JPH10510059A - 抗アルファ−ガラクトシルスクリーニング技術 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ガラクトシルエピトープを使って化合物およびライブラリーを標識し、次いで着目の性質を有する細胞に関係するアッセイに従ってスクリーニングする。便利には、スクリーニングは標的細胞を使い、化合物を該細胞と接触させることができる。化合物の各々がそれの正体の情報または合成方法の情報を担持している。非特異的に結合した細胞を洗い流した後、血液を細胞に適用し、それによりガラクトシルエピトープへの抗体結合が補体カスケードを開始する。プラークを同定し、該プラークと関連した化合物を同定する。プラークの形成は該化合物が標的細胞に対して特異的親和性を有すること、細胞への該化合物の結合が抗体の結合を妨害しないこと、および該複合体が補体カスケードによって細胞毒性活性を有し得ることを証明する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗アルファ−ガラクトシルスクリーニング技術序論 技術分野 本発明の分野は、分子標的への結合についての化合物のスクリーニングである 。背景 製薬業は、数が増加し続けている病気を治療することができる新規化合物の開 発に絶えず依存している。様々な病原性物質を検出できる能力が高まるにつれ、 １または複数の病原体に対して特異性を有する新規治療薬を開発する機会が生じ る。加えて、組織、可動細胞、器官、分化の程度などに関連して、個々の細胞に 関連づけられた多数の細胞マーカー（レセプターを含む）が存在する。多くの場 合、それらのマーカーへの結合は、細胞内過程を開始させるかまたは抑制するよ うに膜の向こう側でシグナルを変換するだろう。それらの過程は活性化／不活性 化、分化、分泌、増殖、細胞障害活性、様々な栄養素の代謝などを含み得る。多 くの場合、それらの様々な過程に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして 作用する化合物を得たいと希望する。加えて、様々な細胞を選択的に致死させた り様々な細胞を不活性化させたりしたいと望むこともある。例えば、正常細胞を 害することなく癌細胞を選択的に殺すことができることは非常に望ましいだろう 。 更に、現在使われている薬剤の多くは複数の作用を有する。薬剤は着目の特定 の作用を発揮するよりも、宿主にとって有害となり得 る他の一連の作用をもたらす。ほとんどの場合、この有害作用は、薬剤が我々の 所望しているほど標的に特異的でなく、その結果別の標的に結合しそして望まし くない副作用を誘導するためである。 新規化合物を合成することまたは自然界の新規化合物を同定することは非常に 費用がかかる。従ってほとんどの場合、有効な薬理作用基(Pharmacophore)のレ パートリーが比較的限定される。関連薬剤デザインは幾分看破力があるとわかっ たが、期待するほど上手くはいっていない。薬剤がそれのレセプターに結合する 時、レセプターのコンホメーションが変化し得ることが判明したために状況は特 に複雑である。従って、レセプターと薬剤とが相互作用する様式に依存して結合 部位の立体的コンホメーションが相当な変化を受けることがあり、これは薬剤を デザインする時に重要な掛かり合いを持つ。 薬剤の開発に利用できる化合物により大きな多様性を加えるために、組合せラ イブラリーが作製された。それらのライブラリーは多数の化合物、特に何千もの 化合物を比較的短時間のうちに調製することができると言われる。組合せライブ ラリーはモチーフなしで無作為に作製することができ、多様性が10¹²化合物であ ることができる。最初は、ほとんどの場合、化合物は、連続的に付加してオリゴ マーを形成することによる、同じ二官能価を使い異なる側基を有するオリゴマー であった。このアプローチはそれ自体オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド に非常に適していた。実際、天然アミノ酸よりもむしろ多種多様なアミノ酸類似 体を使ってオリゴペプチドが拡大された。こうして、非常に異なる側基および異 なるカルボキシル基とアミノ基の間の介在成分を有する鎖が調製された。より最 近になって、組合せライブラリーは中心の薬理作用基を基にして合成有機分子を 組み込むことができることが示された。 組合せライブラリーでは、薬剤開発の制限要因はもはや化合物の多様性ではな い。代わりに、化合物の活性についてのスクリーニングが制限段階になった。多 数の化合物を特定の性質について迅速にスクリーニングすることができるために は、比較的安価で、高い忠実度を有する迅速な技術を持つことが必要である。加 えて、該技術は所望の治療特性を有する化合物を同定する能力を与えるべきであ る。よって、どんなアッセイ技術でも、活性を容易に検出することができるよう な手順と、同定される活性を有する化合物の本質を考慮に入れるべきである。関連文献 Galili他，J．Exp．Med．（1985）162:573-582; Galili 他，PNAS（1987）84: 1369-1373；およびGalili他，Blood（1993）82:2485-2493を参照のこと。組合せ ライブラリーに関連した参考文献（前掲）も参照のこと。