KR20140080504A

KR20140080504A - 스크리닝 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140080504A
Application number: KR1020147010622A
Authority: KR
Inventors: 비욘 프렌데우스; 제니 맷슨
Original assignee: 바이오인벤트 인터내셔날 에이비
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-06-30
Also published as: CN107663238A; AU2012311542A1; JP2015501289A; CA2848932A1; RU2014115956A; DK2758532T3; JP2018154627A; EP2758532B1; HK1200486A1; WO2013041643A1; CA2848932C; PT2758532T; JP6370220B2; EP2758532A1; US20140227249A1; ES2690783T3; GB201116364D0; KR102024125B1; CN103827302A; US10191049B2

Abstract

본 발명은 향상된 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 차등적으로 그리고/또는 저빈도로 발현되는 리간드에 특이적인 항-리간드를 식별하기 위한 항-리간드 라이브러리 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

스크리닝 방법 및 이의 용도{SCREENING METHODS AND USES THEREOF}

본 발명은 향상된 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 다르게 발현되는 그리고/또는 드물게 발현되는 리간드에 특이적인 항-리간드를 식별하는 항-리간드 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

단백질 또는 펩타이드계 라이브러리는 종종 특정 리간드에 대한 특이성으로 항-리간드 분자를 선별하는데 사용된다.

이러한 라이브러리는, 단백질 분자가 일부 방식으로 특정 단백질 분자를 암호화하는 유전 정보에 물리적으로 연결되도록 구성된다. 따라서, 단백질 분자는 이의 유전자와 함께 표시된다.

통상적으로 사용되는 디스플래이 형태는 단백질 분자를 제시하는 세포 또는 바이러스 숙주 파티클에 의존하며; 그리고 박테리아 디스플래이(Francisco et al., 1993) 및 파아지 디스플래이(Smith, 1985; Smith 및 Scott, 1993; Winter et al., 1994)를 포함한다. 이러한 시스템은 숙주 파티클의 표면에 잠재적 항-리간드 분자를 디스플래이하나, 디스플래이된 분자에 대한 유전 정보는 상기 파티클 내부에 은닉되고, 상기 방법은 특정 단백질계 항-리간드의 선별에 성공적으로 이용되었다.

시험관내 번역에 의존하는 다른 디스플래이 형태가 존재하며; 이에는 단백질 분자와 유전 정보의 비공유 결합에 의존하는 다양한 형태의 리보솜 디스플래이(Mattheakis et al., 1994; Hanes 및 Pluckthun, 1997; He 및 Taussig, 1997)가 포함되며; 그리고 다른 디스플래이 형태는 또한 시험관내 번역에 의존하며, 이에 의해 프로퓨전(Weng et al., 2002) 또는 공유결합 디스플래이 테크놀로지(Gao et al., 1997)와 같이 유전 정보와 잠재적 항-리간드 단백질 분자 사이에 공유결합이 존재한다.

예를 들어, 펩타이드 라이브러리가 사용되는 경우에, 디스플래이된 펩타이드 또는 단백질성 항-리간드 라이브러리는 완전히 무작위화되거나, 또는 변이성을 부여하는 추가 구조가 포함된 불변부 스캐폴드 구조에 기초할 수 있다.

종종 사용되는 스캐폴드 구조는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 기초하나(McCafferty et al., 1990), 또한 파이브로넥틴(Jacobsson 및 Frykberg, 1995; Koide et al ., 1998), 단백질 A 도메인(Stahl et al., 1989), 또는 BPTI(Markland et al., 1991)과 같은 소 안정 단백질 도메인과 같은 다른 스캐폴드에 기초할 수 있다.

디스플래이 라이브러리로부터 특정 바인딩 특이성을 나타내는 항-리간드의 선별은 종종 소위 "바이오패닝(biopanning)" 방법을 이용하여 수행된다.

표적 리간드는 고체 표면에 고정될 수 있으며, 라이브러리의 특정 항-리간드 멤버들은 고정된 표적 리간드에 노출되어 관심있는 항-리간드가 표적 리간드에 바인딩할 수 있도록 한다. 비결합된 라이브러리 멤버는 후속적으로 세척 제거되고, 관심있는 항-리간드는 회수되고 증폭된다.

예를 들어, 파아지 발현 항체 프레그먼트와 같은 항-리간드 라이브러리의 멤버들과 다른 단백질성 파티클은 "점착성(sticky)"이며, 이는 일부 비-표적 특이성 분자의 바인딩 및 분리를 일으킨다. 예를 들어, 우유, 소 혈청 알부민, 혈청(인간/태아 상태의 송아지(foetal calf)), 젤라틴과 같은 비-특이적 항-리간드의 백그라운드 바인딩을 감소시키는 블로킹제로 작용하기 위해 그리고 특정(비-세포성) 적용에서는 세제로 작용하기 위해 항-리간드 디스플래이 구조물/리간드 혼합물에 특정 화합물을 첨가하여, 비-특이적 바인딩이 최소화될 수 있다.

라이브러리 멤버의 세포에 대한 비-특이적 바인딩을 줄이고, 오염 및/또는 비-특이적으로 바인딩된 라이브러리 멤버로부터 세포의 분리를 돕기 위해 다수의 세정 공정이 고안되었다.

이러한 방법은 전단력을 최소화하고 해리된 파아지의 재바인딩을 이루게 하기 위해, 컬럼에 자기로(magnetically) 고정된 세포들의 세정을 포함한다(Siegel et al., 1997). 세포를 세정하는 또 다른 방법은, 비특이적 및 저친화 항-리간드를 선택적으로 제거하고, 유리-항-리간드 및 비특이적으로 바인딩된 항-리간드로부터 세포들 및 세포-바인딩된 항-리간드를 공간적으로 더 분리하기 위해, Ficoll 및 Percoll과 같은 보다 높은 밀도의 매체에서 원심분리하는 것이다(Carlsson et al., 1988; Williams 및 Sharon, 2002).

