ES2898929T3 - Diagnóstico y tratamiento de alfa-sinucleinopatías - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para diagnosticar alfa-sinucleinopatías o para monitorizar la respuesta al tratamiento con un medicamento usado para tratar alfa-sinucleinopatías a través de la detección de alfa-sinucleína en una muestra de un sujeto que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra obtenida de un sujeto, b) aplicar la muestra a un ensayo de luminiscencia, y c) opcionalmente, comparar los resultados con un control, donde dicha muestra es una muestra sanguínea, una muestra de plasma o una muestra de suero, y donde el ensayo de luminiscencia emplea Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) en la que dos fluoróforos diferentes son ligados a dos anticuerpos que se unen a la alfa-sinucleína o a la pS129 (fosfo- serina 129) de la alfa-sinucleína (con la numeración de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1), donde uno de los fluoróforos usados presenta un mayor tiempo de fluorescencia (donante) que el otro fluoróforo usado (aceptor).
Description
DESCRIPCIÓN
Diagnóstico y tratamiento de alfa-sinucleinopatías
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un ensayo de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) que permite el diagnóstico y la monitorización de la respuesta al tratamiento con un medicamento usado para tratar alfa-sinucleinopatías, tal como en pacientes de la enfermedad de Parkinson, a través de la detección de los niveles de alfa-sinucleína en los pacientes.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Parkinson con demencia (PDD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia sistémica múltiple (MSA) son ejemplos de trastornos neurodegenerativos con patología cerebral de a-sinucleína. La PD es el trastorno del movimiento más común y se caracteriza por temblores, bradiquinesia o dificultad para iniciar movimientos, rigidez y dificultad en el equilibrio, también referida como inestabilidad postural. Se cree que la PD afecta aproximadamente a entre cuatro y seis millones de personas en todo el mundo. Aproximadamente el 80% de los pacientes desarrollan demencia que conduce a PDD. Típicamente, la demencia se produce de forma tardía en el curso de la enfermedad de Parkinson. En la DLB, la demencia es el primer síntoma, mientras que los síntomas motores pueden aparecer durante el primer año, siendo éste el distintivo clínico entre estos trastornos. La DLB puede representar hasta el 15-20% de todas las demencias.
La alfa-sinucleína es una proteína pequeña intraneuronal de 140 aminoácidos, localizada presinápticamente de forma predominante. La acumulación intraneuronal de a-sinucleína da como resultado la formación de agregados dentro de las neuronas, tales como cuerpos de Lewy y cuerpos pálidos, que son inclusiones citoplásmicas redondeadas grandes, neuritas de Lewy, que están hilvanadas como inclusiones en axones, y pequeñas inclusiones sinápticas.
El proceso que conduce a la agregación de a-sinucleína y a toxicidad no se conoce bien. Las mutaciones o duplicaciones del gen de a-sinucleína son una causa rara de PD y DLB. Se ha publicado que las mutaciones patogénicas A30P, A53T, E46K (Kruger et al., 1998) (Polymeropoulos et al., 1998) (Zarranz et al., 2004) y la duplicación y triplicación de la a-sinucleína (Chartier-Harlin et al., 2004) (Singleton et al., 2003) producen PD o DLB. La mayoría de dichas mutaciones se han relacionado con un aumento de la tasa de formación de especies protofibrilares y finalmente fibrilares, y éstas pueden presentar diferentes propiedades tóxicas. La agregación se asocia con la fosforilación de alfa-sinucleína en la serina 129. Mientras que la alfa-sinucleína normal solo está fosforilada en una pequeña proporción (4%), la alfa-sinucleína fibrilar se estima que está fosforilada en un 80%, y los anticuerpos para pS129 alfa-sinucleína detectan los agregados más pequeños.
