182,181,180,179,178,177,176,175,174,173,172,171,170,169,168,167,166,165,164,163,162,161,160,159,158,157,156,155,154,153,152,151,150,149,148,147,146,145,144,143,142,141,140,139,138,137,136,135,134,133,132,131,130,129,128,127,126,125,124,123,122,121,120,119,118,117,116,115,114,113,112,111,110,109,108,107,106,105,104,103,102,101,100；99；98；97；96；95；94；93；92；91；90；89；88；87；86；85；84；83；82；81；80；79；78；77；76；75；74；73；72；71；70；69；68；67；66；65；64；63；62；61；60；59；58；57；56；55；54；53；52；51；50；49；48；47；46；45；44；43；42；41；40；39；38；37；36；35；34；33；32；31；30；29；28；27；26；25；24；23；22；21；20；19；18；17；16；15；14；13；12；11；10或9个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽包含少于50个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽包含少于30个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽包含少于25个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽包含少于20个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽包含少于15个氨基酸。

根据本发明的分离的多肽可以使用本领域已知的任何方法产生。它们可以例如作为重组多肽在宿主细胞中(例如在细菌、酵母或真核宿主细胞中)产生，或化学合成(参见综述Kent S.B.H.Chem.Soc.Rev.,2009,38,338-351和Bradley L.et al Annu Rev BiophysBiomol Struct.2005；34:91-118或R.B.Merrifield(1969)."Solid-phase peptidesynthesis."Advances in enzymology and related areas of molecular biology 32:221-96.；R.B.Merrifield(1969)."The synthesis of biologically active peptidesand proteins."JAMA 210(7):1247-54.and Raibaut,L.,O.El Mahdi and O.Melnyk(2015)."Solid Phase Protein Chemical Synthesis."Topics in current chemistry)。

根据本发明的抗体

本发明人已经产生了针对本发明多肽的特异性抗体。

首先，为测定BLCA在刚地弓形虫中的原位动力学，发明人提出了针对分别位于BCLA蛋白保守重复序列的末端的两种合成肽的多克隆抗体(参见实施例1和图2b)。产生了针对包含在这些重复中的两种肽(肽1和2)的内部抗体。使用针对两种BCLA衍生肽产生的自制抗体通过蛋白质印迹监测的BCLA表达显示在FR235222处理后BCLA的上调(参见图2c)。

其次，通过用合成肽BCLA的C端抗原结构域(残基1089-1275)(SEQ ID NO：2)免疫小鼠产生单结构域抗体(或纳米抗体或VHH)。更准确地，本发明人已经发现，针对抗体特异性识别本发明的分离的多肽和染色感染刚地弓形虫的细胞系样品以及来自弓形虫病患者(检测组织包囊)和来自弓形虫病小鼠模型的脑样品的能力筛选抗体。本发明抗体的筛选步骤表明这些抗体对于特别是具有BCLA抗原结构域的本发明分离的多肽而言是特异性的。

本发明提供了特异性结合本发明的分离的多肽的抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同的含义，且将在本发明中同等使用。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅涵盖完整抗体分子，还涵盖抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，lambda(1)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘移动、补体结合和与Fc受体(FcR)结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域的结构并因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3和VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区的每一个的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。

可通过本领域已知的常规方法测定结合本发明的分离多肽的抗体。本发明多肽的成熟形式优选用于测定结合本发明多肽的表位的抗体。或者，可使用保留结合纳米抗体XX的本发明分离多肽的任何变体形式。许多不同的竞争性结合测定形式可用于测定表位结合。可以使用的免疫测定包括但不限于使用诸如放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和补体固定测定的技术的竞争性测定系统。这些测定是常规的并且是本领域熟知的(参见例如，Ausubel et al.,eds,1994CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&sons,Inc.,New York)。例如，

(GE Healthcare,Piscataway,NJ)是常规用于单克隆抗体的表位仓(bin)组的多种表面等离子体共振测定形式之一。另外，可以进行常规的交叉阻断试验，如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow andDavid Lane,1988中描述的那些。合适的ELISA测定的实例也在以下实施例中描述。

如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与抗原之间在单个抗原位点处的相互作用强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区在许多位点通过弱非共价力与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。亲和力可以通过测量K_D来测定。本文所用的术语“K_D”是指解离常数，其由K_d与K_a之比(即K_d/K_a)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可以使用本领域公知的方法测定。测定抗体K_D的方法是通过使用表面等离子体共振，或使用生物传感器体系如

体系。

本发明提供特异性结合分离多肽的抗体，所述分离多肽包含以下或由以下组成：

(i)由刚地弓形虫多肽BCLA(SEQ ID NO：1)组成的氨基酸序列；

(ii)由C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275)组成的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；

(v)(i)-(iv)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

这些抗体可识别位于分离多肽(i)-(v)中任一种的至少9个连续氨基酸的片段内或包含位于其中的至少一个氨基酸的表位。

优选地，所述表位位于包含或由分离多肽(i)-(v)中任一种组成的片段内。

最优选地，所述表位位于BCLA的C端抗原结构域(SEQ ID NO：2)内和BCLA的内部重复结构域(残基304-924)内，其称为TgR1-TgR13(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：16)。这些抗体的特征在于它们特异性结合本发明的刚地弓形虫BCLA多肽。

在一个具体实施方案中，特异性结合rBCLA多肽的抗体特异性结合选自下组的氨基酸序列：

(i)GELQPAEAEEARLLVADLKAV(SEQ ID N°32)

(ii)VRVEGEAFFRASVDLYEA(SEQ ID N°33)

(iii)KLRPLTKGELVDVVRQ(SEQ ID N°34)

(iv)TQIFVQDRASAFLRV(rBCLA的肽36)(SEQ ID N°35)

(v)AAEQMKAVFAMVEEG(rBCLA的肽44)(SEQ ID N°36)

(vii)(i)-(vi)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

在更具体的实施方案中，特异性结合rBCLA多肽的抗体特异性结合选自下组的氨基酸序列：

(i)GELQPAEAEEARLLV(rBCLA的肽12)(SEQ ID N°37)；

(ii)QPAEAEEARLLVADL(rBCLA的肽13)(SEQ ID N°38),

(iii)EAEEARLLVADLKAV(rBCLA的肽14)(SEQ ID N°39),

(iv)VRVEGEAFFRASVDL(rBCLA的肽21)(SEQ ID N°40),

(v)EGEAFFRASVDLYEA(rBCLA的肽22)(SEQ ID N°41)；

(vi)AFFRASVDLYEAVKN(rBCLA的肽23)(SEQ ID N°42),

(vii)KLRPLTKGELVDVVR(rBCLA的肽30)(SEQ ID N°43)

(vii)(i)-(viii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

本发明进一步提供了特异性结合由BCLA的BCLA内部重复结构域(残基304-924)组成的氨基酸序列的抗体，其称为TgR1-TgR13(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：16)。

因此，在一个具体实施方案中，特异性结合BCLA的内部重复结构域的抗体结合选自下组的氨基酸序列：

(iii)(i)-(ii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段.

在更具体的实施方案中，特异性结合BCLA TgR4的内部重复结构域的抗体结合选自下组的氨基酸序列：

(i)AAGSMEKEKPVLPGEGEGH(TgR4的结构域A)；(SEQ ID N°44)

(ii)VLPKHETKPALTDEKRTKPGGP(TgR4的结构域B),(SEQ ID N°45)。

(i)AAGSMEKEKPVLPGE(TgR4的肽3)；(SEQ ID N°46)

(ii)GSMEKEKPVLPGEGE(TgR4的肽4)(SEQ ID N°47)

(iii)MEKEKPVLPGEGEGH(TgR4的肽5)(SEQ ID N°48)

(iv)KEKPVLPGEGEGHVL(TgR4的肽6)(SEQ ID N°49)

(v)KPVLPGEGEGHVLPG(TgR4的肽7)(SEQ ID N°50)

(vi)HVLPKHETKPALTDEK(TgR4的肽13),(SEQ ID N°51)

(vii)PKHETKPALTDEKRT(TgR4的肽14),(SEQ ID N°52)

(viii)HETKPALTDEKRTKP(TgR4的肽15)(SEQ ID N°53)

(ix)TKPALTDEKRTKPGG(TgR4的肽16)(SEQ ID N°54)。

在一个具体实施方案中，抗体特异性结合具有以下序列的BCLA(TgRx)的内部重复结构域：

其中Xaa1是谷氨酸(E)或无氨基酸残基

其中Xaa2是精氨酸(R)或丝氨酸(S)

其中Xaa3是脯氨酸(P)或甘氨酸(G)

其中Xaa4是丙氨酸(A)或甘氨酸(G)

其中Xaa5是丙氨酸(A)或无氨基酸残基

其中Xaa6是甘氨酸(G)或精氨酸(R)

其中Xaa7是丝氨酸(S)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)

其中Xaa8是赖氨酸(K)或谷氨酸(E)

其中Xaa9是赖氨酸(K)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)

其中Xaa10为脯氨酸(P)或亮氨酸(L)

其中Xaa11为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)

其中Xaa12是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)

其中Xaa13是甘氨酸(G)或精氨酸(R)

其中Xaa14为缬氨酸(V)或丙氨酸(A)

其中Xaa15为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)

其中Xaa16是组氨酸(H)、天冬氨酸(D)或丙氨酸(A)

其中Xaa17是苏氨酸(T)、精氨酸(R)、甲硫氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)

其中Xaa18是脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)

其中Xaa19是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)

其中Xaa20是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)

其中Xaa21是赖氨酸(K)、甘氨酸(G)或谷氨酸(E)

其中Xaa22是精氨酸(R)或缬氨酸(V)

其中Xaa23是赖氨酸(K)、谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)

其中Xaa24是甘氨酸(G)、缬氨酸或异亮氨酸(I)

其中Xaa25是甘氨酸(G)或谷氨酸(E)

其中Xaa26是精氨酸(R)或脯氨酸(P)

其中Xaa27是苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、赖氨酸(K)或蛋氨酸(M)

其中Xaa28是谷氨酸(E)或丙氨酸(A)

和序列SEQ ID N°64的至少9个连续氨基酸的片段。

本发明还提供了抗体，其特异性结合由BCLA的内部重复结构域内的肽1和肽2(SEQID NO：17-27)中任一个组成的氨基酸序列，所述BCLA的内部重复结构域称为TgR1-TgR13(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：16)。

在一个具体的实施方案中，本研究中使用的肽1和2是

肽1:EMERPAAGSMEK(SEQ ID N°21)

肽2:VLPKHETKPALT(SEQ ID N°22)。

这些抗体可以是多克隆的或单克隆的。当抗体是单克隆抗体时，它们可以例如对应于嵌合、人源化或完全人抗体、抗体片段和单结构域抗体。

术语“嵌合抗体”是指包含抗体的VH结构域和VL结构域以及人抗体的CH结构域和CL结构域的抗体。

根据本发明，术语“人源化抗体”是指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区但保留之前非人抗体的CDR的抗体。

术语“抗体片段”是指含有包含所述抗体的CDR的可变结构域的抗体的片段。基本抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')2Fv、scFv、dsFv。抗体片段的实例还参见综述，Holliger etal Nature Biotechnology 23,issue 9 1126-1136(2005)，其通过引用并入本文。

术语“Fab”表示具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中，H链的N末端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

术语“F(ab')2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在通过用蛋白酶胃蛋白酶处理IgG获得的片段中，所述抗原结合活性略大于通过铰链区的二硫键结合的Fab。

术语“Fab'”是指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得。

单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH:VL异二聚体，其通常由包括通过编码肽的接头连接的VH和VL编码基因的基因融合体表达。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH:VL异二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFvs的结合自发形成，也可以通过肽接头(诸如二价sc(Fv)2)偶联单价scFvs产生。

术语“双抗体”、“三抗体”或“四抗体”是指具有多价抗原结合位点(2、3或4)的小抗体片段，该片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。

如本文所用，术语“单结构域抗体”具有其在本领域中的一般含义，并且是指可以在自然缺乏轻链的骆驼科哺乳动物中发现的抗体类型的单重链可变结构域。这种单结构域抗体也称为VHH或

对于(单)结构域抗体的一般描述，还参考上述现有技术以及EP 0368684 Ward et al.(Nature 1989Oct 12；341(6242):544-6),Holt et al.,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；以及WO 06/030220,WO 06/003388。纳米抗体的分子量约为人IgG分子的十分之一，并且蛋白质的物理直径仅为几个纳米。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体结合抗原位点的能力，所述抗原位点对于较大的抗体蛋白是功能上不可见的，即骆驼纳米抗体可用作检测抗原的试剂，所述抗原使用经典的免疫技术以其它方式隐蔽，并且可用作治疗剂。因此，小尺寸的另一个结果是纳米抗体由于与靶蛋白的沟或窄缝中的特定位点结合而可以抑制，并因此可以以更类似于经典低分子量药物的功能而不是经典抗体的功能的能力起作用。低分子量和紧凑尺寸进一步导致纳米抗体是极其热稳定的，对极端pH和蛋白水解消化稳定，并且抗原性差。另一个结果是纳米体容易从循环系统移动到组织中，甚至穿过血脑屏障，并且可以治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可以进一步促进药物转运穿过血脑屏障。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合表明了巨大的治疗潜力。单结构域抗体的氨基酸序列和结构可以被认为由四个框架区或“FR”组成，其在本领域中分别被称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；和“框架区4”或“FR4”；这些框架区被三个互补决定区或“CDR”中断，在本领域中分别称为“互补决定区”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，单结构域抗体可定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。在本发明的上下文中，单结构域抗体的氨基酸残基根据由国际免疫遗传学信息系统氨基酸编号(http://imgt.cines.fr/)给出的VH结构域的通用编号进行编号。

免疫后产生几种VHH(单结构域抗体)，其导致良好的免疫应答。产生的文库具有良好的大小和插入频率。在His rBCLA(SEQ ID N°3)上的噬菌体展示选择已产生许多良好的克隆，其中3个(ERB-1G6、ERB-1B11和ERB-1A12)显示非常好的表观亲和力，其中ERB-1G6在大肠杆菌中也显示高生产水平。

对于单结构域抗体的可变重链(VH)，ERB-1F1、ERB-1F2、ERB1H4、ERB-1D7、ERB-1G6、ERB-1B11和ERB-1A12 VHH的序列描述于下表1中。

表1

获得这些抗体的方法是本领域熟知的。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过用包含或由(i)-(vii)中任一项组成的所述片段免疫非人哺乳动物来获得。从多克隆抗体开始，然后可以使用标准方法获得单克隆抗体。

本发明的抗体可以与可检测标记缀合以形成免疫缀合物。合适的可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这种可检测标记的免疫缀合物的方法是本领域普通技术人员熟知的，并且在下文更详细地描述。

可检测标记可以是通过放射自显影检测的放射性同位素。特别可用于本发明目的的同位素是³H、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S和¹⁴C。

免疫缀合物也可用荧光化合物标记。通过将免疫缀合物暴露于适当波长的光并检测所得荧光来确定荧光标记的抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

或者，免疫缀合物可通过将抗体与化学发光化合物偶联而被可检测地标记。通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

类似地，生物发光化合物可用于标记本发明的免疫缀合物。生物发光是在生物系统中发现的一种类型的化学发光，其中催化蛋白增加化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

或者，免疫缀合物可通过将单克隆抗体与酶连接而被可检测地标记。当将酶缀合物在合适的底物存在下孵育时，酶部分与底物反应产生化学部分，其可例如通过分光光度、荧光或目视手段被检测。可用于可检测地标记多特异性免疫缀合物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。

本发明的抗体可以用金属化学元素(如镧系元素)标记。镧系元素提供了优于其它标记物的若干优点，因为它们是稳定的同位素，存在大量的它们可用的高达100种或更多种不同的标记，它们是相对稳定的，并且当使用质谱法检测时，它们是高度可检测的并且容易在检测通道之间分辨。镧系元素标记物还提供宽动态检测范围。镧系元素表现出高灵敏度，对光和时间不敏感，因此非常灵活和稳健，并且可以用于许多不同的设置中。镧系元素是原子序数为57-71的15种金属化学元素的系列。它们也称为稀土元素。可以使用CyTOF技术检测镧系元素。CyTOF是电感耦合等离子体飞行时间质谱(ICP-MS)。CyTOF仪器能够每秒分析多达1000个细胞的与可获得的稳定同位素标记一样多的参数。

本领域技术人员知道可根据本发明使用的其它合适的标记。标志物部分与单克隆抗体的结合可以使用本领域已知的标准技术完成。

此外，通过使用已经与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素缀合的单克隆抗体可以增强免疫化学检测的便利性和通用性。