선별 공정의 효율에 따라, 원하는 수준으로 비특이적 항-리간드를 제거하거나 최소한 충분히 감소시키기 위해 수 라운드의 패닝(panning)이 필요할 수 있다(Dower et al., 1991).

또 다른 선별 방법으로, 표적 리간드(들)은 용액중에 특정 항-리간드 라이브러리 멤버에 바인딩한다. 그 다음, 바인딩된 항-리간드는 예를 들어, 표적 리간드에 부착된 회수가능한 태그를 이용하여 분리된다. 가장 일반적으로 사용되는 태그는 바이오틴이며, 이는 표적 분자와 디스플래이된 특정 라이브러리 멤버 간의 복합체가 예를 들어, 자기 비드(magnetic bead)와 같은 고형 지지체에 결합된 아비딘을 이용하여 회수가능하게 한다(Siegel et al., 1997).

이러한 방법은, 표적 리간드가 잘 알려져 있고, 정제된 형태로 이용가능한 경우에 사용된다. 단일 표적 리간드를 한 번에 선별하는 것은 정례적인 것이다. 여러 정의된 표적 리간드에 대한 선별이 동시에 수행될 수 있다. 표적 리간드는 하나 이상의 소 합텐(haptens), 단백질, 탄수화물, DNA 및 리피드일 수 있다.

다수 적용에 있어서, 다르게 발현되는 리간드들에 대한 특이적 항-리간드들이 관심의 대상이다. 예를 들어, 단백질들은 건강한 대조군에 비해 질병을 가진 환자로부터 유래된 세포 및 조직에서 다르게 발현될 수 있다. 이러한 질병은 미생물, 바이러스 또는 기생충 감염, 천식, 만성 염증 및 자가면역 질환, 암, 신경학적 질환, 심혈관 질환 또는 위장 질환을 포함한다. 마찬가지로, 예를 들어, 혈장, 뇌척수액, 소변, 정액 및 점액과 같은 체액의 단백질 조성은 건강한 대조군에 비해 질병을 가진 환자들간에 다를 수 있다.

결과적으로, 차등적으로 발현되는 리간드들을 식별하기 위한 조사 도구로서 이들의 일반적 적용성 외에, 차등적으로 발현되는 리간드들에 특이적인 항-리간드들이 질병의 진단, 예방 및/또는 치료용 도구로 사용될 수 있다.

유전체학 및 단백질체학 분야에서 최근의 진전은 아직 정의되지 않은 차등적으로 발현되는 분자들이 다수 존재함을 나타내며, 이는 이러한 잠재적 표적 리간드에 대해 특이적인 항-리간드의 생성 방법의 중요성을 강조한다.

다수의 이러한 차등적으로 발현되는 분자들은 세포 표면에 존재하는 것으로 예측되며, 이에 따라 예를 들어, 생리활성(예, 세포독성)제에 컨주게이트될 수 있는 특이적 항체를 사용하여 표적 치료를 위한 잠재적 표적을 구성한다.

크고 매우 다양한 항-리간드 디스플래이 라이브러리는 탄수화물, 단백질, 리피드 또는 이의 복합 작용의 알려지지 않은 세포성 리간드에 대한 특이성으로 항-리간드를 분리하는 방법을 제공한다.

바이오패닝 공정은 현재 전-세포, 세포-부분 및 세포막 기반 방법들을 포함하며, 이는 원칙적으로 이들의 본래 형태로 세포막 리간드에 특이적인 항-리간드를 나타내는 디스플래이 구조물을 분리하는 것을 가능케 한다.

인간 및 인간화된 치료 항체는 급성 및 만성 염증 질환, 면역 및 중추신경계 질환 및 암을 포함하는 다양한 질병을 치료하는데 점점 사용이 증가되고 있다. 인간 치료 항체는, 뮤린, 키메릭 및 인간화 치료 항체에 비해, 이의 완전한 인간 특성 및 관련된 면역원성의 부재, 항체 Fc-의존성 숙주 면역 이펙터 메커니즘을 참여시키는 최적의 능력, 및 보다 우수한 생체내 반감기에 기인하여 인간 질병을 치료하는데 가장 매력적인 양상으로 간주된다. 인간 항체는 오늘날 인간화 마우스 및 고 다양화된 파아지 항체 라이브러리를 포함하는 다양한 기술에 의해 통상적으로 생성된다.

대(>10⁵ 유니크 항체 클론) 인간 항체 라이브러리는 사실상 모든 종류의 자기 항원을 포함하는 상당한 수의 항원들에 특이적인 고 친화성 항체를 함유하기에 충분히 다양화된다. 자기 항원은 자가면역 질환에서와 같이 정상적인 조직 성분임에도 불구하고 체액성 또는 세포-매개 면역 반응의 표적이 되는 항원이며, 중요한 치료학적 관심의 항원 카테고리를 나타낸다.

또한, 인간 항체 라이브러리는, 이러한 카테고리의 항체들이 자체-내성의 메커니즘에 의해 생체내에서 음성적으로 선별되기 때문에, 인간과 마우스 사이에 구조적으로 보존된 리셉터 에피토프에 바인딩하는 항체에 대한 선별시, 인간 면역글로블린 유전자를 운반하는 트랜스제닉 마우스와 비교하여 이점을 제공하는 것으로 여겨진다. 보존된 리전은 종종 기능적으로 관련되며(예, 리간드/리셉터 유도 세포 반응의 바인딩 및 부여에 필요한 리간드-바인딩 도메인), 이러한 보존된 에피토프를 표적하는 항체들은 공통 유전자(syngeneic) 실험적 질병 모델 시스템에서 생체내 치료 활성을 스크리닝할 수 있기 때문에, 이러한 보존된 리전은 특정 치료학적 관심 대상이 된다.