Gal α−１，３−ガラ クトースのペプチドミメオトープ(mimeotope)については1995年９月27日〜10月 １日の第３回国際異種移植会議（the Third International Congress for xenot ransplantation）摘要のMcClellan，Oral 34[250]も参照のこと。発明の要約 結合活性について多数の化合物を迅速にスクリーニングするための方法および 組成物並びに特異的な細胞障害活性を有する化合物を直接提供するための方法お よび組成物が提供される。この方法は、組合せライブラリー中の化合物にα−ガ ラクトシル成分のようなハプテンを結合することを含む。次いで修飾された化合 物を、接触の結果が個々に識別可能である所で細胞または標的分子と接触させ、 例えば各部位において各化合物を同定することができる標的細胞の 芝生（lawn）の上に塗布するかまたは標的分子と共にインキュベートすることが できる。次いで細胞または分子を洗浄して非特異的に結合した化合物を除去する 。次いで抗体依存性細胞障害系を細胞に添加し、そこで抗ハプテン（例えば抗α ガラクトシル）抗体が細胞に結合した化合物に結合し、溶解を開始させる。細胞 の溶解は該化合物が細胞に特異的に結合したことを示す。２つの類似細胞を比較 することにより、例えば、２つの細胞の芝生を既知の表面レセプターが異なるよ うにしそしてそれらとライブラリーのメンバーとの接触の結果（例えばプラーク の位置）を比較することにより、一方の芝生には存在するが他方の芝生には欠け ているレセプターに結合する化合物を同定することができる。加えて、標的に特 異的に結合するガラクトシル修飾化合物は、標的レセプターに対するアゴニスト またはアンタゴニストとしての作用にかかわらず、細胞毒性薬として使うことが できる。特定の実施態様の記載 本発明によれば、標的表面膜化合物に特異的な親和性を有する化合物を同定す る方法が提供される。詳しくは、ガラクトシルエピトープ（「ガラクトシルエピ トープ」はα−ガラクトシルに特異的な抗体に特異的に結合する任意の化合物を 意味するものである）が様々な化合物に普遍的に結合していれば、標的細胞への 特異的結合についてライブラリーをスクリーニングすることができる。各化合物 と細胞との相互作用は個々に識別可能であろう。ライブラリーの化合物と標的細 胞とをヒトポリクローナル抗体の存在下で一緒にすることにより、化合物−ガラ クトシル接合体の仲介を通してガラクトシルエピトープに特異的な免疫グロブリ ンが細胞に結合するだろう。ガラクトシルエピトープへの血中抗体の結合による 免疫複合体の 形成は補体カスケードを開始させるだろう。補体細胞毒性の結果としての細胞の 致死を測定することができ、これは細胞への化合物の結合を暗示するだろう。適 当な制御を使うことにより、特定の表面膜タンパク質に結合する化合物の細胞毒 性を制限することができる。結果として生じる化合物−ガラクトシル接合体は、 ヒトまたは霊長類の血液の存在下で細胞を殺すための細胞毒性薬として使うこと ができる。 α−ガラクトシルに対する抗体は、ヒトでは一般に高レベルで見つかる。この 抗体はヒト血液中の全ＩｇＧ％の１％のレベルで存在すると報告されている。Ga lli 他，J．Exp．Med．（1985）162:573-582；Galili他，PNAS（1987）84:1369- 1373; およびGalili他，Blood（1993）82:2485-2493 を参照のこと。この抗体に 対する最小のリガンドは、α−ガラクトシルエピトープと呼ばれるエピトープ G alα １−３Gal である。このエピトープはビーズに結合されており（Chembiome d，Edmonton，Alberta，Canada）、容易に合成することができ、そしてガラクト シル基の第一炭素原子を通して多種多様な慣用官能基、例えばカルボキシル、ア ミノ、オキシ、チオなどと結合させることができる。 特定の連結基（linking group）はそれが結合される化合物によって異なるだ ろう。ある場合には、連結基は結合であり、アセチルへのまたは、アセチル基が 存在しても存在しなくてもよい窒素基への結合であることができる。結合でない 時、連結基は通常約１〜20個の水素以外の原子、より普通には約１〜12個の水素 以外の原子を有し、例えば飽和または不飽和の、通常約１〜12個の、より普通に は約１〜８個の、特に約１〜６個のヘテロ原子（大部分は酸素、窒素、硫黄など であろう）を有する脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式またはそれらの組合せで あることができる。 組合せライブラリーを調製する場合、基本的に２つの型があり得る：大部分に ついては、異なる化合物が同一の二官能性を共有しそして連続的に付加してオリ ゴマーを提供するというオリゴマー型；通常は異なる官能性に基づいて、最終生 成物が非オリゴマーであり、通常は中心基に基づいて中心基の周りに様々な付属 基を付けた合成有機分子であるように、異なる化合物を組み合わせるという非オ リゴマー型。大部分についてはライブラリーは少なくとも６つの化合物、通常少 なくとも10の化合物、より頻繁には少なくとも100 の化合物を含んで成り、10,0 00またはそれ以上の化合物を含んで成ってもよい。 ほとんどの場合、オリゴマー化合物は少なくとも４員、通常は少なくとも５員 であって且つ普通は30員より少数、通常は15員以下、より普通には12員以下を有 するだろう。