CN111630382A - α-共核蛋白病的测定、方法和治疗 - Google Patents

α-共核蛋白病的测定、方法和治疗 Download PDF

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Abstract

披露了一种检测受试者样本中α‑突触核蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a)从受试者获取样本；5b)将该样本用于发光测定；以及c)任选地将结果与对照进行比较。

Description

α-共核蛋白病的测定、方法和治疗
技术领域
本发明涉及一种测定，该测定可以通过评估和监测患者体内的α-突触核蛋白水平来诊断和有效治疗诸如帕金森病等α-共核蛋白病。
背景技术
帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩(MSA)均为具有α-突触核蛋白脑病理学特征的神经退行性疾病的示例。PD是最常见的运动障碍，其特征表现为震颤、运动徐缓或起步困难、强直和平衡障碍(又称姿势不稳)。据信全世界大约400万至600万人受到PD影响。大约80％的PD患者会发展为痴呆，从而导致PDD。痴呆通常发生在帕金森病的晚期。而在DLB中，痴呆是首发症状，但第一年可能会出现运动症状，因此痴呆是这些疾病之间的临床区别。DLB可能占所有痴呆的高达15％-20％。
α-突触核蛋白是位于神经细胞内的由140个氨基酸组成的小分子蛋白，主要位于突触前。α-突触核蛋白在神经细胞内积聚导致在神经元内形成多种聚集体，如路易体和苍白体(为较大的圆形细胞质内含物)、路易神经突(轴突内丝状内含物)和小突触内含物。
导致α-突触核蛋白聚集和毒性的过程尚不十分明确。α-突触核蛋白基因突变或重复是PD和DLB的罕见病因。据报告，致病突变A30P、A53T、E46K(Kruger等人,1998)(Polymeropoulos等人，1998)(Zarranz等人,2004)和α-突触核蛋白的双重重复和三重重复(Chartier-Harlin等人,2004)(Singleton等人,2003)可以导致PD或DLB。这些突变中的大多数都与原纤维体(protofibrillar)形成速率增加有关并最终形成纤维体，而这些原纤维体或纤维体可能具有不同的毒性。聚集与丝氨酸129处发生的α-突触核蛋白磷酸化相关联。正常的α-突触核蛋白仅发生很低程度(4％)的磷酸化，但估计纤维状α-突触核蛋白的磷酸化程度高达80％，并且pS129α-突触核蛋白的抗体可以检测到最小的聚集体。
研究发现少量的α-突触核蛋白存在于细胞外的脑间质液、脑脊液(CSF)和血液中。这些α-突触核蛋白的来源尚不清楚，但可能是从细胞中释放出来的，包括从细胞体和突触中释放出来(例如神经元细胞激活时的突触释放过程)。其中一些也可能来自患病和死亡的细胞。在许多血细胞和血小板中也发现了α-突触核蛋白，这些可能是血液中α-突触核蛋白的来源。一小部分α-突触核蛋白在外泌体中分泌，而细胞外液中大部分α-突触核蛋白均为游离蛋白，与外泌体无关。
需要使用改进的诊断工具来鉴别处于具有α-突触核蛋白病理学特征的神经退行性疾病早期阶段的患者。有证据表明，神经退行性病变过程可能开始于临床诊断前10-20年。REM睡眠行为障碍(RBD)目前认为是α-共核蛋白病的前驱阶段。大多数RDB患者在确诊为RBD后的20年内会转为PD或DLB。α-共核蛋白病前驱期的其他体征包括嗅觉丧失。
如今，在运动症状明显之前，尚无生化检查方法帮助临床医生进行诊断。而等到运动症状明显时，大脑可能已经发生了实质性损伤。随着新的改进的疾病治疗方法的出现，精确诊断检测将变得更加重要，这将有望阻止或减缓疾病的进展。