사실상 모든 종류의 인간 가용성 항원(예, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 리피드, 탄수화물 및 컨주게이트 분자 등), 뿐만 아니라 세포 표면 리셉터(예, 1TM, 4TM, 7TM 및 멀티-TM 스패닝 리셉터 등)에 특이적인 고 친화성 항체가 매우 다양화된 인간 항체 라이브러리로부터 성공적으로 분리되었다.

세포 표면 리셉터는 중요한 치료학적 관심 대상의 표적 중 하나의 카테고리를 구성하며, 다양한 암 세포 연관 리셉터에 바인딩하는 여러 항체들은 리툭시맵(항-CD20), 트라스투주맵(항-Her2) 및 세툭시맵(항-EGFR)을 포함하는 암 치료용으로 승인되었다.

그러나, 치료 효능은 항체 리셉터 특이성으로부터 쉽게 예측되지 않으며; 동일한 표적 리셉터에 대한 항체는 이들의 바인딩 친화성에 관계없이 치료 효능의 크게 달라질 수 있으며(Beers et al., 2008; Cragg 및 Glennie, 2004), 변형적인 분자 표적에 대한 항체들은 촉망되며, 때로는 예기치 않은 치료 가능성을 나타낼 수 있다(Beck et al., 2010; Cheson 및 Leonard, 2008). 예를 들어, CD20 항원에 대해 유사한 친화도로 바인딩되며, 동일한 마우스 IgG2a 불변부를 운반하는 다양한 CD20 특이 항체 클론들은 생체내에서 B 세포를 고갈시키는 능력이 기본적으로 다르며(Beers et al., 2008; Cragg 및 Glennie, 2004), CD20 보다 다른 종양-관련 세포 표면 리셉터에 대한 항체가 B 세포 암에 대해 현저한 항종양 활성을 가질 수 있다(Cheson 및 Leonard, 2008).

따라서, 매우 다양화된 항체 라이브러리에서, 어느 주어진 타입의 암에 대해 가장 치료학적으로 효능이 있으며, 강력하고, 가장 잘 용인되는 항체는 여러 다양한 리셉터들 중 하나에 특이적이기 쉬우며, 매우 다양화된 라이브러리에서 치료학적으로 최적의 항체 클론을 식별하는 것은 다양한 질병의 세포-관련 리셉터들에 특이적인 다수의, 이상적으로는 모든 라이브러리 멤버들을 기능적으로 스크리닝하는 것이 필요하다.

출원인은 인간 파아지 항체 라이브러리로부터 다른 세포 집단(비-표적 세포들)과 비교하여 하나의 세포 집단에서 차등적으로 발현되는 다양한 표면 리셉터들에 바인딩하는 항체 클론들의 회수를 가능케 하는 스크리닝 기술(바이오패닝 방법)(WO2004/023140, Fransson et al., 2006; Frendeus, 2006)(이하, 차등 바이오패닝이라고도 함)을 앞서 개발하였다. WO2004/023140 (및 이로부터 발생된 모든 국가 출원들)은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

이 스크리닝 공정은 도 1에 개략적으로 나타낸 6 단계로 필수적으로 구성된다. 중요하게도, 이 공정은 하기 순서의 스크리닝 단계를 포함한다.

1) 차등적 바이오패닝, 그 다음

2) 표적 대 비-표적 특이성에 대한 스크리닝, 그 다음

3) Sanger 기술에 의한 보다 작은 수의 클론의 통상적인 시퀀싱.

이 기술을 이용하여, 표적 세포 대 비-표적 세포 차등 발현 표면 리셉터에 대해 고 특이성을 나타내는 항체의 풀(pool)을 생성하는 것이 가능하였다.

Sanger 시퀀싱은 "저 처리량(low throughput)" 방식으로 유니크 바인더를 식별하는데 현재 사용되는 기술의 예이다. 다른 예는 제한 효소 다이제스션 전 및 후에 항체 유전자 DNA를 겔에 런닝하여 다른 제한 효소에, 간접적으로 다른 서열에 대한 다른 감도를 통해 유니크 사이즈를 나타내는 것을 포함한다.

Cancer B 세포(표적) 대 T 세포(비-표적) 차등 발현 표면 리셉터를 표적하는 항체를 분리하기 위해 적용할 경우에("BnonT" 차등 바이오패닝), 이 공정은 HLA-DR, 표면 Ig 및 ICAM-1을 포함하는 다양한 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체들을 식별하였다(표 1).

예를 들어, 연속 차등 바이오패닝, 스크린 포 바인딩(screen for binding) 및 Cancer B 세포(표적) 대 T 세포(비-표적) 차등 발현 표면 리셉터를 표적하는 Sanger 시퀀싱("BnonT" 차등 바이오패닝)과 같은 기존의 스크리닝 방법에 의해 분리된 항체들의 빈도 및 특이성

항체 서열	클론의 수( 시험된 81 클론으로부터)	특이성
#1	71	sIgM
#2	4	HLA-DR
#3	1	ICAM-1
#4	1	sIgM
#5	1	sIgM
#6	1	sIgM
#7	1	sIgM
#8	1	불검출

그러나, 표적 리셉터는 모두 상대적으로 고 발현되며(세포당 50,000-400,000 리셉터), 이 방법에 의해 식별된 유니크 항체 서열의 수(스크리닝된 81개 중 8개)는 제한적이었다.