En el fluido intersticial del cerebro, en el fluido cerebroespinal (CSF) y en la sangre se encuentran pequeñas cantidades de alfa-sinucleína extracelularmente. El origen de esta alfa-sinucleína no está claro, pero probablemente es liberada por células, tanto de cuerpos celulares como de sinapsis, por ejemplo durante la liberación sináptica cuando se activan las células neuronales. Una parte también es probable que proceda de células enfermas y muertas. La alfa-sinucleína también se encuentra en muchas células sanguíneas y plaquetas, que son una fuente probable de la alfa-sinucleína en sangre. Una pequeña proporción de alfa-sinucleína se secretada en los exosomas, mientras que la mayor parte de la alfa-sinucleína del fluido extracelular se encuentra en forma de proteína libre no asociada con exosomas.
Existe una necesidad de mejores herramientas diagnósticas para identificar pacientes en etapas tempranas de una enfermedad neurodegenerativa con patología de a-sinucleína. Existen evidencias de que el proceso neurodegenerativo comienza años, quizás 10-20 años, antes del diagnóstico clínico. El trastorno de comportamiento de sueño REM (RBD) es reconocido actualmente como la etapa prodrómica de una a-sinucleinopatía. La mayoría de las personas con RDB pasarán a PD o DLB durante los siguientes 20 años desde el diagnóstico del RBD. Otros signos de la etapa prodrómica de la alfa-sinucleinopatía incluyen la pérdida del olfato.
Hoy día no existen métodos bioquímicos para ayudar en un diagnóstico clínico antes de que los síntomas motores sean evidentes. En ese punto, probablemente ya se ha producido un daño cerebral sustancial. La importancia de los ensayos diagnósticos precisos se hará cada vez mayor según vayan emergiendo nuevas terapias modificadoras de la enfermedad, que con suerte detendrán o frenarán la progresión de la enfermedad.
Se dispone de varios ensayos para medir la alfa-sinucleína total, y algunos de ellos han sido validados o se están validando en estudios clínicos de gran tamaño (Goldman et al., 2017). Estos estudios han demostrado que una pequeña disminución de la alfa-sinucleína total en el CSF está asociada a la enfermedad de Parkinson. También existen varios ensayos exploratorios para medir algunos tipos de formas oligoméricas de alfa-sinucleína, y de formas fosforiladas en la Serina-129 (Majbour et al., 2016a), y los datos preliminares sugieren que estas especies pueden aumentar en el CSF de PD. Sin embargo, nuevamente la diferencia entre los niveles de los pacientes y de los controles son pequeños y existe una gran variabilidad entre individuos. Todos los ensayos actuales adolecen de dicha pequeña diferencia y de la variación entre individuos, lo que hace que estos ensayos no sean útiles para ayudar en el diagnóstico de enfermedades con agregación de alfa-sinucleína. En definitiva, las evidencias actuales sugieren que la a-sinucleína
total en CSF está reducida en PD y que las subespecies de oligómeros de a-sinucleína, o de alfa-sinucleína fosforilada, pueden distinguir la PD de los controles.
La medición de alfa-sinucleína en fluidos biológicos periféricos, plasma sanguíneo y saliva, ha dado lugar a resultados incluso más variables que en el CSF. En el último estudio grande, los niveles en plasma y saliva de a-sinucleína no diferenciaron significativamente la PD de los participantes de control sanos, y no se observó ninguna correlación significativa de los niveles de a-sinucleína en fluidos biológicos periféricos (plasma y saliva) con los niveles de asinucleína en CSF (Goldman et al., 2017). Por lo tanto, actualmente la a-sinucleína en CSF es de mayor utilidad diagnóstica para la PD que la a-sinucleína periférica. La toma de muestras de CSF es una forma más invasiva de obtención de muestras, y sería beneficioso disponer de un biomarcador plasmático para la PD, si esto fuera posible.
Hongli Zhao et al han descrito el uso de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) para detectar alfa sinucleína en CSF (Zhao et al., 2017).
