JP3295431B2 - 抗アルファ−ガラクトシルスクリーニング技術 - Google Patents

抗アルファ−ガラクトシルスクリーニング技術

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Description

【発明の詳細な説明】 序論 技術分野 本発明の分野は、分子標的への結合についての化合物
のスクリーニングである。
背景 製薬業は、数が増加し続けている病気を治療すること
ができる新規化合物の開発に絶えず依存している。様々
な病原性物質を検出できる能力が高まるにつれ、１また
は複数の病原体に対して特異性を有する新規治療薬開発
する機会が生じる。加えて、組織、可動細胞、器官、分
化の程度などに関連して、個々の細胞に関連づけられた
多数の細胞マーカー（レセプターを含む）が存在する。
多くの場合、それらのマーカーへの結合は、細胞内過程
を開始させるかまたは抑制するように膜の向こう側でシ
グナルを変換するだろう。それらの過程は活性化／不活
性化、分化、分泌、増殖、細胞障害活性、様々な栄養素
の代謝などを含み得る。多くの場合、それらの様々な過
程に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用
する化合物を得たいと希望する。加えて、様々な細胞を
選択的に致死させたり様々な細胞を不活性化させたりし
たいと望むこともある。例えば、正常細胞を害すること
なく癌細胞を選択的に殺すことができることは非常に望
ましいだろう。
更に、現在使われている薬剤の多くは複数の作用を有
する。薬剤は着目の特定の作用を発揮するよりも、宿主
にとって有害となり得る他の一連の作用をもたらす。ほ
とんどの場合、この有害作用は、薬剤が我々の所望して
いるほど標的に特異的でなく、その結果別の標的に結合
しそして望ましくない副作用を誘導するためである。
新規化合物を合成することまたは自然界の新規化合物
を同定することは非常に費用がかかる。従ってほとんど
の場合、有効な薬理作用基（Pharmacophore）のレパー
トリーが比較的限定される。関連薬剤デザインは幾分看
破力があるとわかったが、期待するほど上手くはいって
いない。薬剤がそれのレセプターに結合する時、レセプ
ターのコンホメーションが変化し得ることが判明したた
めに状況は特に複雑である。従って、レセプターと薬剤
とが相互作用する様式に依存して結合部位の立体的コン
ホメーションが相当な変化を受けることがあり、これは
薬剤をデザインする時に重要な掛かり合いを持つ。
薬剤の開発に利用できる化合物により大きな多様性を
加えるために、組合せライブラリーが作製された。それ
らのライブラリーは多数の化合物、特に何千もの化合物
を比較的短時間のうちに調製することができると言われ
る。組合せライブラリーはモチーフなしで無作為に作製
することができ、多様性が1012化合物であることができ
る。最初は、ほとんどの場合、化合物は、連続的に付加
してオリゴマーを形成することによる、同じ二官能価を
使い異なる側基を有するオリゴマーであった。このアプ
ローチはそれ自体オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオ
チドに非常に適していた。実際、天然アミノ酸よりもむ
しろ多種多様なアミノ酸類似体を使ってオリゴペプチド
が拡大された。こうして、非常に異なる側基および異な
るカルボキシル基とアミノ基の間の介在成分を有する鎖
が調製された。より最近になって、組合せライブラリー
は中心の薬理作用基を基にして合成有機分子を組み込む
ことができることが示された。
組合せライブラリーでは、薬剤開発の制限要因はもは
や化合物の多様性ではない。代わりに、化合物の活性に
ついてのスクリーニングが制限段階になった。多数の化
合物を特定の性質について迅速にスクリーニングするこ
とができるためには、比較的安価で、高い忠実度を有す
る迅速な技術を持つことが必要である。加えて、該技術
は所望の治療特性を有する化合物を同定する能力を与え
るべきである。よって、どんなアッセイ技術でも、活性
を容易に検出することができるような手順と、同定され
る活性を有する化合物の本質を考慮に入れるべきであ
る。
関連文献 Galili他,J.Exp.Med.（1985）162:573−582;Galili
他,PNAS（1987）84:1369−1373;およびGalili他,Blood
（1993）82:2485−2493を参照のこと。組合せライブラ
リーに関連した参考文献（前掲）も参照のこと。Gal α
−1,3−ガラクトースのペプチドミメオトープ（mimeoto
pe）については1995年９月27日〜10月１日の第３回国際
異種移植会議（the Third International Congress for
xenot ransplantation）摘要のMcClellan,Oral 34［25
0］も参照のこと。
発明の要約 結合活性について多数の化合物を迅速にスクリーニン
グするための方法および組成物並びに特異的な細胞障害
活性を有する化合物を直接提供するための方法および組
成物が提供される。この方法は、組合せライブラリー中
の化合物にα−ガラクトシル成分のようなハプテンを結
合することを含む。次いで修飾された化合物を、接触の
結果が個々に識別可能である所で細胞または標的分子と
接触させ、例えば各部位において各化合物を同定するこ
とができる標的細胞の集密的培養物（lawn）の上に塗布
するかまたは標的分子と共にインキュベートすることが
できる。次いで細胞または分子を洗浄して非特異的に結
合した化合物を除去する。次いで抗体依存性細胞障害系
を細胞に添加し、そこで抗ハプテン（例えば抗αガラク
トシル）抗体が細胞に結合した化合物に結合し、溶解を
開始させる。細胞の溶解は該化合物が細胞に特異的に結
合したことを示す。２つの類似細胞を比較することによ
り、例えば、２つの細胞の集密的培養物を既知の表面レ
セプターが異なるようにしそしてそれらとライブラリー
のメンバーとの接触の結果（例えばプラークの位置）を
比較することにより、一方の集密的培養物には存在する
が他方の集密的培養物には欠けているレセプターに結合
する化合物を同定することができる。加えて、標的に特
異的に結合するガラクトシル修飾化合物は、標的レセプ
ターに対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての
作用にかかわらず、細胞毒性薬として使うことができ