표적 세포 차등 발현 표면 리셉터에 특이적인 제한된 수의 클론만이 시퀀싱되었으나, 한 항체 클론의 고 빈도가 회수된 "BnonT" 항체 풀에서 제한된 항체 다양성을 나타내었다. 따라서, 상기 기술은 여러 다양한 차등 발현 리셉터에 대한 치료 잠재력을 갖는 항체들이 제한된 스크리닝 노력에 의해 식별되었다는 견지에서 이전의 세포 기반 패닝 기술에 비해 현저한 향상을 제공하나(Fransson et al., 2006), 이러한 관찰은 지배적인 통상적인 견지에 따라, 이러한 패닝은 단지 제한된 다양성을 갖는 항체 풀을 생성하며, 상대적으로 고 발현되고 강하게 차등적으로 발현되는 표면 리셉터에 대한 항체들로 구성되기 때문에, 추가적인 개선이 요구되는 것을 보여주었다(Hoogenboom, 2002)(Liu et al., 2004; Mutuberria et al., 1999; Osbourn et al., 1998).

초기의 바이오패닝 방법(WO 2004/023140 및 Frendeus, 2006)에 교시된 대로 수행된 인실리코(in silico) 산출은, 차등적으로 선별된 "BnonT" 항체 풀이 각각의 여러 차등 발현 표면 리셉터에 대하여 상당히 더 많은 수의 항체들을 함유해야 하는 것으로 나타내었다(도 2).

상기 풀에서 현저히 더 많은 수의 항체 클론들의 시퀀싱을 수행하는 당시의 시퀀싱 능력은 상당히 어려웠으며(사실상 실행불가능함), 이에 따라 차등적으로 선별된 항체 풀은 초기 스크리닝에 의해 나타나는 것보다 상당히 더 다양화되어야 한다는 가설이 간접적인 접근을 이용하여 시험되었다. 따라서, 재조합 ICAM-1 단백질과 컨주게이트된 면역 비드(표 1의 차등적으로 선별된 항체 풀에서 시퀀싱된 초기의 81 클론중에서 ICAM-1이 단일 항체 클론에 의해 표적되는 세포 표면 리셉터임)를 사용하여, 차등적으로 선별된 "BnonT" 항체 풀을 부가적인 ICAM-1 특이 항체 클론의 존재에 대해 패닝하였다. 재조합 ICAM-1에 대해 차등적으로 선별된 항체 풀을 패닝하여 회수된 1260 항체 클론들을 스크리닝하여 21개의 부가적인 ICAM-1 특이 항체 서열/클론을 식별하였다.

이러한 관찰은 본래의 차등 바이오패닝 방법이 차등적으로 발현된 항원들에 대한 항체 클론들을 식별할 수 있으나, 차등적으로 선별된 항체 풀은 이러한 초기 스크리닝으로부터 나타난 것보다 훨씬 더 다양화되었으며, 통상적인 스크리닝 접근에 의해 측정되는 것보다 현저히 더 다양화되었음을 입증하였다.

출원인은 관심 있는 리간드에 대한 복수의 다양한 항-리간드를 검출하는 차등 바이오패닝 방법의 정확도를 향상시키는 방법을 현재 창안하였다. 이에 따라, 본 발명은 인간 항체 라이브러리 (및 다른 분자 라이브러리)로부터, 다른 세포 집단(들)에 비해, 표적 세포 집단에서 저 수준 내지 고 수준으로 이들의 본래 세포 표면 환경에서 차등적으로 발현되는 다양한 리간드들(예, 리셉터들)에 특이적인 인간 항체와 같은 고 친화도 항-리간드의 풀을 회수할 수 있는 방법을 개시한다.

본 발명은 기존에 고안된 스크리닝 방법과 여러 견지에서 다르다(도 8), 우선, 독특하고 강력한 차등 바이오패닝 방법과 표적 세포 차등 발현된 표면 리셉터들에 특이적인 항체에 대한 차세대 딥 시퀀싱(deep sequencing) 및 후속적인 확인 스크리닝 - "리버스 스크리닝(reverse screening)"을 결합함으로써, 본 발명은 1) 질적으로 그리고 2) 양적으로 독특한 항체 풀의 생성을 가능케 한다.

중요하게도, 본 방법에 의해 확인되는 항체 클론과 같은 항-리간드는, 우선, a) 표적 세포 대 비-표적 세포에서 차등적으로 발현되며, 그리고 b) 표적 세포에서 이들의 본래 세포 표면 환경으로 발현되는 리셉터들에 대한 이들의 고 친화 바인딩, 및 둘째로, 시험관내 및 생체내 실험 질병 모델 시스템에서 치료 효과를 중재하는 이러한 특성들을 갖는 항체들의 입증된 능력(Beck et al., 2010; Fransson et al., 2006)에 기초하여 치료 잠재력을 모두 가질 수 있다.

따라서, 요컨대, 본 발명은 다음을 가능케 한다:

1. 고, 중 및 저 수준으로 발현되는 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체들을 함유하는 차등 바이오패닝에 의한 항체 풀의 생성

2. 중저(intermediary and low) 발현 표면 리셉터에 특이적인 항체들을 식별하기 위해 초과되어야 하는, 시퀀싱된 항체 클론들의 수의 보다 낮은 역치가 존재하며,

3. 상기 이러한 보다 낮은 역치는, 증가된 항체 클론 수의 시퀀싱이 중저 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체 식별의 수를 증가시키며,

4. 차등적으로 발현되는 항체 풀에서 중저 발현 표면 리셉터에 특이적인 항체들의 포괄적인 식별은 딥 시퀀싱을 필요로 한다.

따라서, 본 발명의 제 1 견지로,

(a) 항-리간드의 라이브러리에서 차등 바이오패닝을 수행하여 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 단계; 및

(b) 단계 (a) 중에 분리된 항-리간드에서 고 처리 시퀀싱(high throughput sequencing)을 수행하는 단계

를 포함하는 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법이 제공된다.