存在几种测定可以检测总α-突触核蛋白，其中一些已经过验证或正在大规模临床研究中进行验证(Goldman等人,2017)。这些研究表明CSF中总α-突触核蛋白的少量减少与帕金森病具有关联性。还有几种探索性测定方法可以检测α-突触核蛋白的某些低聚体形式和丝氨酸129上的某些磷酸化形式(Majbour等人,2016a)，初步数据表明这些形式的α-突触核蛋白可能在PD CSF中增加。但是，患者水平和对照水平之间的差异仍然很小，并且个体间差异较大。当前所有的检测都存在差异小和个体间差异大的问题，使得这些测定无法用于帮助诊断具有α-突触核蛋白聚集的疾病。总而言之，目前的证据表明PD中总CSFα-突触核蛋白减少，并且α-突触核蛋白低聚体或磷酸化的α-突触核蛋白亚种可以区分PD与对照。
测量外周生物体液、血浆和唾液中的α-突触核蛋白所产生的结果比CSF更加多变。在最新的大型研究中，血浆和唾液中的α-突触核蛋白水平并未显著区分PD患者和健康对照参与者，并且外周生物体液(血浆和唾液)中的α-突触核蛋白水平与CSF中的α-突触核蛋白水平之间也没有显著相关性(Goldman等人,2017)。因此，目前CSFα-突触核蛋白比外周α-突触核蛋白对PD具有更高的诊断价值。但是，CSF采样是更具侵入性的样本获取方法，如果可能的话，用血浆生物标志物检测PD是有益的。
发明内容
监测α-突触核蛋白的聚集对于研究共核蛋白病的发病机制至关重要，共核蛋白病是一组神经退行性疾病，包括帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)、播散性路易体病(DLBD)和多系统萎缩(MSA)。因此，本发明的方法可以用于诊断或监测上述疾病的疾病进展情况。可替代地，该方法可用于监测或跟踪治疗反应，并进行与患者治疗相关的讨论。在某些实施方案中，这种治疗可以是针对α-突触核蛋白的主动或被动免疫治疗，例如包含α-突触核蛋白的抗体治疗或疫苗接种。
在一个实施方案中，本发明是一种体外方法，该方法包括以下步骤：
a)从患者获取样本
b)将该样本用于本发明的一种发光测定；以及
c)任选地将结果与对照进行比较。
样本优选血液样本、血浆样本或血清样本。
所用的抗体为与荧光团相连的α-突触核蛋白抗体。在本发明的方法中可以使用两种不同的荧光团，它们可以与结合α-突触核蛋白的两种抗体相连。一种荧光团(供体)比另一种荧光团(受体)的荧光时间更长。
供体优选选自Lumi4-Tb(Tb2+穴合物)或铕穴合物(Eu3+穴合物)，受体优选选自XL665或荧光素或d2。
通过在兼容的读取仪器中测量荧光发射(优选在两个不同的波长下，例如665nm和620nm)来检测能量转移的水平，以此评估供体和受体之间的接近度。
附图说明
图1显示了使用PHERAstar FSX设备进行的测量，该设备可以同时测量620nM(Tb穴合物供体)和665nm(d2受体)的发射。计算每个孔的比率665/620*10000。使用该比率计算相对能量转移率ΔF％，并且可以将其标准化为蛋白浓度。柱状图显示了使用试剂盒1和试剂盒2(检测聚集的α突触核蛋白)测量的每个血浆样本(稀释8倍)的标准化为蛋白的ΔF％。三名PD患者和三名健康对照之间具有明显区别。该图显示，PD患者血浆中聚集的α-突触核蛋白水平显著较高，因此该方法可用于基于血液样本来鉴别、诊断和监测PD患者的疾病进展。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于在α-突触核蛋白相关疾病的诊断方法中使用的测定，所述α-突触核蛋白相关疾病即为α-共核蛋白病，其中聚集的不溶性α-突触核蛋白以路易体、路易神经突和小突触内含物的形式在脑部积聚。此类疾病包括但不限于一种或多种神经退行性疾病，如帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)和REM睡眠行为障碍(RBD)以及其他具有α-突触核蛋白病理学特征的神经退行性疾病。
本发明提供了两种测定的新用途，一种基于聚集的α-突触核蛋白，一种基于磷酸化的α-突触核蛋白。两种测定都显示出PD患者的血浆较之对照个体的血浆发生较大增加(图1)。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种使用本发明的发光测定，通过使用有效量的α-突触核蛋白抗体来治疗诊断患有诸如帕金森病等α-共核蛋白病的患者，以此治疗所述患者的方法。