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar alfa-sinucleinopatías o para monitorizar la respuesta al tratamiento con un medicamento usado para tratar alfa-sinucleinopatías a través de la detección de alfasinucleína en una muestra de un sujeto que comprende las etapas de:
a) proporcionar una muestra obtenida de un sujeto,
b) aplicar la muestra a un ensayo de luminiscencia, y
c) opcionalmente, comparar los resultados con un control,
donde dicha muestra es una muestra sanguínea, una muestra de plasma o una muestra de suero, y donde el ensayo de luminiscencia emplea Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) en la que dos fluoróforos diferentes son ligados a dos anticuerpos que se unen a la alfa-sinucleína o a la pS129 (fosfoserina 129) de la alfa-sinucleína, donde uno de los fluoróforos usados presenta un mayor tiempo de fluorescencia (donante) que el otro fluoróforo usado (aceptor).
El método in vitro de la invención puede usarse para detectar alfa-sinucleína agregada en una muestra, donde el ensayo de luminiscencia emplea dos anticuerpos de alfa-sinucleína idénticos que se unen a la alfa-sinucleína.
El método in vitro de la invención puede usarse para detectar alfa-sinucleína fosforilada en una muestra, donde el ensayo de luminiscencia emplea dos anticuerpos de alfa-sinucleína diferentes, donde un anticuerpo se une en los residuos 120-140 de la alfa-sinucleína y el otro anticuerpo se une a la pS129 de la alfa-sinucleína.
En una realización del método in vitro de la invención, el fluoróforo donante se selecciona entre Lumi4-Tb (criptato de Tb2+) o criptato de Europio (criptato de Eu3+).
En otra realización del método in vitro de la invención, el fluoróforo aceptor se selecciona entre d2, XL665 o fluoresceína.
El método in vitro según la invención, donde el sujeto es un humano.
Figuras
Figura 1: muestra mediciones realizadas usando un dispositivo PHERAstar FSX, que permite la medición simultánea de las emisiones a 620 nm (criptato de Tb - donante) y a 665 nm (d2 - aceptor). Para cada pocillo se calcula la ratio de 665/620*10000. La tasa de transferencia de energía relativa, Delta F %, se calcula usando la ratio y puede normalizarse respecto a la concentración de proteína. El gráfico de columnas muestra la Delta F % normalizada a proteína para cada una de las muestras de plasma (diluidas ocho veces) medidas usando tanto el kit n°1 como el kit n°2 (que detecta alfa-sinucleína agregada). Existe una clara distinción entre los tres pacientes de PD y los tres controles sanos. Esta muestra que existe un nivel significativamente alto de alfa-sinucleína agregada en el plasma de los pacientes de PD, y que este método se puede usar para identificar y diagnosticar y monitorizar la progresión de la enfermedad en pacientes de PD basándose en una muestra sanguínea.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar un ensayo de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) para uso en métodos diagnósticos para trastornos relacionados con alfa-sinucleína, es decir, alfa-sinucleinopatías donde la acumulación de alfa-sinucleína insoluble agregada en forma de cuerpos de Lewy, neuritas de Lewy y pequeñas inclusiones sinápticas, está presente en el cerebro. Dichos trastornos incluyen, aunque sin limitación, uno o más trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Parkinson con demencia (PDD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), la atrofia sistémica múltiple (MSA), y el trastorno de comportamiento de sueño REM (RBD) y otros trastornos neurodegenerativos con patología de alfa-sinucleína.
La presente invención proporciona un nuevo uso para dos ensayos de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET), uno basado en alfa-sinucleína agregada y otro basado en alfasinucleína fosforilada. Ambos ensayos muestran un incremento grande de los niveles en plasma entre pacientes de PD e individuos de control (Figura 1).
La respuesta al tratamiento de un tratamiento con anticuerpos para alfa-sinucleinopatías puede evaluarse midiendo el nivel de alfa-sinucleína en sangre, plasma o suero de los pacientes.
La evaluación puede realizarse antes del tratamiento con anticuerpos (p.ej., cuando se diagnostica al paciente) o después de 1, 2, 3, 4 o más tratamientos, Por ejemplo, el método, según una realización, también puede usarse para monitorizar la respuesta a tratamiento del tratamiento con anticuerpos y la progresión de la enfermedad.