상기 방법은

(c) 차등적으로-발현된 리간드에 특이적인 항체에 대한 확인 스크리닝을 수행하는 단계

를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 차등 바이오패닝 단계는

(i) 항-리간드의 라이브러리를 제공하는 단계;

(ii) 서브트랙터 리간드(subtractor ligand) 구조물에 고정되거나 편입된 리간드를 포함하는 제 1 리간드 집단을 제공하는 단계;

(iii) 표적 리간드 구조물에 고정되거나 편입된, 단계 (ii)에서와 동일한 리간드를 포함하는 제 2 리간드 집단을 제공하는 단계;

(iv) 차등적으로 발현된 표적 리간드에 대한 항-리간드의 분리가 가능하도록 질량 작용의 보편적 법칙

로부터 유도된 하나 이상의 식을 이용하여 상기 집단들에서 서브트랙터 리간드 구조물 및 표적 리간드 구조물의 양을 측정하는 단계로서,

상기 식에서:

A, B, C & D = 반응에서의 참여물(반응물 및 생성물)

a, b, c & d = 밸런스드 화학 방정식에 필요한 계수인, 서브트랙터 리간드 구조물 및 표적 리간드 구조물의 양을 측정하는 단계;

(v) 단계 (iv)에서 측정된 서브트랙터 리간드 구조물의 양을 제공하는 단계;

(vi) 단계 (iv)에서 측정된 표적 리간드 구조물의 양을 제공하는 단계;

(vii) 서브트랙터 리간드 구조물에 바인딩된 항-리간드로부터 표적 리간드 구조물에 바인딩된 항-리간드를 분리하는 분리 수단을 제공하는 단계;

(viii) 단계 (v) 및 (vi)에 의해 제공된 리간드 구조물에 단계 (i)의 라이브러리를 노출시켜 리간드에 항-리간드를 바인딩시키는 단계; 및

(ix) 상기 분리 수단을 이용하여 상기 표적 리간드 구조물에 고정되거나 편입된 리간드에 바인딩된 항-리간드를 분리하는 단계

의 보조 단계들을 포함할 수 있다.