抗体治疗的治疗效果可以通过测量患者血液、血浆或血清中α-突触核蛋白的水平来进行评价。该评价可以在抗体治疗前(如患者诊断时)或1、2、3、4或更多次治疗后进行。例如，根据一个实施方案，该方法可以用于监测抗体治疗的治疗效果和疾病进展。
该测定可包括以下步骤：
a.在适当的结合条件下，将患者的血液、血浆或血清样本用于发光测定；以及
b.如果适用，将数据与未患有帕金森病的人的对照数据进行比较，或例如，将数据与不同(更早)时间点从同一人处获得的数据进行比较，从而监测疾病进展。
根据结果，可以确定患者是否应该继续接受治疗，或者如果是刚刚确诊则为患者是否要开始治疗。例如，如果通过检测获得的数据显示与对照相比，存在更多α-突触核蛋白，则可以建议继续治疗或开始治疗。
对照与患者之间的差异可能超过2倍、3倍、4倍或更高。如图1所示，对照水平极低，因此可以通过忽略背景来获得阳性结果。
该测定是一种基于HTRF(均相时间分辨荧光)测定的测量发光的测定。该技术结合了荧光共振能量转移技术(FRET)与时间分辨测量(TR)(Degorce等人,2009,CurrentChemical Genomics[当前化学基因组学],3,22-32)。在TR-FRET测定中，当彼此非常接近时，通过供体与受体分子(例如偶联至抗体)之间的荧光共振能量转移产生信号。
HTRF技术可以使用铕穴合物作为荧光供体来监测诸如抗体或铽穴合物(Tb)等生物分子之间的反应。示例包括铕穴合物(Eu3+穴合物)和Lumi4-Tb(Tb2+穴合物)。
针对HTRF开发的受体可以是XL665，其是一种从红藻中纯化的藻胆蛋白色素。XL665是一种分子量为105kDa的巨大异源六聚体大结构，在分离后交联，以在HTRF测定中获得更好的稳定性并保持其光物理性质。具有一系列与XL665非常相似的光物理性质但其特征是有机结构比XL665小100倍的一类受体是如土螯合物(earth chelate)或穴合物。使用较小的实体可以解决有时在基于XL665的TR-FRET系统中疑似存在的空间位阻问题。这些近红外受体也特别适用于均相测定，因为其发射不太可能受到内在介质，或在典型化合物筛选过程中出现的化合物自发荧光的干扰。这些红色受体的性质也使其适合与铽穴合物进行耦合。此外，由于其发射光谱内存在其他峰，铽穴合物可以与诸如荧光素等绿色受体耦合，发射荧光在520nm范围内，其例如可以允许设计具有两个读数的多重检测。
特别地，有利地使用诸如稀土螯合物或穴合物等荧光化合物，尤其是铽、铕、镝、钐或钕螯合物或穴合物。优选使用铽或铕穴合物。
在使用本发明的测量方法进行检测和/或确定的荧光方法中，将有利地选择欧洲专利申请EP 180 492和EP 321 353中所述的稀土穴合物。
优选使用欧洲专利申请180 492中所述的铽穴合物Tb三联双吡啶(trisbipyridine)或铕穴合物Eu三联双吡啶或者欧洲专利申请EP 321 353中所述的穴合物Eu三联双吡啶二胺和Tb三联双吡啶二胺。
根据有利特征，荧光供体化合物为铕穴合物，并且荧光受体化合物选自d2、别藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白B、藻蓝蛋白C或藻蓝蛋白R。
也可以使用诸如曙红或赤藓红等磷光化合物作为发光供体。在此情况下，有利地使用选自诸如欧洲专利申请EP 71 991和EP 314 406中提及的叶绿素类或诸如欧洲专利申请EP 71 991中提及的卟啉类或诸如国际专利申请WO 88 04777中提及的酞菁类的荧光受体化合物。
根据本发明的另一个特征，用于检测和/或确定介质(例如血液、血浆或血清)中α-突触核蛋白的发光方法包括以下步骤：
1)向所述含有来自患者或受试者的α-突触核蛋白的介质中加入与发光供体耦合的抗α-突触核蛋白的一抗；
2)加入与发光受体耦合的α-突触核蛋白二抗；
3)在加入试剂后孵育所述介质；
4)在发光供体的激发波长下激发所得介质；以及
5)测量发光供体在某一波长下的信号(该测量用作参考)，以及在不同波长下能量转移产生的信号。