El ensayo comprende las etapas de:
a. Aplicar una muestra de sangre, plasma o suero de un paciente a un ensayo de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) en condiciones de unión apropiadas, donde el ensayo de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) emplea dos fluoróforos diferentes ligados a dos anticuerpos que se unen a alfa-sinucleína o a la pS129 (fosfo-serina 129) de la alfa-sinucleína, donde uno de los fluoróforos usados presenta un mayor tiempo de fluorescencia (donante) que el otro fluoróforo usado (aceptor), y
b. si es aplicable, comparar los datos con un control procedente de una persona que no padece la enfermedad de Parkinson, o por ejemplo comparar los datos con los datos obtenidos en un punto temporal diferente (anterior) de la misma persona, monitorizando así la progresión de la enfermedad.
Basándose en el resultado se puede determinar si el paciente debe continuar el tratamiento o no, o en caso de haber sido diagnosticado si el paciente debe iniciar el tratamiento. Por ejemplo, si los datos obtenidos mediante el ensayo muestran más alfa-sinucleína presente en comparación con el control, se puede recomendar continuar o iniciar el tratamiento.
La diferencia entre el control y el paciente puede ser de dos veces, tres veces o cuatro veces o más. Tal como se muestra en la Figura 1, el control es muy bajo y por tanto se puede obtener un resultado positivo descontando el ruido de fondo.
El ensayo es un ensayo basado en HTRF (Fluorescencia Resuelta en el Tiempo Homogénea). Esta tecnología combina la tecnología de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) con una medición resuelta en el tiempo (TR) (Degorce et al., 2009, Current Chemical Genomics 3, 22-32). En los ensayos de TR-FRET, se genera una señal a través de una transferencia de energía de resonancia fluorescente entre un donante y una molécula aceptora (p.ej., acoplada a un anticuerpo) cuando se encuentra en estrecha proximidad uno respecto a la otra.
La tecnología HTRF puede emplear criptato de Europio como donante de fluorescencia para monitorizar reacciones entre biomoléculas tales como anticuerpos o criptato de Terbio (Tb). Los ejemplos incluyen criptato de Europio (criptato de Eu3+) y Lumi4-Tb (criptato de Tb2+).
Un aceptor desarrollado para HTRF puede ser el XL665, un pigmento de ficobiliproteína purificado a partir de algas rojas. El XL665 es una construcción grande heterohexamérica de 105 kDa, reticulado tras aislamiento para mejorar la estabilidad y la conservación de sus propiedades foto-físicas en ensayos de HTRF. Un tipo de aceptor que posee una serie de propiedades foto-físicas muy similares a las del XL665, aunque caracterizado por estructuras orgánicas que son 100 veces más pequeñas que el XL665, es, p.ej., el quelato o criptato de tierras raras. El uso de entidades más pequeñas solventa los problemas de impedimentos estéricos que se atribuyen a veces a los sistemas de TR-FRET basados en XL665. Estos aceptores del infrarrojo cercano también son particularmente adecuados para ensayos homogéneos, ya que su emisión es menos probable que se vea alterada por la autofluorescencia intrínseca del medio o del compuesto que se produce en los típicos procesos de evaluación de compuestos. Las propiedades de estos aceptores rojos también los hacen adecuados para el acoplamiento con criptato de Terbio. Además, debido a picos adicionales en su espectro de emisión, el criptato de Terbio puede acoplarse a aceptores verdes tales como la fluoresceína, que emiten en el rango de 520 nm, que por ejemplo pueden permitir el diseño de ensayos múltiples con dos lecturas. En particular, se puede usar de forma ventajosa un compuesto fluorescente tal como un quelato o criptato de tierras raras, especialmente un quelato o criptato de terbio, europio, disprosio, samario o neodimio. Preferiblemente se usará un criptato de terbio o europio.