本发明的另一个目的是使用至少一种如上所述的根据本发明的分离的刚地弓形虫多肽用于检测抗刚地弓形虫多肽BCLA的抗体和/或评估其在生物样品中的量的方法。

如本文所用，术语“生物样品”是指受试者的任何生物样品；组织样品或体液样品。在关于检测抗刚地弓形虫多肽BCLA的抗体的方法的优选实施方案中，生物样品是所述受试者的体液。这种样品的非限制性实例包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液和脑脊液(CSF)和房水。

更特别地，体液样品是血清或房水样品。在关于检测抗刚地弓形虫多肽BCLA的抗体的方法的优选实施方案中，生物样品是流体样品，更特别是脑样品。

本发明的检测和诊断方法：

在一些实施方案中，本发明的方法在体外或离体进行。

·用于检测刚地弓形虫多肽BCLA的方法

本发明的目的是一种用于检测本发明的刚地弓形虫多肽BCLA和/或评估其在生物样品中的量的方法。

生物样品是指但不限于组织样品、培养基和细胞样品、全血样品、血清样品、血浆样品、房水样品、唾液样品、脑脊液样品、肌肉样品或脑组织样品。

在关于检测刚地弓形虫BCLA多肽的优选实施方案中，生物样品是组织样品，更特别是肌肉样品或脑样品。

检测刚地弓形虫多肽BCLA可以包括分离蛋白质/多肽：基于蛋白质分子量的离心；基于质量和电荷的电泳；基于疏水性的HPLC；基于尺寸的尺寸排阻色谱；以及基于蛋白质对所使用的特定固相的亲和力的固相亲和力。一旦分离，刚地弓形虫多肽BCLA可以基于已知的“分离谱”鉴定，例如，对于该蛋白质的保留时间，并且使用标准技术测量。或者，分离的蛋白质可通过例如质谱仪检测和测量(参见实施例部分)。

可通过使用标准电泳和免疫诊断技术，包括免疫测定(如竞争)，直接反应(如免疫组化)，或夹心型测定，来测定本发明的刚地弓形虫多肽BCLA种类的检测和量。此类测定包括但不限于蛋白质印迹；凝集试验；酶标记和介导免疫测定，例如ELISA；生物素/抗生物素蛋白型测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀等。反应通常包括显示标记，如荧光、化学发光、放射性酶标记或染料分子，或用于检测抗原和抗体或与其反应的抗体之间复合物形成的其它方法。

例如，刚地弓形虫多肽BCLA的量可以通过多种技术和方法用本领域中任何众所周知的方法来进行：RIA试剂盒(DiaSorin；IDS,Diasource)Elisa试剂盒(Fujirebio,ThermoFisher,EHTGFBI,R&D DY2935,IDS(手工)IDS(适用于开放式分析仪)免疫化学发光自动化方法(MesoScaleDiscovery,DiaSorin Liaison,Roche Elecsys family,IDS iSYS)(Janssen et al.,2012)Simoa/Quanterix。

在具体实施方案中，本发明的方法包括使生物样品与结合配偶体接触。

如本文所用，结合配偶体是指能够选择性地与本发明的刚地弓形虫多肽BCLA相互作用的分子。

结合配偶体通常可以是多克隆或单克隆抗体，优选单克隆抗体。

在另一个实施方案中，结合配偶体可以是适配子。适配子是一类在分子识别方面代表抗体的替代物的分子。适配子是能够以高亲和力和特异性识别几乎任何种类的靶分子的寡核苷酸或寡肽序列。这些配体可以通过随机序列文库的指数富集(SELEX)通过配体的系统进化来分离，如Tuerk et al.(1990)Science,249,505-510所描述。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成获得。在该文库中，每个成员是具有独特序列的最终被化学修饰的线性寡聚物。在Jayasena 1999中综述了这类分子的可能的修饰、用途和优点。肽适配子由平台蛋白(例如大肠杆菌硫氧还蛋A，其通过两种杂交方法选自组合文库(Colas et al.(1996)Nature,380,548-50)。

本发明的结合配偶体(如抗体或适配子)可用可检测的分子或物质标记，如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其它标记。通常，(直接或间接)提供信号的标记是本领域已知的。

如本文所用，关于结合配偶体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质(诸如放射性剂或荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))偶联(即物理连接)至抗体或适配子来直接标记抗体或适配子，以及通过与可检测物质的反应性来间接标记探针或抗体。本发明的抗体或适体可以通过本领域已知的任何方法用放射性分子标记。例如，放射性分子包括但不限于用于闪烁照相研究的放射性原子，例如I123、I124、In111、Re186、Re188。

上述测定通常涉及结合伴侣(即抗体或适配子)在固体支持物中的结合。可用于实施本发明的固体载体包括基质如硝化纤维素(例如，以膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)；聚偏二氟乙烯；重氮化的纸；尼龙膜；活化珠，磁响应珠等。更特别地，可以使用ELISA方法，其中用一组抗刚地弓形虫多肽BCLA的抗体包被微量滴定板的孔。然后，将含有或怀疑含有刚地弓形虫多肽BCLA的体液样品添加到包被的孔中。孵育足以形成结合配偶体-刚地弓形虫多肽BCLA复合物的一段时间后，可洗涤板以除去未结合的物质并添加标记的二级结合分子。使二级结合分子与任何捕获的样品标志物蛋白反应，洗涤板，并使用本领域熟知的方法检测二级结合分子的存在。

作为结合配偶体，可以标记二级结合分子。

本发明的抗体结合和免疫缀合物可用于检测本发明的抗刚地弓形虫多肽BCLA，和/或评估其在生物样品，特别是组织样品、培养基和细胞样品、全血样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品或脑组织样品中的量。因此，它们可用于诊断与刚地弓形虫剂有关的所有疾病。

·诊断潜伏型弓形虫病的方法(检测刚地弓形虫多肽BCLA)

因此，检测根据本发明的刚地弓形虫多肽BCLA的方法可用于从生物样品中体外诊断弓形虫病。特别地，本发明的检测方法因此可用于体外诊断来自生物样品的潜伏型弓形虫病或潜伏型弓形虫病。如本文所用，术语“生物样品”是指受试者的任何生物样品。生物样品意指但不限于任何组织样品、培养基和细胞样品、全血样品、血清样品、血浆样品、尿液样品、唾液样品、脑脊液样品。

在关于使用检测刚地弓形虫BCLA多肽的方法的优选实施方案中，所述生物样品是组织样品，更特别是脑组织样品或肌肉组织样品。

本发明的另一个目的是用于检测本发明的刚地弓形虫多肽BCLA，和/或评估其在生物样品中的量的方法，其中所述方法包括在允许刚地弓形虫多肽BCLA和所述抗体/免疫缀合物之间形成免疫复合物的条件下使所述样品与本发明的抗体或免疫缀合物接触，并检测或测量形成的免疫复合物。

本发明的另一个目的是用于检测生物样品中的裂殖子包囊和/或评估其数量的方法，其中所述方法包括在允许包囊表面的刚地弓形虫多肽BCLA和所述抗体/免疫缀合物之间形成免疫复合物的条件下，将所述样品与本发明的抗体或免疫缀合物接触，并检测或测量形成的免疫复合物。

形成的免疫复合物可以使用标准技术通过多种方法检测或测量，包括，作为非限制性实例，酶联免疫吸附测定(ELISA)或其它固相免疫测定、放射免疫测定、电泳、免疫荧光或蛋白质印迹。

本发明的另一个目的是用于体外诊断弓形虫病的方法，其中所述方法包括在来自待测受试者的生物样品中检测如上所示的刚地弓形虫多肽BCLA的存在。

术语“弓形虫病”具有其在本领域中的一般含义，并且是指在孕妇和免疫受损患者中具有医学重要性的全世界分布的人畜共患感染。刚地弓形虫(弓形虫病的病原体)已经与其恒温宿主(包括人)共同进化了通常作为准隐蔽群体并因此具有亚临床体征的持续策略，因此优化了向新宿主传播的机会。在其长时间停留在温血动物体内的过程中，增殖阶段(速殖子)转变为持续阶段(包囊-封闭的裂殖子)，这为寄生虫提供了传播到新宿主的独特机会，而没有经历其仅限于猫科动物的性阶段。当免疫平衡短暂地或更可持续地破裂时发生的速殖子群体的不受控制的扩增可导致危及生命的疾病，并且在先天性弓形虫病的情况下，可导致出生缺陷。持久性(其取决于寄生虫亚群对缓慢复制技能的获取和快速复制群体的破坏)关键地需要IL-12/IFN-γ免疫轴，然而刚地弓形虫已独特地进化了精细调节和表观遗传调节的发育程序以操作阶段转化。

在有些实施方案中，所述弓形虫病是先天性弓形虫病。

因此，本发明涉及用于体外诊断先天性弓形虫病的方法，其中所述方法包括检测来自待测试受试者的生物样品中根据权利要求1的多肽的存在。

如本文所用，术语“潜伏型弓形虫病”是指弓形虫病疾病的持续阶段(包囊-封闭的裂殖子)。在以速殖子贯穿机体增殖为特征的初始感染期之后，来自宿主免疫系统的压力引起刚地弓形虫速殖子转化为半休眠的、缓慢分裂的寄生虫细胞阶段的裂殖子。在宿主细胞内，这些裂殖子的簇被称为组织包囊。囊壁由寄生泡膜形成。尽管实际上在任何器官中都可以形成包含裂殖子的组织包囊，但是组织包囊主要形成并持续存在于脑、眼和横纹肌(包括心脏)中。然而，特定的组织向性可以在中间宿主物种之间变化；在猪中，大部分组织包囊存在于肌肉组织中，而在小鼠中，大部分包囊存在于脑中。包囊的直径尺寸通常为5-50μm(50μm是平均人发宽度的约2/3)。

此外，本发明还提供了包含至少一种本发明的抗体或其片段的试剂盒。本发明的试剂盒可含有偶联至固体支持物，例如组织培养板或珠(例如琼脂糖珠)的抗体。可以提供试剂盒，其含有用于体外(例如在ELISA或蛋白质印迹中)检测和定量刚地弓形虫多肽BCLA的抗体。这种用于检测的抗体可以带有标记，例如荧光或放射性标记。

·诊断潜伏型弓形虫病的方法(检测刚地弓形虫多肽BCLA)

当作为重组蛋白合成时，发明人明确证明BCLA构成具有高灵敏度的潜伏性感染的有效血清学标记，其与小鼠脑中包囊的存在明确且唯一地相关。已经在人患者中检测到抗BCLA抗原的抗体。在鉴定为Sag1或速殖子相关抗原血清阳性的患者中检测富集滴度。人中抗BCLA IgG合成和包囊之间的进一步相关性是由与存在包囊强烈相关的病理学组中显著更强的记录滴度带来的。值得注意的是，在经历血清学再活化的患者和患有经证实的眼弓形虫病的患者中(参见实施例图10和13中的实验数据)。在后一种情况下，所开发的ELISA测定还可以检测这些患者中的一些的房水和血清中的BCLA抗体。通过开辟新的诊断视角，检测针对半休眠包囊的弓形虫抗体是弓形虫病血清学诊断的显著改进。实际上，至少在商品化试剂盒中，几乎没有囊壁或表面裂殖子的成分被鉴定，并且没有一种显示出用作血清学目的的抗原。理想的抗原应仅在潜伏性裂殖子阶段表达，理想地应暴露于包囊表面，这是在BCLA多肽中发现的两个特征。

此外，本发明人已经证明，儿童在出生前新合成特异性抗BCLA IgG。因此，与通过

和

滴定Toxo IgG相比，BCLA反应性可以进一步更好地指导出生时先天性弓形虫病的诊断(参见实施例3)。

因此，检测根据本发明的刚地弓形虫多肽的自身抗体的方法由此可用于从生物样品中体外诊断弓形虫病。特别地，本发明的检测方法因此可用于体外诊断来自生物样品的潜伏型弓形虫病或先天性弓形虫病。

本发明的另一个目的是用于体外诊断弓形虫病的方法，其中所述方法包括在来自待测试受试者的生物样品中检测如上所述的根据本发明的刚地弓形虫多肽的T自身抗体的存在。

因此，本发明涉及确定受试者是否患有潜伏型弓形虫病的方法，所述方法包括：

a)在所述患者的生物样品中检测对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性；和任选地

b)从步骤a)的结果推断患者是否患有潜伏型弓形虫病，对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性指示潜伏型弓形虫病。

本发明还涉及抗潜伏型弓形虫病的抗体作为用于诊断(或确认)患者中潜伏型弓形虫病的生物标志物的用途。

本发明还涉及用于诊断或确认患有或疑似患有潜伏型弓形虫病的患者中潜伏型弓形虫病的诊断的体外方法，其包括：

a)从患者获得生物样品，和

b)在生物样品中检测针对本发明的刚地弓形虫多肽的抗体；

其中所述生物样品中抗体的存在诊断或确认患者中潜伏型弓形虫病的诊断。

因此，本发明涉及确定受试者是否患有先天性弓形虫病的方法，所述方法包括：

b)从步骤a)的结果推断患者是否患有先天性弓形虫病，对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性指示先天性弓形虫病。

本发明还涉及抗先天性弓形虫病的抗体作为诊断(或确认)患者中先天性弓形虫病的生物标志物的用途。

本发明还涉及用于诊断或确认患有或疑似患有先天性弓形虫病的患者中潜伏型弓形虫病的诊断的体外方法，其包括：

a)从患者获得生物样品，和

b)在生物样品中检测针对本发明的刚地弓形虫多肽的抗体；

其中所述生物样品中抗体的存在诊断或确认患者中先天性弓形虫病的诊断。

如本文所用，术语“生物样品”是指受试者的任何生物样品。在关于使用抗刚地弓形虫BCLA多肽的抗体的检测的方法的优选实施方案中，所述生物样品是所述受试者的体液。这种样品的非限制性实例包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液和脑脊液(CSF)和房水。

更特别地，体液样品是血清或房水样品。

在优选实施方案中，待测试的患者患有或疑似患有弓形虫病。

在另一个优选实施方案中，待测试的患者疑似患有弓形虫病，并且进行该方法以确认患者实际上患有潜伏型弓形虫病。

在另一个实施方案中，待测试的患者是孕妇和/或免疫受损患者(即，HIV患者或在接受移植物之前通过免疫调节治疗的患者)，并且进行该方法以确定患者是否实际上患有潜伏型弓形虫病。

当受试者呈现急性弓形虫病的体征和症状时，弓形虫病的当前治疗如下：

·乙胺嘧啶(Daraprim)。这种典型地用于疟疾的药物是叶酸拮抗剂。它可以防止身体吸收B族维生素叶酸(叶酸、维生素B-9)，尤其是当患者长期服用高剂量时。为此，可以推荐服用另外的叶酸。乙胺嘧啶的其它潜在副作用包括骨髓抑制和肝毒性。

·磺胺嘧啶。该抗生素与乙胺嘧啶一起用于治疗弓形虫病。

对于HIV/AIDS患者，弓形虫病的治疗选择也是乙胺嘧啶和磺胺嘧啶与叶酸(甲酰四氢叶酸)。另一种选择是乙胺嘧啶与克林霉素(Cleocin)一起服用。

对于感染弓形虫病的孕妇和婴儿：

如果感染发生在妊娠第16周之前，则孕妇接受抗生素螺旋霉素。使用这种药物可以降低婴儿患潜伏型弓形虫病的神经问题的风险。

如果感染发生在妊娠第16周之后，或如果测试显示未出生的孩子患有弓形虫病，孕妇可以被给予乙胺嘧啶和磺胺嘧啶以及叶酸(甲酰四氢叶酸)。

本发明还提供用于选择患有适合用至少一种叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物治疗的潜伏型弓形虫病的患者的体外方法，其包括：

b)当检测到针对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性时，选择适合用至少一种叶酸拮抗剂(即乙胺嘧啶)和/或抗生素化合物(即磺胺嘧啶或螺旋霉素)治疗的患者。

本发明的确定患者是否患有潜伏型弓形虫病的方法、抗本发明的刚地弓形虫多肽的抗体作为用于诊断(或证实)潜伏型弓形虫病的生物标记的用途、以及选择患有适合用至少一种叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物治疗的潜伏型弓形虫病的患者的方法可以是例如体外或离体方法。

本发明还涉及治疗感染潜伏型弓形虫病的患者的方法，所述患者显示针对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性，所述方法包括向患者施用叶酸拮抗剂(即乙胺嘧啶)和/或抗生素化合物(即磺胺嘧啶或螺旋霉素)或包含所述化合物的药物组合物。

本发明还提供叶酸拮抗剂(即乙胺嘧啶)和/或抗生素化合物(即磺胺嘧啶或螺旋霉素)或包含所述化合物的药物组合物，其用于治疗患有表现出针对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性的潜伏型弓形虫病的患者。

在一些实施方案中，测试其免疫反应性的本发明的刚地弓形虫多肽是BCLA(脑包囊负载相关抗原)蛋白(缩写为“BCLA”)，BCLA的C端结构域末端(残基1089-1275，SEQ ID N°2)(缩写为“rBCLA”)，或BCLA的内部重复结构域(BCLA的残基304-924)，其称为TgR1-TgR13(SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：16)。

