JP2006522589A - 被験体の細胞において生物学的標的を不活性化する試験化合物の能力を測定する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、被験体にインビボで投与される場合、生物学的標的のインヒビターである化合物（「試験化合物」）が目的の生物学的コンパートメントにおいて生物学的標的を阻害する能力を評価する方法を提供する。被験体の細胞において試験化合物が生物学的標的を不活性化する能力を測定する方法であって、以下の工程：（ａ）試験化合物を被験体に投与して、試験化合物と反応する、被験体の身体中の生物学的標的が不活性化され、試験化合物と反応しない生物学的標的は遊離のままである、工程；（ｂ）１つ以上の細胞種を含む生物学的サンプルを被験体から除去する工程；（ｃ）生物学的サンプル又はそれらのフラクション内の遊離の生物学的標的の量を決定する工程；及び（ｄ）工程（ｃ）において決定される量とコントロールサンプル中の遊離の生物学的標的の量とを比較する工程を含む、方法。

Description

（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願番号第６０／４６０，９２０号（２００３年４月７日出願）に対する優先権を請求し、この内容全体は本明細書中に参考として組み込まれる。

（発明の背景）
薬物開発のプロセスはしばしば、生物学的標的分子に結合し、生物学的標的分子の活性を調整する化合物の同定に関係する。例えば、標的のためのリガンドとしての初期スクリーニングによって同定される化合物を、次いで、インビトロでの細胞ベースのアッセイ又は細胞を含まないアッセイにおいてそれらの化合物が標的の活性を調整する能力について評価することができる。しかし、候補薬物のインビトロ活性はほとんどの場合において直接的に決定されるが、被験体にインビボで投与される場合、候補薬物が目的の生物学的コンパートメントにおける標的に影響を与える能力を決定するのは非常に困難である。しかし、このような情報は、適切な用量及び候補薬物の投薬スケジュールを決定し、生物学的標的と観察された臨床効果との影響を関係付けるために特に高価値であり得る。

現在、目的の生物学的標的の１つは種々のタンパク質からのＮ−末端メチオニン残基の翻訳後開裂を触媒する酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ−２である。この酵素は、真菌代謝物フマギリンの分子標的であり、種々のアナログと共に、内皮細胞の増殖及び分裂を停止し、抗血管形成活性を有することが示された。それ故に、メチオニンアミノペプチダーゼ−２は、異常性血管形成と関連する疾患、例えば固体腫瘍を処置するために使用可能な化合物の開発のための分子標的として目的のものである。

メチオニンアミノペプチダーゼ−２及び治療薬剤として他の生物学的標的を阻害する化合物の開発は、分子標的に対するこのような化合物のインビボ効果を測定する方法によって補助される。従って、標的組織において、インビボで投与される生物学的標的のインヒビターの、生物学的標的、例えば、メチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性に対する影響を決定する方法が必要とされる。

（発明の概要）
本発明は、被験体にインビボで投与される場合、生物学的標的のインヒビターである化合物（「試験化合物」）が目的の生物学的コンパートメントにおいて生物学的標的を阻害する能力を評価する方法を提供する。特に、本方法は、試験化合物によって不活性化されない、生物学的サンプルにおける生物学的標的の量又はフラクションの決定を可能にする。本方法は、以下の工程：（１）試験化合物を被験体に投与して、試験化合物と反応する被験体の身体中の生物学的標的が不活性化され、試験化合物と反応しない生物学的標的は遊離のままである、工程と；（２）１つ以上の細胞種を含む生物学的サンプルを被験体から除去する工程と；（３）生物学的サンプル又はそれらのフラクション中の遊離の生物学的標的の量を決定する工程と；及び、場合により、（４）工程（３）において決定される量とコントロールサンプル中の遊離の生物学的標的の量とを比較する工程とを含む。コントロールサンプルにおいて決定される量と比較した場合の工程（３）において決定される遊離の生物学的標的の量の減少は、生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおける不活性化された生物学的標的の量の測定値を与える。

１つの実施形態では、生物学的標的はメチオニンアミノペプチダーゼ−２（以下、「ＭｅｔＡＰ−２」とも称される）であり、本発明は、被験体にインビボで投与される場合、ＭｅｔＡＰ−２のインヒビターである試験化合物が目的の生物学的コンパートメントにおいてＭｅｔＡＰ−２活性を阻害する能力を評価する方法を提供する。特に、本方法は、試験化合物によって不活性化されない、生物学的サンプルにおけるＭｅｔＡＰ−２の量又はフラクションの決定を可能にする。本方法は、以下の工程：（１）試験化合物を被験体に投与して、被験体の身体中の、試験化合物と反応するＭｅｔＡＰ−２は不活性化されたＭｅｔＡＰ−２であり、試験化合物と反応しないＭｅｔＡＰ−２は遊離のＭｅｔＡＰ−２である、工程と；（２）１つ以上の細胞種を含む生物学的サンプルを被験体から除去する工程と；（３）生物学的サンプル又はそれらのフラクション内の遊離のＭｅｔＡＰ−２の量を決定する工程と；及び、場合により、（４）工程（３）において決定される量とコントロールサンプル中の遊離のＭｅｔＡＰ−２の量とを比較する工程とを含む。コントロールサンプルにおいて決定される量と比較した場合の工程（３）において決定される遊離のＭｅｔＡＰ−２の量の減少は、生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおける不活性化されたＭｅｔＡＰ−２の量の測定値を与える。

１つの実施形態では、生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおける遊離の生物学的標的、例えばＭｅｔＡＰ−２の量が、以下の工程：（ｉ）生物学的サンプル又はそれらのフラクションと生物学的標的の飽和量の定量可能な不可逆インヒビターとを接触させて、遊離の生物学的標的の実質的に全てが定量可能な不可逆生物学的標的インヒビターと反応して標的／インヒビター複合体を形成する工程と；及び工程（ｉ）において形成される標的／インヒビター複合体の量を決定する工程とを含む方法によって決定される。

試験化合物は、生物学的標的のインヒビターであるか、そうであると考えられる任意の化合物であることができる。好ましくは、試験化合物は、インビトロアッセイにおいて、例えば、細胞ベースのアッセイ又は細胞を含まないアッセイにおいて、生物学的標的のインヒビターであることが示されている。試験化合物は、好ましくは、生物学的標的の活性部位に指向するインヒビターである化合物であるか、又は生物学的分子の生物学的に関連するリガンド結合部位に結合する化合物である。試験化合物はさらに、例えば、アロステリック効果を介して、活性部位以外の部位で生物学的標的に結合することによって、生物学的標的を阻害する化合物であることができる。

別の実施形態では、本発明は、生物学的サンプルにおいて、生物学的標的、例えばＭｅｔＡＰ−２の不可逆インヒビターの量を決定するための方法を提供する。本方法は、以下の工程：（１）生物学的サンプルと飽和量の生物学的標的とを接触させて、生物学的標的の不可逆インヒビターの実質的に全てが、生物学的標的と反応して生物学的標的を不活性化させ、不可逆インヒビターと反応しない生物学的標的は遊離の生物学的標的である、工程と；（２）遊離の生物学的標的の量を決定する工程と；及び（３）遊離の生物学的標的の量と工程（１）において添加される生物学的標的の量とを比較する工程とを含み、工程（１）において測定される量と比較した場合の工程（２）において測定される量の減少は、生物学的サンプル中の不可逆インヒビターの量の測定値を与える。

別の実施形態では、上記工程（３）は、遊離の生物学的標的の量と、コントロール生物学的サンプル中の遊離の生物学的標的の量とを比較する工程によって置換される。コントロール生物学的サンプルは、生物学的サンプルと同一のサンプルであるが、被験体から誘導されるか、又は不可逆インヒビターが投与されないインビトロ系から誘導される。コントロール生物学的サンプルはさらに、上述の方法の工程（１）と実質的に同一の様式で生物学的標的と接触する。

１つの実施形態では、遊離の生物学的標的の量は、生物学的サンプル中の生物学的標的の活性を測定することによって決定される。別の実施形態では、遊離の生物学的標的の量は、以下の工程：（ｉ）生物学的サンプルと生物学的標的の飽和量の不可逆の定量可能なインヒビターとを接触させて、遊離の生物学的標的の実質的に全てが不可逆の定量可能なインヒビターと反応して標的／インヒビター複合体を形成する工程と；及び、（ｉｉ）工程（ｉ）において作製される標的／インヒビター複合体の量を決定する工程とを含む方法によって決定される。工程（ｉ）においてサンプルに添加される酵素の量と比較した場合に、形成される複合体の量の減少は、不活性化された生物学的標的の量の測定値であり、従って、生物学的サンプル中の不可逆インヒビターの量の測定値である。

（発明の詳細な説明）
本発明は、被験体の特定の組織又は細胞の集合又は他の生物学的コンパートメントにおける生物学的標的の活性レベルについて、インビボで被験体に投与される試験化合物の効果を決定するための方法を提供する。特定的には、本方法は、特定の生物学的コンパートメント又は細胞種内での試験化合物による生物学的標的の不活性化度を決定することができる。本方法は、例えば、目的の組織又は細胞種内で試験化合物が生物学的標的の活性を阻害する能力を評価するために使用することができる。この情報は、インビボで生物学的標的の効果的なインヒビターである化合物を同定するための使用することができる。本方法はさらに、被験体、例えば、生物学的標的のインヒビターで処置可能な状態を患う患者の特定の試験化合物、例えば、薬物又は候補薬物である試験化合物に対する応答を評価するために使用することができる。本方法はさらに、インビボでの試験化合物の異なる投与経路を評価するために、及び／又は試験化合物の投薬量及び頻度を最適化するために使用することができる。

第１の実施形態では、本発明の方法は以下の工程を含む：（１）試験化合物を被験体に投与して、試験化合物と反応する、被験体の身体中の生物学的標的が不活性化され、試験化合物と反応しない生物学的標的は遊離のままである、工程と；（２）１つ以上の細胞種を含む生物学的サンプルを被験体から除去する工程と；（３）生物学的サンプル又はそれらのフラクション内の遊離の生物学的標的の量を決定する工程と；及び、場合により、（４）工程（３）において決定される量とコントロールサンプル中の遊離の生物学的標的の量とを比較する工程。