En los métodos fluorescentes de detección y/o determinación que usan el método de medición de la invención, se elegirá de forma ventajosa un criptato de tierras raras descrito en las solicitudes de Patente Europeas EP 180492 y EP 321 353.
Se usará preferiblemente el criptato de terbio trisbipiridina de Tb o el criptato de europio trisbipiridina de Eu, tal como se describen en la solicitud de Patente Europea EP 180 492, o los criptatos trisbipiridinadiamina de Eu y trisbipiridinadiamina de Tb, descritos en la solicitud de Patente Europea EP 321 353.
Según una característica ventajosa, el compuesto donante fluorescente es un criptato de europio y el compuesto aceptor fluorescente se selecciona entre d2, aloficocianina, aloficocianina B, ficocianina C o ficocianina R.
También es posible usar un compuesto fosforescente, tal como eosina o eritrosina, como donante luminiscente. En este caso, será ventajoso usar un compuesto aceptor fluorescente seleccionado entre clorofilas tales como las mencionadas en las solicitudes de Patente Europea EP 71991 y EP 314406, o porfirinas tales como las mencionadas en la solicitud de Patente Europea EP 71 991, o bien ftalocianinas tales como las de la solicitud de Patente Internacional WO 8804777.
Según otra característica de la invención, el ensayo de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) para detectar y/o determinar alfa-sinucleína en una muestra de sangre, plasma o suero comprende las etapas de:
1) añadir, a dicha muestra que contiene alfa-sinucleína procedente del paciente o sujeto, un primer anticuerpo contra alfa-sinucleína, acoplado a un donante luminiscente,
2) añadir un segundo anticuerpo de alfa-sinucleína acoplado a un aceptor luminiscente,
3) incubar dicho medio después de la adición de los reactivos,
4) excitar el medio resultante a la longitud de onda de excitación del donante luminiscente, y
5) medir la señal del donante luminiscente a una longitud de onda (sirviendo esta medida como referencia), y la señal resultante de la transferencia de energía a una longitud de onda diferente.
Según una realización, se pretende un ensayo para la detección de la agregación de alfa-sinucleína usando la tecnología HTRF. La alfa-sinucleína agregada se detecta usando anticuerpos monoclonales de alfa-sinucleína específicos, marcados con un donante tal como criptato de Tb o con un aceptor. Cuando los colorantes se encuentran en estrecha proximidad, la excitación del donante con una fuente de luz (láser o lámpara flash) activa una transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) hacia el aceptor, que a su vez genera fluorescencia a una longitud de onda específica (665 nm). El anticuerpo marcado con aceptor o Tb se une a alfa-sinucleína. Cuando la alfa-sinucleína se agrega, el anticuerpo marcado con aceptor o Tb pasa a estar en estrecha proximidad generando la FRET. La intensidad de señal es proporcional al número de agregados formados.
La monitorización de la agregación de alfa-sinucleína es de gran interés para estudiar la patogénesis de las sinucleinopatías, un grupo de enfermedades neurodegenerativas que incluye la enfermedad de Parkinson (PD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), la enfermedad de cuerpos de Lewy difusa (DLBD), y la atrofia sistémica múltiple (MSA). Por consiguiente, el método de la presente invención se puede usar para diagnosticar o monitorizar las enfermedades mencionadas. Alternativamente, el método puede usarse para monitorizar o seguir la respuesta al tratamiento y para adoptar decisiones en relación al tratamiento de los pacientes. En una realización, dicho tratamiento es un tratamiento con anticuerpos de alfa-sinucleína.
Por tanto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar o seguir sinucleinopatías tales como la enfermedad de Parkinson en pacientes, que comprende las etapas de:
a) obtener una muestra del paciente,
b) aplicar la muestra a un ensayo de luminiscencia, tal como se ha descrito anteriormente, y
c) opcionalmente, comparar los resultados con un control,
donde dicha muestra es una muestra de sangre, una muestra de plasma o una muestra de suero, y donde el ensayo de luminiscencia emplea Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) en la que dos fluoróforos diferentes están ligados a dos anticuerpos que se unen a alfa-sinucleína o a la pS129 (fosfoserina 129) de la alfa-sinucleína, donde uno de los fluoróforos usados presenta un mayor tiempo de fluorescencia (donante) que el otro fluoróforo usado (aceptor).