それらの化学は一般にカルボキシルとアミノ基の組合せ、ヒドロキ シルとホスフェート、ポリエーテル、それらの類似体および組合せに基づくだろ う。便利には、ペプチドライブラリーには、多様なオリゴマーを調製できるよう に天然のまたは合成のアミノ酸を使うことができる。合成アミノ酸の場合、アミ ノ基がα位以外のところにあってもよく、側鎖が異なってもよく、アミノ基が単 置換されてもよい。リン酸エステル、特にオリゴヌクレオチドの場合、それの水 素、アミノおよび硫黄類似体、並びにより低い酸化状態、例えばホスホンアミド 、ホスホロチオネート、ホスフィット等、リン酸基の代わりに他の二塩基性酸（ 例えば炭酸）を使うこと、ヒドロキシル基の供給源を変えること、例えば単糖を 変えること、５員もしくは６員環の糖を使うこと、酸素の代わりに窒素または硫 黄を使うことなどを使用することができる。ヌクレオシドの天然のプリンおよび ピリミジン塩基の代わりに、他の塩基を使ってもよくまたは完全に異なる側基を 使ってオリゴ マーの多様性を増加させてもよい。側基が重合もガラクトシルエピトープの存在 も妨害しない限り、コンホメーション、電荷、官能基などを変化させて側基を選 ぶことができる。 オリゴマー型組合せライブラリーの場合、ガラクトシルエピトープは様々な方 法で導入することができる。化学物質の性質に応じて、ガラクトシル基は１また は複数のモノマー基と共に導入することができる。あるいは、オリゴマーに最終 官能価を付加するための任意の慣用の官能価を使って、最終構成単位としてガラ クトシルエピトープを提供することができる。オリゴマー化合物の調製において 周知のように、合成工程の最中に基が反応しないように種々の基は保護される。 保護された基は反応系列の最後に脱保護することができる。例えば、例として米 国特許第4,833,902 号；同第5,182,366号；同第5,010,175 号および同第2,270,1 70 号；並びにWO 93/06121 ；WO 94/06291 ；WO 92/10588 およびWO 92/09300 を参照のこと。大部分については、オリゴマーは、固体表面（粒子、シリコンチ ップまたは他の便利な固形支持体であることができる）に結合された状態での鎖 の伸長により調製される。関係する結合は通常、支持体から所望の化合物を遊離 させるために化学的にまたは光学的に開裂可能であろう。オリゴマーを合成する ためにおよび特定オリゴマーの同定に備えるために様々な技術が開発されている 。例えば、WO 92/00091 ；WO 94/02515 ；WO 93/20242 ；WO 94/06017 ；WO 94/ 04558 ；WO 91/17823 ；およびCho 他，Science（1993）261:1303を参照のこと 。 ライブラリーが非オリゴマー型ライブラリーである場合、合成方法は合成工程 の便利な段階でガラクトシルエピトープを導入する能力を組み込むだろう。大部 分については、これはライブラリーの全メンバーをガラクトシルエピトープの導 入を目的として同一容器内 に一緒にするかまたは異なる容器にアリコートに分けるという最終段階であろう 。 ガラクトシルエピトープを様々な官能性(functionality)に連結するには様々 な化学を使うことができる。例えば、Gobbo 他，Int．J．Pept．Protein Res． （1992）40:54-61；WoodおよびWetzel，Bioconjug．Chem．（1992）3:391-6；Fi lira他，Int．J．Pept．Protein Res．（1990）36:86-96；Kazimierczuk 他，Z ．Naturforsch．(1985)40:715-720；RademannおよびSchmidt，Carbohydr．Res． （1995）269:217-25；並びにWong他，Glycoconj．J．（1993）10:227-234 を参 照のこと。ガラクトシルエピトープをライブラリー中の重合性モノマー、オリゴ マー、または合成有機化合物に連結させる特定の方法は、ガラクトシルエピトー プが血中の抗体への結合に利用できる限り、本発明にとって重要ではない。 ガラクトシル成分の数は少なくとも１であり、合成化合物は通常多くて２であ ろう。オリゴマーの場合は、その数はオリゴマーの数まで、通常はオリオマーの 数の２分の１以下、より普通にはオリゴマーの数の５分の１以下であることがで き、好都合には全部で５以下、より好都合には全部で３以下であろう。 化合物をスクリーニングするために、アッセイはタンパク質または細胞標的へ の化合物の結合に関連した検出可能なシグナルに備えるだろう。アッセイの性質 によって、検出可能なシグナルは吸光または発光、プラーク形成、または他の便 利なシグナルであることができる。結果は定量的であっても定性的であってもよ い。 特異的結合について化合物をスクリーニングするために、細胞に結合したヒト （または霊長類）抗体を検出するのに様々なイムノアッセイを使うことができる 。ガラクトシルエピトープに特異的に結合したヒト抗体を検出するのに、標識し た抗hIg 、例えば抗hIgM， hIgGまたはそれらの組合せを使うことができる。様々な標識、例えば放射性同位 体、酵素、蛍光物質、化学発光物質、粒子などを使うことができる。標識した抗 hlg を提供する市販のキットも多数存在し、製造業者のプロトコールに従って使 うことができる。 