KR20190024446A - 고친화성 단백질 포획제, 그것의 스크리닝 방법 및 이를 이용한 단백질 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드를 포함하는 단백질 포획제 및 그 스크리닝 방법, 이를 이용한 분석 방법에 대한 것이다.

Description

고친화성 단백질 포획제, 그것의 스크리닝 방법 및 이를 이용한 단백질 검출 방법 {HIGH AFFINITY PROTEIN CAPTURE AGENTS, SCREENIGN METHOD OF IT, AND PROTEIN DETECTION METHOD USING IT}

본 발명은 고친화성 단백질 포획제, 그것의 스크리닝 방법 및 이를 이용한 단백질 검출 방법에 대한 것이다.

효소결합 면역 분석법 (enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 이하 “ELISA”라 한다)는 널리 사용되는 검출 방법으로, 목적 물질을 확인하기 위하여 항체항원 반응을 이용한다. 이 중 샌드위치 ELISA는 항원 검출에 널리 이용되는데, 고정된 1차 항체에 목적 단백질, 즉 항원이 결합하고, 효소가 결합된 2차 항체가 상기 항원과 결합한 후, 기질을 첨가하여 발색되는 반응 생성물을 확인하여 수행된다. 그러나 비록 샌드위치 ELISA가 항원 검출에 현재 널리 사용되는 방법이긴 하나, 항체-항체 페어링(paring)이 이루어지는데 상당한 시간이 걸리고 항체의 제조 비용 또한 적지 않은 단점이 있다.

본 발명자들은 속도가 빠른 ELISA 방법에 대하여 연구하던 중 특정 크기를 가진 펩타이드를 이용 시 ELISA의 수행 속도가 빠를 뿐 아니라 특이성이 높아 분석 효율이 뛰어나다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 분석 속도가 빠르고 분석 효율이 높은 단백질 포획제, 그것의 스크리닝 방법 및 이를 이용한 단백질 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 10-mer 이하의 펩타이드 및 항체를 포함하는 단백질 포획제를 제공한다.

또한 본 발명은 항체를 고정하는 단계; 상기 고정된 항체에 표적 단백질을 처리하는 단계; 펩타이드를 처리하는 단계;및 펩타이드와 표적 단백질의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 표적 단백질에 특이적인 펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 항체를 고정하는 단계; 상기 고정된 항체에 시료를 처리하는 단계; 펩타이드를 처리하는 단계;및 상기 펩타이드와 표적 단백질의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하며, 상기 시료에는 표적 단백질이 포함되어 있거나 포함되어 있지 않고, 상기 항체 및 상기 펩타이드는 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는, 시료의 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 표적 단백질에 대하여 높은 친화성과 결합 효율을 갖는다.

본 발명의 펩타이드는 빠른 속도로 스크리닝할 수 있으며, 이를 이용한 표적 단백질의 검출, 시료의 분석은 기존의 ELISA보다 소요 시간이 단축되고 정확도가 높은 장점을 갖는다.

도 1은 본 발명의 단백질 검출 방법을 보여주는 모식도이다.
도 2는 1차 형광 염료가 부착된 표적 단백질의 모식도이다.
도 3은 2차 형광 염료가 부착된 항체의 모식도이다.
도 4는 표적 단백질에 항체 및 펩타이드가 결합된 것을 보여주는 모식도이다.
도 5는 펩타이드들의 고속대량스크리닝 방법을 보여주는 모식도이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> 표적 단백질 검출에 사용되는 펩타이드의 스크리닝

표적 단백질 검출에 사용되는 펩타이드의 스크리닝 방법을 도 1 내지 도 3을 이용하여 설명한다.

표적 단백질에 1차 형광 염료(예컨대 빨간색 형광 염료)를 부착한다(도 1). 한편, 상기 표적 단백질과 결합 친화성 및 특이성이 높은 단일클론 항체를 준비한다. 상기 항체에 2차 형광 염료(예컨대, 오렌지색 형광 염료)를 부착하고(도 2), 상기 2차 형광 염료가 부착된 항체를 플레이트에 고정한다. 이 때 상기 형광 외 ELISA에서 사용하는 기존의 표지 물질(예컨대, 발색단 등)을 사용하거나 신규 표지 물질을 제조하여 사용할 수 있다.

6-mer의 펩타이드들이 비드(bead)에 붙어있는 라이브러리 (이하 라이브러리)를 준비하다. 그리고 상기 항체 및 표적 단백질에 라이브러리와 어세이한다. 펩타이드가 표적 단백질의 상기 항체 결합 부위가 아닌 다른 결합 부위에 결합하면, 상기 1차 형광(빨간색) 및 2차 형광(오렌지색)를 가진 비드가 확인된다(도 3). 상기 1차 형광 및 2차 형광으로 표지된 비드들을 초고속 스크리닝 툴 (예. COPAS bead sorter)을 이용하여 분리해내고, 상기 비드가 부착된 펩타이드의 서열을 확인 한 후 표적 단백질 검출에 사용하게 된다.

<실시예 2> 펩타이드들의 고속대량스크리닝

6-mer 크기의 펩타이드라이브러리를 1,000개 이상, 바람직하게는 10,000개 이상, 더욱 바람직하게는 100,000개 이상, 더더욱 바람직하게는 200,000개 이상 합성한다(1일 소요).