る。
特定の実施態様の記載 本発明によれば、標的表面膜化合物に特異的な親和性
を有する化合物を同定する方法が提供される。詳しく
は、ガラクトシルエピトープ（「ガラクトシルエピトー
プ」はα−ガラクトシルに特異的な抗体に特異的に結合
する任意の化合物を意味するものである）が様々な化合
物に普遍的に結合していれば、標的細胞への特異的結合
についてライブラリーをスクリーニングすることができ
る。各化合物と細胞との相互作用は個々に識別可能であ
ろう。ライブラリーの化合物と標的細胞とをヒトポリク
ローナル抗体の存在下で一緒にすることにより、化合物
−ガラクトシル接合体の仲介を通してガラクトシルエピ
トープに特異的な免疫グロブリンが細胞に結合するだろ
う。ガラクトシルエピトープへの血中抗体の結合による
免疫複合体の形成は補体カスケードを開始させるだろ
う。補体細胞毒性の結果としての細胞の致死を測定する
ことができ、これは細胞への化合物の結合を暗示するだ
ろう。適当な制御を使うことにより、特定の表面膜タン
パク質に結合する化合物の細胞毒性を制限することがで
きる。結果として生じる化合物−ガラクトシル接合体
は、ヒトまたは霊長類の血液の存在下で細胞を殺すため
の細胞毒性薬として使うことができる。
α−ガラクトシルに対する抗体は、ヒトでは一般に高
レベルで見つかる。この抗体はヒト血液中の全IgG％の
１％のレベルで存在すると報告されている。Galli他,J.
Exp.Med.（1985）162:573−582;Galili他,PNAS（1987）
84:1369−1373;およびGalili他,Blood（1993）82:2485
−2493を参照のこと。この抗体に対する最小のリガンド
は、α−ガラクトシルエピトープと呼ばれるエピトープ
Galα１−13Galである。このエピトープはビーズに結合
されており（Chembiomed,Edmonton,Alberta,Canada）、
容易に合成することができ、そしてガラクトシル基の第
一炭素原子を通して多種多様な慣用官能基、例えばカル
ボキシル、アミノ、オキシ、チオなどと結合させること
ができる。
特定の連結基（linking group）はそれが結合される
化合物によって異なるだろう。ある場合には、連結基は
結合であり、アセチルへのまたは、アセチル基が存在し
ても存在しなくてもよい窒素基への結合であることがで
きる。結合できない時、連結基は通常約１〜20個の水素
以外の原子、より普通には約１〜12個の水素以外の原子
を有し、例えば飽和または不飽和の、通常約１〜12個
の、より普通には約１〜８個の、特に約１〜６個のヘテ
ロ原子（大部分は酸素、窒素、硫黄などであろう）を有
する脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式またはそれらの
組合せであることができる。
組合せライブラリーを調製する場合、基本的に２つの
型があり得る：大部分については、異なる化合物が同一
の二官能性のを共用しそして連続的に付加してオリゴマ
ーを提供するというオリゴマー型；通常は異なる官能性
に基づいて、最終生成物が非オリゴマーであり、通常は
中心基に基づいて中心基の周りに様々な付属基を付けた
合成有機分子であるように、異なる化合物を組み合わせ
るという非オリゴマー型。大部分についてはライブラリ
ーは少なくとも６つの化合物、通常少なくとも10の化合
物、より頻繁には少なくとも100の化合物を含んで成
り、10,000またはそれ以上の化合物を含んで成ってもよ
い。
ほとんどの場合、オリゴマー化合物は少なくとも４
員、通常は少なくとも５員であって且つ普通は30員より
少数、通常は15員以下、より普通には12員以下を有する
だろう。それらの化学は一般にカルボキシルとアミノ基
の組合せ、ヒドロキシルとホスフェート、ポリエーテ
ル、それらの類似体および組合せに基づくだろう。便利
には、ペプチドライブラリーには、多様なオリゴマーを
調製できるように天然のまたは合成のアミノ酸を使うこ
とができる。合成アミノ酸の場合、アミノ基がα位以外
のところにあってもよく、側鎖が異なってもよく、アミ
ノ基が単置換されてもよい。リン酸エステル、特にオリ
ゴヌクレオチドの場合、それの水素、アミノおよび硫黄
類似体、並びにより低い酸化状態、例えばホスホンアミ
ド、ホスホロチオネート、ホスフィット等、リン酸基の
代わりに他の二塩基性酸（例えば炭酸）を使うこと、ヒ
ドロキシル基の供給源を変えること、例えば単糖を変え
ること、５員もしくは６員環の糖を使うこと、酸素の代
わりに窒素または硫黄を使うことなどを使用することが
できる。ヌクレオシドの天然のプリンおよびピリミジン
塩基の代わりに、他の塩基を使ってもよくまたは完全に
異なる側基を使ってオリゴマーの多様性を増加させても
よい。側基が重合もガラクトシルエピトープの存在も妨
害しない限り、コンホメーション、電荷、官能基などを
変化させて側基を選ぶことができる。
オリゴマー型組合せライブラリーの場合、ガラクトシ
ルエピトープは様々な方法で導入することができる。化
学物質の性質に応じて、ガラクトシル基は１または複数
のモノマー基と共に導入することができる。あるいは、
オリゴマーに最終官能価を付加するための任意の慣用の
官能価を使って、最終構成単位としてガラクトシルエピ
トープを提供することができる。オリゴマー化合物の調
製において周知のように、合成工程の最中に基が反応し
ないように種々の基は保護される。保護された基は反応
系列の最後に脱保護することができる。例えば、例とし
て米国特許第4,833,902号；同第5,182,366号；同第5,01
0,175号および同第2,270,170号；並びにWO93/06121;WO9
4/06291;WO92/10588およびWO92/09300を参照のこと。大
部分については、オリゴマーは、固体表面（粒子、シリ
コンチップまたは他の便利な固体支持体であることがで
きる）に結合された状態での鎖の伸長により調製され
る。関係する結合は通常、支持体から所望の化合物を遊
離させるために化学的にまたは光学的に開列可能であろ
う。オリゴマーを合成するためにおよび特定オリゴマー
の同定に備えるために様々な技術が開発されている。例
えば、WO92/00091;WO94/02515;WO93/20242;WO94/06017;
WO94/04558;WO91/17823;およびCho他,Science（1993）2
61:1303を参照のこと。
ライブラリーが非オリゴマー型ライブラリーである場