細胞毒性効果について化合物をスクリーニングするためには、１つの化合物が 所望の活性を有することを保証するのに様々なプロトコールを使うことができる 。通常は細胞が使われるだろうが、それは天然に存在する細胞系、変更された細 胞系、などであることができる。細胞は原核であっても真核であってもよい。例 えば、病原体に関心がある場合、すなわちエピトープに化合物−ガラクトシル接 合体が結合することが重要でない場合、病原性細胞を抗体依存性細胞毒性系の存 在下で各々の化合物と組み合わせて細胞毒性効果を測定することができる。この アッセイは、化合物を投与する予定である宿主の細胞に対する様々な候補化合物 の作用を決定する前にまたは決定した後で実施することができる。こうして、投 与形式に基づいて、出会うかもしれない宿主細胞に対する親和性と病原性の標識 に対する親和性との間の示差的分析を得ることができる。 ある場合には、自己免疫疾患、移植などにおいてＴ細胞によって存在し得るよ うな特定の細胞状態、例えば活性化状態に関心があるだろう。この場合には、ま ず最初に化合物をスクリーニングして静止状態の細胞に結合するものを決定し、 そして静止状態の細胞に結合していない化合物に関して、活性化細胞に対する細 胞毒性について残りの候補化合物をスクリーニングすることができる。次いで化 合物に出くわし得る宿主中に存在する別の細胞についてスクリーニングし、それ らの細胞毒性効果を調べることができる。あるいは、癌細胞と正常細胞を使い、 化合物のいずれが正常細胞に比べて癌細胞に対してより高い親和性を有するかを 調べる。再び、正常細胞へ の結合について化合物のライブラリーをスクリーニングし、その効果を調べるこ とができる。正常細胞に対して細胞毒性でない化合物を、次に癌細胞に対するそ れらの細胞毒性効果についてスクリーニングすることができる。正常細胞に対し て幾らか細胞毒性が存在しても、その他の点で癌細胞に効果的であることが証明 される場合、癌細胞の場合に細胞毒性活性に有意な差があれば、正常細胞に対す る低い細胞毒性を許容するのを厭わないかもしれない。 天然に得られる細胞を使う代わりに、組換え技術により変更された細胞を使う こともできる。例えば、培養により増殖せしめることができ、特定遺伝子をアッ プレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることにより変更すること ができる細胞を使ってもよい。こうして、表面上の単一タンパク質に関して異な る細胞が得られるだろう。次いで特定のタンパク質が存在するかまたは欠けてい る細胞に対するライブラリーのメンバーの効果について該ライブラリーを示差的 にアッセイすることができる。こうして、化合物が表面膜上に存在するタンパク 質のいずれとも異なるような特定の表面膜タンパク質に対して特異的な親和性を 有するかどうかを決定することができる。 例えば、異なる種、イソタイプまたはそれらの組合せを使った、特定の表面膜 タンパク質に結合する抗体（該抗体は補体依存性細胞障害効果を開始しない）を 用いることにより、細胞間を識別してもよい。抗体、阻止抗血清またはモノクロ ーナル抗体を細胞の一部分に添加することにより、それらの細胞はライブラリー メンバーへの結合に利用できる標的タンパク質を持たなくなるだろう。こうして 、単一タンパク質の１グループにおける利用不能性に基づいたそれらの応答が異 なる比較細胞を作製する。抗体は一般に使用が最も便利な試薬であるだろうが、 同じ機能を提供する他の特異的結合物質 を使ってもよい。 結合を測定するためのアッセイにおいて、抗体依存性細胞障害系を使うことが できる。大部分については、抗ガラクトシル抗体と補体とを含有するヒト全血ま たは血漿を細胞障害効果に使うことが便利である。しかしながら、細胞障害効果 に必要な成分のみが存在する、血液または血漿の成分の合成混合物を使うことも 可能である。これは血液または血漿の成分が該アッセイの結果に悪影響を及ぼし 得る場合に望ましいかもしれない。 また、細胞の芝生も多数の候補をスクリーニングするのに非常に便利な方法で あるが、他の技術も利用できる。それらの技術は、マルチウエルプレート、およ び組合せライブラリーの調製に使われる様々な装置、例えばピン、ティーバッグ などの使用が挙げられる。様々な装置の性質に関連して個別に細胞を増殖させる ことができ、この場合装置を細胞と接触させるかまたは該装置上で細胞を増殖さ せることができる。細胞を接種した適当な培養液中に該装置を浸漬させるか、ま たは他の方法で細胞と候補化合物との接触に備える。細胞毒性薬を添加した後、 様々な方法で溶解について分析することができる。生存細胞と死細胞とを識別す るのにＦＡＣＳを使ってもよく、⁵¹Cr放出を使ってもよく、または上清中の細胞 内化合物の検出が活性化合物の検出に役立ってもよい。 加えて、化合物がアゴニスト活性を有するのかアンタゴニスト活性を有するの かを知りたいと思うことがある。主題のアッセイ技術は、標的タンパク質に結合 するライブラリー中の化合物を決定するための迅速な方法に備える。一度候補化 合物の数が実質的に限定されれば、化合物それ自体の活性を検出するためのより 精巧なアッセイを使うことができる。こうして、迅速なスクリーニングを実施し て結合親和性および特異性を決定することができ、次いでより強固 なスクリーニングを実施して活性を決定することができる。