根据一个实施方案，该测定预期用于使用HTRF技术检测α-突触核蛋白聚集。使用标记有诸如Tb穴合物的供体或受体的特异性α-突触核蛋白单克隆抗体来检测聚集的α-突触核蛋白。当染料非常接近时，用光源(激光或闪光灯)激发供体，引发朝向受体的荧光共振能量转移(FRET)，其然后在特定波长(665nm)发出荧光。用受体或Tb标记的抗体与α-突触核蛋白结合。当α-突触核蛋白聚集时，用受体或Tb标记的抗体就会非常接近，从而产生FRET。信号强度与形成的聚集体数量成比例。
监测α-突触核蛋白的聚集对于研究共核蛋白病的发病机制非常重要，共核蛋白病是一组神经退行性疾病，包括帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)、播散性路易体病(DLBD)和多系统萎缩(MSA)。因此，本发明的方法可以用于诊断或监测上述疾病。可替代地，该方法可用于监测或跟踪治疗反应，并做出与患者治疗相关的决定。在一个实施方案中，该治疗为α-突触核蛋白抗体治疗。
因此，本发明涉及诊断或跟踪患者体内诸如帕金森病等共核蛋白病的方法，该方法包括以下步骤
a)从患者获取样本
b)将该样本施用于如上所述的发光测定；以及
c)任选地将结果与对照进行比较。
样本优选血液样本、血清样本或血浆样本。
所用的抗体可为与荧光团相连的α-突触核蛋白抗体。所用的荧光团(供体)比所用的另一种荧光团(受体)的荧光时间更长。供体优选选自Lumi4-Tb(Tb2+穴合物)或铕穴合物(Eu3+穴合物)，并且受体优选选自d2、XL665或荧光素。
通过在兼容的读取仪器中测量荧光发射(优选在两个不同的波长下，例如665nm和620nm)来检测能量转移的水平，以此评估供体和受体之间的接近度。
如在此使用的，术语“α-突触核蛋白”与“α-突触核蛋白蛋白”同义，并且是指任何α-突触核蛋白蛋白亚型(例如在UniProt中鉴定为P37840，1-3)。如下显示了关于序列的α-突触核蛋白的氨基酸编号，其中甲硫氨酸(M)是氨基酸残基1(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0002549943890000081
在一些实施方案中，α-突触核蛋白抗体可以结合α-突触核蛋白或pS129α-突触核蛋白的120-140之间的C末端残基。
本发明还涉及一种通过施用有效量的结合α-突触核蛋白上的表位的抗体来治疗帕金森病患者的方法，其中该患者已经通过本发明的测定进行诊断或监测。
实施例
该测定可用于使用血液样本来鉴别、诊断和监测患有α-共核蛋白病(例如帕金森病)的患者。
测定原理：
该测定基于时间分辨荧光-共振能量转移(TR-FRET)技术的使用。
FRET基于两种染料(供体和受体)之间的能量转移。当供体被激发时，其将能量传递给受体，然后受体发射出被测量的荧光。只有当染料彼此非常接近时，才可能出现上述情形。普通FRET研究受背景荧光的限制，非常短暂。可以通过将时间分辨测量与FRET相结合来解决这一问题，以避免背景和非特异性荧光。同时，TR-FRET中的受体被设计为参与FRET时发出长寿命的荧光。
在α-突触核蛋白聚集试剂盒中，用供体或受体分子标记特异性单克隆抗体。在磷酸突触核蛋白试剂盒(S129P)中，使用两种抗体，一种为α-突触核蛋白抗体，并且另一种为磷酸突触核蛋白特异性抗体(S129P)，其中一种抗体用供体标记，并且另一种用受体染料标记。当抗体(用供体和受体染料标记)与人α-突触核蛋白聚集体结合时，它们变得彼此非常接近，并在激发时产生FRET。
患者
患者从Bispebjerg-Frederiksberg医院神经内科门诊部招募。PD的临床诊断根据英国帕金森病学会脑库(UK Parkinson’s Disease Society Brain Bank)临床诊断标准进行定义。连续纳入患者，并对所有患者进行临床随访。随访时，只有符合明确PD诊断诊断标准的患者才被纳入研究。对照组的受试者未患有可能影响中枢神经系统的疾病。
血浆样本
在各自门诊时抽取静脉血，并于当天在Bispebjerg Movement DisordersBiobank(丹麦哥本哈根)进行处理。所有血浆样本均在纳入时采集。在EDTA涂覆的聚丙烯管中采集样本，并以2000×g于4℃下离心10分钟；然后将上清血浆等分，并于-80℃下储存在400μL聚丙烯(PP)管中，直到分析日，在该日将其在冰上解冻30分钟。