Los anticuerpos usados son anticuerpos de alfa-sinucleína ligados a fluoróforo. El fluoróforo usado presenta un mayor tiempo de fluorescencia (donante) que el otro fluoróforo usado (aceptor). El donante se selecciona preferiblemente entre Lumi4-Tb (criptato de Tb2+) o criptato de Europio (criptato de Eu3+), y el aceptor preferiblemente se selecciona entre d2, XL665 o fluoresceína.
La proximidad entre el donante y el aceptor se determina detectando el nivel de transferencia de energía, midiendo la emisión de fluorescencia, preferiblemente a dos longitudes de onda diferentes (tal como 665 nm y 620 nm) en un lector compatible.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “alfa-sinucleína” es sinónimo de “ la proteína de alfa-sinucleína” y se refiere a cualquiera las isoformas de la proteína de alfa-sinucleína (identificadas, por ejemplo, en UniProt como P37840, 1-3). La numeración de aminoácidos de la alfa-sinucleína se proporciona en relación a la secuencia mostrada a continuación, siendo metionina (M) el resido de aminoácido 1 (SEQ ID NO: 1):
MDVFMKGLSK AKEGWAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV
GSKTKEGWH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP
DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
Los anticuerpos de alfa-sinucleína, en algunas realizaciones, pueden unirse a los residuos C-terminales entre 120 140 de la alfa-sinucleína o la pS129 de la alfa-sinucleína
Ejemplo
Este ensayo puede usarse para identificar, diagnosticar y monitorizar pacientes que padecen una alfa sinucleinopatía, p.ej., enfermedad de Parkinson, usando una muestra sanguínea.
Principio del ensayo:
Este ensayo se basa en el uso de la tecnología de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET).
La FRET se basa en la transferencia de energía entre dos colorantes, un donante y un aceptor. Cuando el donante es excitado, transfiere energía al aceptor, que a su vez emite una fluorescencia que es medida. Esto solo es posible si los colorantes están muy próximos uno al otro. Los estudios FRET normales están limitados por la fluorescencia de fondo, que es extremadamente transitoria. Esto puede solventarse combinando mediciones resueltas en el tiempo con la FRET para evitar el ruido de fondo y la fluorescencia no específico. Asimismo, los aceptores en la TR-FRET se diseñan para emitir fluorescencia de vida larga cuando están implicados en la FRET.
En el kit de agregación de alfa sinucleína, un anticuerpo monoclonal específico es marcado con una molécula de donante o de aceptor. En el kit de fosfo-sinucleína (S129P), se usan dos anticuerpos, uno es un anticuerpo de alfasinucleína y el otro es un anticuerpo específico de fosfo-sinucleína (S129P), donde uno de los anticuerpos es marcado con un colorante donante y el otro con un colorante aceptor. Cuando los anticuerpos (marcados con colorantes donantes y aceptores) se unen a los agregados de alfa-sinucleína humana, se disponen en una estrecha proximidad uno respecto del otro y generan FRET tras excitación.
Pacientes
Los pacientes fueron reclutados de la clínica de pacientes externos del Departamento de Neurología, Hospitales Bispebjerg-Frederiksberg. El diagnóstico clínico para PD se definió según los criterios diagnósticos clínicos del “UK Parkinson's Disease Society Brain Bank”. Los pacientes fueron incluidos consecutivamente y se realizó un seguimiento clínico para todos los pacientes. En el seguimiento, solo fueron aceptados en el estudio los pacientes que cumplían los criterios diagnósticos para un diagnóstico de PD definido. Los sujetos del grupo de control estaban libres de enfermedades que pudieran afectar al sistema nervioso central.