在具体实施方案中，针对其测试免疫反应性的蛋白质是rBCLA多肽。

在另一个具体实施方案中，针对其测试免疫反应性的蛋白质是BCLA、rBCLA序列或BCLA的内部重复结构域(BCLA的残基304-924)的至少9个连续氨基酸的肽片段，其称为TgR1-TgR13(SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：16)。

特别地，术语针对其测试免疫反应性的本发明的刚地弓形虫多肽是指：

(i)由刚地弓形虫多肽BCLA(SEQ ID NO：1)组成的氨基酸序列；

(v)(i)-(iv)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

因此，在一个具体实施方案中，针对其测试免疫反应性的从rBCLA多肽分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)GELQPAEAEEARLLVADLKAV(rBCLA的结构域A)(SEQ ID N°32)

(ii)VRVEGEAFFRASVDLYEA(rBCLA的结构域B)(SEQ ID N°33)

(iii)KLRPLTKGELVDVVRQ(rBCLA的结构域C)(SEQ ID N°34)

(iv)TQIFVQDRASAFLRV(rBCLA的肽36和rBCLA的结构域D)(SEQ ID N°35)

(v)AAEQMKAVFAMVEEG(rBCLA的肽44和rBCLA的结构域E)(SEQ ID N°36)

(vii)(i)-(vi)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

在更具体的实施方案中，针对其测试免疫反应性的从rBCLA多肽分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)GELQPAEAEEARLLV(rBCLA的肽12)(SEQ ID N°37)；

(ii)QPAEAEEARLLVADL(rBCLA的肽13)(SEQ ID N°38),

(iii)EAEEARLLVADLKAV(rBCLA的肽14)(SEQ ID N°39),

(iv)VRVEGEAFFRASVDL(rBCLA的肽21)(SEQ ID N°40),

(v)EGEAFFRASVDLYEA(rBCLA的肽22)(SEQ ID N°41)；

(vi)AFFRASVDLYEAVKN(rBCLA的肽23)(SEQ ID N°42),

(vii)KLRPLTKGELVDVVR(rBCLA的肽30)(SEQ ID N°43)

(vii)(i)-(viii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

因此，在一个具体实施方案中，针对其测试免疫反应性的从BCLA的内部重复结构域分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(iii)(i)-(ii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

在更具体的实施方案中，针对其测试免疫反应性的从BCLA的内部重复结构域分离的刚地弓形虫多肽选自下组：

(i)AAGSMEKEKPVLPGEGEGH(TgR4的结构域A)；(SEQ ID N°44)

(ii)VLPKHETKPALTDEKRTKPGGP(TgR4的结构域B),(SEQ ID N°45)

(iv)(i)-(iii)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

(i)AAGSMEKEKPVLPGE(TgR4的肽3)；(SEQ ID N°46)

(ii)GSMEKEKPVLPGEGE(TgR4的肽4)(SEQ ID N°47)

(iii)MEKEKPVLPGEGEGH(TgR4的肽5)(SEQ ID N°48)

(iv)KEKPVLPGEGEGHVL(TgR4的肽6)(SEQ ID N°49)

(v)KPVLPGEGEGHVLPG(TgR4的肽7)(SEQ ID N°50)

(vi)HVLPKHETKPALTDEK(TgR4的肽13),(SEQ ID N°51)

(vii)PKHETKPALTDEKRT(TgR4的肽14),(SEQ ID N°52)

(viii)HETKPALTDEKRTKP(TgR4的肽15)(SEQ ID N°53)

(ix)TKPALTDEKRTKPGG(TgR4的肽16)(SEQ ID N°54)

(xi)(i)-(x)的序列的至少9个连续氨基酸的片段。

由于BCLA多肽具有贯穿不同结构域(尤其是在rBCLA中以及在BCLA TgR1-TgR13的内部重复结构域中)的大量表位，因此组合本发明的BCLA免疫原性肽片段可以是有利的。

因此，在另一个实施方案中，针对其测试免疫反应性的本发明的分离的多肽是本发明的两个免疫原性肽片段之间的融合体，诸如

因此，在另一个实施方案中，本发明的来自BCLA内部重复结构域(TgRx)的多肽(针对其测试免疫反应性)具有以下序列：

其中Xaa1是谷氨酸(E)或无氨基酸残基

其中Xaa2是精氨酸(R)或丝氨酸(S)

其中Xaa3是脯氨酸(P)或甘氨酸(G)

其中Xaa4是丙氨酸(A)或甘氨酸(G)

其中Xaa5是丙氨酸(A)或无氨基酸残基

其中Xaa6是甘氨酸(G)或精氨酸(R)

其中Xaa7是丝氨酸(S)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)

其中Xaa8是赖氨酸(K)或谷氨酸(E)

其中Xaa9是赖氨酸(K)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)

其中Xaa10为脯氨酸(P)或亮氨酸(L)

其中Xaa11为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)

其中Xaa12是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)

其中Xaa13是甘氨酸(G)或精氨酸(R)

其中Xaa14为缬氨酸(V)或丙氨酸(A)

其中Xaa15为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)

其中Xaa16是组氨酸(H)、天冬氨酸(D)或丙氨酸(A)

其中Xaa17是苏氨酸(T)、精氨酸(R)、甲硫氨酸(M)或谷氨酰胺(Q)

其中Xaa18是脯氨酸(P)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)

其中Xaa19是天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)

其中Xaa20是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)

其中Xaa21是赖氨酸(K)、甘氨酸(G)或谷氨酸(E)

其中Xaa22是精氨酸(R)或缬氨酸(V)

其中Xaa23是赖氨酸(K)、谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)

其中Xaa24是甘氨酸(G)、缬氨酸或异亮氨酸(I)

其中Xaa25是甘氨酸(G)或谷氨酸(E)

其中Xaa26是精氨酸(R)或脯氨酸(P)

其中Xaa27是苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、赖氨酸(K)或蛋氨酸(M)

其中Xaa28是谷氨酸(E)或丙氨酸(A)

和序列SEQ ID N°64的至少9个连续氨基酸的片段。

“具有基本上同源的氨基酸序列的多肽”是指与全长多肽参考序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的多肽。在本申请的上下文中，使用全局比对计算同一性百分比(即，在其全长上比较两个序列)。比较两个或多个序列的同一性的方法是本领域熟知的。例如，当考虑其全长时，可以使用采用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman and Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)的《needle》程序找到两个序列的最佳比对(包括空位)。needle程序例如可在ebi.ac.uk万维网站点上获得。优选使用EMBOSS::needle(全局)程序以及Blosum62矩阵计算根据本发明的同一性百分比，其中“空位开放”参数等于10.0，“空位延伸”参数等于0.5。

如贯穿本申请使用的，表述“针对靶蛋白的免疫反应性”(此处为本发明的刚地弓形虫多肽)意指来自待测试患者的样品包含特异性抗靶标的抗体。

因此，通过证明待测试生物样品中特异性抗靶蛋白或该靶蛋白片段的抗体的存在，可以容易地检测针对靶蛋白的免疫反应性。

例如，当与全长蛋白比较时，靶蛋白的片段可以在N端或C端截短，或者可以缺少内部残基。优选地，所述片段的长度为至少约9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、250、300、350、400、450、500或更多个氨基酸。

这种测试可以由本领域普通技术人员通过使用标准方法进行，例如酶联免疫吸附测定(“ELISA”)、蛋白质印迹/斑点印迹、转染细胞上的免疫组化、Luminex(参见综述Immunodiagnostics:A Practical Approach,R.Edwards Editor,Oxford UniversityPress 2000；Manual of Molecular And Clinical Laboratory Immunology,J.D.FoldsR.G.Hamilton,B.Detrick Editors ASM Press 2006；Immunology and Serology inLaboratory Medicine,M.L.Turgeon,Mosby Inc,2008)。

例如，为了确定样品中抗BCLA抗体的存在，靶蛋白可以是全长BCLA多肽、称为rBCLA(SEQ ID N°2)的C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275)、称为TgR1至TgR13(SEQ IDNOO:4-SEQ ID NO:16)的BCLA的内部重复结构域(BCLA的残基304-924)或其片段。优选地，靶蛋白由以下组成或包含以下：C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275，称为rBCLA(SEQ IDN°2))，BCLA的内部重复结构域(BCLA的残基304-924)，称为TgR1至TgR13(SEQ ID NO:4-SEQID NO:16))或其片段。

本文所用的术语“患者”表示哺乳动物，更特别是人。

在本发明的上下文中，术语“治疗”在本文中用于表征治疗方法或过程，其目的在于(1)减缓或停止该术语适用的疾病状态或病症的症状的发展、加重或恶化；(2)减轻或改善该术语适用的疾病状态或病症的症状；和/或(3)逆转或治愈该术语适用的疾病状态或病症。

用于上述方法或用于治疗患有潜伏型弓形虫病的患者的叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物在药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中提供，所述载体、赋形剂或稀释剂不损害待治疗的患者。

可用于本发明组合物的药学上可接受的载体和赋型剂包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型的表面活性剂如吐温或其它类似的聚合物递送基质，血蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。

如本领域技术人员所理解的，将组合物适当地配制成与预期的施用途径相容。合适的施用途径的实例包括肠胃外途径，包括例如肌内、皮下、静脉内、腹膜内或局部注射。也可使用口服途径，条件是组合物为适于口服施用的形式，能够保护活性成分免受胃和肠酶的影响。

此外，用于上述方法或用于治疗患有潜伏型弓形虫病的患者的叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物的量是治疗有效量。

待使用的叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物和待施用的组合物的确切量将根据待治疗患者的年龄和体重、疾病类型、施用方式、施用频率以及包含叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物的组合物中的其它成分而变化。这些浓度可由本领域技术人员典型地确定。实际施用的化合物的量通常由医师根据相关情况来确定，所述相关情况包括待治疗的病症、所选择的施用途径、所施用的实际叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。

通常，用于上述方法或用于治疗患有潜伏型弓形虫病的患者的叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物可以在典型范围内施用。有效剂量也将根据施用途径以及与其它试剂共同使用的可能性而变化。例如，典型剂量。

本发明还提供了用于上述方法的试剂盒，所述试剂盒用于诊断潜伏型弓形虫病或用于选择适于用至少一种叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物治疗的患有潜伏型弓形虫病的患者。

这种试剂盒包括用于检测抗至少一种本发明的刚地弓形虫多肽的抗体的装置。

优选地，试剂盒至少包含用于检测抗BCLA多肽或C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275)或其片段的抗体的装置。

这种装置可以是靶蛋白，即如上所述测试针对其的免疫反应性的本发明的刚地弓形虫多肽或其片段。例如，当测试针对BCLA的免疫反应性时，靶蛋白是全长BCLA蛋白，由以下组成或包含以下：称为rBCLA(SEQ ID N°2)的C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275)、称为TgR1至TgR13(SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:16)的BCLA的内部重复结构域(BCLA的残基304-924)，优选地，靶蛋白由以下组成或包含以下：称为rBCLA(SEQ ID N°2)的C端抗原结构域(BCLA的残基1089-1275)、称为TgR1至TgR13(SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:16)的BCLA的内部重复结构域(BCLA的残基304-924)。

用于检测抗至少一种本发明的刚地弓形虫多肽的抗体的装置还可以包括特异性结合人抗体的抗体(用作“二抗”，其结合来自待测试样品的特异性结合靶蛋白的抗体)。这些抗体可用可检测的化合物(如荧光团或放射性化合物)标记。

在优选实施方案中，根据本发明的试剂盒可以进一步包含对照样品，所述对照样品包含已知量的抗体和/或使用所述试剂盒诊断潜伏型弓形虫病或选择患有适合用至少一种叶酸拮抗剂和/或抗生素化合物治疗的潜伏型弓形虫病的患者的说明书。

装置可以存在于例如小瓶或微量滴定板中，或附着于固体载体上。例如，靶蛋白可以附着到膜或阵列上。

本发明的另一个目的是用于在受试者中检测裂殖子包囊和/或评估其量的方法，其中所述方法包括：

a)在所述受试者的流体样品中检测针对根据权利要求1至2中任一项所述的刚地弓形虫多肽的免疫反应性；和任选地

b)从步骤a)的结果推导出裂殖子包囊的存在和/或量，针对本发明的刚地弓形虫多肽的免疫反应性指示所述受试者中裂殖子包囊的存在和/或量。

在优选实施方案中，生物样品是所述受试者的体液。这种样品的非限制性实例包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液和脑脊液(CSF)和房水。

更特别地，体液样品是血清或房水样品。

本文引用的所有参考文献，包括期刊论文或摘要、公布的专利申请、公布的专利或任何其它参考文献，通过引用全部并入本文，包括在引用的参考文献中呈现的所有数据、表、图和文本。

将根据以下实施例和附图进一步评价本发明。

附图说明

图1.BCLA是由TgHDAC3调节的裂殖子特异性基因。

(a)在用FR235222抑制TgHDAC3之后通过LC-MS/MS进行的全蛋白质组定量分析揭示了它们BCLA中的裂殖子特异性蛋白质的表达。火山图通过比较感染II型(PruΔku80)菌株的未处理的(DMSO,0.1％)VS FR235222处理的(90nM)原代人成纤维细胞显示了刚地弓形虫的分布。通过将FR235222处理的样品的强度除以DMSO处理的样品(对照)的强度获得蛋白质计数的log2比率(x轴)。下调和上调的蛋白分别以红点显示于图的左侧和右侧。垂直黑线表示log2倍数变化值。水平黑色虚线区分蛋白质(红点)，显示p值<0.01的至少2倍丰度变化。(b)显示BCLA基因在以下过程中的表达(每百万映射读数的转录物的片段/千碱基[FPKM]值)的条形图：在口服感染弓形虫包囊(CZ克隆H3)后第3天至第7天的小鼠急性(速殖子)或慢性(包囊闭合性裂殖子)感染、各种猫肠上皮阶段(EES)样品中(EES1：非常早期EES；EES2：早期EES；EES3：混合EES；EES4：晚期EES；EES5：非常晚期EES)，以及在来自小鼠脑的包囊和体外培养的速殖子中。BCLA仅在慢性期期间在包囊闭合性裂殖子中表达，并且在从EES1至EES5的猫肠上皮阶段(EES)中未发现(数据源：www.ToxoDB.org)。(c)刚地弓形虫染色体Ib上BCLA基因座(品红色)的基因组浏览器(IGB)截屏，显示两种组蛋白标志物(H3K14ac，H3K9me3)、TgHDAC3、TgCRC230以及RNA-seq(以FPKM表达，黑色)的读数。y轴表示读数密度。该图显示了BCLA基因处H3K14ac、H3K9me3、TgHDAC3和TgCRC230的富集。(d)左图：当通过免疫荧光测定监测时，CRISPR介导的TgHDAC3基因破坏导致TgHDAC3信号抑制。右图：当通过免疫荧光测定监测时，CRISPR介导的TgHDAC3基因破坏触发BCLA过表达。

图2.BCLA蛋白揭示了以非结构化和串联重复序列为特征的独特结构。

(a)图表说明显示作为蛋白质氨基酸位置(经由IUPred服务器产生)的函数的病症得分。ANCHOR2和IUPred2算法结果分别以蓝色和红色显示。BCLA的C端结构域末端(残基1089-1275，下文称为rBCLA)预测为结构化的，与含有核心重复基序的蛋白质的其余部分相反。(b)由II型(ME49)刚地弓形虫菌株编码的BCLA蛋白在其结构中显示13个重复(TgR1至TgR13)。由Eurogentec公司制备针对这些重复中包含的两种肽(肽1和2)的内部抗体。(c)与DMSO(对照)相比，使用针对两种BCLA衍生肽产生的自制抗体通过蛋白质印迹监测的BCLA表达显示在FR23522处理后BCLA的上调。

图3.FR235222诱导后的BCLA位于液泡空间内和液泡膜处。

(a)FR235222刺激后每个PV中BCLA强度的定量。每个符号标记单个PV的BCLA密度。结果表示为两个独立实验的平均值±标准偏差；定量的PV数至少为70。星号表示当比较每个单独的FR235222处理的菌株和相应的对照(DMSO，0.1％)时的统计学显著性，如通过未配对的双尾学生t检验(Mann Whitney检验)所测定(****p<0.0001；NS，不显著)。

图4.BCLA缺失不显著影响寄生虫体外生长或液泡形成和成熟。

(a)与WT菌株相比，评估体外培养的76k-GFP-luc-Δbcla速殖子在HFF中的侵入百分比(左图)以及细胞内增殖率(右图)。两种菌株中HFF侵入％非常相似，但是BCLA缺失诱导细胞内增殖减少30％。结果表示为两个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示当通过Mann Whitney检验(未配对双尾学生t检验)比较76k-GFP-luc-Δbcla和76k-GFP-luc时的统计显著性，**p<0.01；NS，不显著。