여기에 염료로 표지한 표적 단백질을 처리하고, 다른 색깔의 염료로 표지된 단클론 항체를 처리한 후 이 둘을 어세이한 후, 라이브러리와 어세이한다. 자동 비드 분류장치를 이용하여 두가지 형광이 동시에 나타나는 비드만을 분류한다(1일 소요). 그리고 확인한 회수한 비드로 부터 펩타이드를 절단하고 (20분), 각 비드위의 펩타이드를 샘플링하여 MALDI-TOF/TOF에 의하여 펩타이드 시퀀싱을 수행한다(2일 소요).

이 때 6-mer 펩타이드를 기준으로 시간 당 50개 펩타이드의 시퀀싱이 가능하다. 이 시퀀싱 결과물을 바탕으로 서열 분석을 하여 가장 빈번한 서열 모티프를 찾아낸다. 이상적으로는 20만개 이상의 라이브러리의 스크리닝이 4일 안에 가능하다. (도 4)

<실시예 3> 표적 단백질의 검출

본 발명의 단백질 검출 방법, 진단 방법은 고정화된 포획 항체에 표적 단백질이 포함된 시료를 처리하고 세척한 후, 여기에 상기 단백질과 결합하는 펩타이드를 처리하고, 이를 확인하는 단계를 포함한다(도 5).

먼저, 상기 실시예 1 및 실시예 2의 방법을 이용하여 표적 단백질의 검출에 적합한 펩타이드 서열을 확보한다. 확보된 펩타이드를 다량확보하여 이차항체를 대신하여 사용한다. 항체를 플레이트에 고정하고, 환자의 혈액을 모사한 혈청(serum)에 표적단백질이 스파이크된 시료를 항체가 코팅된 플레이트에 넣어 반응시킨 후 세척한다. 그 후 상기 펩타이드에 발색단을 부착하여 첨가하고, 표적 단백질과 결합되지 않은 펩타이드들을 제거한다. 그리고 기질을 첨가하고 발색을 측정하여 표적 단백질을 검출한다.

이는 항체-항체 페어링을 이용한 기존의 ELISA보다 시간 및 비용 면에서 개선된 것이다. 또한 이러한 표적 단백질의 검출 방법을 이용하여 여러가지 질병의 진단이 가능하다. 특히, 다양한 단백질 마커에 대하여 항체-펩타이드들 페어링의 프로테오믹스에 근거하여 다중 진단이 가능하다.

<실시예 4> 단백질 포획제의 적용

본 발명의 단백질 포획제는 펩타이드 및 항체를 포함한다. 본 발명의 펩타이드는 분자량이 0.5 kDa 이상 10 kDa 미만이며, 바람직하게는 1 kDa 이상 3 kDa 이하이다. 본 발명의 펩타이드는 2-mer 이상 10-mer 이하의 길이를 가지며, 바람직하게는 2-mer 이상 8-mer 이하의 길이를 갖고, 더욱 바람직하게는 5-mer 이상 8-mer 이하의 길이를 갖는다. 본 발명의 펩타이드는 이렇게 짧은 길이를 갖기 때문에 합성수율이 우수할 뿐 아니라 초고속 스크리닝이 가능하다.

본 발명의 펩타이드는 약 139 Å, 약 150 kDa의 2차 항체 또는 약 25 Å, 약 5 내지 20 kDa의 액타머(aptamer)보다 크기 및 분자량이 작은데도 불구하고 표적 화합물에 대한 결합 친화도(binding affinity)가 우수하다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 수백에서 수십 nM 의 친화도의 범위로 신약의 모티프 분자등의 일반적인 친화도인 μM 범위를 고려할때 약 1,000배 정도로 강하게 결합한다.

또한 본 발명의 펩타이드는 항체와 페어링하여 진단 장치, 의료 기기 등에 적용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 당뇨환자 관리용 CRP 정량 의료 기기, 동반진단(Companion Diagnostics, CDx), ELISA, 프로테오믹스 기반 헬스케어용 진단 등에 적용될 수 있다.

Claims (10)

1. 펩타이드를 포함하는 단백질 포획제.
   
2. 제 1항에 있어서,
   항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 포획제.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 8-mer 이하의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 포획제.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 표적 펩타이드에 대한 특이적 결합능을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 포획제.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 1 kDa 이상 5 kDa 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 포획제.
   
6. 항체를 고정하는 단계;
   상기 고정된 항체에 표적 단백질을 처리하는 단계;
   펩타이드를 처리하는 단계;및
   펩타이드와 표적 단백질의 결합 여부를 확인하는 단계
   를 포함하는 표적 단백질에 특이적인 펩타이드의 스크리닝 방법.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 항체는 1차 표지 물질을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
8. 제 6항에 있어서,
   상기 표적 단백질은 2차 표지 물질을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
9. 제 6항에 있어서,
   상기 펩타이드는 비드를 갖고 있는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
10. 항체를 고정하는 단계;
    상기 고정된 항체에 시료를 처리하는 단계;
    펩타이드를 처리하는 단계;및
    상기 펩타이드와 표적 단백질의 결합 여부를 확인하는 단계
    를 포함하며,
    상기 시료에는 표적 단백질이 포함되어 있거나 포함되어 있지 않고,
    상기 항체 및 상기 펩타이드는 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는, 시료의 분석 방법.
    

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