生物学的標的は、薬学治療の標的又は潜在的な標的である任意の生物学的分子であることができる。例えば、生物学的標的は、疾患の開始又は進行にかかわる生物学的分子であることができる。生物学的標的は、例えば、ペプチド、タンパク質又は核酸であることができる。好ましくは、生物学的標的はタンパク質である。例えば、生物学的標的はサイトカイン；レセプター、例えば、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４を含むＧ−タンパク質共役型レセプター、ソマトスタチンレセプター、及びＧｎＲＨレセプター；核転写因子、例えばアンドロゲンレセプター、エストロゲンレセプター、ＮＦｋＢ又はＮＦＡＴ；レセプターキナーゼ、例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、インスリン様増殖因子レセプター及びＨｅｒ−２／Ｎｅｕ；ポリＤＮＡ分子、又はＲＮＡ分子であることができる。他の好適な生物学的標的としては、酵素、例えば、キナーゼ、例えば、チロシンキナーゼ又はセリン／スレオニンキナーゼ；チミジレートシンターゼ；シクロオキシゲナーゼ、例えば、プロスタグランジンＧシンターゼ、プロスタグランジンＨシンターゼ；プロテアーゼ、例えば、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン；及びペニシリン結合タンパク質が挙げられる。好ましい実施形態では、生物学的標的はＭｅｔＡＰ−２である。

本発明の目的のために、化合物は、生物学的標的と結合する場合、生物学的標的「と反応する」。化合物は、化合物と標的との間の共有結合の形成を介して標的と結合することができるか、又は、例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、極性相互作用、水素結合、又はこれらの種類の相互作用の２つ以上の組み合わせを介して、非共有結合することができる。

１つの実施形態では、遊離の生物学的標的の量は、アッセイ、例えば、活性アッセイ又は結合アッセイを用いて測定される。例えば、レセプターがその内因性リガンドに結合する能力は、サンプル中の遊離のレセプターの量を決定するために使用することができる。生物学的標的が酵素である場合、例えば、サンプルの酵素活性はさらに、標準的な活性アッセイを用いて決定することができる。

別の実施形態では、生物学的サンプル中の遊離の生物学的標的の量を決定する工程（工程（３））は、以下の工程：（ｉ）生物学的サンプル又はそれらのフラクションと生物学的標的の飽和量の定量可能な不可逆インヒビターとを接触させて、遊離の生物学的標的の実質的に全てが定量可能な不可逆生物学的標的インヒビターと反応して標的／インヒビター複合体を形成する工程と；及び（ｉｉ）工程（ｉ）において形成される標的／インヒビター複合体の量を決定する工程とを含む方法によって達成される。この実施形態では、工程（３）において決定される遊離の生物学的標的の量とコントロールサンプル中の遊離の生物学的標的の量とを比較する工程（工程（４））は、工程（ｉｉ）において決定される標的／インヒビター複合体の量とコントロール生物学的サンプル中で形成される標的／インヒビター複合体の量とを比較する工程を含む方法によって達成され、ここで、コントロール生物学的サンプルにおいて形成される量と比較した場合の工程（ｉｉ）において決定される標的／インヒビター複合体の量の減少は、生物学的サンプル中の生物学的標的の不活性化度の測定値を与える。

好ましい実施形態では、本発明は、被験体にインビボで投与される場合、被験体中の１つ以上の細胞種において試験化合物がＭｅｔＡＰ−２を不活性化する能力を測定する方法を提供する。本方法は、以下の工程：（１）試験化合物を被験体に投与して、被験体の身体において試験化合物と反応するＭｅｔＡＰ−２が不活性化されたＭｅｔＡＰ−２であり、試験化合物と反応しないＭｅｔＡＰ−２が遊離のＭｅｔＡＰ−２である、工程と；（２）被験体から生物学的サンプルを除去する工程であって、ここで、生物学的サンプルが１つ以上の種類の細胞を含む、工程と；（３）生物学的サンプル又はそれらのフラクション中の遊離のＭｅｔＡＰ−２の量を決定する工程と；及び、場合により（４）工程（３）において決定される遊離のＭｅｔＡＰ−２の量とコントロールサンプルにおいて決定される遊離のＭｅｔＡＰ−２の量とを比較する工程とを含む。

１つの実施形態では、生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおける遊離のＭｅｔＡＰ−２の量は、サンプル中のＭｅｔＡＰ−２酵素活性を測定することによって決定される。酵素活性と存在する活性酵素の量との相関関係が与えられ、遊離の酵素の量がこの様式で決定されてもよい。ＭｅｔＡＰ−２活性を測定するための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，２６１，７９４号（本明細書にその全体が参考として組み込まれる）中に教示される方法が挙げられる。

別の実施形態では、生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおける遊離のＭｅｔＡＰ−２の量は、以下の工程：（ｉ）生物学的サンプルまたはそのフラクションと飽和量の定量可能な不可逆ＭｅｔＡＰ−２インヒビターとを接触させて、生物学的サンプル中の遊離のＭｅｔＡＰ−２の実質的に全てが定量可能な不可逆Ｍｅｔａｐ−２インヒビターと反応してＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体を形成する工程と；及び（ｉｉ）工程（ｉ）において作製されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量を決定する工程とを含む方法によって決定される。工程（ｉｉ）において決定される量は、コントロール生物学的サンプルにおいて形成されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量と比較することができ、ここで、コントロール生物学的サンプルにおいて形成される量と比較した場合の工程（ｉｉ）において決定されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量の減少は、生物学的サンプル中のＭｅｔＡＰ−２の不活性化度の測定値を与える。

本方法では、試験化合物は任意の好適な経路によって被験体に投与することができる。試験化合物が目的の生物学的コンパートメント内でＭｅｔＡＰ−２分子のフラクションを不活性化する場合、この生物学的コンパートメントは不活性化されたＭｅｔＡＰ−２分子を含み、試験化合物がコンパートメント中のいずれのＭｅｔＡＰ−２分子も不活性化しない場合、生物学的コンパートメントは遊離のＭｅｔＡＰ−２を含む。「不活性化されたＭｅｔＡＰ−２」は、本明細書でこの用語が使用される場合、試験化合物と反応し、それ故に、定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターと反応することができないＭｅｔＡＰ−２を指す。「遊離のＭｅｔＡＰ−２」は、本明細書でこの用語が使用される場合、試験化合物との反応によって不活性化されず、それにより、定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターを反応することが可能なＭｅｔＡＰ−２分子を指す。遊離のＭｅｔＡＰ−２と不可逆の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターとの反応は、ＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体を作製する。次いで、形成されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量が決定され、場合により、コントロールサンプルにおいて形成される複合体の量と比較される。コントロールと比較した場合の試験化合物の投与後に形成される複合体の量の減少は、不活性化されたＭｅｔＡＰ−２が試験サンプル中に存在するためであると考えられ、それによって、ＭｅｔＡＰ−２の不活性化度の測定値を与える。

形成されるこのような複合体の量は、１つの実施形態において、コントロール生物学的サンプル、例えば、試験化合物の投与前に被験体から除去されているが、それ以外は目的の生物学的サンプルとは同一であるサンプル中で形成されるこのような複合体の量と比較することができるか；又は、全ＭｅｔＡＰ−２タンパク質を定量し、サンプル中の全ＭｅｔＡＰ−２を基準として、形成される複合体のフラクションを決定することができる。従って、本方法は、被験体の特定の組織又は細胞種が試験化合物によって不活性化されている、全ＭｅｔＡＰ−２のフラクションを決定することができる。１つの極端な例では、試験化合物のインビボ投与は、生物学的サンプルが誘導される細胞又は組織中のＭｅｔＡＰ−２の実質的に全てを不活性化し、この場合には、形成される複合体の量は、生物学的サンプル中の全ＭｅｔＡＰ−２タンパク質と比較して小さい。他の極端な例では、試験化合物は生物学的サンプルが誘導される細胞又は組織中のＭｅｔＡＰ−２をほとんど又は全く不活性化しない。この状況では、形成される複合体の量は、生物学的サンプル中の全ＭｅｔＡＰ−２タンパク質に近い。

例えば、試験化合物を被験体に投与する前に、コントロール生物学的サンプルは被験体から除去される。コントロール生物学的サンプルは、試験化合物の投与後に除去される生物学的サンプルと同一であり、実質的に同一の様式で加工又はフラクション化される。コントロール生物学的サンプル、又はそれらの適切なフラクションは、定量可能な不可逆ＭｅｔＡＰ−２インヒビターと接触する。次いで、コントロールサンプルにおいて形成されるＭｅｔＡＰ−２−不可逆インヒビター複合体の量が測定され、工程（４）において決定される結果と比較される。コントロール生物学的サンプル又はそれらのフラクションについて測定された量と比較した場合の、試験化合物を投与した後の生物学的サンプル又はそれらのフラクションについて測定される複合体の量の減少は、試験化合物をインビボで投与することによって生物学的サンプル内の全ＭｅｔＡＰ−２の一部分が不活性化した結果であると考えられる。

１つの実施形態では、工程（３）において決定される結果は、試験化合物に暴露されていない１つ以上のコントロール動物から得られた、１つ以上のそれ以外は同一の生物学的サンプルから得られた結果と比較される。生物学的サンプルを除去する前に、好ましくは、試験化合物について使用される同じ投与経路を介して、プラセボ又はビヒクルをコントロール動物に投与することができる。生物学的サンプルは、好ましくは、試験動物から生物学的サンプルを除去及び加工するのと同じ様式で、コントロール動物から除去され、加工される。

別の実施形態では、生物学的サンプル中の全ＭｅｔＡＰ−２が決定され、形成される複合体の量と比較される。サンプル中のＭｅｔＡＰ−２タンパク質の全量は、例えば、ＭｅｔＡＰ−２に特異的な抗体を用いて、及び抗体とタンパク質との間の複合体の量を決定する方法、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定される。一般的に、本明細書中では、サンプル中の全ＭｅｔＡＰ−２タンパク質は不活性化されたＭｅｔＡＰ−２及びＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の合計であると推定される。従って、ＭｅｔＡＰ−２タンパク質の全量と比較した場合に、形成される複合体の量の比較は、試験化合物によって不活性化したＭｅｔＡＰ−２の量の測定値を与える。

別の実施形態では、コントロール生物学的サンプルは、被験体に試験化合物を投与する前に、試験被験体から除去される。この実施形態では、コントロール生物学的サンプルは、好ましくは、試験動物から生物学的サンプルを除去及び加工するのと同じ様式で、被験体から除去され、加工される。コントロール及び試験生物学的サンプルの両方が、飽和量の定量可能なインヒビターに供され、形成される複合体の量が、この２つの場合について比較される。コントロールサンプルにおいて形成される量と比較した場合の試験サンプルにおいて形成される複合体の量の減少は、試験サンプル中のＭｅｔＡＰ−２の試験化合物による不活性化の測定値を与える。