合、合成方法は合成工程の便利な段階でガラクトシルエ
ピトープを導入する能力を組み込むだろう。大部分につ
いては、これはライブラリーの全メンバーをガラクトシ
ルエピトープの導入を目的として同一容器内に一緒にす
るかまたは異なる容器にアリコートに分けるという最終
段階であろう。
ガラクトシルエピトープを様々な官能性（functional
ity）に連結するには様々な化学を使うことができる。
例えば、Gobbo他,Int.J.Pept.Protein Res.（1992）40:
54−61;WoodおよびWetzel,Bioconjug.Chem.（1992）3:3
91−6;Filira他,Int.J.Pept.Protein Res.（1990）36:8
6−96;Kazimierczuk他,Z.Naturforsch.（1985）40:715
−720;RademannおよびSchmidt,Carbohydr.Res.（1995）
269:217−25;並びにWong他,Glycoconj.J.（1993）10:22
7−234を参照のこと。ガラクトシルエピトープをライブ
ラリー中の重合性モノマー、オリゴマー、または合成有
機化合物に連結させる特定の方法は、ガラクトシルエピ
トープが血中の抗体への結合に利用できる限り、本発明
にとって重要ではない。
ガラクトシル成分の数は少なくとも１であり、合成化
合物は通常多くて２であろう。オリゴマーの場合は、そ
の数はオリゴマーの数まで、通常はオリオマーの数の２
分の１以下、より普通にはオリゴマーの数の５分の１以
下であることができ、好都合には全部で５以下、より好
都合には全部で３以下であろう。
化合物をスクリーニングするために、アッセイはタン
パク質または細胞標的への化合物の結合に関連した検出
可能なシグナルに備えるだろう。アッセイの性質によっ
て、検出可能なシグナルは吸光または発光、プラーク形
成、または他の便利なシグナルであることができる。結
果は定量的であっても定性的であってもよい。
特異的結合について化合物をスクリーニングするため
に、細胞に結合したヒト（または霊長類）抗体を検出す
るのに様々なイムノアッセイを使うことができる。ガラ
クトシルエピトープに特異的に結合したヒト抗体を検出
するのに、標識した抗hIg、例えばhIgM,hIgGまたはそれ
らの組合せを使うことができる。様々な標識、例えば放
射性同位体、酵素、蛍光物質、化学発光物質、粒子など
を使うことができる。標識した抗hIgを提供する市販の
キットも多数存在し、製造業者のプロトコールに従って
使うことができる。
細胞毒性効果について化合物をスクリーニングするた
めには、１つの化合物が所望の活性を有することを保証
するのに様々なプロトコールを使うことができる。通常
は細胞が使われるだろうが、それは天然に存在する細胞
系、変更された細胞系、などであることができる。細胞
は原核であっても真核であってもよい。例えば、病原体
に関心がある場合、すなわちエピトープに化合物−ガラ
クトシル接合体が結合することが重要でない場合、病原
性細胞を抗体依存性細胞毒性系の存在下で各々の化合物
と組み合わせて細胞毒性効果を測定することができる。
このアッセイは、化合物を投与する予定である宿主の細
胞に対する様々な候補化合物の作用を決定する前にまた
は決定した後で実施することができる。こうして、投与
形式に基づいて、出会うかもしれない宿主細胞に対する
親和性と病原性の標識に対する親和性との間の示差的分
析を得ることができる。
ある場合には、自己免疫疾患、移植などにおいてＴ細
胞によって存在し得るような特定の細胞状態、例えば活
性化状態に関心があるだろう。この場合には、まず最初
に化合物をスクリーニングして静止状態の細胞に結合す
るものを決定し、そして静止状態の細胞に結合していな
い化合物に関して、活性化細胞に対する細胞毒性につい
て残りの候補化合物をスクリーニングすることができ
る。次いで化合物に出くわし得る宿主中に存在する別の
細胞についてスクリーニングし、それらの細胞毒性効果
を調べることができる。あるいは、癌細胞と正常細胞を
使い、化合物のいずれか正常細胞に比べて癌細胞に対し
てより高い親和性を有するかを調べる。再び、正常細胞
への結合について化合物のライブラリーをスクリーニン
グし、その効果を調べることができる。正常細胞に対し
て細胞毒性でない化合物を、次に癌細胞に対するそれら
の細胞毒性効果についてスクリーニングすることができ
る。正常細胞に対して幾らか細胞毒性が存在しても、そ
の他の点で癌細胞に効果的であることが証明される場
合、癌細胞の場合に細胞毒性活性に有意な差があれば、
正常細胞に対する低い細胞毒性を許容するのを厭わない
かもしれない。
天然に得られる細胞を使う代わりに、組換え技術によ
り変更された細胞を使うこともできる。例えば、培養に
より増殖せしめることができ、特定遺伝子をアップレギ
ュレーションまたはダウンレギュレーションすることに
より変更することができる細胞を使ってもよい。こうし
て、表面上の単一タンパク質に関して異なる細胞が得ら
れるだろう。次いで特定のタンパク質が存在するかまた
は欠けている細胞に対するライブラリーのメンバーの効
果について該ライブラリーを示差的にアッセイすること
ができる。こうして、化合物が表面膜上に存在するタン
パク質のいずれとも異なるような特定の表面膜タンパク
質に対して特異的な親和性を有するかどうかを決定する
ことができる。
例えば、異なる種、イソタイプまたはそれらの組合せ
を使った、特定の表面膜タンパク質に結合する抗体（該
抗体は補体依存性細胞障害効果を開始しない）を用いる
ことにより、細胞間を識別してもよい。抗体、阻止抗血
清またはモノクローナル抗体を細胞の一部分に添加する
ことにより、それらの細胞はライブラリーメンバーへの
結合に利用できる標的タンパク質を持たなくなるだろ
う。こうして、単一タンパク質の１グループにおける利
用不能性に基づいたそれらの応答が異なる比較細胞を作
製する。抗体は一般に使用が最も便利な試薬であるだろ
うが、同じ機能を提供する他の特異的結合物質を使って
もよい。
結合を測定するためのアッセイにおいて、抗体依存性
細胞障害系を使うことができる。大部分については、抗
ガラクトシル抗体と補体とを含有するヒト全血または血
漿を細胞障害効果に使うことが便利である。しかしなが
ら、細胞障害効果に必要な成分のみが存在する、血液ま
たは血漿の成分の合成混合物を使うことも可能である。
これは血液または血漿の成分が該アッセイの結果に悪影