Muestras de plasma
Se extrajo sangre venosa en las respectivas clínicas y se procesó el mismo día en el “Bispebjerg Movement Disorders Biobank”, Copenhague, Dinamarca. Todas las muestras de plasma fueron recolectadas a inclusión. Las muestras fueron recolectadas en tubos de polipropileno recubierto de EDTA, y se centrifugaron a 2000 x g durante 10 minutos a 4°C; el plasma sobrenadante se dividió a continuación en alícuotas y se almacenó en tubos de polipropileno (PP) de 400 pL a -80°C hasta el día del análisis, cuando se descongelaron en hielo durante 30 minutos.
Ejemplo 1
Se analizaron las muestras procedentes de los pacientes (3x controles y 3x pacientes de PD). Se usaron dos kits comerciales de Cisbio, el kit de agregación de alfa-sinucleína (Kit n°1) y un kit de fosfo-sinucleína (Kit n°2), para comparar las muestras. Cada muestra fue evaluada en tres diluciones diferentes. Las muestras fueron diluidas en el tampón proporcionado con los kits y se pipetearon a una placa de 386 pocillos por duplicado. Se añade la mezcla de anticuerpos al pocillo y se incuba a temperatura ambiente. Se incluyen en la placa controles positivos y negativos.
Las mediciones se realizaron usando un dispositivo PHERAstar FSX, que permite la medida simultánea de las emisiones a 620 nm (criptato de Tb - donante) y a 665 nm (d2 - aceptor). Para cada pocillo se calcula la ratio de 665/620*10000. La tasa de transferencia de energía relativa, Delta F %, se calcula usando la ratio y puede normalizarse respecto a la concentración de proteína. El gráfico de columnas muestra la Delta F % normalizada a proteína para cada una de las muestras (diluidas ocho veces) medida usando el kit n°1 y el kit n°2. Existe una clara distinción entre los tres pacientes de PD y los tres controles sanos. Este ejemplo muestra que existe un nivel significativamente elevado de alfa-sinucleína agregada y de fosfo-sinucleína en el plasma de los pacientes de PD, y que este método puede usarse para identificar y diagnosticar casos de PD basándose en una muestra de sangre.
Claims (6)
1. Un método in vitro para diagnosticar alfa-sinucleinopatías o para monitorizar la respuesta al tratamiento con un medicamento usado para tratar alfa-sinucleinopatías a través de la detección de alfa-sinucleína en una muestra de un sujeto que comprende las etapas de:
a) proporcionar una muestra obtenida de un sujeto,
b) aplicar la muestra a un ensayo de luminiscencia, y
c) opcionalmente, comparar los resultados con un control,
donde dicha muestra es una muestra sanguínea, una muestra de plasma o una muestra de suero, y donde el ensayo de luminiscencia emplea Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente Resuelta en el Tiempo (TR-FRET) en la que dos fluoróforos diferentes son ligados a dos anticuerpos que se unen a la alfa-sinucleína o a la pS129 (fosfoserina 129) de la alfa-sinucleína (con la numeración de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1), donde uno de los fluoróforos usados presenta un mayor tiempo de fluorescencia (donante) que el otro fluoróforo usado (aceptor).
2. El método in vitro según la reivindicación 1 para detectar alfa-sinucleína agregada en una muestra, donde el ensayo de luminiscencia emplea dos anticuerpos de alfa-sinucleína idénticos que se unen a la alfa-sinucleína.
3. El método in vitro según la reivindicación 1 para detectar alfa-sinucleína fosforilada en una muestra, donde el ensayo de luminiscencia emplea dos anticuerpos de alfa-sinucleína diferentes, donde un anticuerpo se une en los residuos 120-140 de la alfa-sinucleína y el otro anticuerpo se une a la pS129 de la alfa-sinucleína.
4. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el fluoróforo donante se selecciona entre Lumi4-Tb (criptato de Tb2+) o criptato de Europio (criptato de Eu3+).
5. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el fluoróforo aceptor se selecciona entre d2, XL665 o fluoresceína.
6. El método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sujeto es un humano.
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