試験化合物は、インビボ阻害活性の評価が望ましい任意の化合物であることができる。好ましくは、試験化合物は、インビトロでその生物学的標的を阻害する能力を有する。

インビトロでのＭｅｔＡＰ−２阻害活性は、当該技術分野で公知の方法、例えば、米国特許第６，２６１，７９４号に開示されるアッセイを用いて決定することができる。ＭｅｔＡＰ−２活性を阻害する種々の化合物は公知である。好適なＭｅｔＡＰ−２インヒビターとしては、米国特許第６，２０７，７０４号；同第６，０６３，８１２号；同第６，０４０，３３７号；同第５，２０４，３４５号；同第５，７８９，４０５号；同第５，１８０，７３５号；同第５，１８０，７３８号；同第５，１６６，１７２号；同第５，１６４，４１０号；及び公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／６１４３２；ＷＯ０２／０５８０４；ＷＯ０２／４２２９５；ＷＯ９９／５９９８７；及びＷＯ９９／５９９８６に記載されるフマギリン誘導体が挙げられる。

好ましくは、試験化合物は、生物学的標的に強固に結合する。より好ましくは、試験化合物は、生物学的標的の不可逆インヒビターである。「不可逆インヒビター」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、生物学的標的を阻害し、アッセイが終了するのに必要な時間と比較して、生物学的標的から解離する速度が遅い化合物である。例えば、試験化合物が生物学的標的から速度ｋで解離する場合、もともと不活性化された生物学的標的の５０％が、約０．６９３０２／ｋ時間、不活性化されたままで残る。従って、アッセイの終了時間ｔが、約０．７／ｋ未満、０．６／ｋ未満、０．５／ｋ未満、０．４／ｋ未満、０．３／ｋ未満、０．２／ｋ未満又は０．１／ｋ未満であることが好ましい。１つの実施形態では、不可逆インヒビターは生物学的標的と反応して共有結合を形成する。

生物学的標的がＭｅｔＡＰ−２である場合、試験化合物は、好ましくは、ＭｅｔＡＰ−２酵素の活性部位と相互作用し、その結果、試験化合物の分子がＭｅｔＡＰ−２の分子と接触すると、酵素の活性部位に試験化合物がとどまり、ＭｅｔＡＰ−２分子と別のインヒビター分子との反応をブロックする。試験化合物はさらに、活性部位以外のＭｅｔＡＰ−２上の部位に結合することによってＭｅｔＡＰ−２を阻害する化合物であることができる。好ましくは、試験化合物は、ＭｅｔＡＰ−２の不可逆インヒビターである。このような化合物は、ＭｅｔＡＰ−２の酵素活性を阻害し、酵素から十分にゆっくりと解離し、その結果、本発明の方法の時間スケールでは、酵素からの解離はほとんどないと予想される。Ｍｅｔａｐ２の好適な不可逆インヒビターとしては、ＭｅｔＡＰ−２の共有結合インヒビターが挙げられる。

「ＭｅｔＡＰ−２の共有結合インヒビター」は、ＭｅｔＡＰ−２分子の活性部位中の官能基と反応してインヒビターと酵素の共有結合を形成する不可逆インヒビターである。ＭｅｔＡＰ−２の共有結合インヒビターの好適な例としては、上に記載されるような、オバリジン、フマギリン、フマギロール及びフマギリンアナログが挙げられる。

「飽和量」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、特定の反応パートナーに対して相対的にモル基準で過剰である化合物の量を指す。例えば、不可逆の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、遊離のＭｅｔＡＰ−２の予定された量よりもモル過剰で存在する場合、飽和量で存在する。不可逆の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、例えば、遊離のＭｅｔＡＰ−２の予定された量の１．１〜１０倍モル過剰で存在することができる。遊離のＭｅｔＡＰ−２の予定された量は、例えば、コントロールサンプル中で形成されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量を用いて決定することができる。あるいは、不可逆の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、滴定することができ、添加されるインヒビターが増えるにつれてＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量が決定される。飽和量の不可逆の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、より多くの不可逆の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターの添加が、もはや形成されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量が増加しない場合に存在する。好ましい実施形態では、飽和量の不可逆の定量可能なインヒビター存在下で、サンプル中の遊離の生物学的標的の実質的に全てが標的／インヒビター複合体に共有結合する。本発明の方法の操作のために、遊離の生物学的標的の全ての分子が標的／インヒビター複合体に変換されることは必要ではないが、複合体に変換される量は遊離のままである量よりも大きいべきである。すなわち、遊離の生物学的標的の約５０％より多い量、好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％が標的／インヒビター複合体に変換されるべきである。

試験化合物は、好適な経路、例えば、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内注射を含む非経口；又は頬、経口、膣、直腸、眼球、眼球内、鼻腔、局所、皮内又は経皮経路を介して被験体に投与することができる。試験化合物は、当該技術分野で公知の方法を用いて投与のために処方化することができ、好ましくは、試験化合物の化学的性質と一致し、投与の意図される経路と一致する様式で処方化される。

「生物学的コンパートメント」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、被験体の身体の一部分であり、例えば、臓器又は臓器の集合、組織又は組織の集合、又は細胞又は細胞の集合、又は細胞種であることができる。生物学的サンプルは、被験体から除去される任意の臓器、組織、細胞又はそれらの組み合わせを含むことができ、１つの実施形態では、試験化合物が治療効果の少なくとも一部分を担うと予想される組織又は細胞種である。例えば、生物学的サンプル又はそれらのフラクションは、全血、血液フラクション、又は血液細胞の特定の集合、例えば、赤血球、白血球、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、マクロファージ、又は他の専門的な抗原が存在する細胞；白血病細胞、リンパ腫細胞、腫瘍組織；癌細胞；骨髄；滑膜、滑膜液、脳脊髄液、皮膚、肝臓組織又は細胞、心臓組織、肺組織、脳組織、筋肉組織、骨、上皮、内皮、前立腺組織、胸部組織、リンパ節、及び脾臓であることができる。１つの実施形態では、生物学的サンプルは、定量可能なインヒビターと接触する前に加工される。このような加工としては当該技術分野で公知の方法が挙げられ、例えば、生物学的サンプル、組織均質物、及び細胞溶解物からの特定の細胞種の単離を挙げることができる。好ましい生物学的サンプル又はそれらのフラクションとしては、白血球、肝臓、リンパ節及び脾臓が挙げられる。

「定量可能なインヒビター」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、以下を含む分子である。（１）生物学的標的と相互作用して生物学的標的を阻害する部分（「結合」部分）及び（２）インヒビター又はインヒビター／生物学的標的複合体の固定化又は定量を可能にする部分（「定量部分」）。好ましくは、結合部分は、試験化合物と同じ部位で生物学的標的に結合する。この実施形態では、生物学的標的の分子と試験化合物との間の反応は、生物学的標的の分子と定量可能なインヒビターとの間の後に続く反応を妨害する。好適な定量部分としては、ビオチン部分；メトトレキサート部分：放射能同位体、例えば、トリチウム又は^１２５Ｉ；蛍光部分、例えば、フルオロセイン；抗体、例えば、生物学的標的と相互作用する部分に共有結合する抗体；一本鎖オリゴヌクレオチド、及び当該技術分野で公知の他のものが挙げられる。標的及び好適な結合部分の例としては、チミジレートシンターゼ／ジデアザフォレート誘導体；シクロオキシゲナーゼ／アセチルサリチル酸；セリンプロテアーゼ／フェニルメチルスルホニルフルオリド及びＮ−α−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン；ペニシリン結合タンパク質／ペニシリンが挙げられる。

１つの実施形態では、標的／インヒビター複合体は、好適な技術、例えば、サイズに基づいて分子を分離する技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー及びゲル電気泳動を用いて、未反応の定量可能なインヒビターから分離される。例えば、定量部分が蛍光部分である場合、得られた標的／インヒビターフラクションの蛍光強度は、存在する複合体の量を決定するために使用することができる。同様に、定量部分が放射能同位体である場合、標的／インヒビターフラクションの放射能活性のレベルは、形成される複合体の量を定量するために使用することができる。

「定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビター」は、上に記載されるように、ＭｅｔＡＰ−２の不可逆の定量可能なインヒビターである。好ましい定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、共有結合ＭｅｔＡＰ−２インヒビターである。特に好ましい定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、定量部分を含むフマギリンアナログである。

被験体は、試験化合物の効果についての情報が望ましい任意の動物であることができる。好ましくは、被験体は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタ、又は霊長類、例えば、非ヒト霊長類、例えばサル又は類人猿、又はヒトである。１つの実施形態では、被験体は、実験動物であり、好ましくはマウス又はラットである。被験体はさらに、ヒトの疾患（例えば、固体腫瘍及び血液の癌、リウマチ性関節炎又は制御不可能な又は所望でない血管形成及び／又は炎症に関連する他の疾患癌）と類似した症状が進むように遺伝子操作又は他の操作をされた実験動物であることができる。

１つの実施形態では、定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターは、以下の一般構造Ｉを有するフマギリンアナログである。

式中、Ｌはリンカー基であり、Ｘはビオチニル部分である。Ｌは、フマギリン中心に対してビオチン部分を結合させるのに好適な任意の部分であることができる。好適な定量可能なＭｅｔａｐ２インヒビターの例としては、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１５１８３−１５１８８（１９９８）；Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ ４：４６１−４７１（１９９７））及びＳｉｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６０９９−６１０３（１９９７））（これらはそれぞれその全体が本明細書中に組み込まれる）に開示されるビオチン−フマギリン結合体が挙げられる。式Ｉの好ましい化合物は、式ＩＩの化合物である。

形成されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量は、種々の方法、例えば、実施例２に記載されるプロトコルを用いて決定することができる。１つの実施形態では、複合体は、定量部分が結合する固体支持体を用いて固定される。例えば、固体支持体は、定量部分と共有結合又は非共有結合によって相互作用する表面結合部分を含むことができる。

定量部分がビオチンである場合、例えば、好適な表面結合部分はアビジン及びストレプトアビジンを含み、これらはビーズ、プレート及び当該技術分野で公知の他の固体支持体の表面に結合させることができる。固体支持体は、好ましくは、任意のバックグラウンドシグナルを除去するために洗浄される。固定された複合体は、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量することができる。実施例１に示される実施形態では、ＭｅｔＡＰ−２はビオチニル化フマギリンアナログと複合体を形成し、得られたＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体はストレプトアビジンビーズ上に捕捉される。固定された複合体は、抗−ＭｅｔＡＰ−２抗体と接触した後、二次抗体に接触する。この結果は、単離されたＭｅｔＡＰ−２を用いた標準的な曲線と比較することができる。