響を及ぼし得る場合に望ましいかもしれない。
また、細胞の集密的培養物も多数の候補をスクリーニ
ングするのに非常に便利な方法であるが、他の技術も利
用できる。それらの技術は、マルチウエルプレート、お
よび組合せライブラリーの調製に使われる様々な装置、
例えばピン、ティーバッグなどの使用が挙げられる。様
々な装置の性質に関連して個別に細胞を増殖させること
ができ、この場合装置を細胞と接触させるかまたは該装
置上で細胞を増殖させることができる。細胞を接種した
適当な培養液中に該装置を浸漬させるか、または他の方
法で細胞と候補化合物との接触に備える。細胞毒性薬を
添加した後、様々な方法で溶解について分析することが
できる。生存細胞と死細胞とを識別するのにFACSを使っ
てもよく、51Cr放出を使ってもよく、または上清中の細
胞内化合物の検出が活性化合物の検出に役立ってもよ
い。
加えて、化合物がアゴニスト活性を有するのかアンタ
ゴニスト活性を有するのかを知りたいと思うことがあ
る。主題のアッセイ技術は、標的タンパク質に結合する
ライブラリー中の化合物を決定するための迅速な方法に
備える。一度候補化合物の数が実質的に限定されれば、
化合物それ自体の活性を検出するためのより精巧なアッ
セイを使うことができる。こうして、迅速なスクリーニ
ングを実施して結合親和性および特異性を決定すること
ができ、次いでより強固なスクリーニングを実施して活
性を決定することができる。活性の測定には様々な技術
が現存する。該技術では、検出可能なシグナルに備えて
マーカー遺伝子が活性化されるように、細胞を変更する
ことができる。便利には、シグナルは、色素の産生、標
識抗体を使って検出することができる表面膜タンパク質
の産生、または様々な技術のいずれかにより上清中に検
出することができるタンパク質の分泌、に関連させるこ
とができる。例えば、発現される遺伝子は、上清中に分
泌されるようにリーダー配列を持つように修飾されたル
シフェラーゼ遺伝子であることができ、次いでそれによ
り適当な基質を使って発光の形成について上清をスクリ
ーニングすることができる。
ライブラリーをスクリーニングするのに様々なプロト
コールを使うことができる。ある程度、これは化合物の
調製の性質に依存するだろう。例えば、化合物は化合物
の各々が分離可能であるように個々の粒子、ピン、膜な
どに結合させることができる。加えて、入手可能な化合
物の量はライブラリーの作製に使う方法に依存して異な
るだろう。更に、支持体への化合物の結合の性質によっ
て、一連のアッセイを実施できるように化合物のアリコ
ートを遊離させることができる。加えて、化合物をアッ
セイする方法は、活性を有することが示される化合物を
同定する能力によって左右されるだろう。
グリッドの各位置において組成がどんなものか判るよ
うにグリッド中の一表面上に化合物が個別に存在する場
合、グリッドと同様に組織された細胞の集密的培養物を
提供することができ、それに固体表面に結合させた化合
物の名を記名して置くことができる。一度集密的培養物
と固体支持体を記名したら、化合物を取り付けた方法に
従って表面から化合物を遊離させることができる。化合
物が細胞表面上のタンパク質に結合するのに十分な時間
の後、細胞の集密的培養物を洗浄して非特異的に結合し
た化合物を除去する。１回または複数回の洗浄を含める
ことができるが、所望の親和性の程度に依存して、洗浄
が様々な程度の緊縮性に備えてもよい。洗浄が完了した
後、哺乳類の血液または血漿を添加し、細胞毒性に十分
な時間の間インキュベーションする。次いで血漿または
血液を除去し、プラークを観察することができ、そこで
グリッド中の位置によって化合物の性質を決定すること
ができる。もちろん、血漿または血液は集密的培養物の
中の細胞を自然に殺してしまうであろういずれも成分を
含んではならない。
調製方法は繰り返すことができるので、同等な場所に
同一化合物が用意されている複数の固体支持体を調製す
ることができ、その結果として個々の化合物の活性を決
定するために同一または異なる細胞を使ってスクリーニ
ングを繰り返すことができる。
ある場所には、標識の増幅のためにポリメラーゼ連鎖
反応を使って、核酸標識により化合物の正体を決定する
ことができる。例えばWO93/20242を参照のこと。この場
合、溶解物を取り、その溶解物を核酸標識に特異的なプ
ライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応溶媒中に導入する
ことにより、活性である化合物を決定することができ
る。増殖の時に、核酸標識を配列決定することができま
たは他の手段によりその配列を決定することができる。
この手段は化合物を調製するのに使う合成方法を指すだ
ろう。
あるいは、標識が粒子から遊離可能であり且つ該粒子
に結合した化合物のための合成手順を記した二元情報を
与える標識粒子を使うことができる。例えば、Ohlmeyer
他,PNAS USA（1993）90:10922を参照のこと。それらの
標識は便利には、ガスクロマトグラフィー−電子捕獲に
より検出することができるアルキレン化合物の同族系列
であることができる。連結基の性質によって、特定化合
物を同定する前に粒子を２回または３回使えるように粒
子からの部分的遊離に備えてもよい。
大部分についてライブラリーを記述してきたが、ガラ
クトシルエピトープを化合物の各々に取り付けることが
できる限り、化合物のどんな大きい群でも同時にスクリ
ーニングすることができる。巨大分子、オリゴペプチ
ド、リボ核酸、樹状体（デンドリマー）などを含む天然
と合成の両方の異なる源からの化合物も同様な方法でス
クリーニングすることができる。
アッセイにおけるプラークの形成は、細胞（通常は表
面タンパク質）へのライブラリーのメンバーの結合が、
抗体へのα−ガラクトシルエピトープ結合を妨害しない
こと、免疫複合体が補体カスケードを開始させるのに十
分な安定であること、および該メンバーが標的に対して
高い親和性を有することを証明する。
本方法論は、致死させるべき細胞標的、特にα−gal
エピトープが低または無である細胞標的が存在するどん
な状況でも、特定の用途がある。例えば、細胞標的は病
原性の原核生物であることができる。様々な生物として
はミクロバクテリウム、エルシニア、シュードモナス、
ボルデテラ・ペルツッシス（百日咳菌）、トレポネーマ
・パリダム（梅毒トレポネーマ）、ナイセリア・ゴノレ
エ（淋菌）、ストレプトコッカス、ヘモフィルス・イン
フルエンゼ（インフルエンザ菌）などが挙げられる。他