实施例1
对来自患者的样本(3个对照样本和3个PD患者样本)进行分析。使用来自Cisbio的两个商业试剂盒，即α-突触核蛋白聚集试剂盒(试剂盒1)和磷酸突触核蛋白试剂盒(试剂盒2)来比较样本。每个样本在三个不同的稀释度下进行检测。采用随试剂盒附带的缓冲液对样本进行稀释，并移液至386孔板中，一式两份。将抗体混合物加入到孔中，并在室温下孵育。孔板中包含阳性对照和阴性对照。
使用PHERAstar FSX装置进行测量，该装置可以同时测量620nM(Tb穴合物供体)和665nm(d2受体)处的发射。计算每个孔的比率665/620*10000。使用该比率计算相对能量转移率ΔF％，并且可以将其标准化为蛋白浓度。
柱状图显示了使用试剂盒1和试剂盒2测量的每个样本(稀释8倍)的标准化为蛋白的ΔF％。三名PD患者和三名健康对照之间具有明显区别。该实施例显示，PD患者血浆中聚集的α-突触核蛋白和磷酸突触核蛋白水平显著较高，并且该方法可用于基于血液样本来鉴别和诊断PD病例。
序列表
<110> H.隆德贝克有限公司（H. Lundbeck A/S）
<120> α-共核蛋白病的测定、方法和治疗
<130> 1098-WO-PCT
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140

Claims (13)

1.一种检测受试者样本中α-突触核蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
a)从受试者获取样本；
b)将该样本用于发光测定；以及
c)任选地将结果与对照进行比较。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本为血液样本、血浆样本或血清样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该发光测定使用与α-突触核蛋白或pS129α-突触核蛋白上120-140残基内结合的α-突触核蛋白抗体进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该发光测定使用与α-突触核蛋白或pS129α-突触核蛋白上120-140残基内的不同表位结合的两种不同的α-突触核蛋白抗体进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所用的一种荧光团(供体)比所用的另一种荧光团(受体)的荧光时间更长。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该供体荧光团选自Lumi4-Tb(Tb2+穴合物)、铕穴合物(Eu3+穴合物)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中该受体荧光团选自d2、XL665或荧光素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中通过测量荧光来检测能量转移水平，从而评估该供体和该受体之间的接近度。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果该方法显示该样本中的α-突触核蛋白高于健康受试者的对照样本，则该受试者接受有效量的抗α-突触核蛋白抗体治疗。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法用于诊断或监测α-共核蛋白病。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法用于监测用于治疗α-共核蛋白病的药物的治疗反应。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者为人类。
13.一种通过施用有效量的结合α-突触核蛋白上的表位的抗体来治疗帕金森病患者的方法，其中该患者已经通过权利要求1-9的测定进行诊断或监测。
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