活性の測定には様々 な技術が現存する。該技術では、検出可能なシグナルに備えてマーカー遺伝子が 活性化されるように、細胞を変更することができる。便利には、シグナルは、色 素の産生、標識抗体を使って検出することができる表面膜タンパク質の産生、ま たは様々な技術のいずれかにより上清中に検出することができるタンパク質の分 泌、に関連させることができる。例えば、発現される遺伝子は、上清中に分泌さ れるようにリーダー配列を持つように修飾されたルシフェラーゼ遺伝子であるこ とができ、次いでそれにより適当な基質を使って発光の形成について上清をスク リーニングすることができる。 ライブラリーをスクリーニングするのに様々なプロトコールを使うことができ る。ある程度、これは化合物の調製の性質に依存するだろう。例えば、化合物は 化合物の各々が分離可能であるように個々の粒子、ピン、膜などに結合させるこ とができる。加えて、入手可能な化合物の量はライブラリーの作製に使う方法に 依存して異なるだろう。更に、支持体への化合物の結合の性質によって、一連の アッセイを実施できるように化合物のアリコートを遊離させることができる。加 えて、化合物をアッセイする方法は、活性を有することが示される化合物を同定 する能力によって左右されるだろう。 グリッドの各位置において組成がどんなものか判るようにグリッド中の一表面 上に化合物が個別に存在する場合、グリッドと同様に組織された細胞の芝生を提 供することができ、それに固体表面に結合させた化合物の名を記名して置くこと ができる。一度芝生と固体支持体を記名したら、化合物を取り付けた方法に従っ て表面から化合物を遊離させることができる。化合物が細胞表面上のタンパク質 に結合するのに十分な時間の後、細胞の芝生を洗浄して非特異的に 結合した化合物を除去する。１回または複数回の洗浄を含めることができるが、 所望の親和性の程度に依存して、洗浄が様々な程度の緊縮性に備えてもよい。洗 浄が完了した後、哺乳類の血液または血漿を添加し、細胞毒性に十分な時間の間 インキュベーションする。次いで血漿または血液を除去し、プラークを観察する ことができ、そこでグリッド中の位置によって化合物の性質を決定することがで きる。もちろん、血漿または血液は芝生の中の細胞を自然に殺してしまうであろ ういずれも成分を含んではならない。 調製方法は繰り返すことができるので、同等な場所に同一化合物が用意されて いる複数の固体支持体を調製することができ、その結果として個々の化合物の活 性を決定するために同一または異なる細胞を使ってスクリーニングを繰り返すこ とができる。 ある場合には、標識の増幅のためにポリメラーゼ連鎖反応を使って、核酸標識 により化合物の正体を決定することができる。例えばWO 93/20242 を参照のこと 。この場合、溶解物を取り、その溶解物を核酸標識に特異的なプライマーを含む ポリメラーゼ連鎖反応溶媒中に導入することにより、活性である化合物を決定す ることができる。増殖の時に、核酸標識を配列決定することができまたは他の手 段によりその配列を決定することができる。この手段は化合物を調製するのに使 う合成方法を指すだろう。 あるいは、標識が粒子から遊離可能であり且つ該粒子に結合した化合物のため の合成手順を記した二元情報を与える標識粒子を使うことができる。例えば、Oh lmeyer他，PNAS USA（1993）90:10922を参照のこと。それらの標識は便利には、 ガスクロマトグラフィー−電子捕獲により検出することができるアルキレン化合 物の同族系列であることができる。連結基の性質によって、特定化合物を同定す る前に粒子を２回または３回使えるように粒子からの部分的遊離に 備えてもよい。 大部分についてライブラリーを記述してきたが、ガラクトシルエピトープを化 合物の各々に取り付けることができる限り、化合物のどんな大きい群でも同時に スクリーニングすることができる。巨大分子、オリゴペプチド、リボ核酸、樹状 体（デンドリマー）などを含む天然と合成の両方の異なる源からの化合物も同様 な方法でスクリーニングすることができる。 アッセイにおけるプラークの形成は、細胞（通常は表面タンパク質）へのライ ブラリーのメンバーの結合が、抗体へのα−ガラクトシルエピトープ結合を妨害 しないこと、免疫複合体が補体カスケードを開始させるのに十分な位安定である こと、および該メンバーが標的に対して高い親和性を有することを証明する。 本方法論は、致死させるべき細胞標的、特にα−gal エピトープが低または無 である細胞標的が存在するどんな状況でも、特定の用途がある。例えば、細胞標 的は病原性の原核生物であることができる。様々な生物としてはミクロバクテウ ム、エルシニア、シュードモナス、ボルデテラ・ペルツッシス（百日咳菌）、ト レポネーマ・パリダム（梅毒トレポネーマ）、ナイセリア・ゴノレエ（淋菌）、 ストレプトコッカス、ヘモフィルス・インフルエンゼ（インフルエンザ菌）など が挙げられる。他の病原体としては、真核生物、特に真菌、例えばカンジダ、ヒ ストプラスマ等、および原生動物、例えばジアルジア属が挙げられる。加えて、 感染細胞中の表面膜タンパク質に備えるウイルスも主題化合物の標的であること ができ、この場合スクリーニングされる細胞はウイルスにより感染されている。 細胞が異常であるかまたは宿主に対してもしくは宿主の処理に対して不利な形 で作用する宿主細胞も標的として働くことができる。