の病原体としては、真核生物、特に真菌、例えばカンジ
ダ、ヒストプラスマ等、および原生動物、例えばジアル
ジア属が挙げられる。加えて、感染細胞中の表面膜タン
パク質に備えるウイルスも主題化合物の標的であること
ができ、この場合スクリーニングされる細胞はウイルス
により感染されている。
細胞が異常であるかまたは宿主に対してもしくは宿主
の処理に対して不利な形で作用する宿主細胞も標的とし
て働くことができる。例えば、正常組織から区別するこ
とができる癌組織は主題化合物の標的として働くことが
できる。自己免疫疾患またはGVHDまたは移植拒絶に関連
づけられるＴもしくはＢ細胞も標的として働くことがで
きる。性質にかかわらず、該細胞が正常細胞から区別で
きる限り、異常細胞も標的として働き得る。よって、乾
癬病変、リンパ腫細胞、細菌、真菌、寄生生物、ウイル
スなどに感染した細胞は、主題化合物の標的となり得
る。また、細胞全部を除去せずに、細胞の一部分、例え
ば識別マーカーを発現している細胞、例えばＴ細胞サブ
セット、活性化された血小板、内皮細胞、ホルモンまた
はサイトカインレセプター発現細胞、を剥離したいと思
う場合、主題化合物を利用することができる。
主題化合物は、特異的標的への種々の剤の輸送のため
のビヒクルとして働くように修飾することができる。α
−ガラクトシル基を多数の異なる基、例えばキレート化
剤、特に放射性標識、毒素、検出可能な標識、抗生物
質、細胞毒性薬、ハプテン、例えばABO、HBsAgなどをキ
レート化するためのキレート化剤で置き換えることがで
きる。あるいは、α−ガラクトシル基を持つかまたは持
たない主題化合物を、生体内診断または治療のために放
射性標識することができる。
主題化合物は、該化合物の性質、適応症の性質、投与
の頻度、急性か慢性かの治療の必要性などに依存して様
々な形式で投与することができる。主題化合物は、一般
的な生理学的に許容される処方に従って、液体または粉
末として製剤化することができる。種々の担体、例えば
水、リン酸塩緩衝化塩溶液、鉱油、植物油、アルコー
ル、脂肪酸エステル、ミョウバン、砂糖などを使っても
よい。活性化合物の用量は、上述したような特定の目的
に応じて広く異なるだろうが、既知の方法に従って経験
的に容易に決定することができる。主題化合物は粉末、
液体、エーロゾル、カプセル、デポー製剤から、錠剤等
として投与することができる。主題化合物は非経口的
に、経口的にまたは吸入により投与することができる。
投与は脈管内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、病巣内な
どであることができる。
主題化合物は、多数の変形のうちの１つが存在するこ
とに関心があるようなアッセイにおいて使うことができ
る。これは、１つまたは数個の対立遺伝子の存在に関心
がある場合に、例えば主要組織適合複合体、血液型判
定、病原菌株などにおいて、特に適用可能である。様々
な対立遺伝子を有する細胞をスクリーニングすることに
より、該対立遺伝子の各々に特異的に結合する化合物を
同定することができる。次いで、各部位が特定の標的化
合物に特異的な異なる化合物を有する、化合物のライブ
ラリーを含んで成る多化合物装置（multicompound devi
ce）を調製することができる。この化合物のライブラリ
ーを細胞と接触せしめそして溶解を検出することによ
り、様々な標的化合物のどれが存在するかを容易に決定
することができる。
次の実施例は例示のつもりで与えられ、限定のつもり
ではない。
実験 αGal成分を含むポリペプチド組合せライブラリーの
調製とスクリーニングによる、ヒトCD4に特異的な治療
薬の同定 ライブラリーの合成はまず、ガラクトシル環の第一炭
素上の反応性基を使ったαGal二糖の生成を必要とす
る。簡単に言えば、これは臭素で保護された２つの環状
化合物（2,3,4,6−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシルブロミドと4,6−Ｏ−ベンジリデン−
1,2−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−ガラクトピラノ
ース）を作製することにより達成される。この２つの構
造物を立体選択的合成により結合せしめて2,4,6,2′,
3′,4′,6′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−α−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブ
ロミドを与える。後者の化合物をナトリウムメトキシド
のメタノール性溶液で処理して臭素を３−チオプロピオ
ン酸のチオグリコシドで置き換える。この末端基は遊離
アミンと反応性であり、既知のプロテアーゼとグリコシ
ダーゼ消化に対して耐性である共有結合を生じる。組合
せライブラリー中へのαGal残基の導入を可能にする試
薬の合成を完成させるために、この構造をアルギニンの
第二級アミンに付加する（αGal−ｓ−Ｒと呼ぶ；ここ
でＲはアミノ酸一文字記号のアルギニンである）。
組合せ化学は、既知のコア結合性配列の周りにリガン
ドが構築される時に最もよく機能する。コア配列は高親
和性−高特異性リガンドの誘導体化のための出発点とし
て使われる。更に、コア配列が既知の生物学的相互作用
から得られる時、コア配列の同定は最も簡単である。よ
って、次のペプチドエピトープスキャンを実施し、ヒト
CD4との相互作用において重要であることが知られてい
るヒト免疫不全ウイルス−１からのgp120分子の307−33
2aa鎖からそのようなコア配列を同定した。全長のgp120
結合領域を包含する重複した14マーペプチドをｆ−moc
化学を使って作製する。それらのペプチドは14マー配列
のアミノ末端のところにαGal−ｓ−Ｒエピトープを含
む。
こうして作製された重複ペプチドの限定ライブラリー
を、可溶性CD4への結合についてアッセイする。これは
次のようにして実施する：可溶性CD4（Intracell:Bosto
n,MA）を96ウエルのドットブロット装置のニトロセルロ
ース膜上に炭酸塩コーティング緩衝液,pH9.6中10μg/m
でスポットする。その膜をリン酸塩緩衝化塩溶液（PB
S）中で洗浄し、５％ウシ血清アルブミン（BSA;注記:BS
Aは非グリコシル化型であり、従ってアッセイを妨害し
得る末端αGal基を持たない）で飽和させる。αGal標識
を含む各ペプチドを個々のウエルに１μg/mで加え、3