도 1 - ( Fransson et al Int J Canc 2006)에 기술된 차등 바이오패닝 방법의 개략도. 화살표 아래의 숫자는 각각의 5 스크리닝 단계들(1 내지 5) 및 2개의 후속적인 합성 및 확인 단계들 (6) 및 (7)에 따른 스크리닝 공정에서 보유된 파아지-abs 또는 항체 클론들의 수를 나타낸다. 상기 단계들은 (1) 차등 바이오패닝, (2) scFv 컨버티드 클론들의 콜로니 피킹, (3) 단일 클론 수준에서 scFv 클론의 발현, (4) 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터에 특이적인 scFv 클론의 스크리닝, (5) 유니크 Ab 서열의 ID에 대한 시퀀싱, (6) IgG 합성, 및 (7) 시험관내/생체내 기능 시험이다.
도 2 - 암 B 세포 대 Jurkat T 세포의 차등 바이오패닝("BnonT")으로부터 유도된 항체 풀이, 통상적인 방법을 이용하여 실험적으로 식별되는 것보다 각각의 여러 차등 발현 표면 리셉터들에 대해 상당히 보다 더 많은 수의 항체를 함유함을 보여주는 인실리코( in silico ) 산출
(1)은 산출이 WO 2004/023140에 교시된 바와 같이 수행되었음을 나타낸다.
도 3. DU -145 전립선암 대 Jurkat T 세포의 차등 바이오패닝("DnonT")으로부터 유도된 파아지 -항체 풀이, 표적 세포( DU -145) 집단에 고 특이적이다.
A) 그래프는 FACS에 의해 분석되는 표적 DU145 세포에 대한, 2 라운드의 차등 바이오패닝에 따라 얻어진 파아지-풀의 도즈-의존성 특이적 바인딩을 나타낸다. 비-표적 Jurkat 세포에 대해 검출가능한 바인딩은 없다.
B) 그래프는 FMAT에 의해 분석되는 DU145 세포 대 Jurkat 세포의 2 라운드의 차등 바이오패닝 후 얻어진 풀로부터 무작위 선별된 각각의 1408 개별 클론의 특이적 바인딩을 나타낸다.
도 4. 표적 DU -145 세포는 표적 대 비-표적 세포 표면에 대한 이들의 절대 표적 세포 발현 수준 및 이들의 상대적 발현 수준에 기초하여, "고 차등 발현", "중간 차등 발현" 또는 "저 차등 발현"으로 분류될 수 있는 여러 표면 리셉터들을 발현한다.
표적(DU145) 및 비-표적(Jurkat) 세포는 Zenon Alexa Fluor 647 표지 항체를 이용한 플로우 사이토메트리에 의해 3개의 항원들 HER2, CD24 및 CD130의 발현에 대해 스크리닝되었다.
A) 도면은 제논 표지 항체로 염색된 표적 및 비-표적 세포의 평균 형광 강도를 나타낸다.
B) 도면은 HER2, CD24 및 CD130을 발현하는 세포들의 퍼센트를 나타낸다.
도 5. 스캐차드 조사구( Scatchard plot ) 분석은, 세포당 6,000 - 400,000 리셉터의 차등 바이오패닝 및 딥 시퀀싱에 의해 분리된 항체들에 의해 표적된 차등 발현 표면 리셉터들의 발현 수준을 밝혀내었다.
A. 포화 곡선
B. 로젠탈 조사구(Rosenthal plots). 항-CD130 항체의 친화도(KD)는 0.8nM인 것으로 추정되었으며, CD130 표면 리셉터의 수는 6.300/cell인 것으로 추정되었다. 항-CD24 항체의 친화도는 5.6nM인 것으로 추정되었으며, 에피토프의 수는 8.400/cell인 것으로 추정되었다. 항-HER2의 친화도는 47nM인 것으로 추정되었으며, 에피토프의 수는 110,000/cell인 것으로 추정되었다. 평가는 INF 감마 자극된 DU145 세포에 대한 ¹²⁵ I 표지 항체의 로젠탈 조사구로 수행되었다.
도 6. DU -145 전립선암 대 Jurkat T 세포의 차등 바이오패닝("DnonT")으로부터 유도된 항체 풀은 고 발현, 중간 발현 및 저 발현 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론들을 함유한다.
스캐차드 및 FACS 분석(도 4 및 5)에 기초하여, HER2, CD24 및 CD130을 다양한 수준에서 발현되는 리셉터들로서 특성화하였다.
A) 도면은 모든 항원에 특이적인 항체 클론이 ELISA에 의해 분석되는 바와 같이 DU-145 대 Jurkat 세포의 2 라운드의 차등 바이오패닝에 의해 생성된 항체 풀에 존재함을 나타낸다.
B) 도면은 A에서 표적 특이 클론들이 선별되고 바인딩에 대해 재시험된 경우에, 대부분의 클론들이 여전히 표적 항원에 양성임을 나타낸다. 회수된 표적 표면 리셈터 특이 항체 클론들의 시퀀싱은 차등 선별된 항체 풀; 8개의 항-HER2, 1개의 항-CD24 및 3개의 항-CD130 항체들에서 (적어도) 12개의 독특한 항체들의 존재를 입증하였다.
도 7. 증가된 수의 차등적으로 선별된 항체 클론들의 시퀀싱은, 결과적으로 저 발현된 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 증가된 수의 항체 클론들의 식별을 형성하였다.
증가된 크기의 3개의 무작위 선별된 풀(각각, 91 클론들, 255 클론들 및 813 클론들)에서 항체 클론 서열을 검출하였다. 그 후, 3개의 모든 풀에서 발견된 클론들("풍부한 클론들(abundant clones)"), 보다 큰 2개의 풀에서만 발견된 클론들("덜 빈번한 클론들(less frequent clones)", 또는 가장 큰 풀에서만 발견된 클론들("드문 클론들(rare clones)")을 FACS에 의해 DU145 세포에 대한 바인딩에 대하여 분석하고, 풍부한, 덜 빈번한 및 드문 클론들의 평균 형광 강도를 비교하였다.
데이터는 분명히, 풍부한 클론들 > 덜 빈번한 클론들 > 드문 클론들로 평균 리셉터 발현 수준을 나타낸다. 따라서, 증가된 수의 차등 선별된 항체 클론의 시퀀싱은 저 발현 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터에 특이적인 항체 클론들의 증가된 수의 식별을 형성한다.
A) 도면은 각 항체 클론들로 염색된 DU-145 세포들의 평균 형광 강도를 나타낸다.
B) 도면은 각 항체 클론들이 바인딩하는 표적 세포들의 퍼센트를 나타낸다.
클론들은 무작위 선별되었기 때문에, 이들의 일부는 비-바인더이며, 이들은 분석전에 제외하였다(바인더는 퍼센트로 포지티브 염색된 세포 및 기하학적 평균 모두에 대해 적어도 2회의 네거티브 컨트롤에서 신호를 제공하거나, 또는 기하학적 평균의 높은 신호로서 3회 제공하는 클론으로 정의된다.).
다중 분석에 대해 본페로니 보정(Bonferroni's correction)을 이용한 ANOVA에 의해 산출된 *=p<0.05, **=p<0.01
도 8 - 기존에 기술된 차등 바이오패닝 스크리닝 방법(A., 상위 패널) 및 신규의 향상된 방법(B., 하위 패널)의 스크리닝 단계들의 비교를 나타내는 개략적인 도면.
두 방법은 여러 견지에서 다르다. 우선, 리버스 스크리닝 방법에서, WO 2004/023140 차등 바이오패닝의 파아지-ab의 scFv 전환, scFv 발현 및 바인딩 특이성에 대한 scFv 스크리닝 단계들이 생략되었다. 2번째, 리버스 스크리닝 방법에서, 차등 바이오패닝은 (딥) 시퀀싱이 직후에 후속하나, WO 2004/023140 스크리닝 공정에서는, 풀에서 항체 클론들의 시퀀싱은 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터 특이성에 대해 개별 scFv 클론의 스크리닝에 선행된다. 3번째이면서 가장 중요하게, 리버스 스크리닝 공정을 이용하여 달성되는 항체 클론의 수(10,000's) 및 (저 발현 차등 발현 리셉터에 특이적인 항체들의 포괄적인 생성을 포함하는) 항체 클론의 질은 사실상 기존의 A의 차등 바이오패닝 방법을 이용하여 달성될 수 없다.
단계들은 (1) 차등 바이오패닝, (2) scFv 컨버티드 클론들의 콜로니 피킹, (3) 단일 클론 수준에서 scFv 클론들의 발현, (4) 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 scFv 클론들의 스크리닝, (5) 유니크 Ab 서열의 ID에 대한 시퀀싱, (6) IgG 합성, (7) 시험관내/생체내 기능 시험, (2') 차세대 딥 시퀀싱, (3') HT IgG 합성, (4') 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 IgG 클론들의 스크리닝, (5') 시험관내/생체내 기능 시험이다.
도 9 - DU -145 전립선 암 대 Jurkat T 세포의 2 라운드 차등 바이오패닝으로 부터 유도되어 회수된 파아지 -항체 풀의 인 실리코 ( in silico ) 산출.

본 발명의 단계들은 반드시 어느 특정 순서로 수행되어야 하는 것으로 의도되는 것은 아니다.