代替の実施形態では、ＭｅｔＡＰ２／インヒビター複合体は、固定された抗−ＭｅｔＡＰ−２抗体を用いて捕捉され、アビジン−又はストレプトアビジン−で標識された検出部分と接触する。ビオチニル化フマギリン誘導体は、次いで、アビジン又はストレプトアビジン基と複合体化され、複合体に検出部分をカップリングさせる。例えば、蛍光タグ又は放射線核種は、アビジン又はストレプトアビジンに接続することができる。別の実施形態では、ＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体は、好適な分離方法、例えば、透析又はゲルろ過クロマトグラフィーによって未反応の定量可能なＭｅｔＡＰ−２インヒビターから分離される。ＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体を含むフラクションは、次いで、当該技術分野で公知のように、定量部分について好適な方法を介して分析される。例えば、定量部分が蛍光基である場合、蛍光強度を決定することができる。定量部分が放射線核種である場合、フラクションの放射能活性レベルを決定することができる。

なお別の実施形態では、本発明は、生物学的サンプルにおいて、生物学的標的、例えばＭｅｔＡＰ−２の不可逆インヒビターである化合物を定量する方法を提供する。この方法は、以下の工程：（１）生物学的サンプルと飽和量の生物学的標的とを接触させて、生物学的標的の不可逆インヒビターである化合物の実質的に全てが生物学的標的と反応して不活性化された生物学的標的及び遊離の生物学的標的を形成する工程と；及び（２）前記生物学的サンプル中の生物学的標的の量を決定する工程とを含む。

１つの実施形態では、遊離の生物学的標的の量は、生物学的標的の活性、例えば酵素活性又は結合活性を測定することによって決定される。

別の実施形態では、遊離の生物学的標的の量は、以下の工程：（ｉ）生物学的サンプルと生物学的標的の飽和量の定量可能なインヒビターとを接触させて、生物学的標的サンプル中の遊離の生物学的標的の実質的に全てが定量可能な不可逆インヒビターと反応して標的／インヒビター複合体を形成する工程と；（ｉｉ）工程（ｉ）において作製される標的／インヒビター複合体の量を決定する工程と；及び（ｉｉｉ）工程（ｉ）において決定される標的／インヒビター複合体の量と工程（１）において添加される生物学的標的の全量とを比較する工程とを含む方法によって決定され、ここで、工程（１）において添加される生物学的標的の量と比較した場合の工程（ｉｉ）において決定される標的／インヒビター複合体の量の減少は、前記生物学的標的の不可逆インヒビターである前記生物学的サンプル中の化合物の量を示す。

この実施形態では、生物学的標的は、生物学的サンプル中に不可逆インヒビターが予定された量よりもモル過剰で存在する場合、不可逆インヒビターの飽和量で存在する。生物学的標的は、例えば、不可逆インヒビターの予定された量の１．１〜１０倍モル過剰で存在することができる。不可逆インヒビターの予定された量は、例えば、インヒビター／インヒビター複合体クロマトグラフィー決定法を用いて決定することができる。本発明の方法の操作のために、不可逆インヒビターの全ての分子が生物学的標的と反応することは必要ではないが、生物学的標的と反応する量はそうでない量と比較して大きいべきである。すなわち、不可逆インヒビターの約５０％より多い量、好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％が生物学的標的と反応すべきである。

不可逆インヒビターは、１個の分子種又は２つ以上の種の組合せであることができる。例えば、不可逆インヒビターは、インビボで被験体に投与される試験化合物、試験化合物の１つ以上の活性代謝物又はそれらの組み合わせであることができる。

生物学的サンプルは、被験体、例えば、インビボで試験化合物を投与可能な被験体から除去される生物学的サンプル、又はインビトロアッセイ、例えば、細胞ベースのアッセイ又は細胞を含まないアッセイで使用されるサンプルであることができる。例えば、生物学的サンプルは、インビトロで肝臓ミクロソームを含むことができ、本方法は、例えば、肝臓ミクロソームと共に試験化合物をインキュベートした後に残る全インヒビター活性を決定するために使用することができる。このようなインキュベーションの後に、活性は、親化合物、１つ以上の活性代謝物、又はそれらの組み合わせに起因する。

本方法はさらに、生物学的サンプルの他の分析、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ゲル電気泳動、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング、ＥＬＩＳＡを介する可溶性分子の捕捉と組み合わせることができる。例えば、生物学的サンプル内の１つ又は複数の細胞種上の細胞外又は細胞内タンパク質は、フローサイトメーターによって検出可能な蛍光分子で標識された抗体と接触させることができる。データの分析は、例えば、生物学的サンプル内の細胞の数又は種類における変化、生物学的サンプル内の細胞の表面及び／又は内側表面上の分子発現レベルにおける変化、生物学的サンプル内の細胞の複製段階を決定することができる。生物学的サンプルの好ましい種類は、全血、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、又は血管形成又は炎症の任意の領域から誘導される。発現を観察することができる分子の好適な例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＧＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＸＣＲ４、及びＤＮＡが挙げられる。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、限定を意図すべきではない。本明細書全体で引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容、ならびに図面は、本明細書中に参考として組み込まれる。

実施例１：式ＩＩのビオチニル化フマギリンアナログ（化合物１）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ１．８ｍｍｏｌ（１．２当量）を乾燥ＤＭＦ１０ｍＬに溶解した。４．８当量のＤＩＥＡを添加し、この溶液をカルボン酸が溶液になるまで穏やかに加熱した。次いで、この溶液を室温まで冷却した。オーブンで乾燥した丸底フラスコに、塩化２−クロロトリチル樹脂（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ）１．５ｍｍｏｌを乾燥ジクロロメタン（「ＤＣＭ」１０ｍＬ）中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ溶液を懸濁した樹脂に添加し、乾燥Ｎ_２下で４時間攪拌した。次いで、反応混合物をろ別し、ＤＭＦ３×３ｍＬ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ（１７：６：２）３×３ｍＬ、ＤＣＭ３×３ｍＬ、ＤＭＦ２×３ｍＬ、及びＤＣＭ３×３ｍＬで樹脂をすすいだ。次いで、樹脂をＫＯＨで高減圧下２時間乾燥した。ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ビオチン）のついた樹脂は、ジベンゾフルベン吸収によって約０．６３ｍｍｏｌ／ｇであると決定された。

Ｆｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｄ−Ｖａｌ−ＯＨを、ＦＭＯＣ脱保護のためのＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて（２×５分）、及びカップリングのためのＤＭＦ中の０．４Ｍ ＮＭＭ中の５当量のＦＭＯＣ−アミノ酸／ＨＢＴＵ（１×１時間）を用いて、Ｒａｉｎｉｎ ＰＳ−３ペプチド合成機中で連続してカップリングさせた。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて（２×５分）ＰＳ−３上でＮ末端Ｆｍｏｃ基を除去した。

化合物−樹脂０．６ｍｍｏｌを乾燥ＤＣＭ９ｍＬ中で膨潤させた。この懸濁液に、Ｏ−スクシンイミジル−フマギロール（Ｆｕｍ−ＯＳｕ）２．４ｍｍｏｌ（４当量）及びトリエチルアミン３．６ｍｍｏｌ（６当量）を添加した。混合物を乾燥Ｎ_２下で５時間攪拌し、次いで反応混合物をろ別し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、反応を新鮮な試薬を用いて繰り返した。

化合物１は、３０％のヘキサフルオロイソプロパノール／ＤＣＭ１２ｍＬ中で３０分かけて樹脂（０．６ｍｍｏｌ）から解離した。解離した生成物をろ別し、樹脂洗浄液（ＤＣＭ３×１０ｍＬ）と合わせた。ろ液を減圧下で濃縮し、約５０％純度の粗生成物を得た。粗物質を分取ＨＰＬＣによって精製した。１．５ｍｍｏｌの全出発樹脂から合わせて粗生成物から得た純度９６％の化合物の収量は３６０ｍｇ（２２％）であった。

実施例２：化合物２を投与した後の、ラット白血球溶解物及び組織における遊離ＭｅｔＡＰ−２の決定
本実施例及び実施例３で使用される化合物２は、以下の化合物である：
（１−カルバモイル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸−（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−５−メトキシ−４−［（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチル−３−（３−メチル−ブタ−２−エニル）−オキシラニル］−１−オキサ−スピロ［２．５］オクタ−６−イルエステル

材料
完全プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ １８３６１４５）、錠剤１個／５０ｍＬ
ＥＬバッファー（Ｑｉａｇｅｎ ７９２１７）
ＮＰ−４０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４９２０１５）
ＮＰ−４０溶解バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０
ＰＢＳ：リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．２
ＲＢＣ溶解バッファー：ＥＬバッファー中に再懸濁された完全プロテアーゼインヒビター
ＷＢＣ溶解バッファー：０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、及び１ｍＭ ＮａＦが追加されたＮＰ−４０溶解バッファー（ｐＨ７．４）
追加されたＰＢＳ洗浄バッファー：ＰＢＳポリプロピレン、丸底の９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３７９０）中で再懸濁された完全プロテアーゼインヒビター
ＢＳＡ（フラクションＶ，Ｓｉｇｍａ Ａ−３２９４）
ＰＢＳＴ：ＰＢＳ中の０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０
ＢＳＡ／ＰＢＳＴ：ＰＢＳＴ中の０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ ９６−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５５００）
エタノール（ＡＡＰＥＲ ０５０１０１）
化合物２：エタノール中の４０ｍＭ溶液として提供され、−２０℃で保存された。

化合物１、ＤＭＳＯ中の４０ｍＭ溶液として提供され、−２０℃で保存され、ｒＭｅｔＡＰ２（Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓ，１８．５μＭストック）、０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中の０．２ｎｇ／μＬ、１００μＬアリコート、−２０℃で保存された。

抗−ＭｅｔＡＰ２ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ ７１−７２００）
ヤギ抗−ウサギ−ＨＲＰポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ ８１−６１２０）
ＴＭＢ，ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ ５０−７６−０２）
ＴＭＢ，ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ ５０−６５−０２）。

（ＷＢＣ溶解物の調製）
ＲＢＣ溶解
ＲＢＣ及びＷＢＣ溶解バッファーを調製し、それぞれ使用前に少なくとも３０分間氷上で冷却し、溶解物の調製開始から１時間以内に使用した。全血０．８ｍＬを１５ｍＬコニカル管に氷上で移した。氷冷したＲＢＣ溶解バッファー４ｍＬを添加し、数回ひっくり返して氷上に戻した。数回ひっくり返しつつ氷上で１５分間インキュベートした。混合物が１５分後に半透明にならなければ、有意な量のＲＢＣがまだ存在している場合がある。短時間回転させ、さらに１０分間インキュベートした。遠心分離し、バケットローター（１，４００ＲＰＭ又は約４００×ｇ）で４℃で１０分間回転させた。ＲＢＣ溶解物の上清をデカンテーションして捨て−吸収パッドに対して管を穏やかにのせた。氷で冷却したＲＢＣ溶解バッファー１．６ｍＬを１５ｍＬコニカル中のペレットに添加し、短時間回転させた。前と同じように遠心分離し、上清をデカンテーションし、氷上のＷＢＣペレットを含有する管に置いた。氷で冷却した追加されたＰＢＳ洗浄バッファー３．２ｍＬを添加し、短時間回転させた。前と同じように遠心分離し、上清をデカンテーションし、氷上のＷＢＣペレットを含有する管に置いた。