例えば、正常組織から区別 することができる癌組織は主題化合物の 標的として働くことができる。自己免疫疾患またはGVHDまたは移植拒絶に関連づ けられるＴもしくはＢ細胞も標的として働くことができる。性質にかかわらず、 該細胞が正常細胞から区別できる限り、異常細胞も標的として働き得る。よって 、乾癬病変、リンパ腫細胞、細菌、真菌、寄生生物、ウイルスなどに感染した細 胞は、主題化合物の標的となり得る。また、細胞全部を除去せずに、細胞の一部 分、例えば識別マーカーを発現している細胞、例えばＴ細胞サブセット、活性化 された血小板、内皮細胞、ホルモンまたはサイトカインレセプター発現細胞、を 剥離したいと思う場合、主題化合物を利用することができる。 主題化合物は、特異的標的への種々の剤の輸送のためのビヒクルとして働くよ うに修飾することができる。α−ガラクトシル基を多数の異なる基、例えばキレ ート化剤、特に放射性標識、毒素、検出可能な標識、抗生物質、細胞毒性薬、ハ プテン、例えばＡＢＯ、HBsAg などをキレート化するためのキレート化剤で置き 換えることができる。あるいは、α−ガラクトシル基を持つかまたは持たない主 題化合物を、生体内診断または治療のために放射性標識することができる。 主題化合物は、該化合物の性質、適応症の性質、投与の頻度、急性か慢性かの 治療の必要性などに依存して様々な形式で投与することができる。主題化合物は 、一般的な生理学的に許容される処方に従って、液体または粉末として製剤化す ることができる。種々の担体、例えば水、リン酸塩緩衝化塩溶液、鉱油、植物油 、アルコール、脂肪酸エステル、ミョウバン、砂糖などを使ってもよい。活性化 合物の用量は、上述したような特定の目的に応じて広く異なるだろうが、既知の 方法に従って経験的に容易に決定することができる。主題化合物は粉末、液体、 エーロゾル、カプセル、デポー製剤から 、錠剤等として投与することができる。主題化合物は非経口的に、経口的にまた は吸入により投与することができる。投与は脈管内、腹腔内、筋肉内、皮下、経 皮、病巣内などであることができる。 主題化合物は、多数の変形のうちの１つが存在することに関心があるようなア ッセイにおいて使うことができる。これは、１つまたは数個の対立遺伝子の存在 に関心がある場合に、例えば主要組織適合複合体、血液型判定、病原菌株などに おいて、特に適用可能である。様々な対立遺伝子を有する細胞をスクリーニング することにより、該対立遺伝子の各々に特異的に結合する化合物を同定すること ができる。次いで、各部位が特定の標的化合物に特異的な異なる化合物を有する 、化合物のライブラリーを含んで成る多化合物装置（multicompound device）を 調製することができる。この化合物のライブラリーを細胞と接触せしめそして溶 解を検出することにより、様々な標的化合物のどれが存在するかを容易に決定す ることができる。 次の実施例は例示のつもりで与えられ、限定のつもりではない。実験 αGal 成分を含むポリペプチド組合せライブラリーの調製とスクリーニングに よる、ヒトCD4 に特異的な治療薬の同定。 ライブラリーの合成はまず、ガラクトシル環の第一炭素上の反応性基を使った αGal 二糖の生成を必要とする。簡単に言えば、これは臭素で保護された２つの 環状化合物（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノ シルブロミドと４，６−Ｏ−ベンジリデン−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α −Ｄ−ガラクトピラノース）を作製することにより達成される。この２つの構造 物を立体選択的合成により結合せしめて２，４，６，２′，３′， ４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −Ｄ−ガラクトピラノシルブロミドを与える。後者の化合物をナトリウムメトキ シドのメタノール性溶液で処理して臭素を３−チオプロピオン酸のチオグリコシ ドで置き換える。この末端基は遊離アミンと反応性であり、既知のプロテアーゼ とグリコシダーゼ消化に対して耐性である共有結合を生じる。組合せライブラリ ー中へのαGal 残基の導入を可能にする試薬の合成を完成させるために、この構 造をアルギニンの第二級アミンに付加する（αGal-s-Ｒと呼ぶ；ここでＲはアミ ノ酸一文字記号のアルギニンである）。 組合せ化学は、既知のコア結合性配列の周りにリガンドが構築される時に最も よく機能する。コア配列は高親和性−高特異性リガンドの誘導体化のための出発 点として使われる。更に、コア配列が既知の生物学的相互作用から得られる時、 コア配列の同定は最も簡単である。よって、次のペプチドエピトープスキャンを 実施し、ヒトCD4 との相互作用において重要であることが知られているヒト免疫 不全ウイルス−１からのgp120 分子の307-332aa 鎖からそのようなコア配列を同 定した。全長のgp120 結合領域を包含する重複した14マーペプチドをf-moc 化学 を使って作製する。それらのペプチドは14マー配列のアミノ末端のところにαGa l-s-Ｒエピトープを含む。 こうして作製された重複ペプチドの限定ライブラリーを、可溶性CD4 への結合 についてアッセイする。