"측정된 양을 제공하는 단계(providing the determined amount)"는, 본 발명의 방정식이 제공된 알려진 양이 원하는 항-리간드(들)를 분리하는데 적절한지 확인하기 위해 사용되도록 이미 알려진 리간드의 양을 제공하는 것을 의미함을 포함한다.

주어진 선별 공정에 이용되는 반응 파라미터는 질량 작용의 법칙 및 이로부터 유도된 방정식을 적용하고, 분자 라이브러리 다양성, 항-리간드 복제수, 원하는 상향 조절 검출 한계, 원하는 항-리간드 친화도, 및 리간드 농도와 같은 파라미터를 고려하여 산출함으로써 본 발명에 따라 최적화될 수 있다.

제 1 견지의 방법의 고 처리 시퀀싱은 454 시퀀싱, 일루미나(Illumina), SOLiD 방법, 헬리코스 시스템(Helicos system) 또는 Complete Genomics 및 Pacific Bioscences로부터 제조된 것에 의해 수행될 수 있다.

차세대 시퀀싱의 출현은 고 처리 방식으로 다수의(1,000s 내지 1,000,000s) 후보 유전자를 시퀀싱할 수 있게 하였다(이하, "딥 시퀀싱(deep sequencing)"이라 함).

454 시퀀싱은 Margulies et al.(2005)에 의해 기술되었다(본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 454 방법에서, 시퀀싱될 DNA는 분별되고 어댑터와 함께 제공되거나, 또는 DNA의 세그멘트가 상기 어댑터를 함유하는 프라이머를 이용하여 PCR-증폭될 수 있다. 어댑터는 DNA Capture Beads에 대한 바인딩 및 에멀젼 PCR 증폭 프라이머 및 시퀀싱 프라이머를 어닐링하기 위해 필요한 뉴클레오타이드 25-mers이다. DNA 프래그먼트는 단일 스트랜드로 이루어지며, 단지 하나의 DNA 프래그먼트가 하나의 비드에 부착되도록 하는 방식으로 DNA 포획 비드에 부착된다. 그 다음, DNA 함유 비드는 워터-인-오일 혼합물에서 증폭되어 단지 하나의 비드를 함유하는 마이크로리액터를 형성한다.

상기 마이크로리액터 내에서, 프래그먼트는 PCR-증폭되고, 비드 당 수백만의 복제수를 형성한다. PCR 후에, 에멀젼은 부서지고, 비드는 피코 타이터 플래이트 상에 로딩된다. 피코-타이터 플래이트의 각 웰은 단지 하나의 비드를 함유할 수 있다. 시퀀싱 효소를 상기 웰에 첨가하고, 뉴클로타이드를 고정된 순서로 상기 웰들을 지나가게 흘린다. 뉴클레오타이드의 편입은 피로포스페이트의 방출을 일으키며, 이는 화학 발광 신호를 형성하는 반응을 촉진한다. 이 신호는 CCD 카메라에 의해 기록되고, 소프트웨어를 사용하여 신호를 DNA 서열로 번역한다.

일루미나 방법에서(Bentley (2008)), 단일 가닥의 어댑터-제공 프래그먼트는 광학적으로 투명한 표면에 부착되고 "브릿지 증폭(bridge amplification)"된다. 이 공정은 각각 독특한 DNA 프래그먼트의 복제본을 함유하는 수백만 클러스터를 형성한다. DNA 폴리머라아제, 프라이머 및 4개의 표지된 가역성 터미네이터 뉴클레오타이드가 첨가되고, 그 표면은 표지의 위치 및 특성을 측정하기 위해 레이저 형광으로 이미지화된다. 그 다음, 보호기가 제거되고, 상기 공정은 수 사이클 반복된다.

SOLiD 공정(Shendure (2005))은 454 시퀀싱과 유사하며, DNA 프레그먼트는 비드의 표면에서 증폭된다. 시퀀싱은 표지된 프로브의 라이게이션 및 검출 사이클을 포함한다.

고 처리 시퀀싱에 대한 여러 다른 기술이 현재 개발되고 있다. 이의 예는 Helicos system(Harris (2008)), Complete Genomics(Drmanac (2010)) 및 Pacific Biosciences(Lundquist (2008))이다. 이는 급속하게 발달하고 있는 기술분야이기 때문에, 고 처리 시퀀싱을 본 발명에 적용하는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

항체 가변 도메인(Fv), scFv 또는 Fab 서열을 암호화하는 것들과 같은 DNA의 긴 스트레치를 시퀀싱할 수 있는 기구들은 단지 원형 단계에 있지만, 현재 이용가능한 기구들은 scFv CDRH1 내지 CDRH3 도메인을 암호화하고 스패닝하는 서열과 같은 보다 짧은 DNA 스트레치를 시퀀싱할 수 있다. 그러나, 시퀀싱 기술은 긴 스트레치 DNA 시퀀싱이 가능하도록 향상되기 때문에, 이러한 기술은 또한 본 발명의 범위 내에서 잘 작동될 것이다.

본 발명의 방법의 확인 스크리닝 단계는 예를 들어, 플로우-사이토메트리, FMAT(Fluorescent Microvolumetric Assay Technology), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), MSD(Meso Scale Discovery) 및 CBA(Cytometric Bead Array)와 같은 리간드/항-리간드 바인딩을 어드레싱하는 어느 어세이를 이용하여 표적 구조물 대 서브트랙터 구조물에 대한 분리된 항-리간드 풀 및/또는 각각의 항-리간드 클론의 특정 리간드 바인딩을 검출함으로써 수행될 수 있다.

일 구현으로, 상기 방법의 리간드는 표적 구조물 또는 서브트랙터 구조물 중 하나에서 발현되지 않는다. 즉, 표적 구조물 또는 서브트랙터 구조물 중 하나에서만 발현된다.