ＷＢＣ溶解
氷で冷却したＷＢＣ溶解バッファー０．４ｍＬをＷＢＣペレットに添加し、短時間回転させた。粉砕し、ピペットで吸い上げ吸出し、ラベリングしたミクロ遠心管に移し、２〜８℃で約３０分穏やかに揺らした。約１３．２Ｋｒｐｍで４℃で１０分間、ミクロ遠心分離した。上清を３つのほぼ等量のアリコートに分けミクロ遠心管に入れた。サンプルを凍結させ、−７０℃で保存した。

（脾臓の均質化及び溶解手順）
追加されたＰＢＳ、ＲＢＣ溶解バッファー及びＷＢＣ溶解バッファーを調製し、使用前に氷上で３０分冷却した。

組織の粉砕
追加されたＰＢＳ２ｍＬを使い捨て組織粉砕管にわけ、氷上に置いた。新しく収集した脾臓を組織粉砕管に移し、氷上に置いた。組織を均質化し、氷上で１０分間サンプルを沈降させた（遠心分離ではない）。

細胞溶解
上清を５０ｍＬコニカル管に氷上でデカンテーションした。氷で冷却したＲＢＣ溶解バッファー１０ｍＬを添加し、数回ひっくり返して氷上に戻した。数回ひっくり返しつつ氷上で１０分間インキュベートした。バケットローターで４００×ｇ（１５７０ｒｐｍ）で４℃で１０分間回転させることによって遠心分離した。ＲＢＣ溶解物の上清をデカンテーションして捨て−吸収ティッシューに対して管を穏やかにのせた。氷で冷却したＲＢＣ溶解バッファー４ｍＬを５０ｍＬコニカル中のペレットに添加し、短時間回転させた。前と同じように遠心分離し、上清をデカンテーションし、氷上のＷＢＣペレットを含有する管に置いた。氷で冷却した追加されたＰＢＳ洗浄バッファー１０ｍＬを添加し、短時間回転させた。前と同じように遠心分離し、上清をデカンテーションし、氷上のＷＢＣペレットを含有する管に置いた。氷で冷却したＷＢＣ溶解バッファー１ｍＬをＷＢＣペレットに添加し、短時間回転させた。粉砕し、ピペットで吸い上げ吸出し、シラン化されたミクロ遠心管に移し、４℃で３０分穏やかに揺らした。最大速度で４℃で１０分間、ミクロ遠心分離した。上清をアリコートに分け、凍結させ、−８０℃で保存した。

（肝臓、胸腺及びリンパ節の均質化及び溶解手順）
追加されたＰＢＳを調製し、使用前に氷上で３０分冷却した。可能ならば秤量中も臓器サンプルが凍結したままにするために氷を使用した。可能でない場合、サンプルを氷上で融解させた。全ての加工は氷上で行った。各肝臓サンプル０．２ｇ±０．０５ｇを使い捨て組織粉砕機内に秤量して入れた。追加されたＰＢＳ１ｍＬ（約５容積）全てに添加し、均質化するまで組織を粉砕した。ＰＢＳ中の１０％ＮＰ−４０（最終濃度は約１％）１２０μＬを添加し、４℃で攪拌しつつ３０分間続けて溶解した。サンプルをシラン化したミクロ遠心管に移し、最大速度で４℃で１０分間、ミクロ遠心分離した。上清をアリコートに分け、−８０℃で保存した。

（ＥＬＩＳＡ）
各溶解物２０μＬをポリプロピレン９６−ウェルプレートに分けて処理した：
＋化合物２サンプル（バックグラウンドコントロール）：４０ｍＭの化合物２ストックを１０μＭワーキングストックで１：４０００に希釈し、化合物２の最終濃度を１μＭにするためにバックグラウンドサンプルに２μＬ添加した。

−化合物２サンプルは、ＥｔＯＨビヒクル（ＰＢＳＴ４，０００μＬ中の１μＬのＥｔＯＨ）を受け入れ、サンプルに２μＬ添加した。覆い、水道水で穏やかに混合し、室温で３０分インキュベートした。この時間の間に、ｒＭｅｔＡＰ２を−２０℃から取り出し融解させた。標準曲線のための一連の希釈液を調製した：ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中の８、４、２、１、０．５、及び０ｎｇ／ｍＬのｒＭｅｔＡＰ２。４０ｍＭの化合物１ストックを１０μＭワーキングストックで１：４０００に希釈し、化合物１の最終濃度を１μＭにするためにバックグラウンドサンプルに２μＬ添加した。；覆い、水道水で穏やかに混合し、攪拌せずに室温で１時間インキュベートした。使用する少なくとも３０分前に、ストレプトアビジンプレートを４℃から除去した。サンプル１：１０（２０μＬサンプル内の１８０μＬ）をそれぞれＰＢＳＴを用いて希釈し、十分に混合した。希釈したサンプルの２０μＬ及び４０μＬのアリコートをストレプトアビジンプレートに移し、３０μＬ及び１０μＬのＰＢＳＴを添加し（全体積がそれぞれ５０μＬ）、十分に混合した：シグナルサンプル（シグナルサンプル＝−化合物２）について各体積のアリコートを２つ組にしバックグラウンドサンプル（バックグラウンドサンプル＝＋化合物２）について各体積のアリコートを１個使用した。プレートあたり２つ組のｒＭｅｔＡＰ２希釈シリーズの２０μＬのアリコートをプレートに移し、それぞれＰＢＳＴ３０μＬを添加した。覆い、プレートシェーカーでプレートを中速で室温で１時間インキュベートした。２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５０μＬで手動で３回洗浄した。プレートをシンク上で軽く叩きＳＤＳ２％を除去した。ナプキンの上で叩いて拭き取った。プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μＬで４回洗浄した。１２チャネルピペットを用いてＰＢＳＴ中の１：５００抗−ＭｅｔＡＰ２抗体５０μＬを添加し、同時に抗体を３つ組に受け、覆い、プレートシェーカーでプレートを中速で室温で１時間インキュベートした。１つのプレートはＰＢＳＴ５ｍＬ及び抗−ＭｅｔＡＰ２抗体１００μを必要とする。

プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μＬで４回洗浄した。

１２チャネルピペットを用いてＰＢＳＴ中の１：５０００ヤギ抗−ウサギ−ＨＲＰ抗体５０μＬを添加し、同時に抗体を３つ組に受け、覆い、プレートシェーカーでプレートを中速で室温で１時間インキュベートした。１つのプレートはＰＢＳＴ５ｍＬ及び１μＬ抗−ウサギ−ＨＲＰ抗体を必要とする。アリコー５０μＬ／ウェル。

ＨＲＰ−結合抗体を添加してすぐ後に、プレートリーダーの電源を入れ、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍでの値を読むために設定した。ＴＭＢ溶液を４℃から除去し、必要になるまで室温で保存した。

プレート洗浄機を用いてＰＢＳＴ３００μＬで４回洗浄し、各プレート中の全てのウェルにＰＢＳＴ５０μＬを添加し、最初のプレートを開始する前に１０分間放置した。

一度に１プレート：
ＰＢＳＴを除去し、シンク上でひっくり返し、紙で拭き取り、ＨＲＰのために１：１ＴＭＢ基質／溶液Ｂ１００μＬを添加した。１プレートに一度で十分な１：１ＴＭＢ基質／溶液Ｂを作製した。

ＴＭＢ基質を添加して１０分後に、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４１００μＬを添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

実施例３：化合物２を投与した後のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルの薬力学的研究
（目的）
本試験の目的は、一回投薬がＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに投与された後の、化合物２活性の薬力学マーカーとして、白血球、肝臓、脾臓、リンパ節及び胸腺中に残る遊離のＭｅｔＡＰ−２の割合を決定することがであった。

（材料及び方法）
９０匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットをＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手し、この試験のフェーズＩ及びＩＩａのために使用した。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２６／性）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， ＮＹ）から入手し、この試験のフェーズＩＩｂのために使用した。動物を、ウッドチップ（ＰｒｏＣｈｉｐ（Ｒ） ｂｅｄｄｉｎｇ，Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｃ）を敷いた大きなレキサン樹脂かご（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ Ｃａｇｉｎｇ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）中でかごあたり２〜３匹で飼った。使用した市販の動物の餌は、適宜入手可能なＳｔａｎｄａｒｄ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（＃２０１８，Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｃ．）であった。各餌ロットから調製されるコンポジットサンプルは、購入前に製造業者によって分析された。塩素化された公共の水道水は適宜入手した。この試験と干渉し得ることが知られている汚染物質は存在しないことが合理的に予想されるため、餌及び水の特定の分析は行わなかった。動物のための室温及び湿度の目的条件は、それぞれ７０±２°Ｆ及び５０±２０％であった。動物は、１２時間の明／暗サイクルにおかれ、処置の５日前に動物を新しい環境に慣れさせた。

試験中に使用される動物は、処置前の臨床的観察から受容可能な認定にもとづいて選択された。グループの評価について手順を交換することなくランダムに行った。尾に消せないインクでその固有の動物番号及び投薬グループを含むかごカードを付けて各動物を同定した。

試験の間、少なくとも１日１回、生きているか又は瀕死かについて動物を観察し、投薬用量を計算する目的のために体重（０．１ｇに近い）を処置の２日前まで測定した。

研究設計のまとめ
表１：フェーズＩ研究設計の概要

＊ＭｅｔＡＰ−２レベルのベースラインを確立するため
＊＊それぞれ３動物の６個のサブグループ（サブグループ１−４時間点、サブグループ２−２４時間点、サブグループ３−４８時間点、サブグループ４−７２時間点、サブグループ５−９６時間点、サブグループ６−１２０時間点）
（目的）
白血球（ＷＢＣ）におけるＭｅｔＡＰ−２阻害を、静脈内（ＩＶ）、腹膜内（ＩＰ）、経口栄養（ＰＯ）又は皮下（ＳＣ）経路のいずれかによって雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに投与される化合物２の１回投薬（３０ｍｇ／ｋｇ）後に試験した。

（試験項目／配合物）
５％デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）中の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％トレハロース、２．０％マンニトール（ｖ／ｖ）の溶液中で化合物２を調製した。投薬を保持するアリコート（２つ組において１ｍＬ）を、各試験フェーズから得て、ＨＰＬＣによる可能な将来の分析のために−７０℃で保存した。