これは次のようにして実施する：可溶性CD4（Intracell : Boston，MA）を96ウエルのドットブロット装置のニトロセルロース膜上に炭酸 塩コーティング緩衝液，pH 9.6中10μg/mlでスポットする。その膜をリン酸塩緩 衝化塩溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；注記：Ｂ ＳＡは非グリコシル化型であり、従ってアッセイを妨害し得る末端αGal 基を持 たない）で飽和させる。ａGal 標識を含む各ペプチ ドを個々のウエルに１μg/mlで加え、37℃にて２時間インキュベートする。膜を 再び洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合したBSIB4 レ クチン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）と共にインキュベートする（注 記：BSIB4 は末端αGal 糖に特異的なレクチンである）。37℃でのもう２時間の インキュベーションともう１回の洗浄の後、ｏ−フェニルアミンジアミン（OPDA ；Sigma）とのインキュベーションにより結合したレクチン接合体の存在を証明 する。2.5 N HCl の添加により反応を停止させ、結果を目で評価する。 この分析は正確な組合せライブラリーの作製のための２つのコアモチーフ１） RIQRと２）FVTIを与える。第一モチーフは、それの増強された結合特性と、２つ の帯電アルギニンの存在が可溶性の親水性化合物の生成をもたらすだろうという 事実のために、更なる誘導体化のために選ばれる。コア配列と末端糖残基を含有 する最初の13マー組合せハイブリトープライブラリー：αGal-s-Ｒ−XXX −B1− RIOR−B2−XXX（ここでB1とB2はＬまたはＤアミノ酸の任意の決定されているア ミノ酸であり、Ｘはまだ決定されていないアミノ酸を意味する）を作製する。組 合せペプチドはアルギニンの遊離型第一級アミンを通してαGal-s-Ｒに連結され る。これは単一のαGal 糖を含有する1,600 の13マーの既知の順列(permutation ) を与える。 このライブラリーは補体依存性方式で合成され試験される。ヒトCD4+クローン （SUP-T1：ATCC，Rockville，MD）を過剰の⁵¹Cr（Amersham，Arlington Hts.，I L）中で37℃で２時間インキュベーションすることにより標識する。細胞を洗浄 し、次いで17枚のマイクロタイタープレートに10,000細胞／ウエルの密度でアリ コートに分ける。ペプチド／抗体に結合したCD4 の免疫活性調節を防ぐためにそ の後の全段階は氷上で実施する。各化合物を異なるウエルに１μg/ mlの濃度で添加する。メリビオースカラム（Sigma：メリビオースは末端αGal 基を含む）から免疫アフィニティー精製されたヒト抗αGal 抗体を、2.3 μg/ml の最終濃度になるように各ウエルに添加する。補体（クラスＩ：One lambda，Ca noga Park，CA）を１：10の最終希釈度でウエルに添加し、１時間インキュベー トする。次いでプレートを５分間遠心し、上清を収穫する。乾燥した後、ペプチ ドと抗体に結合した細胞の補体依存性溶解後に培地中に放出された⁵¹Crの量を、 ガンマカウンター中で評価する。 ⁵¹Crの放出量が最大であることは、αGal 含有ヘキサマーの結合が最強である ことを表す。最良の結果を与えるB1とB2の組合せを選択し、他の２残基の限定に 使う。こうして、単一のαGal 残基を含む限定された13マーが単離されるまで、 反復工程を続ける。 次にこの組合せ生成物の特異性および有用性を試験する。ａGal-13マーを正常 ヒト末梢血リンパ球中のCD4 細胞の溶解についてアッセイする。これは、フィコ ール密度勾配により赤血球から白血球を分離することにより行う。抗CD4 抗体を 使った単純な蛍光標示式細胞分取法（FACS）はこのＴ細胞亜集団の存在を証明す る。次いで細胞をαGal-13マー、天然のヒト抗αGal 抗体および補体と共にイン キュベーションし、この集団を除去する。該試料を使った２回目のFACS分析はCD 4+細胞の消失を証明する。 更に、多数の個体の血清において機能する生成物の能力を試験する。SUP-T1細 胞を標識し、αGal-13マーと共にインキュベートし、次いで多数の新鮮なヒト血 清試料と共にインキュベートする。天然ヒト抗αGal 抗体と生来の補体が標識し た標的を溶解する。上清を収集し、ガンマカウンター中で分析する。 当該方法および組成物は広い用途、特に細胞毒性活性を有する化合物を開発し たいと思うような用途、を有することは明らかである 。一般に利用できる組合せ技術のいずれも、ライブラリー中の化合物の各々がガ ラクトシルエピトープを有するような大規模ライブラリーの作製に使うことがで きる。こうして、細胞の特定の標的に対して高い特異性と親和性を有し、且つ生 体内で該細胞の除去を誘導するように補体カスケードを開始させることができる 、化合物を限定することができる。 本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行 物または特許出願それぞれが明確に且つ個別に参考により組み込まれると指摘さ れたかのように参考により本明細書に組み込まれる。 