图5.BCLA缺失不显著改变腹膜内感染速殖子的小鼠中刚地弓形虫毒力或包囊负担。

(a)Balb/c和NMRI小鼠中76k-GFP-luc-Δbcla菌株与其亲本菌株76k-GFP-luc(WT)的毒力比较。balb/c小鼠(n＝20)和NMRI小鼠(n＝43)分别通过腹膜内(i.p.)注射10⁴和10⁶个速殖子来接种，并在35天内监测存活。使用Log-rank(Mantel-Cox)试验和Gehan-Breslow-Wilcoxon试验测试显著性。感染Δbcla速殖子的小鼠存活至与WT菌株相同的时间范围(NS，不显著)。(b)评估Δbcla菌株与WT菌株相比迁移通过慢性感染刚地弓形虫的小鼠的脑血屏障并在脑中形成刚地弓形虫包囊的能力。收获在(a)中呈现的攻击存活下来的NMRI小鼠和Balb/c小鼠的脑，并使用显微镜通过定量PCR±包囊计数测试，以分别评估寄生虫载量和包囊数。结果表示为至少两个独立实验的平均值±标准偏差。通过非配对双尾学生t-检验(Mann Whitney检验)测试统计学显著性。感染Δbcla菌株的小鼠显示出寄生载量和脑中包囊数减少的趋势(但不显著，NS)。

图6.BCLA缺陷的包囊以急剧的形态学变化为特征

将含有Δbcla裂殖子的包囊的包囊形态与来自亲本76k-GFP-luc(WT)菌株的包囊形态进行比较。收获在图6a中呈现的攻击存活下来的NMRI小鼠的脑，使用Percoll梯度方法纯化包囊并在显微镜下进行形态学表征。使用ZEN软件(Zeiss)测量含有Δbcla的包囊的(a)包囊面积和(b)GFP荧光强度，并与用WT包囊获得的那些进行比较。含有Δbcla的包囊具有比WT包囊显著更低的大小和更低的GFP强度。结果表示为至少两个独立实验的平均值±标准偏差。星号表示当比较含Δbcla的包囊和WT包囊的包囊面积时的统计显著性，如通过未配对双尾学生t检验(Mann Whitney检验)所测定(***p<0.001)。比例尺，10μm。

图7.BCLA缺失既不改变感染性，也不改变经口饲喂包囊的小鼠的宿主免疫应答。

评估含有76k-GFP-luc-Δbcla的包囊与76k-GFP-luc亲本菌株(WT)相比的毒力和感染性。C56BL/6小鼠(n＝6)和NMRI小鼠(n＝20)分别用Δbcla或WT菌株的46个包囊和20个包囊经口感染。在感染后8天，在C56BL/6小鼠中观察到回肠中的急性反应。在感染后8-10周在NMRI小鼠中评估脑中的慢性应答。(a)通过qPCR定量8天前经口感染的C56BL/6小鼠的回肠中的寄生虫载量。Δbcla和WT菌株之间的统计显著性通过未配对的双尾学生t-检验(Mann Whitney检验)测试。未观察到显著差异(NS，不显著)。(b)8天前经口感染的C56BL/6小鼠回肠中的细胞因子(IFNγ、IL-22、IL-18和IL-1β)和趋化因子(CCL2)的qRT-PCR分析。使用TBP水平将RNA水平标准化。显示平均值±标准差。Δbcla和WT之间的统计学显著性通过Mann Whitney检验测试。未观察到显著差异(NS，不显著)。(c)收集8-10周前经口感染的NMRI小鼠的脑，并使用显微镜通过定量PCR和包囊计数测试以分别评价寄生虫载量和包囊数。结果表示为两个独立实验的平均值±标准偏差。Δbcla和WT之间的统计学显著性通过Mann Whitney检验测试。未观察到显著差异(NS，不显著)。感染Δbcla菌株的小鼠显示出寄生载量和脑中包囊数减少的趋势(但不显著，NS)。(d)8-10周前经口感染的NMRI小鼠脑中细胞因子(TNF-α、IFNγ、IL-6、IL-22)的qRT-PCR分析。使用TBP水平将RNA水平标准化。显示平均值±标准差。Δbcla和WT之间的统计学显著性通过Mann Whitney检验测试。未观察到显著差异(NS，不显著)。

图8.rBCLA不与急性感染的小鼠血清反应

用0.5μg重组rBCLA加载单个蛋白质印迹条带。对从具有各种刚地弓形虫菌株、感染途径和小鼠遗传背景的弓形虫病急性期小鼠收集的血清测试条带。rBCLA在感染的急性期(7-8天)不与小鼠抗体反应。(a)对来自通过腹膜内注射(i.p.)COUG和COUG-Δmyr1(非典型单倍型11)菌株的10⁴个速殖子感染7天的NMRI小鼠的血清的免疫印迹。血清不与rBCLA反应。(b)对来自通过i.p.注射RH(I型)菌株的10³个速殖子感染7天的CBA小鼠的血清的免疫印迹。血清不与rBCLA反应。(c)对来自通过经口途径用76k-GFP-luc或76k-GFP-luc-Δbcla(II型)菌株的47个包囊感染8天的C57BL/6小鼠的血清的免疫印迹。血清不与rBCLA反应。

图9.rBCLA是小鼠模型中刚地弓形虫慢性感染的血清学标志物

用0.5μg rBCLA加载单个蛋白质印迹条带，并在弓形虫病的亚慢性期(21-41天)或慢性期(>42天)从小鼠收集的血清上进行测试。rBCLA仅与II型囊原性菌株(PruA7、ME49或76k-GFP-luc)感染后亚慢性或慢性弓形虫病小鼠的抗刚地弓形虫IgG抗体反应。(a)对来自在42天期间通过i.p.注射PruA7(II型)菌株的10³至10⁶个速殖子/小鼠感染的Balb/c小鼠的血清的免疫印迹。根据速殖子载量，血清与rBCLA相当成比例地反应。(b)对来自在80天期间通过i.p.注射ME49(II型)菌株的10⁶个速殖子/小鼠感染的CBA小鼠的血清的免疫印迹。血清与rBCLA强烈反应。(c)对来自在22个月期间经口感染76k-GFP-luc(II型)菌株的20个包囊的NMRI小鼠的血清的免疫印迹。血清与rBCLA强烈反应。(d)对来自在21天期间通过i.p.注射76k-GFP-luc或76k-GFP-luc-Δbcla(II型)的10⁶个速殖子/小鼠感染的Balb/c小鼠的血清的免疫印迹。用76k-GFP-luc感染的小鼠的血清与rBCLA强烈反应，而用76k-GFP-luc-Δbcla感染的小鼠几乎不与rBCLA反应。(e)对来自通过i.p.注射RH(I型)菌株的10³个速殖子/小鼠感染，随后用乙胺嘧啶(PYR)或磺胺嘧啶(Sulfa)处理22天的CBA小鼠的血清的免疫印迹。血清与rBCLA反应非常轻微。(f，g)对来自通过i.p.注射(f)CTG(III型)菌株或i.p.注射(g)PruΔku80(II型)菌株的10⁶个速殖子/小鼠感染42天的NMRI小鼠的血清的免疫印迹。血清不与rBCLA反应。(h)对来自通过i.p.注射76k-GFP-luc(II型)菌株的10⁵个速殖子/小鼠感染并在42天期间重新活化或不使用皮质激素类处理的Balb/c小鼠的血清的免疫印迹。所有血清与rBCLA强烈反应。

图10.rBCLA的蛋白水解分析揭示了BCLA的最小抗原区的边界。

(a)通过SDS PAGE分析蛋白水解反应。考马斯染色显示输入样品和每种蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶)的所有这些时间点(10、20和50分钟)的SDS PAGE。(b)印迹凝胶与阳性小鼠血清一起孵育，并通过抗小鼠IgG抗体显示。(c)印迹凝胶与偶联过氧化物酶的抗6his IgG一起孵育。黑色箭头显示非降解rBCLA。红色和蓝色光标箭头显示反复发生的N端降解，表明rBCLA被胰凝乳蛋白酶快速降解，并被弹性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶部分降解，在17-kDa标志物周围产生稳定的片段。

图11.评估rBCLA作为人中血清学标志物。

用0.5μg rBCLA加载单个蛋白质印迹条带，并在用分离自人的菌株感染的小鼠血清上或直接在人血清上测试。(a)对来自i.p.注射感染有来自疑似(临床疑似但羊水或胎盘刚地弓形虫PCR阴性)或确诊(羊水刚地弓形虫PCR阳性)先天性弓形虫病的妇女的羊水或胎盘的Swiss小鼠的血清的免疫印迹。来自感染阳性羊水的小鼠的血清与rBCLA强烈反应。(b)对来自患有或没有弓形虫感染的人患者的血清(S)或房水(HA)的免疫印迹。人血清和房水随机选自格伦布泽帕大学医院寄生虫学-真菌学临床实验室的生物库。对于每个样品，使用

(bioMérieux)和

(Abbott)系统进行弓形虫血清学测定，两个系统均基于ELISA衍生技术，并且使用每位患者的医疗记录评估临床状态。值得注意的是，

基于rSAG1抗原，而

基于rSAG1和rGRA8抗原。将用rBCLA获得的血清学结果与每位患者的血清学和临床状态进行比较，以评估它们是否与特异性刚地弓形虫血清学和/或临床状态相关。患有(α)已证实或疑似眼弓形虫病、(β)血液病期间弓形虫病再活化(免疫抑制)和(γ)近期原发性感染(1-2个月)的患者的血清与rBCLA反应。(δ)来自鉴定为“既往免疫”的3名血清阳性患者的血清和来自相当近期感染(2.5个月)的1名患者的血清不与rBCLA反应。(ζ)来自血清阴性患者的所有测试血清不与rBCLA反应，表明该抗原在人中具有良好的特异性。

图12.评估BCLA作为人血清学标志物。

(a)重复序列n°4和rBCLA区域中的表位作图区域的示意图。肽覆盖显示为代表肽序列上方或下方的单个15aa肽的线，其中显示部分编号。显示显著或强反应性的区域分别在全框或虚线框中突出显示，并且每个单独的肽片段用(*或**)标记。(b)BCLA阳性血清的表位作图。下图是显示核心重复区域和rBCLA区域上的肽的相对反应性的柱状图，使用5种不同的阳性印迹和阴性背景扣除来计算。上图是在阳性人血清上进行的具有编号肽的斑点印迹膜显象模式的实例。(c)用于5份阳性血清和1份阴性血清的肽斑点印迹，其中肽编号和区域被覆盖。在右边，显示了这些相同血清的rBCLA和SAG1(Architect)的ELISA滴定。

图13.人血清中的BCLA反应性。通过经典SAG1血清学(Vidas和Architect IgG/IgM)和其他医疗先决条件评估的临床状态类别中分组的个体BCLA ELISA滴定(以UI表示)的散点图。这些组如下：SAG1血清阴性患者(蓝点)、既往免疫患者(菱形)、免疫受损患者中的活性弓形虫病(立方体)、免疫受损患者中的无症状血清学再活化(三角形)和经证实的眼弓形虫病患者(立方体)。柱状图显示每组的中值BCLA滴定值和四分位数间距。使用Kruskal-Wallis非参数检验，随后使用Dunn's后检验来计算统计学显著性，以单独比较所有后者组与血清阴性患者组。指示灰色区域(70-90UI)和阳性截止线(在90UI)。

图14.小鼠慢性感染期rBCLA免疫原性与致包囊菌株的相关性。(a)小鼠rBCLA反应性随时间和依赖刚地弓形虫菌株的ELISA血清学滴定。根据刚地弓形虫菌株类型分组UI中给出的个体ELISA测量，其中致包囊菌株(ME49、PruA7、76K)以斑点显示，非致包囊菌株(RH、PruKU80、CTG)以星形显示，并且ΔBCLA菌株(在76K或PruKU80背景中)以三角形显示。显示感染后的时间分割以区分急性期(≤8天)，亚慢性期(21-22天)和慢性期(≥42天)。(b)rBCLA ELISA反应性与寄生虫载量、miR-155和miR-146a表达的相关性。显示了在所有慢性感染时间框内(≥±11周)未感染或感染不同刚地弓形虫菌株的不同小鼠品系(NMRI、Balb-C)的rBCLA IgG(以UI表示)、寄生虫载量(以寄生虫qPRC计数表示)和miR-155/miR-142-a的重叠滴定。致包囊菌株(ME49、PruA7、76K)以圆圈显示，非致包囊菌株(RH、PruKU80、CTG)以星形显示，并且ΔBCLA(在76K或PruKU80背景中)以三角形显示。

图15：处于先天性弓形虫病风险的母亲和新生儿血清中的BCLA反应性。

(A-B)在分娩时(母亲)或出生至5.5月龄(婴儿)收集的23名母亲和相应新生儿的血清中BCLA ELISA滴定(以UI表示)的Violin图。(C-D)Sag滴定(

和

IgG/IgM)的Violin图。将血清分为无先天性弓形虫病的“母婴”对(A和C)和确诊为先天性弓形虫病的母婴对(B和D)。平均值±SD的值显示于在每个小图的顶部，而中值之差用MannWhitney检验计算。

具体实施方式

材料和方法

宿主细胞和寄生虫培养物。将HFF原代细胞(Bougdour et al.,2009)、RAW264.7、L929、HCT116、A549和HEK293细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(Invitrogen)、10mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)缓冲液pH7.2、2mM L-谷氨酰胺和50μg/ml青霉素和链霉素(Thermo Fisher Scientific)的Dulbecco’s Modified eagle培养基(DMEM)(Thermo fischer Scientific,France)中培养。将细胞在37℃下在5％CO2中孵育。本研究使用以下弓形虫菌株：I型(RH、GT1)、II型(ME49)、III型(CTG)、非典型(COUG)、犬新孢子虫(Neospora caninum)；RHΔku80(Huynh and Carruthers,2009)、PruΔku80(Fox et al.,2011)、PruA7(Saeij et al.,2007)、COUGΔmyr1(Hakimi，未发表)，和在该研究中获得的PruΔku80Δbcla、PruΔku80-HF-BCLA和76k-GFP-luc-Δbcla。所有寄生虫菌株通过在单层HFF上连续传代而在体外维持。

刚地弓形虫转染。使用BTX ECM 630机器(Harvard Apparatus)，用在细胞混合缓冲液(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,pH 7.6,25mM HEPES pH 7.6,2mMEGTA,5mM MgCl2)中的载体电穿孔刚地弓形虫RHΔku80、PruΔku80和76k-GFP-luc。在2mm比色杯中在1.100V，25Ω和25μF下进行电穿孔。用1μM乙胺嘧啶选择稳定的转基因寄生虫，通过有限稀释在96孔板中单克隆，并通过免疫荧光测定验证。

刚地弓形虫中Cas9介导的C端标记和基因破坏。质粒pTOXO_Cas9-CRISPR由(Sangaréet al.,2016)描述。目标基因(GOI)是BCLA(TGME49_209755)，用于使用CRISPR/Cas9系统进行C端标记(HA-Flag(HF))和基因破坏(KO)。使用Golden策略克隆对应于BCLA的四种寡核苷酸。简言之，将含有靶向TgBCLA基因组序列的sgRNA的引物TgBCLA-CRISP_FWD和TgBCLA-CRISP_REV磷酸化、退火并连接到具有Bsal的线性化的pTOXO_Cas9-CRISP质粒中，得到pTOXO_Cas-CRISPR::sgTgBCLA。然后，用质粒转染刚地弓形虫速殖子并在HFF细胞上生长18-36小时。

本研究中使用的克隆寡核苷酸是：

TgBCLA-KO-CRISP-FWD:

5’-AAGTTGATCACTATTCGTGAAGAAGG-3’(SEQ ID N°28)

TgBCLA-KO-CRISP-REV:

5’-AAAACCTTCTTCACGAATAGTGATCA-3’(SEQ ID N°29)

TgBCLA-HF-CRISP-FWD:

5’-AAGTTGGAACGGCGGTACGGCGACCG-3’(SEQ ID N°30)

TgBCLA-HF-CRISP-REV:

5’-AAAACGGTCGCCGTACCGCCGTTCCA-3’(SEQ ID N°31)

FR235222处理和诱导。FR235222由Astellas Pharma Inc.(Osaka,Japan)并且如Bougdour et al.,2009所述溶于DMSO中，并且培养基中的最终浓度为25ng/mL或50ng/mL。在感染24小时至7天后，将含有FR235222的培养基添加到感染的HFF细胞中。