（血液収集）
ＭｅｔＡＰ−２分析のために、Ａ≧１．０ｍＬの全血サンプルを３動物／グループ／時間点（投薬後４、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間）から採取した。各動物を意識のある頚部静脈穿刺によって１回だけ出血させた。血液をすぐにＥＤＴＡ管に置き、４〜８℃で保存した。各サンプルからの２つの血液スミアを可能な差分計測分析のために作製した。
表２：フェーズＩＩａ試験設計の概要

＊ＭｅｔＡＰ−２レベルのベースラインを確立するため
＊＊それぞれ３動物の６個のサブグループ（サブグループ１−４時間点、サブグループ２−２４時間点、サブグループ３−４８時間点、サブグループ４−７２時間点、サブグループ５−９６時間点、サブグループ６−１２０時間点）
注記：動物のグループ／サブグループの割り当ては試験フェーズＩで使用された配分と同一である。処置前に観察された１０日のウォッシュアウトは、フェーズＩＩａのために開始された。

（目的）
雌性ＳＤラットにおいてＩＶ又はＰＯのいずれかで投与されたＷＢＣにおけるＭｅｔＡＰ−２阻害の繰り返し試験を化合物２の種々の投薬レベルで行った。それに加えて、胸腺及び肝臓を収集し、ＭｅｔＡＰ−２分析のために液体窒素中で迅速に凍結させた。

（試験項目／配合物）
化合物２を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％トレハロース、２．０％マンニトール（ｖ／ｖ）の注射のための水溶液（ＷｆＩ）中で調製した。投薬を保持するアリコート（２つ組中の１ｍＬ）を各試験フェーズから得て、ＨＰＬＣによる可能な将来の分析のために−７０℃で保存した。

（血液収集）
投薬４、２４、４８、７２、９６、１２０時間後、２０ゲージの針を用いて、心臓を突き刺して、全血（＞３．０ｍＬ）を麻酔した動物から採取した（効果を出すためにイソフルラン吸入）。血をすぐにＥＤＴＡ管に入れ、４〜８℃で保存した。

（組織収集）
血液を収集した後、動物をＣＯ_２吸入によって殺した。胸腺全体及び肝臓の左側面の突起物をすりつぶし、別個の組織カセットに置き、さらなるＭｅｔＡＰ−２分析のために液体窒素で迅速に凍結させた。
表３：フェーズＩＩｂ：試験設計の概要

ａ）ＭｅｔＡＰ−２レベルのベースラインを確立するため
ｂ）２／性の４サブグループ（サブグループ１−４時間点、サブグループ２−８時間点、サブグループ３−２４時間点、サブグループ４−４８時間点）（組織及び血液収集）
ｃ）残りの２匹の動物／性／グループ（サブグループ５）は投薬後７２、９６及び１２０時間に血液を収集した。

ｄ）１２０時間の時間点で殺し、サブグループ５と同様に血液をこれらの動物から収集した。

（目的）
化合物２の１回の経口投与後の、組織におけるＭｅｔＡＰ−２ターンオーバーを特徴決定すること、及び性差が存在するか否かを決定すること。

（結果）
化合物２の１回投薬を受けた後のＳＤラットから血液及び組織サンプルを収集した。化合物２によるＭｅｔＡＰ−２の阻害を、サンプル中の遊離のＭｅｔＡＰ−２の量を測定するために設計されたＥＬＩＳＡを用いて観察した。細胞を溶解し、化合物１で処置した。化合物１は化合物２によって誘導体化されていないＭｅｔＡＰ−２分子の活性部位に共有結合する。得られたビオチニル化ＭｅｔＡＰ−２を固定されたストレプトアビジン上で捕捉し、抗−ＭｅｔＡＰ−２抗体及び酵素に結合する二次抗体を用いて検出した。フェーズＩは、化合物２ ３０ｍｇ／ｋｇ用量をＩＶ、ＩＰ、ＰＯ又はＳＣで１回投与した後に、ＭｅｔＡＰ−２阻害が雌性ＳＤラット白血球細胞（ＷＢＣ）溶解物において観察されるか否かを決定するためのパイロット試験として使用された。ＥＬＩＳＡは、全ての投与経路について、遊離のＭｅｔＡＰ−２シグナルの回収による減少を検出することができた。この分析に従って、サンプルの再現からのシグナルが非常に変動し、アッセイは改正が必要であることがわかった。ＥＬＩＳＡフォーマットをストレプトアビジンビーズからプレートに変え、ビオチニル化ＭｅｔＡＰ−２捕捉工程の後に、２％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）での激しい洗浄を加えた。これらの変化は、バックグラウンドシグナルを減らし、アッセイの精度を非常に高めた。フェーズＩＩａ及びＩＩｂのための後に続く分析を実施例２において記載されるプロトコルを用いて行った。フェーズＩＩａでは、雌性ＳＤラットに化合物２を０．３、３及び３０ｍｇ／ｋｇＰＯ又は３ｍｇ／ｋｇをＩＶで１回投薬した。動物を出血させ、投薬の４〜１２０時間後に殺した。肝臓及び胸腺サンプルを試験の次の段階において使用される分析方法の開発のために採取した。図２は、各投薬グループ由来のＷＢＣ溶解物における遊離のＭｅｔＡＰ−２シグナルを示し、平均的な投薬を受けていないグループの値の割合として、各投薬グループにおける平均の遊離のＭｅｔＡＰ−２として与えられる。阻害の持続時間は、一般的に、投薬量に関係し、３０ｍｇ／ｋｇＰＯは、２回の低用量の経口投薬よりもＭｅｔＡＰ−２の阻害をより長くした。３ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与は、３ｍｇ／ｋｇＰＯによく似た結果を与え、３０ｍｇ／ｋｇＰＯよりも顕著に持続的な応答が低かった。

フェーズＩＩｂでは、０．３及び３ｍｇ／ｋｇでの化合物２の１回のＰＯ投薬を使用して、いくつかの臓器においてＭｅｔＡＰ−２の阻害及び回収を調べ、雄性及び雌性のＳＤラットにおける効果を比較した。図３は、投薬４〜４８時間後に、ＷＢＣ、肝臓、脾臓、胸腺及びリンパ節中に残る遊離のＭｅｔＡＰ−２の割合を示す。化合物２によるＭｅｔＡＰ−２阻害における一貫した性差は存在しなかった。ＷＢＣ及び肝臓の遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルは、他の組織におけるレベルよりも明らかに低く、０．３ｍｇ／ｋｇでは顕著な効果がなかった。このことは、組織の感受性における差を反映しているか、又は書く紺パートメントにおける化合物２に対する暴露のレベルの差を反映している。フェーズＩＩａにおけるように、３ｍｇ／ｋｇグループ由来のＷＢＣにおける阻害は、０．３ｍｇ／ｋｇを受けたグループよりも初期には低いが、２つのグループは７２時間までに同様の遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルまで回復した。化合物２を３ｍｇ／ｋｇ受けた４時間後に、全てのコンパートメントにおいてＭｅｔＡＰ−２の平均９５％以上が阻害されていた。３ｍｇ／ｋｇを受けた４８時間後、胸腺組織における遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルは完全に回復し、リンパ節、脾臓、肝臓及びＷＢＣは平均値（±ＳＥＭ）でそれぞれ６３％±１６％、４１％±５％、１３％±５％、１３％±４％であった。図４ではこれらのコンパートメント間の相関を試験するために、ＷＢＣにおけるレベルを基準として、組織における遊離のＭｅｔＡＰ−２シグナルをプロットした。示される曲線は、非線形回帰分析を用いたデータに合った。臓器における阻害を観察するために必要とされるＷＢＣにおけるＭｅｔＡＰ−２阻害度は、化合物２に対するそれぞれの応答の指標であった：肝臓（ほとんど阻害されている）＞脾臓（およそ等しい）リンパ節＞胸腺。全ての場合において、グループがＷＢＣにおいて測定可能な遊離のＭｅｔＡＰ−２を有していない場合、組織は、３％未満の平均残存率を有していた。

（結論）
化合物２によるＭｅｔＡＰ−２の阻害の薬力学はＥＬＩＳＡを用いて測定され、化合物２がＳＤラットに１回投与された後の、血液及び組織サンプル中に存在する遊離のＭｅｔＡＰ−２の量を決定した。ＷＢＣ及び臓器におけるＭｅｔＡＰ−２阻害の持続時間は、ＰＯによって投与される化合物２の投薬に関連しており、３ｍｇ／ｋｇのＩＶで作製された結果は３ｍｇ／ｋｇＰＯの結果と同様であった。化合物２によるＭｅｔＡＰ−２阻害における一貫した性差はなかった。臓器における阻害をランク付けした（応答が減少する順）：肝臓＞脾臓（およそ等しい）リンパ節＞胸腺。ＷＢＣにおいて測定可能な遊離のＭｅｔＡＰ−２が残る化合物２の用量は、組織において３％未満の残存であった。

省略語：
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＬＩＳＡ 酵素結合イムノソルベントアッセイ
Ｅｑｕｉｖ． 当量
ＥｔＯＨ エタノール
Ｎ 数
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＰＩ プロテアーゼインヒビター
ＱＯＤ １日おきに
ｒＭｅｔＡＰ−２ 組み換えメチオニンアミノペプチダーゼ２型、ヒト
ＳＤ 標準偏差
ＳＤＳ ナトリウムドデシルサルフェート
ＳＥＭ 測定の標準誤り
ＴＭＢ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
実施例４：蛍光標識されたフマギリンアナログを用いた生物学的サンプル中のＭｅｔＡＰ−２の分析
（蛍光標識されたフマギリンアナログの調製）
以下に示される蛍光標識されたフマギリンアナログ（「化合物３」）を実施例１におけるように固体相合成を用いて調製し、最終的にＣｙ５ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をリジンのε−窒素原子に付加した。

（マウスの腫瘍移植及び投薬）
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを各１０匹ごとに６グループに分けた。それぞれのマウスに、肢部にＰＢＳ１００μＬ中の１０^６Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植した。移植の７日後に、マウスの１つのグループ（グループ６）に１日おきに化合物２を１００ｍｇ／ｋｇを経口栄養（ＰＯ）で投与する治療を開始した。移植の１３日後に、残ったグループに以下の処置を施した：
グループ１：１日おきに５ｍＬビヒクル（１１％ヒドロキシプロピルシクロデキストリン）；グループ２：１日おきに１％プロピレングリコール／Ｄ５Ｗ中の５−フルオロウラシル５０ｍｇ／ｋｇＰＯ；グループ３：化合物２，３ｍｇ／ｋｇ１日おきにＰＯ；グループ４：化合物２，３０ｍｇ／ｋｇ１日おきにＰＯ；グループ５：化合物２，１００ｍｇ／ｋｇ１日おきにＰＯ。各グループにおいて、最後の投薬は、移植の１９日後に投与され、最後の投薬の２４時間後に、血、脾臓、腫瘍、胸腺及び肝臓サンプルをマウスから集めた。