7℃にて２時間インキュベートする。膜を再び洗浄し、
次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に接合したB
SIB4レクチン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）と共
にインキュベートする（注記:BSIB4は末端αGal糖に特
異的なレクチンである）。37℃でのもう２時間のインキ
ュベーションともう１回の洗浄の後、ｏ−フェニルアミ
ンジアミン（OPDA;Sigma）とのインキュベーションによ
り結合したレクチン接合体の存在を証明する。2.5N HCl
の添加により反応を停止させ、結果を目で評価する。
この分析は正確な組合せライブラリーの作製のための
２つのコアモチーフ１）RIQRと２）FVTIを与える。第一
モチーフは、それの増強された結合特性と、２つの帯電
アルギニンの存在が可溶性の親水性化合物の生成をもた
らすだろうという事実のために、更なる誘導体化のため
に選ばれる。コア配列と末端糖残基を含有する最初の13
マー組合せハイブリトープライブラリー：αGal−ｓ−
Ｒ−XXX−B1−RIOR−B2−XXX（ここでB1とB2はＬまたは
Ｄアミノ酸の任意の決定されているアミノ酸であり、Ｘ
はまだ決定されていないアミノ酸を意味する）を作製す
る。組合せペプチドはアルギニンの遊離型第一級アミン
を通してαGal−ｓ−Ｒに連結される。これは単一のαG
al糖を含有する1,600の13マーの既知の順列（permutati
on）を与える。
このライブラリーは補体依存性方式で合成され試験さ
れる。ヒトCD4＋クローン（SUP−T1:ATCC,Rockville,M
D）を過剰の51Cr（Amersham,Arlington Hts.,IL）中で3
7℃で２時間インキュベーションすることにより標識す
る。細胞を洗浄し、次いで17枚のマイクロタイタープレ
ートに10,000細胞／ウエルの密度でアリコートに分け
る。ペプチド／抗体に結合したCD4の免疫活性調節を防
ぐためにその後の全段階は氷上で実施する。各化合物を
異なるウエルに１μg/mの濃度で添加する。メリビオ
ースカラム（Sigma:メリビオースは末端αGal基を含
む）から免疫アフィニティー精製されたヒト抗αGal抗
体を、2.3μg/mの最終濃度になるように各ウエルに添
加する。補体（クラスI:One lambda,Canoga Park,CA）
を1:10の最終希釈度でウエルに添加し、１時間インキュ
ベートする。次いでプレートを５分間遠心し、上清を収
穫する。乾燥した後、ペプチドと抗体に結合した細胞の
補体依存性溶解後に培地中に放出された51Crの量を、ガ
ンマカウンター中で評価する。
51Crの放出量が最大であることは、αGal含有ヘキサ
マーの結合が最強であることを表す。最良の結果を与え
るB1とB2の組合せを選択し、他の２残基の限定に使う。
こうして、単一のαGal残基を含む限定された13マーが
単離されるまで、反復工程を続ける。
次にこの組合せ生成物の特異性および有用性を試験す
る。αGal−13マーを正常ヒト末梢血リンパ球中のCD4細
胞の溶解についてアッセイする。これは、フィコール密
度勾配により赤血球から白血球を分離することにより行
う。抗CD4抗体を使った単純な蛍光標示式細胞分取法（F
ACS）はこのＴ細胞亜集団の存在を証明する。次いで細
胞をαGal−13マー、天然のヒト抗αGal抗体および補体
と共にインキュベーションし、この集団を除去する。該
試料を使った２回目のFACS分析はCD4＋細胞の消失を証
明する。
更に、多数の固体の血清において機能する生成物の能
力を試験する。SUP−T1細胞を標識し、αGal−13マーと
共にインキュベートし、次いで多数の新鮮なヒト血清試
料と共にインキュベートする。天然ヒト抗αGal抗体と
生来の補体が標識した標的を溶解する。上清を収集し、
ガンマカウンター中で分析する。
当該方法および組成物は広い用途、特に細胞毒性活性
を有する化合物を開発したいと思うような用途、を有す
ることは明らかである。一般に利用できる組合せ技術の
いずれも、ライブラリー中の化合物の各々がガラクトシ
ルエピトープを有するような大規模ライブラリーの作製
に使うことができる。こうして、細胞の特定の標的に対
して高い特異性と親和性を有し、且つ生体内で該細胞の
除去を誘導するように補体カスケードを開始させること
ができる、化合物を限定することができる。
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願
は、あたかも個々に刊行物または特許出願それぞれが明
確に且つ個別に参考により組み込まれると指摘されたか
のように参考により本明細書に組み込まれる。
本発明を今まで十分に記載してきたが、添付の請求の
範囲の精神および範囲から逸脱することなく多数の変更
および修正を行い得ることは当業者にとって明白であろ
う。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ (72)発明者 ビューロー，ローランド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303，パロ アルト，ロス ロード 2747 (72)発明者 プレティ，フィリップ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94027，アザートン，オーデル プレイ ス ３ (56)参考文献 特開 昭63−15162（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−94710（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／2515（ＷＯ，Ａ１) 国際公開95／24924（ＷＯ，Ａ１) 国際公開95／16789（ＷＯ，Ａ１) 欧州特許出願公開345732（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 G01N 33/15 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞またはタンパク質標的に対する化合物
    のライブラリーのメンバーの結合親和性を前記標的への
    前記メンバーの結合により決定する方法であって、ここ
    で前記メンバーはガラクトシルエピトープを含んで成る