小鼠和实验感染。从Janvier Laboratories(Le Genest-Saint-Isle,France)获得6周龄BALBC/c、CBA、NMRI或Swiss小鼠。小鼠护理和实验程序在无病原体条件下根据建立的机构指南和来自Institutional Animal Care和Use Committee of the UniversityGrenoble Alpes的批准方案(协议编号B 3851610006)进行。雌性小鼠用于所有研究。对于腹膜内(i.p.)感染，速殖子在体外生长并通过27号针从宿主细胞中提取，在PBS中洗涤三次，并用血细胞计数器定量。将寄生虫在Hank平衡盐溶液(Life)中稀释，并使用28号针通过i.p.途径用每种菌株(200μl)的速殖子接种小鼠。对于感染性包囊的经口管饲法，将来自慢性感染小鼠(76k-GFP-luc和76k-GFP-luc-Δbcla)的脑在PBS中压碎，在显微镜下定量包囊数，并且使用球尖饲喂针用100μl含有20-40个包囊的脑匀浆强制饲喂小鼠。当将小鼠安乐死时，通过尾部穿刺或通过心内穿刺收集血液。在批准的CO2室中完成动物安乐死。对于回肠的组织学分析和脑的组织学切片上的免疫标记，将回肠和脑从小鼠中取出，完全包埋在石蜡块中并使用显微镜用薄片切片机切成5μm厚的层。对于小鼠存活数据的统计分析，使用Mantel-Cox和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。

包囊纯化。从慢性感染76k-GFP-luc或76k-GFP-luc-Δbcla菌株至少6周的小鼠脑中分离包囊，使用如先前描述的Percoll梯度方法(Cornelissen et al.,1981)，或者直接通过使用10μl移液管处理包囊进行染料实验，以便不使包囊壁劣化用于渗透性研究。在实验结束时既不添加皂苷也不添加胰蛋白酶。

包囊定量。感染后5-12周，将每只受体小鼠的脑在2ml PBS中匀浆。在显微镜下计数脑悬浮液的三个或十个等分试样(每个20μl)中的包囊数。通过计算20μl等分试样中的包囊并乘以100来确定包囊的总数。对于用76k-GFP-luc和76k-GFP-luc-Δbcla感染的小鼠之间包囊定量差异的统计分析，使用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney检验。

包囊表征。用荧光ZEISS ApoTome.2显微镜在载玻片和盖玻片之间获取纯化的包囊的图像。使用ZEN软件(Zeiss)测量包囊面积和GFP强度。为了统计分析76k-GFP-luc和76k-GFP-luc-Δbcla包囊之间的包囊面积和GFP强度差异，使用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney检验。

定量PCR。在DNA提取(QiAmp DNA mini kit,Qiagen)后，使用靶向弓形虫特异性529bp重复元件的定量PCR(Reischl et al.,2003)定量脑或回肠中的寄生虫载量。对于用76k-GFP-luc和76k-GFP-luc-Δbcla感染的小鼠之间的寄生虫载量差异的统计分析，使用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney检验。

脑和回肠中白介素的qRT-PCR分析。使用TRIzol(Thermo Fisher Scientific)从脑或回肠分离总RNA。使用高容量RNA-至-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)用随机六聚体合成cDNA。使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)通过实时定量PCR分析样品的适当探针(脑:TNF-α,INF-γ,IL-6,IL-22β；回肠:INF-γ,CCL2,IL-22β,IL-18和IL-1β)。使用TBP水平将RNA水平标准化。对每个样品的三个独立的生物复制品重复qRT-PCR，并使用结果的平均值。对于感染76k-GFP-luc和76k-GFP-luc-Δbcla的小鼠之间RNA水平的统计学分析，使用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney检验。

免疫荧光显微术。如先前所述(Braun et al.,2013)进行体外寄生虫的免疫荧光测定。简而言之，将在从小鼠脑纯化的盖玻片或包囊上生长的刚地弓形虫感染的HFF细胞在室温下在3％甲醛中固定20分钟，用0.1％(v/v)Triton X-100渗透15分钟并在含有3％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭。为了在脑的组织切片上进行免疫标记，首先将点样在载玻片上的脑层使用甲苯溶剂脱蜡3*10min并使用无水乙醇溶剂脱蜡3*10min。然后，用柠檬酸盐缓冲液pH6处理载玻片，在100℃下加热1小时，用水冲洗2*10分钟，并在含有3％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS中封闭。然后，将细胞或脑层与附图中所示的一抗一起孵育1小时，随后添加以1:1,000稀释度缀合到Alexa Fluor 488或594(分子探针)的二抗1小时。将宿主细胞和寄生虫的细胞核在室温下用在PBS中的2μg/ml的Hoechst33258染色10分钟。将盖玻片用Mowiol封固剂封固在载玻片上，用荧光ZEISS ApoTome.2显微镜获取图像，并通过ZEN软件(Zeiss)处理图像。

抗体。一抗：兔抗BCLA(Eurogentec)、小鼠抗HA(Roche,RRID:ab_2314622)、大鼠抗flag(SIGMA)、小鼠抗CC2(gift from Pr.Louis Weiss)、小鼠抗GRA1、小鼠抗GRA5、小鼠抗GRA7。将蛋白质印迹二抗与碱性磷酸酶(Promega)偶联，而免疫荧光二抗与Alexa Fluor488或Alexa Fluor 494(Thermo Fisher Scientific)偶联。

蛋白质印迹。通过SDS-PAGE分离蛋白质并通过液体转移将其转移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P；EMP Millipore)，并且使用适当的一抗然后是磷酸酶偶联的山羊二抗(Promega)探测蛋白质印迹。使用NBT-BCIP(Amresco)检测信号。

体外FR235222寄生虫和离体包囊上的DBA凝集素标记。将在从小鼠脑纯化的盖玻片或包囊上生长的刚地弓形虫感染的HFF细胞在室温下在3％甲醛中固定20分钟，用0.1％(v/v)Triton X-100渗透15分钟并在含有3％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭。将感染的细胞或包囊用1:100稀释的Dolichos凝集素染色30分钟。用荧光ZEISS ApoTome.2显微镜检查染色的液泡或包囊，并通过ZEN软件(Zeiss)处理图像。

囊壁渗透性。将从小鼠脑纯化的76k-GFP-luc和76k-GFP-luc-Δbcla分离的包囊与不同尺寸的不同染料(葡聚糖、德克萨斯红或级联蓝，3000-40000Da，中性或阴离子赖氨酸可固定)(Promega)以1:100稀释度一起孵育。在室温下孵育20分钟后，用荧光ZEISSApoTome.2显微镜获取图像，并通过ZEN软件(Zeiss)处理图像。分析每种不同染料的最少5个包囊。将在不存在染料的情况下孵育的包囊作为阴性对照。

BCLA(Cter-BCLA)的C端结构域的重组表达

设计和克隆。无序倾向搜索(使用Dis-EMBL或IUPred)预测BCLA在其包括核心重复基序的大部分序列中是高度无序的。然而，C端(约从aa 1100-1275)被预测为结构化的并且可以构成单独的结构域。为了重组表达该结构域，在甲硫氨酸1089处选择N端边界，并且原始C末端是保守的。通过Genscript进行DNA合成以产生由Cter-BCLA(1089-1275)和TEV可切割的N端His-标签组成的融合构建体(图1b)。进行用于大肠杆菌的密码子优化并使用NdeI和XhoI位点通过Genscript在pet30-(a)载体(Addgene)中克隆基因。

重组表达。使用BL21(DE3)-CodonPlus—RIL化学感受态大肠杆菌(Stratagene)进行转化，所述大肠杆菌与1μg的pet30-(a)Cter-BCLA质粒在冰上孵育10分钟，在42℃热激45秒，在LB中在37℃预孵育45分钟，然后铺板在含有卡那霉素(Kan)和氯霉素(Chlo)的LB琼脂板上并孵育12小时。然后，挑选单菌落接种生长16小时的LB/Kan/Chlo 50ml预培养物。然后，5ml生长的预培养物用于接种含有Chlo/Kan的Terrific肉汤培养基(Formedium)的1L烧瓶。将培养物在37℃生长达到OD600为0.5-0.8，然后通过添加0.7mM IPTG(VWR)诱导，并在18℃ ON进一步孵育。孵育后，将细胞在3000G下离心25分钟，弃去上清液并将沉淀在液氮中快速冷冻并保持在-80℃。

裂解。对3个1L培养物沉淀进行纯化，每个重悬于50ml裂解缓冲液中，每50ml裂解缓冲液含有600mM NaCl、50mM Tris pH 8、5mM Beta-巯基乙醇(BME)、0.2％w/v N-LaurylSarkozine和1Complete抗蛋白酶混合物(Roche)标签。使用10分钟脉冲超声处理(15秒开，30秒关)以50°振幅在冰上进行裂解，裂解物从未达到超过13℃的温度。超声处理后，将裂解物在4℃，15000G下离心1小时并弃去沉淀。所有以下步骤随后在4℃下进行。在与5mL预平衡的Ni-NTA树脂孵育之前，将澄清的裂解物补充有30mM咪唑。在温和搅拌下在4℃下分批孵育30分钟。孵育后，将树脂保留在垂直柱上，然后用3*20ml含有600mM NaCl、50mM Tris pH 8、5mM BME,0.2％w/v N-Lauryl Sarkosine和30mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤。然后，用含有300mM NaCl、50mM Tris pH 8、5mM BME和300mM咪唑的缓冲液进行1.5ml分级分离的直接洗脱。然后，合并感兴趣的级分(图8)并使用10KDa截止透析盒(Thermo Scientific)在50mMNaCl,50mM Tris pH 8.5mM BME中透析。

离子交换和大小排阻层析。然后，将全部样品通过色谱系统(Akta Pure,GEhealthcare)直接泵至用与透析相同的缓冲液预平衡的HL-Mono-Q(GE healthcare)5ml柱上。用2个柱体积(CV)洗涤柱，然后通过盐梯度(50mM-2M NaCl)洗脱40ml，1.5ml级分，并对整个洗脱进行280nm吸光度监测。在洗脱过程中，SDS PAGE分析(图3)显示样品在梯度洗脱的后期阶段被纯化，并且早期洗脱级分存在大部分在较高分子量下可见的细菌污染物。收集所需级分，汇集并使用10KDa截止浓缩器(Amicon-Ultra,Millipore)浓缩至600μl。浓缩后，将样品注射到含有150mM NaCl,50mM Tris pH 8,5mM BME的运行缓冲液的S75(GEhealthcare)上，并以与多聚体状态一致的异质峰洗脱，从接近空隙体积开始洗脱超过3ml。汇集所有洗脱组分以产生最终样品。

硫酸铵沉淀。为了避免核酸污染，通过添加15％w/v硫酸铵(Sigma)进行铵沉淀，在4℃温和滚动1小时，然后在10000*G下离心30分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于相同初始体积的缓冲液中。为了清除所有硫酸铵，将样品在与尺寸排阻相同的缓冲液中透析。

有限蛋白水解以发现Cter-BCLA内的抗原性亚片段。为了回收Cter-BCLA的高抗原性亚片段，使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶(均来自SigmaAldrich)对纯化的样品进行有限的蛋白水解。反应在30μl反应体积中在50mM Tris pH8.0、150mM NaCl、5mM BME和0.5mM MgCl₂中进行。在每个反应中，将3μg的Cter-BCLA用100ng的蛋白酶(1/30w/w)在37℃消化50分钟。在每个时间点通过添加10μl的SDS PAGE装载缓冲液，随后在95℃下加热5分钟，然后保持在冰上直到装载在凝胶上来停止反应。

蛋白质印迹BCLA血清学测试。使用装载有5μl 0.1mg/ml样品的15孔4-12％NuPage凝胶(Life technologies)制备单个蛋白质印迹条带。将凝胶在MES缓冲液中在185v下运行40分钟，然后在PVDF膜上在105v下电转移1.5h。然后，将转移的泳道切成单个的条带。然后，将条带在含有5％奶粉(w/v)的TTBS中封闭1小时。然后，在TTBS中以1/400血清稀释度在4℃下进行血清测试1小时。然后，将条带在TTBS中洗涤3次，并进一步与靶向小鼠IgG或人IgG并与磷酸酶碱性酶(Promega)偶联的二抗的1/7500稀释液孵育1小时。3次TTBS洗涤后，通过添加显色底物在RT(Invitrogen)显示印迹。阳性血清中的条带在1-5分钟内出现。与血清测试平行，单个条带总是用作每个印迹组的内部抗原对照。封闭后，将该条带与以1/2000稀释于TTBS中的过氧化物酶偶联的抗聚组氨酸单克隆抗体(Sigma)孵育1小时。在TTBS中三次洗涤步骤后，使用具有金属增强剂(Sigma)的SigmaFast DAB显示印迹。对于每个系列的i.p.或经口感染小鼠，使用商品化试剂盒LD bio弓形虫小鼠IgG(LD bio)，使用先前针对BCLA描述的相同的抗小鼠IgG-碱性磷酸酶缀合物和显色底物，使用IgG免疫应答的蛋白质印迹分析，针对弓形虫抗体检查每个系列中至少一只小鼠的血清。

人血清。人血清回顾性选自法国Grenoble Alpes University Hospital的寄生虫学-真菌学临床实验室的生物库收集。该生物库向法国卫生部登记，编号为DC-2008-582。在2014年1月1日至2018年5月1日期间储存所选血清用于弓形虫血清学常规分析。与

Toxo IgM和IgG(bioMérieux,France)以及Architect Toxo IgG and IgM(Abbott,Germany)的分析在Grenoble Alpes University Hospital的的寄生虫学-真菌学临床实验室进行。

基于蛋白质纯化、免疫印迹和质谱的蛋白质组学分析。将含有Flag标记的蛋白质的PruΔku80-BCLA-HAFlag感染的宿主HFF细胞提取物与抗FLAG M2亲和凝胶(Sigma-Aldrich)在4℃下孵育1小时。用10倍柱体积的BC500缓冲液(20％甘油、20mM Tris-HCl pH8.0、500mM KCl、0.05％NP-40、100mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、0.5mM DTT和1X蛋白酶抑制物)洗涤珠。用稀释于BC100缓冲液中的250g/ml FLAG肽(Sigma-Aldrich)逐步洗脱结合的肽。从胶体蓝染色的凝胶(Thermo Fisher Scientific)切下蛋白质条带，用DTT和碘乙酰胺处理以烷基化半胱氨酸，然后使用修饰的胰蛋白酶(Sequencing grade；Promega)凝胶内消化。通过在线nanoLC-MS/MS(与LTQ-Orbitrap Velos Pro偶联的UltiMate 3000；ThermoFisher Scientific)使用25分钟梯度分析来自各个条带的所得肽。通过针对ToxoDB(20151112版本)的伴随搜索以及包埋在MaxQuant中的经常观察到的污染物数据库，使用MaxQuant(版本1.5.3.17)鉴别并量化肽和蛋白质。最小肽长度设定为7个氨基酸。肽、剃刀+独特肽和独特肽的最小数全部设定为1。将肽和蛋白质水平的最大错误发现率设定为0.01。

BCLA重复序列和rBCLA的表位作图。通过JPT肽技术在N端具有N-乙酰基部分的纤维素膜上定制合成斑点印迹肽测定。筛选两组膜：1)用总共59个肽覆盖rBCLA区(残基1089-1275)，每个15aa长，重叠12个且偏移3个；2)用总共18个肽覆盖重复序列4(残基446-493)，每个长15个氨基酸，重叠12个且偏移3个。如制造商所述进行斑点印迹分析。简言之，首先将膜在100％乙醇中活化5分钟，然后在DPBS-tween中洗涤3次，每次3分钟。在4℃下在DPBS-Tween 0.5％奶粉中封闭O.N，然后在DPBS-tween中再洗涤3*3min。将测试血清在DPBS-tween 0.1％BSA中稀释至1/400，并在室温下与膜孵育3小时。3*3min DPBS-tween洗涤后，将膜与稀释至1/100000的抗IgG过氧化物酶偶联Ab(Sigma A0170)在室温下一起孵育2小时。在DPBS-tween中洗涤3*3min后，将膜短暂浸入新鲜制备的SuperSignal West Pico化学发光底物(ThermoFisher)中，并用C-Digit(Licor)扫描仪显示。使用ImageJ积分点强度。使用ImageJ积分点强度。对于独立斑点印迹的数据分析，使用从未与任何血清反应的肽59的基线积分强度[I_(p＝59)]将来自每个肽点的积分强度[I_(p)]归一化为富集因子Fe_(p)。以下可以用以下等式表示：

Fe_(p)＝I_(p)/I_(p＝69)

其中p代表肽编号。

为了增加符号为(+)的若干个独立的阳性血清印迹的反应性得分，将Fe_(p)富集得分相互相加并减去非特异性反应性，对符号为(-)的相同数量的阴性血清肽进行相同的总和，并减去。肽反应性得分可以通过以下等式表示：

Rs_(p)＝[∑(Fe_(p))⁽⁺⁾-∑(Fe_(P))^(-)]

其中Rs_(p)是特定肽位置的总反应性得分。

BCLA ELISA。肽合成：通过具有N端乙酰基的Genscript合成以下BCLA肽：

AB_F:

Nter-MERPAAGSMEKEKPVLPGEGEGLPKHETKPALTDEKRTKPGGP-Cter(SEQ ID N°55)

A3_B:Nter-AAGSMEKDKLVLPGE-Cter(SEQ ID N°56)

板制备：在4℃下用在100mM碳酸钙缓冲液pH:9.6中的2μg/ml rBCLA、肽AB_F和A3_B均以100μl/孔O.N包被Midisorp板(Nunc)。包被后，将板用350μl的DPBS 0.05％Tween 20(DPBS/Tween)洗涤两次，然后用300μL Superblock封闭缓冲液(ThermoFisher)封闭至少2小时，之后除去缓冲液并将板倒置干燥。一旦干燥，可将板在4℃下储存延长的时间段，而不损失血清学反应性。

样品制备：在测定前不超过2小时，在DPBS 0.05％Tween 20,0.1％BSA中制备所有血清稀释液。对于小鼠和人测试血清，制备1/400稀释液。在两个试验中还新鲜制备了11个标准品，由10个系列稀释的阳性冷冻储液血清组成，设置为100UI。以1/200稀释度开始并以3/4稀释度增量，制备以下滴定点：200UI(1/200)、150UI(1/266),112.5UI(1/356)、84.4UI(1/474)、63.3UI(1/632)、47.5UI(1/843)、35.6UI(1/1124)、26.7UI(1/1498)、20UI(1/1998)、15UI(1/2663)。用1/400稀释度的血清阴性血清制备0UI标准品。

测定：所有随后的步骤在Gemini ELISA自动化平台(Stratec)上实施，但也可在室温手动进行。首先用350μl DPBS/Tween洗涤干燥的板两次。然后，将测试血清和标准品的稀释液以100μl/孔的平行双份分配在板中。然后，将板在室温孵育1小时。孵育期后，用350μlDPBS/Tween洗涤板4次，然后将100μl过氧化物酶偶联的二抗稀释物(1/50000抗小鼠IgG或1/60000抗人IgG，分别为Sigma Aldrich ref A0168和A0170)在DPBS0.05％Tween20，0.1％BSA中快速分配到所有孔中。在室温下1小时后，将板在DPBS tween中洗涤4次。通过添加100μl TMB底物(Thermofisher ref 34029)精确地在室温下20分钟，然后用50μl H2SO4 0.2M终止反应，随后混合30秒来进行显色反应。然后，使用Gemini积分分光光度计在450nm下进行孔吸光度测量。

数据处理：在一式两份空白孔中进行空白扣除，在孔中没有处理一抗/血清，但进行所有后续步骤(洗涤、二抗、底物)。取标准血清稀释物的平均值并用4-参数逻辑回归拟合，其中上渐近线值(D_i)固定在2.5AU并且允许拟合所有其它变量(A_i、B_i、C_i)。从该回归中，如果在一式两份的测量中观察到变异系数高于10％，则测试的稀释复本可计算它们的表观UI并取平均值，然后将重新测试样品。本工作中呈现的所有ELISA数据在独立滴定中获得若干次。

结果

在速殖子中响应于FR235222的蛋白质组的定量分析将BCLA鉴定为新的裂殖子特异性蛋白质。

环肽FR235222对TgHDAC3的特异性抑制显示破坏组蛋白H4乙酰化穿过诱导阶段特异性基因的去抑制的刚地弓形虫基因组的稳态水平(Bougdour et al.,2009；Sindikubwabo et al.,2017)。我们已经利用FR235222的特性开发了能够产生大规模蛋白质组研究所需的大量蛋白质的体外包囊形成系统(Farhat D et al.,手稿编制)。在低剂量和短时间内处理致包囊的II型(PruΔku80)菌株后，我们进行了定量蛋白质组学研究，发现FR235222处理的蛋白质组显著富集了阶段特异性蛋白质，包括那些被认为限于裂殖子阶段的蛋白质(图1a)。根据该分析，我们发现蛋白质TGME49_209755(下文称为BCLA(脑包囊负载相关抗原))在FR235222处理后以与慢性感染期中涉及的几种蛋白质相同的方式被显著诱导(图1a)。这与被报道为限于裂殖子数据集的它的表达谱一致(图1b，来源ToxoDB)。

其它证据支持BCLA表达的表观遗传调节。我们最近报道了短暂抑制的H3K14ac和H3K9me3 PTMs书签基因，其等待寄生虫阶段分化用于阶段特异性表达(Sindikubwabo etal.,2017)。在速殖子中，BCLA基因座显示该双重PTM富集，其区别地标记'平衡的'阶段特异性基因(图1c)。此外，最近的TgHDAC3 ChIP-seq分析(Farhat D et al.,手稿编制)揭示了在BCLA基因座存在组蛋白脱乙酰酶(图1c)。在转染的速殖子中引起BCLA诱导的TgHDAC3的CRISPR介导的基因破坏带来了TgHDAC3参与其调节的确定性遗传证据(图1d)，从而模拟FR235222对酶的作用。我们从这些数据得出结论，BCLA属于由TgHDAC3调节的裂殖子基因家族，并且其周围的异染色质以所谓的双价染色质结构域为代表，能够沉默发育基因，同时保持它们平衡以在细胞分化后快速活化(Sindikubwabo et al.,2017)。

BCLA被分泌到PV中并与体外转化的含有裂殖子的液泡的PVM缔合。

BCLA是编码具有预测的N端信号肽和～150个残基的保守C端区域的140-kDa蛋白质的单一开放阅读框，所述保守C端区域与以48个氨基酸重复13次的基序为代表的中心核心结构域邻接(图2a)，其组成和频率已经通过球虫亚纲和在刚地变形虫谱系中进化(图2b)。虽然BCLA同源蛋白在犬新孢子虫中的保守性很差，但它具有总体上相同的结构，其中较短的重复序列具有与BCLA重复序列共同的特征(数据未显示)。无序倾向搜索(使用dis-embl或IUPred)预测BCLA在其包括核心重复基序的大部分序列中是高度无序的。然而，C端(约从aa 1100-1275)被预测为结构化的并且可以构成单独的结构域(图2a)。

尽管在FR235222处理的样品中通过质谱明确且专门地鉴定了BCLA(图1a)，但在感染期间蛋白质的动力学和亚细胞分布仍未充分研究。为了进一步原位探测刚地变形虫中BLCA的动力学，我们产生了抗分别位于保守重复序列的末端的两个合成肽的多克隆抗体(图2a)。我们首先通过显示将细胞暴露于FR235222显著增加BCLA信号强度来验证蛋白质组数据，所述BCLA信号强度为在约140kDa的预期大小下的蛋白质条带，否则其在未处理的速殖子中是不可检测的(图2c)。

在含有速殖子的成纤维细胞中，所述速殖子表达C端HA-Flag标记形式的缓殖子特异性标记，BCLA在FR235222刺激后在液泡空间中被清楚地检测到，并且在PVM处清楚地积累，而其表达与裂殖子标记ENO1和LDH2的诱导一致(数据未显示)。相反，BCLA在被基因工程化为缺乏BCLA的速殖子感染的细胞中不再被检测到(Δbcla，表2)，从而证实了内部抗体的特异性(数据未显示)。最后，当我们监测表达与HA-Flag标签融合的内源蛋白的I型(RHΔku80)和II型(PruΔku80)系中的BCLA动力学时，我们显示一旦被FR235222刺激，HA标记的BCLA蛋白靶向液泡空间和膜，而与菌株类型无关(数据未显示)。因此，C端融合标记的存在不影响BCLA的亚细胞定位，因为它与在未标记菌株中使用抗BCLA血清时所观察到的相似。

当将刚地变形虫的不同寄生虫菌株暴露于FR235222时，我们最终发现BCLA信号强度随感染菌株而变化很大，从在II型(PruΔku80,ME49,76K-GFP-Luc)菌株中非常强的诱导，在I型(GT1和RHΔku80)和单倍型II(COUG)菌株中相当温和，并且令人惊讶地在被III型(CTG)菌株感染的细胞中检测到微弱(如果没有)信号(图3a和数据未显示)。下面将讨论可以通过菌株容易产生组织包囊的能力来解释的这种差异。

BCLA在体内定位于包囊基质和囊壁

凝集素双歧双歧杆菌凝集素(DBA)结合的糖基化囊壁是促进刚地变形虫持久性和经口传递的关键结构特征(Tomita et al.,2013)。在此，我们提供了BCLA与DBA仅在体外转化的裂殖子周围的膜处共染色的强大证据(数据未显示)，其强烈表明BCLA在其递送到液泡空间中之后随时间在不成熟囊壁处累积(基于薄DBA阳性囊壁)。

然而，考虑到组织培养中的体外裂殖子发育不会导致完全成熟的包囊，我们重新检查了BCLA在分离自慢性感染刚地变形虫II型菌株的小鼠的含有裂殖子的包囊中的定位。在慢性感染的小鼠中，针对BCLA产生的内部抗体染色囊壁以及围绕裂殖子的基质空间(数据未显示)。免疫荧光结果不允许毫无疑义地确定BCLA是位于囊壁的内层还是外层，然而有趣的是，非透化的离体包囊容易被抗体染色，表明蛋白质的外部位置(数据未显示)以及因此其暴露于宿主细胞的细胞质。在含有Δbcla裂殖子的包囊上没有检测到信号(数据未显示)，因此证实了抗BCLA抗体的体内特异性(图4d)。

没有很多BCLA的液泡外功能的证据，但偶尔蛋白似乎被输出到液泡膜之外进入宿主细胞的细胞质(数据未显示)。不幸的是，尽管进行了许多尝试，我们没有发现BCLA输出超出PVM的特定情况，以进一步更详细地研究其在宿主细胞中的功能(如果有的话)，如我们对其它效应物的研究(Hakimi et al.,2017)。然而，我们能够显示BCLA输出是Myr1独立的(数据未显示)，因此不需要输出蛋白的刚地变形虫易位子(Franco et al.,2016)。解释蛋白质在感染细胞的胞质溶胶中积累的典雅方式是在PVM处可能在宿主蛋白酶的控制下发生的加工后释放，但这仍有待证明。将对感染的和FR235222刺激的宿主细胞的BCLA相关蛋白质组进行分析，以确定BCLA与宿主细胞蛋白(包括蛋白酶)的相互作用(如果有的话)是否发生在PVM的面向外的一侧，或者当BCLA被递送到那里时甚至发生在感染细胞的细胞质中。

BCLA对于体内适当的包囊功能是可分配的

为了确定BCLA在裂殖子组织包囊中的功能，我们创建了两种寄生虫系，其中使用Cas9介导的基因编辑(76K-GFP-LucΔbcla)将BCLA的编码区缺失(PruΔku80Δbcla)或通过DHFR盒中断(表2)。然后，我们研究了发病机理和包囊形成。首先，与它们的亲本菌株相比，BCLA缺陷型菌株在体外速殖子条件下没有显示出明显的生长表型(图4A且数据未显示)。BCLA突变既不损害PV驻留蛋白或PVM相关蛋白的表达，也不损害先前研究中识别为涉及PV的形成和成熟的PV驻留蛋白或PVM相关蛋白的定位(即，GRA1、GRA5、GRA7；数据未显示)。如在FR235222刺激后由凝集素DBA阳性标记的含Δbcla的液泡所示，在BCLA缺陷型寄生虫体外转化为裂殖子阶段和形成包囊的能力方面没有检测到差异(数据未显示)。

BCLA对于引发速殖子体内感染不是必需的。

为了研究BCLA在急性感染期间体内的重要性，我们比较了腹膜内(i.p.)感染来自II型背景的WT或BCLA缺陷型寄生虫的BALB/c或NMRI小鼠中的寄生虫过程，接种物含量为1×10⁴-1×10⁶速殖子范围内。在感染后5-8天，用II型BCLA缺陷型速殖子感染的所有小鼠开始表现出感染体征(即体重减轻和翘毛)，并在与亲本菌株76K相同的时间框内的感染存活下来，而与小鼠的接种物和遗传背景无关(图5a)。因此，在小鼠感染的急性期期间，BCLA对于体内生长和发病机理似乎是不必要的。随后在感染后10周通过蛋白质印迹测试攻击后存活下来的动物对寄生虫抗原的血清学应答(数据未显示)。显然，BCLA缺失并不损害感染性，因为所有小鼠都以相同的模式表现出抗刚地弓形虫的IgG，而与寄生虫菌株无关(数据未显示)。

BCLA缺陷影响从慢性感染小鼠分离的脑包囊的完整性。

对感染Δbcla突变体的小鼠的脑的检查证明，在突变菌株的情况下，包囊形成仍可发生(图6b)。然而，与亲本菌株相比，BCLA缺陷型突变体在慢性感染小鼠的CNS中产生相当减少的寄生虫载量，但差异没有达到统计学显著性(图6b且数据未显示)，证明BCLA至少对于在慢性感染期间建立和维持包囊是不可分配的。然而，对包囊的彻底检查显示，分离自被突变寄生虫感染的小鼠的包囊相对较小(图6a)并且含有较少的裂殖子，导致“较低堆积密度”(Watts et al.,2015)和GFP荧光的总体下降(图6b)，这与在总脑中测量的寄生虫载量的轻微下降(图6b)完全一致。除这些定量指标外，含Δbcla的包囊的特征表现为它们的囊壁表面的显著变形导致圆形度的损失，并且在某种程度上表现为独特的“出芽”和“分段或破裂”表型(图6a和数据未显示)，表明BCLA在包囊生长、维持和/或稳定性中的可能作用。

然后，我们评估表面畸形是否会使包囊变得脆性，这是之前报道的含Δcst1的脑包囊的表型(Tomita et al.,2013)。尽管在它们的分离过程中，包囊经受机械应力以将它们从脑组织中释放以通过等密度离心纯化它们(参见方法)，但是我们在该苛刻的程序过程中没有观察到含Δbcla的包囊比WT包囊更脆性(数据未显示)，然而它们中很少破开，而与遗传背景无关。

BCLA的缺失不损害从慢性感染小鼠的脑中分离的包囊的二氟磷酸胆碱凝集素(DBA)的壁染色(数据未显示)。因此，如在通过FR235222处理的速殖子上已经得出结论，BCLA不直接意味着囊壁的半乳糖苷糖基化。包囊内裂殖子的存活力的条件是壁对来自宿主细胞的营养物的渗透性，而后者是非常有限的，壁起到筛的作用，以避免免疫应答的组分。为了测试在不存在BCLA的情况下壁渗透性是否以某种方式改变，我们监测了以3-40kDa的不同大小为代表的荧光团进入包囊。仅在显微镜下观察并检查完整的包囊(无寄生虫渗漏)。具有3-kDa(遍及包囊基质的扩散模式)或10-kDa(具有点状位置的扩散模式)染料的WT和BCLA缺陷的包囊之间的渗透性非常相似。有趣的是，具有较高分子量(40-kDa)的荧光示踪剂不能有效地穿过囊壁，如先前所报道(Lemgruber et al.,2011)。此外，弱标记在菌株之间甚至是不同的，这可能是因为含Δbcla的包囊比含有亲本菌株的包囊更“松散”和可渗透，更充满被渗透性较低、界限清楚且连续的囊壁包围的裂殖子(数据未显示)。总体而言，我们的结果显示BCLA对于体内适当的包囊功能是可分配的，然而蛋白质在囊壁中具有结构作用，其可导致囊壁渗透性缺陷表型。

BCLA对于弓形虫含裂殖子包囊的有效经口感染不是必需的。

为了检查BCLA依赖性包囊变形的体内功能结果，我们用含有Δbcla或亲本菌株的包囊饲喂小鼠，并在两种不同的小鼠遗传背景中评估毒力和感染性。用76k-GFP-luc-Δbcla或76k-GFP-WT菌株的46个孢囊经口感染C57BL/6小鼠，并研究寄生虫在肠中的侵入和传播动力学以及由寄生虫引起的局部免疫应答。在感染的第8天，小鼠血清中的刚地弓形虫特异性IgG非常相似(数据未显示)，并且它们在回肠中的寄生虫载量方面没有显著差异(图7a)。回肠的组织学分析显示具有改变的隐窝-绒毛形态学(数据未显示)和炎性基因座(数据未显示)的肠上皮结构的总体损失，而与菌株遗传背景无关。细胞因子谱显示相同的模式，其中回肠中促炎细胞因子(IFN)和趋化因子(CCL2)明显增加，但以BCLA非依赖性方式增加(图7b)。我们接下来用20个包囊经口感染NMRI小鼠以评估Δbcla包囊散布到血流中并在深层组织中形成新包囊的能力。所有经口感染的小鼠在急性感染期都表现出疾病体征(体重下降)和血清转化(数据未显示)。10周后，对于所有小鼠，在包囊数和寄生虫载量方面没有检测到菌株之间的显著差异(图7c)。这些数据表明BCLA缺陷的包囊能够通过口服途径传播感染并在小鼠中建立以轻度炎症状态为特征的慢性感染。慢性感染的NMRI小鼠的脑中促炎细胞因子的概况表明，Δbcla中的炎症比野生型更不严重，然而这没有实现统计显著性，可能是由于低样本量(每种病症3只小鼠；图7d)。脑中这种相对温和的炎症可能是Δbcla感染的小鼠中相对少的包囊数的结果，然而这必须确定。