（サンプルの分析）
実施例２に記載されるプロトコルに従う分析のために組織サンプルを調製し、実施例２のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて遊離のＭｅｔＡＰ−２を分析した。調製した組織サンプルはさらに、以下のプロトコルを用いて遊離のＭｅｔＡＰ−２活性について分析した。

（材料：）
１０％ ＮｕＰＡＧＥビス−ＴＲＩＳゲル、１．０ｍｍ×１５ウェル、カタログ番号ＮＰ０３０３、ロット番号２０８１９３１、有効期限：２００３年１２月１８日
２０×ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ操作バッファー、カタログ番号ＮＰ００１−０２、ロット番号２２２２４５、有効期限：２００２年５月５日、１×ｍｉｌｌｉＱの水希釈
Ｃｙ５の読みのためのＳｔｏｒｍ／ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、Ｒｅｄ６３５ｎｍ／６５０ＬＰ
Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅの読みのためのＳｔｏｒｍ／ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、Ｂｌｕｅ ４５０／５２０ＬＰ
酸化防止剤、ＮｕＰＡＧＥ、カタログ番号ＮＰ０００５
ｒＭｅｔＡＰ２、Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓ、１８．５３ｕＭストック＝１ｍｇ／ｍＬ
化合物３，０．８ｍｇ（管全体），ＦＷ＝１４８３．２，純度６４％，エタノール３４５ｕＬで再懸濁し、最終濃度を１ｍＭにした（純度を調整）
Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ，分子プローブ、カタログ番号Ｓ−６６５１
溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１％ＮＰ−４０）
Ｂｌｕｅ ＭＷマーカー，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＬＣ５９２５を参照。

（手順：）
１．１．５ｍＬエッペンドルフ管中で、１０ｕＬ容積の溶解バッファー中で所望の濃度になるようにサンプルを希釈した。計算を参照。

２．各管に、溶解バッファー中に希釈した１０ｕＭの化合物３のストック１ｕＬを添加した。

３．氷上で１．０時間インキュベートした。

４．加熱ブロックを７０℃にした。

５．４×サンプルバッファー３．８ｕＬを各管に添加した。

６．ＤＴＴ（Ｎｏｖｅｘ溶液）１．５ｕＬを添加した。

７．各管を７０℃で５分間加熱した。短時間管を回転させた。

８．２つのゲルから底のシールを剥がした。

９．ＶＷＲラボマーカーを付けたゲルのウェルの外形をなぞり、櫛で除去した。

１０．操作バッファー８００ｍＬを調製した。

１１．ゲルを装置内に置き、酸化防止剤０．５ｍＬを中心チャンバーに添加した。チャンバーを１×操作バッファーで満たした。

１２．サンプルをウェルに入れる前に、操作バッファーを用いてゲルの全てのウェルを洗い流した。

１３．ゲルを２００Ｖで室温で６０分操作した。

１４．ゲルを操作した後、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを用いて以下のように染色した。

１５．ゲルをｍｉｌｌｉＱの水で１０分間洗浄した。

１６．Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを添加した（希釈のための計算を参照）
１７．ゲルボックスをホイルで覆い、振り混ぜながら１時間インキュベートした。

１８．Ｑｕｉｃｋｌｙ ｒｉｎｓｅ ｔｈｅ ｇｅｌ ｗｉｔｈ ７．５％ 酢酸．
１９．ゲルを７．５％酢酸で洗浄した。

２０．４５０ｎｍフィルター（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）及び６３５ｎｍ（Ｃｙ５）の両方を同時に用いて、Ｓｔｏｒｍ上でゲルをスキャンした。

２１．ＩｍａｇｅＱｕａｎｔにおける分析：観察において、Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌを選択し、個別の波長のスキャンを見るために並列のグレースケールを選択した。

ｒＭｅｔＡＰ２
ストックは１８．５３ｕＭ＝１８，５３０ｎＭ
１：１００＝１８５．３ｎＭ
１：１，０００＝１８．５３ｎＭ

溶解物：ロードするためにサンプルの体積についてＥＬＩＳＡガイドラインを使用した。

（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）
７．５％（ｖ／ｖ）酢酸（１００ｍＬ中の２０ｕＬ）でストックｓｙｐｒｏ試薬を１：５０００に希釈した。

（化合物３：）
１ｍＭストック＝１０００ｕＭ；１：１００＝１０ｕＭ。サンプル反応中の希釈（１ｕＬ １０ｕＭ＋１０ｕＬ、実際には１：１０ではなく１：１１である）により１ｕＭストックを得た。

１００ｎＭについて：ストック１：１０００＝１ｕＭすなわち１０００ｎＭを希釈した。１ｕＬをｒＭｅｔＡＰ２反応に添加した。

（結果）
この試験の結果は図５に示され、ＥＬＩＳＡプロトコル及びゲルシフト分析を用いて腫瘍組織及び肝臓組織で得られた結果の比較を与える。全ての場合において、コントロールと比較して、遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルの用量依存の減少が両方の組織において見られる。

実施例５：遊離のＭｅｔＡＰ−２の決定
本実施例は、実施例２において記載されるプロトコルの代替法である、遊離のＭｅｔＡＰ−２のＥＬＩＳＡプロトコルを記載する。

（材料：）
ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ ２９１２９）、ＤＭＳＯ中の２．３４ｍＭ ストック、１００μＬのアリコートを−２０℃で保存し、１ヶ月ごとに新鮮なものを調製した。

化合物１、ＤＭＳＯ中の１．１７ｍＭ、５０ｕＬアリコートを−２０℃で保存し、３ヶ月ごとに新鮮なものを調製した。

化合物１−ｒＭｅｔＡＰ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）中の２３４μｇ／ｍＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１ｍＭ ＣｏＳＯ_４、（ＫＦＷ−１０３５−００１）、−２０℃。

Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ ９６−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５５００）。

ポリプロピレン、丸底、９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ ３７９０）
１．７ｍＬポリプロピレンミクロ遠心管（ＶＷＲ２０１７０−０３８又は等価物）。

１５ｍＬコニカルポリプロピレン遠心管（ＶＷＲ２１００８−１０３又は等価物）。

５０ｍＬコニカルポリプロピレン遠心管（ＶＷＲ２０１７１−０３８又は等価物）。

ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）
２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ナトリウムドデシルサルフェート）
抗−ＭｅｔＡＰ−２ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ ７１−７２００）
ヤギ抗−ウサギ−セイヨウワサビペルオキシダーゼポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ ８１−６１２０）。

ＴＭＢ，ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ５０−７６−０２）
ＴＭＢ，ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ５０−６５−０２）
プレートシェーカー（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４６２５）
プレート洗浄機（ＢＩＯ−ＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＥＳｘ ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ）
溶液の調製：
１．マトリックス：２０％、１％又は０．０２％の投薬を受けていない溶解物２５ｍＬ（サンプルの種類及び操作される希釈物に依存する）をＰＢＳＴ内で希釈することによって調製した。

２．ビオチン：
ａ．５０ｍＬコニカル管中で２．３４ｍＭのビオチンストック３７．５μＬをＰＢＳＴ４０ｍＬに添加することによって、２．１９μＭのビオチン溶液を調製した。

ｂ．５０ｍＬコニカル管中で２．１９μＭのビオチン溶液６ｍＬを２０％、１％又は０．０２％のマトリックスに添加することによって、４３８ｎＭのビオチンをマトリックス溶液中で調製した。

３．化合物１：５０ｍＬコニカル管中で１．１７ｍＭの化合物１ストック１５μＬをＰＢＳＴ４０ｍＬに添加することによって、化合物１の４３８ｎＭ溶液を調製した。

４．標準溶液：１０μｇ／ｍＬの化合物１−ｒＭｅｔＡＰ−２の１つのアリコートを標準ワーキングストックとして融解した。

ａ．新しい１０μｇ／ｍＬの標準ワーキングストックが必要な場合、化合物１−ｒＭｅｔＡＰ−２の２３４μｇ／ｍＬのアリコートを融解させ、４３８ｎｍのビオチン４４８μＬにこれを２０μＬ添加し、ピペットで吸い込んだり吸い出したりし、泡立たせることなく十分に混合するために数回ひっくり返すことによって、ポリプロピレンミクロ遠心管中で調製した。溶液を１５μＬのアリコートに分け、−７０℃で凍結させた。

ｂ．ワーキングストックを、１０μＬを４３８ｎｍのビオチン１９０μＬに添加し、ピペットで吸い込んだり吸い出したりし、泡立たせることなく十分に混合するために数回ひっくり返すことによって、５００ｎｇ／ｍＬまで希釈した。

ｃ．標準溶液１〜１０を、マトリックス中の４３８ｎＭに順次希釈し、ピペットで吸い込んだり吸い出したりし、混合するために数回ひっくり返すことによって調製した。

ＥＬＩＳＡ：
１．最終希釈率１：５、１：１０、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００及び１：５０００での試験サンプルの溶解物の調製
ａ．試験サンプルを凍結した保存液から除去し、室温で融解させた。

ｂ．中間体の希釈液をＰＢＳＴ中のサンプルについて調製した後、ポリプロピレン９６−ウェルプレート又はエッペンドルフ管で２つの希釈物に分ける。：
１：５−４０μＬＰＢＳＴ＋４０μＬサンプル
１：１０−６０μＬＰＢＳＴ＋２０μＬサンプル
１：５０−７６μＬＰＢＳＴ＋４μＬサンプル
１：１００−７８μＬＰＢＳＴ＋２μＬサンプル
１：５００−１：１０（９０μＬＰＢＳＴ＋１０μＬサンプル）；１：５０（７６μＬＰＢＳＴ＋４μＬの１：１０サンプル）
１：１０００−１：１０（９０μＬＰＢＳＴ＋１０μＬサンプル）；１：１００（７６μＬＰＢＳＴ＋２μＬの１：１０サンプル）
１：５０００−１：１００（９９０μＬＰＢＳＴ＋１０μｌサンプル）；１：５０（７６μＬＰＢＳＴ＋４μＬの１：１０サンプル）
ピペットで数回吸い込んだり吸い出したりして十分に混合した。