本発明を今まで十分に記載してきたが、添付の請求の範囲の精神および範囲か ら逸脱することなく多数の変更および修正を行い得ることは当業者にとって明白 であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 プレティ，フィリップ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94027, アザートン，オーデル プレイス ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞またはタンパク質標的に対する化合物のライブラリーのメンバーの結 合親和性を前記標的への前記メンバーの結合により決定する方法であって、ここ で前記メンバーはガラクトシルエピトープを含んで成ることにより特徴付けられ 、 前記標的への前記メンバーの結合のための条件下で前記ライブラリーの前記メ ンバーを前記標的と接触せしめ、そこで前記標的と前記メンバーとの相互作用が 個別に識別可能であり； 予め決められた緊縮性の下で、非特異的に結合したメンバーを前記標的から洗 い流し； 前記標的を、霊長類抗ガラクトシル抗体および前記霊長類抗ガラクトシル抗体 の存在に関する検出可能なシグナルを与えるための試薬を含んで成る組成物と接 触せしめ；そして 前記検出可能なシグナルを測定し、それにより特定のメンバーに関する前記検 出可能なシグナルの存在が前記標的への前記メンバーの特異的結合を表す ことを含んで成る方法。 ２．前記標的が細胞である、請求項１に記載の方法。 ３．前記メンバーが前記細胞との接触前に固体支持体に結合される、請求項１ に記載の方法。 ４．前記メンバーがオリゴマーである、請求項１に記載の方法。 ５．前記オリゴマーがオリゴペプチドである、請求項４に記載の方法。 ６．前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。 ７．細胞標的に対する化合物のライブラリーのメンバーの結合親 和性を前記標的への前記メンバーの結合により決定する方法であって、ここで前 記メンバーはガラクトシルエピトープを含んで成ることにより特徴付けられ、 前記細胞標的への前記メンバーの結合のための条件下で前記ライブラリーの前 記メンバーを前記標的と接触せしめ、そこで前記標的と前記メンバーとの相互作 用が個別に識別可能であり； 予め決められた緊縮性の下で、非特異的に結合したメンバーを前記細胞標的か ら洗い流し； 前記細胞標的を、抗ガラクトシル抗体と補体とを含んで成る組成物と接触せし め；そして 前記細胞標的の溶解を測定し、ここで特定のメンバーに関する細胞標的の細胞 溶解が前記細胞標的への前記メンバーの特異的結合を表す ことを含んで成る方法。 ８．前記細胞が細胞の芝生として存在する、請求項７に記載の方法。 ９．前記メンバーがオリゴマーである、請求項７に記載の方法。 10．細胞の表面上にあるタンパク質に対する化合物のライブラリーの構成員の 結合を決定する方法であって、ここで前記メンバーはガラクトシルエピトープを 含んで成ることにより特徴づけられ、 第一の細胞グループへの前記メンバーの結合のための条件下で、前記ライブラ リーの前記メンバーを、結合に利用可能な前記タンパク質を含んで成る第一の細 胞グループと接触せしめ、ここで前記細胞と前記メンバーの各々との相互作用が 個別に識別可能であり； 第二の細胞グループへの前記メンバーの結合のための条件下で、前記ライブラ リーの前記メンバーを、前記タンパク質が結合に利用できないような前記第二の 細胞グループと触せしめ、そこで前記第 二の細胞グループと前記メンバーの各々との相互作用が個別に識別可能であり； 予め決められた緊縮性の下で、前記第一の細胞グループと第二の細胞グループ から非特異的に結合したメンバーを洗い流し； 前記第一および第二の細胞グループを、抗ガラクトシル抗体または抗体依存性 細胞障害系を含んで成る細胞毒性組成物と接触せしめ；そして 前記細胞の溶解を測定し、それにより特定のメンバーに関する前記第一の細胞 グループの細胞の溶解の存在、および前記と同じ特定のメンバーに関する前記第 二の細胞グループの細胞の溶解の欠失が、前記タンパク質への前記メンバーの特 異的結合を表す ことを含んで成る方法。 11．前記細胞が原核である、請求項10に記載の方法。 12．前記細胞が真核である、請求項10に記載の方法。 13．前記細胞毒性組成物が血液または血漿である、請求項10に記載の方法。 14．前記第一の細胞グループと第二の細胞グループが細胞の芝生として接触さ せられる、請求項10に記載の方法。 15．前記細胞グループの一方が正常細胞から成り、そして前記細胞グループの 他方が前記正常細胞の異常形態から成る、請求項10に記載の方法。 16．前記メンバーがオリゴマーである、請求項10に記載の方法。 17．前記オリゴマーがオリゴペプチドである、請求項16に記載の方法。 18．前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項16に記載の方法。 19．化合物の全部がガラクトシルエピトープを含んで成ることに より特徴付けられる化合物の組合せライブラリー。 20．前記化合物がオリゴマーである、請求項19に記載の組合せライブラリー。 21．前記オリゴマーがオリゴペプチドである、請求項20に記載の組合せライブ ラリー。 22．前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項20に記載の組合せラ イブラリー。