用于血清学诊断的BCLA嵌合肽的高水平表达和纯化

先天免疫系统的体液和细胞防御是机体抵抗刚地弓形虫的第一道防线。据报道，抗体有助于在急性感染期间清除寄生虫并介导对继发性弓形虫感染的抗性(Sayles etal.,2000)。因此，一旦建立免疫，IgG保护胎儿在怀孕期间免受垂直传播。尽管急性感染和慢性感染之间的血清学区分具有临床和流行病学相关性，但是目前还没有用于弓形虫病的裂殖子特异性血清学测定来准确估计感染时间以及包囊的存在。此外，由于再活化可以发生在完全免疫活性的患者(例如视网膜脉络膜炎)和免疫受损的患者中，并且最近怀疑脑中存在的包囊与一些神经精神障碍有关。因此，通过开辟新的诊断视角，检测针对半休眠包囊的弓形虫抗体将是弓形虫病血清学诊断的显著改进。然而，至少在商业试剂盒中，很少鉴定出囊壁或表面裂殖子的组分，并且没有一种显示出用作血清学目的的抗原。理想的抗原应该只在潜伏的裂殖子阶段表达，并且理想地应该暴露于包囊的表面，在BCLA中发现的两个特征促使我们测试其抗原性。

为了获得血清WB测试所需的高纯度和大量的BCLA，我们选择重组表达BCLA的C端结构域末端(残基1100-1275，下文称为rBCLA)，其预测为结构化的，与含有核心重复基序的蛋白质的其余部分相反(图2a)。因此，rBCLA在大肠杆菌中表达为具有N端聚组氨酸标记的嵌合蛋白。尽管被有效地表达，但它是天然不溶性的或被隔离为不溶性包涵体，但在裂解步骤中可以使用0.2％N-Lauryl Sarkoside溶解。裂解和离心后，首先用镍亲和树脂拉下rBCLA(数据未显示)。在20.9kDa的理论Mw和4.7的pI的情况下，观察到BCLA在SDS-PAGE凝胶上在17-25kDa分子量标志物之间迁移，同样，在pH:8缓冲液中，BCLA将是强带负电荷的。因此，使用阴离子交换层析可以有效除去大肠杆菌污染物(数据未显示)。最后，rBCLA以可溶形式从尺寸排阻色谱中洗脱(数据未显示)，尽管由于宽体积洗脱范围而多分散并且当洗脱体积接近S75柱的空隙体积时形成多低聚物。在合并洗脱级分之后，进行硫酸铵沉淀和透析的最后阶段以除去核酸污染物(数据未显示)。在最后的纯化阶段之后，通过SDS-PAGE分别解析RH株(LD bio)和rBCLA的速殖子抗原，然后通过免疫印迹用由弓形虫病的不同状态引发的小鼠抗血清探测，以允许通过免疫球蛋白G、M和A进行抗原识别的平行分析。

rBCLA不与急性感染小鼠的血清反应，但构成用于检测抗来自慢性感染小鼠的刚地弓形虫的极好抗原。

我们首先对从急性感染期小鼠收集的血清进行免疫印迹。rBCLA蛋白显然不与被非典型(COUG，单体型II)、强毒(RH，I型)或致包囊(76K，II型)菌株急性感染的小鼠血清反应(图8a-c)，而与全部刚地弓形虫暴露的小鼠血清反应，与其遗传背景(NMRI、CBA、C57BL/6)或感染途径(腹膜内或经口)血清转化无关(图8a-c且数据未显示)。然而，rBCLA与感染II型致包囊菌株(Pru、ME49或76K)后发展潜伏弓形虫病的小鼠的抗刚地弓形虫IgG抗体强烈反应(图9a-c)。在亚慢性(>21天，图9d)或慢性(>42天，图9a-c)感染期用小鼠血清检测rBCLA，其中小鼠血清持续感染22个月(图9c)，具有极强信号。当测定未感染或慢性感染BCLA缺陷型菌株的小鼠血清时，没有检测到反应性，表明IgG抗体在体内特异性抗BCLA(图9d)。因为选择过程发生在抗体亲和力成熟期间(Eisen,2014)，我们推论rBCLA抗原可通过将急性感染期间的IgG与慢性感染期间的IgG相比来检测。很明显，rBCLA不与抗刚地弓形虫IgM或IgA反应(数据未显示)。因此，上述发现有力地支持rBCLA能够区分感染小鼠的寄生虫阶段，对于潜伏性感染具有优先的IgG反应性。

在被致包囊菌株持续感染的小鼠血清中仅检测到rBCLA

显示rBCLA对易于产生潜伏性感染的致包囊菌株具有特异性反应性(图9a-d)。然而，为了维持该论点，必须显示不产生包囊的菌株不能产生抗rBCLA的特异性抗体应答。首先，感染非致包囊性强毒株RH，并依次用乙胺嘧啶或磺胺嘧啶处理以克服急性弓形虫病的动物的血清学分析显示抗速殖子特异性抗体的富集水平(感染后22天；图9e，下图)，而rBCLA几乎检测不到(图9e，上图)。由于我们不能排除处理已经改变了寄生虫在深层组织中的传播，并因此改变了它们分化为裂殖子，我们监测了被CTG持续感染的小鼠中对rBCLA的IgG应答，其中CTG是一种III型菌株，其引起非致死性慢性潜伏性感染，其特征在于适当的阳性血清学(图9f，右图)。接种后42天，没有观察到对rBCLA的反应性(图9f)。与II型感染的主要差异(图9a-d)是慢性感染CTG的小鼠在其脑中具有较低(如果没有)包囊数(Cannellaet al.,2014)，表明包囊负载与rBCLA抗体水平之间的可能关系。同样，来自被通常产生较低包囊数的II型(PruΔku80)菌株持续感染的小鼠血清不与rBCLA反应(图9g)，表明抗rBCLA抗原的小鼠抗体应答在亚慢性感染后迅速发生(>21天p.i.)，并且似乎至少在鼠模型中受到包囊存在的调节。产生潜伏型II型感染的再活化的免疫抑制疗法(类皮质激素)不增强针对rBCLA的抗体反应(图9h)，排除了响应于释放入裂殖子循环的免疫反应的假说。

有限的蛋白水解以发现rBCLA内的抗原亚片段

为了回收rBCLA的高抗原性亚片段，使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶对纯化的样品进行有限的蛋白水解。通过SDS PAGE进行的蛋白水解反应分析(图10a)显示rBCLA被胰凝乳蛋白酶快速降解，并被弹性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶部分降解，在17-kDa标志物周围产生稳定的片段。当按照与上述相同的方案针对阳性小鼠IgG血清(图10b)和His标签(图10c)进行印迹时，可以观察到大多数降解发生在C端，因为它们在His标签印迹中保持阳性。这些相同的降解在抗小鼠IgG WB中呈现较低强度的显示条带，表明构建体的进一步截短在蛋白质印迹分析中不增加小鼠IgG的特异性或灵敏度。

rBCLA也与人血清反应，然而阳性模式仍在调查中

我们接下来表明，与用qPCR阴性羊水或胎盘感染的小鼠相反，感染来自在怀孕期间初次感染并证实先天性弓形虫病的孕妇的羊水阳性的小鼠显然与rBCLA反应(图11A)。因此，rBCLA是一种在临床分离物中预测它们的致包囊特性的合适的血清学标志物。在鼠模型中抗rBCLA免疫球蛋白检测的评估之后，我们的目的是根据患者的血清学和临床状态评估人中抗rBCLA检测的模式(表3)。抗rBCLA抗原的抗体已经在3名强烈疑似或证实的眼弓形虫病的患者中检测到，或者仅在血清中检测到，或者在血清和房水中都检测到(图11b)。这些临床病例是由于视网膜中的刚地弓形虫包囊的再活化，而不是原发性感染，因为没有检测到IgM。在相同的静脉中，由于与血液病相关的免疫抑制而再活化弓形虫病的3名患者也具有抗rBCLA IgG，但与眼弓形虫病的患者相比，蛋白质印迹中的标记较弱，尽管使用

和

的抗体水平相当高(表3)。即使相对小的样品量限制了广泛的概括，rBCLA对由弓形虫病再活化引起的人血清的反应性也为我们的鼠模型提供了进一步的证据，其中我们将rBCLA的存在作为血清学标志物和包囊负荷相关联。出乎意料的是，孕妇中3份近期血清转化的血清和1份先天性弓形虫病儿童血清也与rBCLA反应(图11b)。虽然这难以证明，但最近的原发感染可能在外周组织中产生刚地弓形虫包囊进而引发体液抗BCLA免疫应答。无论如何，所有被确定为刚地弓形虫血清阴性的患者的血清均未检测到rBCLA，表明该抗原对弓形虫病患者具有良好的特异性(图11b)。

表2.本发明所使用的弓形虫菌株

表3.rBCLA抗原与来自人的一些血清和房水反应

制造商建议使用

和

解释血清学值的截止值

IgG(IU/mL):阴性<4；灰色区域:4.0≤x<8.0；阳性:≥8.0

IgM(index):阴性<0.55；灰色区域:0.55≤x<0.65；阳性:≥0.65

IgG(IU/mL):阴性<1.6；灰色区域:1.6≤x<3.0；阳性:≤3.0

IgM(index):阴性<0.50；灰色区域:0.50≤x<0.60；阳性:≥0.60

rBCLA阳性患者中的表位作图显示rBCLA内的大量抗原区和重复区内的一致反应性。

rBCLA的特异性免疫原性质量在来自不同临床类别的一系列血清中通过蛋白质印迹得到证明。主要目的之一是开发基于ELISA的测定法而以成本有效、稳健和快速的方式筛选较大的血清群。然而，为了正确地建立这种几乎完全基于化学合成肽的测定，需要更精确地理解BCLA的局部表位免疫原性。为此，我们设计并合成了覆盖重复区域和rBCLA结构域的纤维素印刷肽阵列(图12a)。这些阵列使用15个aa的肽设计，其中肽之间有3个aa的空位步骤。然后，我们测试了通过针对rBCLA的蛋白质印迹明确阳性的几种血清，并且取相同数目的阴性血清以成比例地减去非特异性反应性。当分析时，在重复区和rBCLA上获得的每种肽的总反应性得分(图12b)为我们提供了两个关键观察结果：首先，尽管具有几个较强的反应性区域，特别是靠近肽13、22、30和43，rBCLA在贯穿结构域中具有许多表位，并且不同的血清将与不同的区域非常不同地反应(图12c)。这强调了在ELISA试验中保持rBCLA作为重组蛋白的要求。此外，由于rBCLA结构域被预测为结构化的，结构化的表位将仅由重组蛋白策略提供，进一步强调了其用途。其次，发现重复基序在几乎所有测试的人血清中在两个分开的区域(肽3-7作为基序A并且13-16作为基序B)中一致地反应。该特征强调了包括一个或几个覆盖这些基序的肽以获得更灵敏的ELISA技术的重要性。因此，从这些结果，我们设计了结合全长BCLA重组蛋白和化学合成的重复基序的ELISA。

使用rBCLA和重复肽的ELISA滴定证实BCLA血清阳性在急性和慢性感染个体中更高。

建立严格的规则以分类和区分不同的临床概况。用开发的BCLA-ELISA试验测试123份血清(全部取自不同个体)。根据患者的临床概况显示以国际单位(UI)表示的他们的ELISA得分(图13)，如下列出：

1)“血清阴性”，其将所有具有SAG1 IgG/IgM阴性血清学的患者(健康或具有其它前期病症)重新分组。

2)“既往免疫”，其将所有患者(健康或具有其它病症)重新分组，将其分类为SAG1阳性IgG但不具有SAG1反应性IgM，且其不属于以下三类。

3)“免疫受损患者的活动性弓形虫病”，其将所有具有经证实的症状性弓形虫病(重组播散性、脑型和原发性弓形虫病)的SAG1 IgG阳性和免疫受损患者重新分组。

4)“免疫受损患者的无症状的血清学再活化”，其将经历血清学再活化但无可见症状的所有免疫受损患者重新分组。

5)“眼弓形虫病”，其将具有SAG1阳性血清学并患有经证实的眼弓形虫病的患者重新分组。

从该分析可以得到几个观察结果。首先，与血清阴性组相比，所有组显示出中值BCLA滴定的显著增加并且具有高得多的阳性率。这在人中证明了SAG1血清阳性状态与发展BCLA阳性状态的能力之间的直接相关性。这也显示SAG1阴性血清学和BCLA血清学之间的当前差异，其仍显示约10％的假阳性发现率。这可以在一些血清中通过与不同BCLA表位的非特异性相互作用、与rBCLA共纯化的强免疫原性外源细菌污染物和具有阴性SAG1血清学的潜在真正BCLA阳性患者来解释。第二个主要观察结果是一些临床特征倾向于产生更强的免疫原性反应，最值得注意的是“免疫受损患者的无症状的血清学再活化”组，其中BCLA血清学滴定远远超过“既往免疫”组中的中值阳性BCLA血清学。最后的观察结果是，对于一些应该总是预期BCLA阳性的组，例如在“免疫受损患者的活动性弓形虫病”和“眼弓形虫病”的情况下，少数血清学保持阴性或在阳性截止值之下。该观察结果可突出ELISA测试的灵敏度缺乏，或潜在说明BCLA血清学在免疫抑制期间可变为阴性的事实。

ELISA测试也一致地将小鼠中的阳性BCLA血清学与成比例的包囊负荷联系起来。

总之，抗rBCLA抗体滴度的半定量分析鉴定了可能携带对BCLA高度应答的WT包囊的BALB/c和NMRI小鼠，其中产量随时间增加(图14A)。将脑相关刚地弓形虫DNA的定量PCR和据报道在缓发生时被特异性诱导(Cannella et al.,2014)的脑相关miR-155和miR-146microRNA的定量相结合，我们提供了rBCLA作为可靠抗原的证据，以在啮齿动物中长期存在原生动物的情况下，通过血清学检测刚地弓形虫裂殖子负载的包囊(图14B)。这些结果是尤其令人感兴趣的，因为ELISA测试的半定量性质明显区别致包囊性刚地弓形虫菌株随时间的应答。

讨论

刚地弓形虫的感染导致急性全身阶段，通过该阶段，孢子迅速建立自身并进一步完成其发育程序，如被持续存在于脑、心脏和骨骼肌中的厚囊壁包围的包囊中所包裹的裂殖子(Jeffers et al.,2018)。宿主免疫应答能够迅速控制速殖子群体扩增，导致以血清转化为代表的终生免疫。然而，由于从速殖子到裂殖子的发育转变是完全双向的，所以免疫功能的任何损害(例如AIDS患者、血液病和免疫抑制治疗)可导致潜伏性感染的再活化，这可引起脑炎和局灶性脑损伤、肺或播散性疾病。

免疫活性受试者中急性和慢性弓形虫病的诊断主要依赖于血清学，并且因为感染通常是无症状的，所以血清学诊断在许多情况下是回顾性的，因为它基于例如在妊娠期间或在移植物环境中血清转化的证明(Robert-Gangneux and Darde,2012)。IgM和IgA抗体水平升高是原发性/急性感染的血清学指标，而高IgG-亲和力排除了原发性感染，缺乏IgM时的持续和稳态IgG水平代表潜伏性感染(Dard et al.,2016)。然而，即使对于训练有素的专家，血清学结果的解释仍然是困难的。当前要克服的挑战是：(i)区分最近和较远的感染；(ii)诊断婴儿的先天性弓形虫病和免疫受损患者的再活化；和iii)确定感染来源，即卵囊VS包囊。虽然在过去几十年中已经开发了许多方法来提高血清学测定的准确性和灵敏度，但是它们难以解决上述问题。明显的原因是，许多(如果不是全部)商业血清学测试试剂盒正在检测在速殖子阶段(例如SAG1)普遍表达或在寄生虫的两个感染阶段(例如GRA8)共同表达的裂解物或重组抗原。

目前，尽管目前还没有可靠的针对弓形虫病的裂殖子特异性血清学测定来估计世界范围内的感染来源，也没有准确地区分急性和潜伏性感染，但取得了进展。事实上，最近的蛋白质组研究已经阐明了孢子体特异性蛋白质的所有组成成分(Fritz et al.,2012；Possenti et al.,2013)，其已经揭示CCp5A作为血清学标志物能够区分感染鸡、猪和小鼠的寄生虫阶段，其中对卵囊感染的动物具有特异性反应性(Santana et al.,2015)。