ｃ．２．１９μＭビオチン２０μＬを全てのサンプルに添加して、ピペットで数回吸い込んだり吸い出したりして十分に混合した。

ｄ．４３８ｎＭの化合物１ １００μＬを全てのサンプルに添加して、ピペットで数回吸い込んだり吸い出したりして十分に混合した。

２．それぞれの標準２００μＬをポリプロピレンプレートの空のウェルに移した。

３．プレートを覆い、室温で１時間インキュベートした。

ストレプトアビジンプレートを使用の少なくとも３０分前に４℃から取り出した。

４．ストレプトアビジンプレート上での捕捉：
ａ．ストレプトアビジンプレートをプレート洗浄機を用いて、ＰＢＳＴ３００μＬを用いて４回洗浄し、紙タオルを用いて拭いて残った溶液を取り除いた。

ｂ．試験サンプルの８０μＬのアリコートをピペットで数回吸い込んだり吸い出し、２つ組で移し、ポリプロピレンプレートからストレプトアビジンプレートへ標準を移した。

ｃ．プレートを覆い、室温で１時間インキュベートした（攪拌せず）。

５．ＰＢＳＴ中の抗−ＭｅｔＡＰ−２抗体の１：５００希釈を調製した。

６．洗浄：
ａ．プレートをプレート洗浄機を用いて、ＰＢＳＴ３００μＬを用いて４回洗浄した。

ｂ．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ１００μＬを添加した。２分後、溶液をプレート洗浄機を用いて吸引した。

ｃ．プレート洗浄機に空のプレートをセットした。

ｄ．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ１００μＬを添加した。２分後、プレート洗浄機を用いてプレートをＰＢＳＴ３００μＬを用いて４回洗浄し、紙タオルを用いて拭いて残った溶液を取り除いた。

７．ＰＢＳＴ中の１：５００抗−ＭｅｔＡＰ２抗体８０μＬ（ピペットを新しいものに変える）を添加し、次いで、覆い、室温で１時間インキュベートした。

８．ＰＢＳＴ中のヤギ抗−ウサギ−ＨＲＰ抗体１：５０００希釈を調製した。（プレートあたり少なくとも８ｍＬ必要）
９．プレートをプレート洗浄機を用いて、ＰＢＳＴ３００μＬを用いて４回洗浄し、紙タオルを用いて拭いて残った溶液を取り除いた。

１０．ＰＢＳＴ中のヤギ抗−ウサギ−ＨＲＰ抗体１：５０００希釈を８０μＬ添加した。プレートを覆い、室温で１時間インキュベートした。

すぐにＨＲＰ−結合抗体を添加し、プレートリーダーの電源をつけ、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍで読むように設定した。ＴＭＢ溶液を４℃から取り出し、必要になるまで室温で保存した。

１１．ＴＭＢ基質を用いた定量：
ａ．１：１ＴＭＢ基質／溶液Ｂを調製した。プレートをＰＢＳＴ３００μＬを用いて４回洗浄し（プレート洗浄機を用いて）、紙タオルを用いて拭いて残った溶液を取り除いた。

ｂ．１００μＬの１：１ＴＭＢ基質／溶液ＢをＨＲＰのために添加した。

ｃ．ＴＭＢ基質を添加した１０分後、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を１００μＬ添加し、４５０ｎｍでの吸収を測定した。

（等価物）
本明細書中に記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を当業者は認識するか、又は通常の実験の範囲内で把握することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

図１は、本発明の１つの実施形態におけるＭｅｔＡＰ−２−インヒビター複合体の定量を示す。 図２は、化合物２を１回投薬した後の、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの白血球における遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルを示すグラフである。 図３は、化合物２を１回投薬した後の、雄性及び雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの白血球、肝臓、脾臓、リンパ節及び胸腺における遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルを示すグラフである。 図４は、化合物２を１回投薬した後の、雄性及び雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの白血球細胞におけるレベルを基準とした、組織における遊離ＭｅｔＡＰ−２の相対的なレベルを示す。 図５は、ビヒクルＰＯ、化合物２を３ｍｇ／ｋｇと１日おきにＰＯ、又は化合物２を３０ｍｇ／ｋｇと１日おきにＰＯ用いて処置した、マウス黒色腫腫瘍をもつマウス由来の腫瘍及び肝臓組織において、両方とも遊離のＭｅｔＡＰ−２レベルにおいて用量依存的な減少を示す、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ及びゲルシフトアッセイの結果を示すグラフを表す。

Claims (25)

1. 被験体の細胞において試験化合物が生物学的標的を不活性化する能力を測定する方法であって、該方法は、以下の工程：
   （ａ）該試験化合物を被験体に投与して、該試験化合物と反応する、該被験体の身体中の生物学的標的が不活性化され、該試験化合物と反応しない生物学的標的は遊離のままである、工程と；
   （ｂ）１つ以上の細胞種を含む生物学的サンプルを該被験体から除去する工程と；
   （ｃ）生物学的サンプル又はそれらのフラクション内の遊離の生物学的標的の量を決定する工程と；及び
   （ｄ）工程（ｃ）において決定される量とコントロールサンプル中の遊離の生物学的標的の量とを比較する工程とを含み、
   ここで、該コントロールサンプルにおいて決定される量と比較した場合の工程（ｃ）において決定される遊離の生物学的標的の量の減少は、該生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおける不活性化された生物学的標的の量の測定値を与える、方法。
2. 遊離の生物学的標的の量が、前記生物学的サンプル又はそれらのフラクション内の生体分子の活性を測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
3. 遊離の生物学的標的の量が、以下の工程：
   （ｉ）前記生物学的サンプル又はそれらのフラクションと前記生物学的標的の飽和量の定量可能な不可逆インヒビターとを接触させて、前記遊離の生物学的標的の実質的に全てが前記定量可能な不可逆生物学的標的インヒビターと反応して標的／インヒビター複合体を形成する工程と；及び
   （ｉｉ）工程（ｉ）において形成される標的／インヒビター複合体の量を決定する工程とを含む方法によって決定される、請求項１に記載の方法。
4. 前記生物学的標的が、酵素、ｇ−タンパク質共役型レセプター、サイトカイン、又はレセプターキナーゼである、請求項１に記載の方法。
5. 前記生物学的標的がＭｅｔＡＰ−２である、請求項４に記載の方法。
6. 被験体から誘導される生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおけるＭｅｔＡＰ−２の不活性化度を決定するための方法であって、該方法は以下の工程：
   （ａ）試験化合物を該被験体に投与する工程であって、ここで、該被験体の身体において該試験化合物と反応するＭｅｔＡＰ−２が不活性化ＭｅｔＡＰ−２であり、該試験化合物と反応しないＭｅｔＡＰ−２が遊離のＭｅｔＡＰ−２である、工程と；
   （ｂ）該被験体から生物学的サンプルを除去する工程であって、ここで、該生物学的サンプルが１つ以上の種類の細胞を含む、工程と；及び
   （ｃ）該生物学的サンプル又はそれらのフラクション中の遊離のＭｅｔＡＰ−２の量を決定する工程と；及び
   （ｄ）工程（ｃ）において決定される量とコントロールサンプルにおいて決定される量とを比較する工程とを含み、
   ここで、工程（ｄ）において決定される量と比較した場合の工程（ｃ）において決定される量の減少は、該生物学的サンプル又はそれらのフラクションにおけるＭｅｔＡＰ−２の不活性化度の測定値である、方法。
7. 前記遊離のＭｅｔＡＰ−２の量が、以下の工程：
   （ｉ）前記生物学的サンプルの少なくとも一部分と飽和量の定量可能な不可逆ＭｅｔＡＰ−２インヒビターとを接触させて、前記生物学的サンプル中の前記遊離のＭｅｔＡＰ−２の実質的に全てが前記定量可能な不可逆Ｍｅｔａｐ−２インヒビターと反応してＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体を形成する工程と；及び
   （ｉｉ）工程（ｉ）において作製されるＭｅｔＡＰ−２／インヒビター複合体の量を決定する工程とを含む方法を用いて決定される、請求項６に記載の方法。
8. 前記生物学的サンプルが、全血、血液フラクション、赤血球、白血球、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、マクロファージ；腫瘍組織；癌細胞；骨髄；滑膜、滑膜液、脳脊髄液；肝臓組織；脳組織；前立腺組織、胸部組織、リンパ節組織及び脾臓からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 工程（ｂ）の後に前記細胞を溶解させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 工程（ｂ）の後に前記生物学的サンプル又は前記生物学的サンプルの一部分を均質化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記試験化合物がインビトロでＭｅｔＡＰ−２活性を阻害する、請求項６に記載の方法。
12. 前記試験化合物がＭｅｔＡＰ−２の不可逆インヒビターである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試験化合物がＭｅｔＡＰ−２の共有結合インヒビターである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記試験化合物がフマギリンアナログである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記定量可能な不可逆ＭｅｔＡＰ−２インヒビターがフマギリンアナログである、請求項１に記載の方法。
16. 前記フマギリンアナログがビオチン部分を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記フマギリンアナログが以下の構造：
    

    

    を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記フマギリンアナログが以下の構造：
    

    

    を有する、請求項１７に記載の方法。
19. 生物学的サンプル中の生物学的標的の不可逆インヒビターである化合物を定量する方法であって、該方法が、以下の工程：
    （ａ）該生物学的サンプルと該飽和量の生物学的標的とを接触させて、該生物学的標的の不可逆インヒビターである化合物の実質的に全てが該生物学的標的と反応して不活性化された生物学的標的及び遊離の生物学的標的を形成する工程と；及び
    （２）該生物学的サンプル中の遊離の生物学的標的の量を決定する工程とを含む、方法。
20. 前記遊離の生物学的標的の量が、前記生物学的標的の活性を測定することによって決定される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記活性が酵素活性又は結合活性である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記遊離の生物学的標的の量が、以下の工程：
    （ｉ）前記生物学的サンプルと前記生物学的標的の飽和量の定量可能なインヒビターとを接触させて、前記生物学的サンプル中の前記遊離の生物学的標的の実質的に全てが該定量可能な不可逆インヒビターと反応して標的／インヒビター複合体を形成する工程と；
    （ｉｉ）工程（ｉ）において作製される標的／インヒビター複合体の量を決定する工程と；及び
    （ｉｉｉ）工程（ｉ）において決定される標的／インヒビター複合体の量と工程（１）において添加される生物学的標的の全量とを比較する工程とを含む方法によって決定され、
    ここで、工程（１）において添加される生物学的標的の量と比較した場合の工程（ｉｉ）において決定される標的／インヒビター複合体の量の減少は、前記生物学的標的の不可逆インヒビターである前記生物学的サンプル中の化合物の量を示す、請求項１９に記載の方法。
23. 前記生物学的標的がＭｅｔＡＰ−２である、請求項１９に記載の方法。
24. ＭｅｔＡＰ−２の不可逆インヒビターである前記化合物がフマギリンアナログである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記生物学的標的がＭｅｔＡＰ−２であり、前記定量可能なインヒビターが定量部分を含むフマギリンアナログである、請求項２２に記載の方法。

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