    ことにより特徴付けられ、 前記標的への前記メンバーの結合のための条件下で前記
    ライブラリーの前記メンバーを前記標的と接触せしめ、
    そこで前記標的と前記メンバーとの相互作用が個別に識
    別可能であり； 予め決められた緊縮性の下で、非特異的に結合したメン
    バーを前記標的から洗い流し； 前記標的を、霊長類抗ガラクトシル抗体および前記霊長
    類抗ガラクトシル抗体の存在に関する検出可能なシグナ
    ルを与えるための試薬を含んで成る組成物と接触せし
    め；そして 前記検出可能なシグナルを測定し、それにより特定のメ
    ンバーに関する前記検出可能なシグナルの存在が前記標
    的への前記メンバーの特異的結合を表す ことを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】前記標的が細胞である、請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】前記メンバーが前記細胞との接触前に固体
    支持体に結合される、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記メンバーがオリゴマーである、請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記オリゴマーがオリゴペプチドである、
    請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドであ
    る、請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】細胞標的に対する化合物のライブラリーの
    メンバーの結合親和性を前記標的への前記メンバーの結
    合により決定する方法であって、ここで前記メンバーは
    ガラクトシルエピトープを含んで成ることにより特徴付
    けられ、 前記細胞標的への前記メンバーの結合のための条件下で
    前記ライブラリーの前記メンバーを前記標的と接触せし
    め、そこで前記標的と前記メンバーとの相互作用が個別
    に識別可能であり； 予め決められた緊縮性の下で、非特異的に結合したメン
    バーを前記細胞標的から洗い流し； 前記細胞標的を、抗ガラクトシル抗体と補体とを含んで
    成る組成物と接触せしめ；そして 前記細胞標的の溶解を測定し、ここで特定のメンバーに
    関する細胞標的の細胞溶解が前記細胞標的への前記メン
    バーの特異的結合を表す ことを含んで成る方法。
  8. 【請求項８】前記細胞が細胞の集密的培養物として存在
    する、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記メンバーがオリゴマーである、請求項
    ７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】細胞の表面上にあるタンパク質に対する
    化合物のライブラリーのメンバーの結合を決定する方法
    であって、ここで前記メンバーはガラクトシルエピトー
    プを含んで成ることにより特徴づけられ、 第一の細胞グループへの前記メンバーの結合のための条
    件下で、前記ライブラリーの前記メンバーを、結合に利
    用可能な前記タンパク質を含んで成る第一の細胞グルー
    プと接触せしめ、ここで前記細胞と前記メンバーの各々
    との相互作用が個別に識別可能であり； 第二の細胞グループへの前記メンバーの結合のための条
    件下で、前記ライブラリーの前記メンバーを、前記タン
    パク質が結合に利用できないような前記第二の細胞グル
    ープと触せしめ、そこで前記第二の細胞グループと前記
    メンバーの各々との相互作用が個別に識別可能であり； 予め決められた緊縮性の下で、前記第一の細胞グループ
    と第二の細胞グループから非特異的に結合したメンバー
    を洗い流し； 前記第一および第二の細胞グループを、抗ガラクトシル
    抗体または抗体依存性細胞障害系を含んで成る細胞毒性
    組成物と接触せしめ；そして 前記細胞の溶解を測定し、それにより特定のメンバーに
    関する前記第一の細胞グループの細胞の溶解の存在、お
    よび前記と同じ特定のメンバーに関する前記第二の細胞
    グループの細胞の溶解の欠失が、前記タンパク質への前
    記メンバーの特異的結合を表す ことを含んで成る方法。
  11. 【請求項１１】前記細胞が原核である、請求項10に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】前記細胞が真核である、請求項10に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】前記細胞毒性組成物が血液または血漿で
    ある、請求項10に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記第一の細胞グループと第二の細胞グ
    ループが細胞の集密的培養物として接触させられる、請
    求項10に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記細胞グループの一方が正常細胞から
    成り、そして前記細胞グループの他方が前記正常細胞の
    異常形態から成る、請求項10に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記メンバーがオリゴマーである、請求
    項10に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記オリゴマーがオリゴペプチドであ
    る、請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドで
    ある、請求項16に記載の方法。
  19. 【請求項１９】化合物の各々がガラクトシルエピトープ
    を含んで成ることにより特徴付けられる、請求項１〜18
    のいずれか１項に記載の方法において使用するための、
    オリゴマー又は合成有機化合物である、化合物の組合せ
    ライブラリー。
  20. 【請求項２０】前記化合物がオリゴマーである、請求項
    19に記載の組合せライブラリー。
  21. 【請求項２１】前記オリゴマーがオリゴペプチドであ