然而，尽管早期的研究报道了特异性裂殖子抗原包括BAG1有助于刺激体液(Munet al.,1999)和细胞介导的抗刚地弓形虫感染的免疫力(Di Cristina et al.,2004)，目前在诊断测试中不认为裂殖子/包囊抗原是潜伏性感染的潜在标记。对裂殖子/包囊特异性标记物的研究在一定程度上受限于收获足够的小鼠脑包囊以分析潜伏期的特异性蛋白质组的能力。在该研究中，我们发现了一种通过在细胞培养物中去阻抑裂殖子基因同时用表观药物操纵速殖子的染色质状态来规避该问题的方法。因此，鉴定了数百种裂殖子限制性蛋白，包括BCLA。

表明蛋白质BCLA对于引发或维持潜伏性感染不是必需的，然而BCLA缺陷导致以鼠模型中脑包囊的变形和圆形度丧失为特征的相当单一的表型。迄今为止，两种囊壁相关蛋白，即BPK1和CST1，参与了刚地弓形虫包囊的结构完整性(Jeffers et al.,2018)。在Δbpk1菌株中，包囊更小并且对胃蛋白酶-酸处理更敏感，并且与BCLA不同，Δbpk1菌株引起经口感染的能力降低(Buchholz et al.,2013)。CST1负责刚地弓形虫包囊的双花扁豆凝集素(DBA)凝集素结合特性。CST1的缺失导致减少的包囊数和以囊壁的下层区域变薄和破裂为特征的脆性脑包囊表型(Tomita et al.,2013)。糖基化缺陷也可以解释Δbcla包囊的变形。实际上，我们具有初步的相互作用数据，表明BCLA与茉莉碱结合蛋白共纯化(数据未显示)，所述茉莉碱结合蛋白是结合GalNAcα1-Ser/Thr寡糖的凝集素，其覆盖了围绕裂殖子的PVM(Tomita et al.,2017)。需要进一步研究以确定这种相互作用是否负责BCLA缺陷介导的特有表型。

不管感染的途径和时间如何，在小鼠中没有明确的BCLA相关表型，我们定向于我们对BCLA发挥免疫原性作用的倾向的研究。因此，我们通过生产具有高纯度的重组蛋白形式的rBCLA达到了另一个里程碑，这提供了标准化血清学测试的机会，并在一定程度上降低了生产成本，在该抗原证明对血清学是有意义的情况下。事实上，我们提供了强大的数据支持rBCLA是抗原性的并且构成用于检测慢性感染小鼠中的抗刚地弓形虫IgG的优良抗原候选物。引人注目的是，我们清楚地将血清中抗原rBCLA的强检测与潜在感染II型致包囊菌株的所有小鼠脑中的包囊负荷相关联。类似的研究声称MAG1抗体水平与脑包囊负荷相关，但是通过使用慢性I型(GT1)感染的不相关模型，它们的实验设置有些偏倚，所述模型需要抗刚地弓形虫化疗以在急性期控制速殖子增殖并避免动物死亡(Xiao et al.,2016)。

值得注意的是，rBCLA不与IgM或IgA反应(数据未显示)，这些标志物通常与急性感染相关，但仅与IgG和亚慢性感染相关。该结果与组织包囊饲养鼠在第10天表现出明显IgM应答的观察结果(

et al.,2018)形成鲜明对比，并增强了在感染潜伏期对抗BCLA的体液应答的观点。同样，用组织包囊经口管饲法接种的小鼠在急性感染时不产生抗BCLA的抗体(图8c)，表明抗BCLA的宿主免疫应答并非源自初次感染期间胃肠道内从摄取的寄生虫释放的第一次暴露于裂殖子和包囊蛋白。这与感染后非常早期发生的针对BAG1和MAG1的体液应答形成鲜明对比(Di Cristina et al.,2004；Mun et al.,1999)。提示对含BCLA的组织包囊的体液免疫应答的我们的发现与刚地弓形虫包囊主要存在于免疫豁免部位(如大脑和骨骼肌)的观点相反。阐明慢性弓形虫病期间体液免疫应答的贡献将需要在小鼠中进一步的工作，并且可能BCLA为研究这些过程提供强大工具。

最后，在与免疫抑制或先天性弓形虫病相关的弓形虫病再活化期间，已经在弓形虫病再活化后的眼弓形虫病患者的一些人血清中检测到抗rBCLA抗体。这些发现与从小鼠模型得出的结论一致，即rBCLA是慢性感染的宿主中组织包囊存在的绝佳的血清学标志物。

实施例2(VHH生产)

免疫接种

在第0天、第14天、第28天和第35天通过4次注射经Eurogentec免疫接种LamasSEL005和SEL006。在第0天、第28天和第43天获得血清。在第43天从大量血液中获得外周血单核细胞(PBMC)。

免疫应答

通过评估第43天血清中rBCLA特异性抗体的存在来测试SEL005和SEL006的免疫应答。在4℃下用每孔200ng抗原包被MaxiSorp板过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤三次后，用PBS中的4％奶粉(MPBS)封闭板。接着，将1％MPBS中的血清的系列稀释液添加到孔中并孵育1小时。在用PBS-Tween洗涤期间除去未结合的抗体。随后，用兔抗VHH(克隆K1216)和偶联HRP的驴抗兔检测结合的抗体。通过O-苯二胺(OPD)在H2O2存在下在490nm的比色反应定量抗体结合。Llamas SEL005和SEL006对His rBCLA显示出非常好的应答。

SEL005第43天和SEL006第43天的文库构建

RNA分离和cDNA合成

在第43天从大量血液中分离外周血淋巴细胞，在Eurogentec从其中分离RNA。将沉淀的RNA溶于无RNA酶的MQ中并测量RNA浓度。为了评估RNA的质量，在凝胶上分析5μl溶解的RNA。图2A显示完整的28S和18S rRNA清晰可见，表明RNA的适当完整性。

使用逆转录酶试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将约40μg RNA(4个反应，每个10μg)转录为cDNA。在Macherey Nagel PCR清除柱上纯化cDNA。使用在前导序列区和CH2区退火的引物扩增重链(常规和仅重链)片段的可变结构域。将5μl加载到1％TBE琼脂糖凝胶上以作为扩增对照。

在该对照后，将剩余的样品上样到1％TAE琼脂糖凝胶上，切下700b片段并从凝胶中纯化。将总共80ng分离的PCR产物用作嵌套PCR的模板(终体积800μl)，以将SfiI和Eco91I限制性位点引入VHH基因的任一端。在Macherey Nagel PCR清洗柱上清洗扩增的VHH片段并以120μl洗脱。首先用SfiI、然后用Eco91I消化洗脱的DNA。作为限制性消化的对照，将4μl该混合物上样到1.5％TBE琼脂糖凝胶上。

限制性消化后，将样品上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。从凝胶上切下400bp片段并在Machery Nagel凝胶提取柱上纯化。将纯化的400bp VHH片段(～330ng)连接到pUR8100噬菌粒载体(～1μg)中并转化到TG1大肠杆菌中。

文库大小

将转化的TG1用10倍稀释液滴定。将5μl稀释液点在补充有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB-琼脂板上。从转化的TG1培养物的点样稀释液计算转化体数(记住转化的最终体积是8ml)。通过计数最高稀释度的菌落并使用以下公式计算转化体的总数并由此计算文库大小：

文库大小＝(菌落的量)×(稀释)×8(ml)/0.005(ml；点样体积)

通过挑选24个不同的克隆并进行菌落PCR来测定噬菌粒载体中的VHH插入频率。～700bp的条带指示成功克隆的VHH片段。～300bp的条带指示空质粒。文库SEL005第43天的插入频率为100％。文库SEL006第43天的插入频率几乎为95％(图4)，这足以继续噬菌体淘选选择。

噬菌体生产和选择

如下所述从文库产生噬菌体：将含有文库SEL005第43天和SEL006第43天的大肠杆菌TG1在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中从甘油原液稀释至OD600为0.05。该接种物中细菌数至少是文库大小的10倍(接种物中>10⁹个细菌)。使此培养物在37℃下生长2小时以达到OD600为～0.5。随后，使用100的MOI(感染复数)用辅助噬菌体VCSM13感染约7ml培养物，在37℃静置30分钟。将感染的细菌离心并重悬于补充有氨苄青霉素(100μg/ml，对于噬菌粒)和卡那霉素(25μg/ml，对于M13噬菌体)的50ml新鲜2xYT培养基中，并在37℃振荡生长过夜。使用PEG-NaCl沉淀从培养物的上清液中沉淀产生的噬菌体。通过连续稀释噬菌体和感染大肠杆菌TG1来计算产生的噬菌体的滴度。分别地，产生的噬菌体的滴度对于SEL005第43天为3×10¹¹/ml，对于SEL006第43天为6×10¹¹/ml，这足以继续选择。

对于第1轮淘选/选择，将20μl沉淀的噬菌体(～10¹⁰个噬菌体，其是文库多样性的>100倍)施加到用His rBCLA包被的孔中。简言之，将100μl抗原以2种浓度5μg/ml和0.5μg/ml包被在MaxiSorp上过夜。作为阴性对照，一个孔仅用PBS孵育。第二天，除去未结合的抗原后，用PBS洗涤平板三次，并用PBS中4％奶粉(MPBS)封闭。同时用2％MPBS预封闭新沉淀的噬菌体30分钟。将预封闭的噬菌体与直接包被的His rBCLA一起孵育2小时。用PBS-Tween和PBS充分洗涤后，用0.1M TEA溶液洗脱结合的噬菌体，随后用1M Tris/HCl pH7.5中和。连续稀释洗脱的噬菌体，然后用于感染TG1细菌，并点样在补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上，并在37℃孵育。

对于第2轮选择，在5μg/ml His rBCLA(最高浓度)上产生来自选择的拯救输出的新噬菌体。将过夜生长的拯救输出物在补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的5ml新鲜2xYT培养基中稀释100倍并生长2小时直至对数期。随后加入1μl辅助噬菌体VCS M13并在37℃孵育30分钟。使培养物在37℃过夜产生噬菌体。使用PEG-NaCl沉淀从培养物的上清液中沉淀产生的噬菌体。

随后，对于第2轮淘选/选择，如下所示将1μl沉淀的噬菌体施加到用His rBCLA包被的孔中：以3种浓度(5μg/ml、0.5μg/ml和0.05μg/ml)将抗原包被在MaxiSorp板上过夜。作为阴性对照，一个孔仅用PBS孵育。第二天，除去未结合的抗原后，用PBS洗涤板三次并用4％MPBS封闭。同时，如上所述将新沉淀的噬菌体在2％MPBS中预封闭30分钟。将预封闭的噬菌体与直接包被的His rBCLA一起孵育2小时。用PBS-Tween和PBS充分洗涤后，用0.1M TEA溶液洗脱结合的噬菌体，随后用1M Tris/HCl pH7.5中和。连续稀释洗脱的噬菌体，然后用于感染TG1细胞，并点样在补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上，并在37℃孵育过夜。

2轮噬菌体展示选择后的筛选

将His rBCLA上第2轮选择的拯救输出物铺板以挑选单个克隆。对于主平板ERB-1，在96孔板中挑选总共92个单个克隆。

为了筛选用于His rBCLA-结合剂的主平板ERB-1，产生含有单克隆VHH的周质提取物。将母板在37℃下在补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中培养，并且在添加甘油至20％的最终浓度后在-80℃下储存。为了产生周质提取物，将主平板ERB-1复制到含有补充有0.1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的1ml 2xYT培养基的深孔板中，并在37℃下生长3小时，然后添加1mM IPTG以诱导VHH表达。VHH表达在室温下进行过夜。通过离心收集细菌，将该沉淀重悬浮于120μl PBS中并进行一次冻融循环来制备周质提取物。离心细菌以从细胞碎片(沉淀)中分离含VHH的可溶性周质级分。为了通过ELISA测试单克隆VHH的结合特异性，在4℃下将His rBCLA(100ng/孔，在PBS中)包被在MaxiSorp板上过夜。洗涤包被的板，随后使用4％MPBS封闭。将封闭的孔与10μl周质提取物和40μl 1％MPBS在室温下孵育1小时。通过用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤除去未结合的VHH。随后，用兔抗VHH(克隆K976)和偶联HRP的驴抗兔检测结合的VHH。通过OPD在H2O2存在下在490nm的比色反应定量VHH的结合。主板ERB-1的所有克隆都能够特异性结合His rBCLA。所使用的两个文库之间没有差异。

结合VHH的His rBCLA的序列分析

基于ELISA结果，选择17个克隆(ERB-1A1、ERB-1F1、ERB-1A2、ERB-1E2、ERB-1F2、ERB-1G2、ERB-1B3、ERB-1H4、ERB-1A5、ERB-1G6、ERB-1D7、ERB-1F7、ERB-1G8、ERB-1E9、ERB-1E10、ERB-1B11和ERB-1A12)进行序列测定。基于ELISA中的结合挑选这些克隆，这些克隆应代表选自不同输出的大多数克隆。

在His rBCLA上选择的VHH的克隆和生产

从所有测序的克隆中，选择7个克隆(ERB-1F1、ERB-1F2、ERB-1H4、ERB-1G6、ERB-1D7、ERB-1B11和ERB-1A12)作为发现的VHH序列的良好代表。然后，使用SfiI和Eco91I限制酶将这些VHH从噬菌粒载体亚克隆到表达载体pMEK222中。再克隆到pMEK222中还在VHH的C端添加FLAG和His-标记，允许检测和亲和纯化。为了生产，通过在37℃下在补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的8ml 2xYT培养基中使含有质粒和所选VHH的细菌生长过夜来制备预培养物。将预培养物稀释到800ml新鲜2xYT中，所述新鲜2xYT在37℃下预热并补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖。使细菌在37℃下生长2小时，然后用1mM IPTG诱导VHH表达。将VHH在37℃表达4小时，通过离心收获细菌。将细菌沉淀重悬于30ml PBS中并在-20℃冷冻。

VHH的纯化和分析

将冷冻的细菌沉淀在室温下解冻，并通过离心使细胞碎片旋转下来。使用His-tag与带钴琼脂糖珠的亲和力(使用TALON珠的固定化金属亲和层析(IMAC))从上清液(可溶性级分)中纯化VHH。用150mM咪唑洗脱结合的VHH，并用PBS透析。

使用280nm处的吸收测量蛋白质浓度，并根据不同VHH的摩尔消光系数和分子量进行校正。

作为质量检查，将1μg纯化的VHH加载到SDS-PAGE上。

通过ELISA分析纯化的VHH与固定的His rBCLA的结合。在4℃下在PBS中用200ng/孔抗原包被MaxiSorp板过夜。用4％MPBS封闭孔后，将系列稀释的VHH添加到包被的孔中并在室温下孵育1小时。洗涤未结合的VHH后，用小鼠抗标记(克隆M2)和偶联HRP的驴抗小鼠检测结合的VHH。通过测量OPD+H2O2在490nm处的比色反应来定量结合。ERB-1G6、ERB-1B11和ERB-1A12显示对固定的His rBCLA的亚纳摩尔表观亲和力。ERB-1F1和ERB-1F2显示低纳摩尔亲和力。ERB-1H4和ERB-1D7显示对His rBCLA的摩尔表观亲和力。

结论

免疫llamas SEL005和SEL006产生良好的免疫应答。产生的文库具有良好的大小和插入频率。在His rBCLA上的噬菌体展示选择已经产生许多良好的克隆，其中3个(ERB-1G6、ERB-1B11和ERB-1A12)显示非常好的表观亲和力，其中ERB-1G6还在大肠杆菌中显示高生产水平。

表4：用于实施本发明的有用氨基酸序列

实施例3：

在本纵向研究中，可以想象，我们表明当正确组合时，BCLA抗体的检测可能会进一步提高当前测试的灵敏度。我们在母婴先天性弓形虫病的情况下进行了BCLA试验。此时，每组母亲/儿童仅测试10对，因此应相应考虑结果。比较两组，一组通过出生后长时期的儿童血清中持久的Sag1 IgG滴度证实先天性弓形虫病，另一组当儿童的血清随时间变成Sag1阴性时排除先天性弓形虫病(Lebech M et al.,1996)。

如通过

和

对Toxo IgG的比较滴定所示，在出生时，两组中的婴儿共享相当的滴定度，没有可辨别的分布(图15C-D)。这可以解释为母亲通过胎盘屏障传递抗Sag1 IgG，因此在出生时不可能有明确的生物学结论。当观察BCLA ELISA滴定时，先天性弓形虫病和排除的先天性弓形虫病之间的分离更清楚。出生时的儿童血清显示比其母亲或排除的先天性弓形虫病组的BCLA滴定反应性大得多(图15A-B)。

该观察结果表明婴儿在出生前新合成特异性抗BCLA抗体，并表明强烈的BCLA反应性可以进一步指导出生时先天性弓形虫病的诊断。

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贯穿本申请，各种参考文献描述了本发明所属领域的状态。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开。

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