    る、請求項20に記載の組合せライブラリー。
  22. 【請求項２２】前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドで
    ある、請求項20に記載の組合せライブラリー。
JP51661397A 1995-10-24 1996-09-27 抗アルファ−ガラクトシルスクリーニング技術 Expired - Fee Related JP3295431B2 (ja)

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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6933366B2 (en) * 1996-12-27 2005-08-23 Tripep Ab Specificity exchangers that redirect antibodies to bacterial adhesion receptors
US6660842B1 (en) * 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
WO1998011436A1 (en) * 1996-09-13 1998-03-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Non-specific affinity enhancement to identify combinatorial library members
DE10031028B4 (de) * 2000-06-26 2008-09-04 Gnothis Holding Sa Verfahren zur Selektion von Partikeln
US6809099B2 (en) * 2000-11-03 2004-10-26 President And Fellows Of Harvard College Saframycins, analogues and uses thereof
US20040236514A1 (en) * 2001-12-13 2004-11-25 Lee Stephen C. Controlling distribution of epitopes in polypeptide sequences
AU2003267124A1 (en) 2002-09-09 2004-03-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bh3 peptides and method of use thereof
US7335359B2 (en) 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
US7318926B2 (en) * 2003-02-06 2008-01-15 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
US7183054B2 (en) * 2003-06-03 2007-02-27 President And Fellows Of Harvard College Assay for identifying biological targets of polynucleotide-binding compounds
CA2645853A1 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Dana-Farber Cancer Institute Methods of determining cellular chemosensitivity
US20090092631A1 (en) * 2007-03-26 2009-04-09 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers that induce an antibody dependent cellular cytotoxicity (adcc) response
CA2775765A1 (en) * 2009-10-05 2011-04-14 Opsonic Therapeutics Inc. High affinity adaptor molecules for redirecting antibody specifity
AU2013317985B2 (en) 2012-09-19 2019-06-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Dynamic BH3 profiling
EP3047276B1 (en) 2013-09-19 2023-06-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of bh3 profiling
EP3289094B1 (en) 2015-04-27 2024-06-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for assessing toxicity using dynamic bh3 profiling

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3819707A1 (de) * 1988-06-09 1989-12-14 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur bestimmung eines antikoerpertiters
WO1994002515A1 (en) * 1992-07-21 1994-02-03 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
DE69517683T2 (de) * 1994-03-15 2001-06-07 Medical College Of Pennsylvania And Hahnemann University, Philadelphia Alpha-galactosyl-epitope enthaltende zusammensetzungen und verfahren für impfstoffe

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