다른 구현으로, 상기 방법의 리간드는 표적 구조물 또는 서브트랙터 구조물 중 하나에서 보다 높은 수준으로 발현된다.

차등 바이오패닝 방법은 리간드로부터 항-리간드를 방출하는 추가의 서브-단계를 포함할 수 있다.

바람직하게, 차등 바이오패닝 단계의 단계 (ii) 내지 (ix)는 복수의 다른 리간드들에 대한 복수의 항-리간드를 분리하기 위해 병렬적으로 수행된다.

차등 바이오패닝 단계의 단계 (ii) 내지 (ix)는 1회 이상 반복된다.

바람직하게, 서브트랙터 구조물 또는 표적 구조물 중 하나의 차등 바이오패닝 단계에서 양은 상기 서브트랙터 또는 표적 구조물의 나머지의 양을 초과하여 제공된다. 과량의 리간드는 10 내지 1000배일 수 있으나, 2 내지 10배이거나, 또는 1000 내지 100,000배일 수 있다.

서브트랙터 리간드 집단의 초과 정도는, 검출가능하며, 차등 발현된 리간들들 사이의 구별이 얼마나 잘 되는지 가장 높은 가능한 "해상도(resolution)"(즉, 저 상향조절되거나, 중 상향조절되거나, 고 상향조절되거나, 또는 독특하게 발현되는 리간드에 대해 특이성을 가지고 항-리간드들 사이에 얼마나 구별이 잘 되는지)를 결정한다. 예를 들어, 100 표적 리간드 특이 항-리간드를 갖는 라이브러리를 사용하고, 모든 항-리간드가 평형 상태에서 리간드에 바인딩되도록 충분한 높은 농도의 양성 리간드를 첨가할 경우에, 10-배 초과의 서브트랙터 리간드 집단은 일반적으로 발현되는 리간드에 대한 특이성으로 항-리간드의 빈도를 90% 감소시키며, 한편 200-배 초과(항-리간드 특이 바인더의 수의 2배)인 경우에는 일반적인 바인더를 제거하도록 한다(WO 2004/023140, 도 5 및 이를 나타내는 데이터에 대한 실시예 4의 마지막 단락 참조).

일 구현으로, 차등 바이오패닝 단계의 단계 (iv)의 식은:

이다.

여기서

bA = 바인딩된 항-리간드

A = 항-리간드의 총수

T = 리간드의 총수

C = 아보가드로 상수(6.022 x 10²³ 파티클/몰)

V = 반응 부피(리터)

K_d = 평형 해리 상수

그리고, 변형적인 구현으로, 차등 바이오패닝 단계의 단계 (iv)의 식은:

이다.

여기서

bA_p = 바인딩된 항-리간드

T_p = C_p에서 리간드의 수

T_s = C_s에서 리간드의 수

C_p = 표적 리간드 구조물의 수

C_s = 서브트랙터 리간드 구조물의 수

A = 항-리간드의 총수

T = 리간드의 총수

C = 아보가드로 상수(6.022 x 10²³ 파티클/몰)

V = 반응 부피(리터)

K_d = 평형 해리 상수

차등 바이오패닝 단계의 분리 수단은 고형 지지체, 셀 멤브레인 및/또는 이의 일부, 합성 멤브레인, 비드, 화학 태그 및 유리 리간드 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 서브트랙터 및 표적 구조물의 분리 수단은 다른 밀도를 가질 수 있다. 서브트랙터 구조물의 분리 수단은 바람직하게 멤브레인 소포 또는 전세포 멤브레인일 수 있다.

차등 바이오패닝 방법의 단계(ix)는 밀도 원심분리(Williams 및 Sharon, 2002), 고형 지지체 격리, 자기 비드 격리(Siegel et al., 1997), 화학 태그 바인딩 및 수상 파티셔닝의 분리 방법 중 적어도 하나에 의해 수행될 수 있다.

보다 바람직하게, 분리 방법은 예를 들어, 피콜(Ficoll); 퍼콜(Percoll); 요오드화 구배 매체와 같은 밀도 구배에서 수행되는 밀도 원심분리이며, 여기서 원심분리 중에, 제 1 및 제 2 표적 리간드는 다른 정도로 피콜 구배를 통해 이동하여, 이에 따라 제 1 및 제 2 표적 리간드가 이들의 다른 종점(end points)으로부터 분리될 수 있다.

가장 바람직하게, 분리 방법은 예를 들어, 피콜과 같은 수크로즈-폴리머 구배를 이용한다.

단계 (a)의 라이브러리는 바람직하게, 항-리간드를 디스플래이하는 복수의 라이브러리 멤버들을 포함하는 디스플래이 라이브러리이다. 이러한 라이브러리의 예는, 항-리간드가 박테리오파아지의 표면에 디스플래이되는 파아지 디스플래이 라이브러리이다.

파아지 코트 단백질 중 하나에 융합된, 박테리오파아지(파아지)의 표면에서 단백질 및 폴리펩타이드의 디스플래이는, 특이적 리간드의 선별을 위한 강력한 도구를 제공한다. 이 '파아지 디스플래이' 기술은 본래, 특정 항원에 대해 고 친화도를 갖는 것들을 선별할 목적으로 대 항체 라이브러리를 생성하기 위해 1985년에 Smith에 의해 사용되었다. 보다 최근에, 상기 방법은 원하는 특성을 갖는 리간드를 식별하기 위해, 파아지 표면에 펩타이드, 단백질 도메인 및 온전한 단백질들을 제시하는데 사용되었다.

파아지 디스플래이 기술 뒤에 있는 원리는 다음과 같다:

(i) 디스플래이를 위한 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 파아지 내로 클로닝되며;

(ii) 클로닝된 핵산은 발현되고 파아지 코트 단백질(전형적으로, 필라멘트성 파아지의 경우에 p3 또는 p8 코트 단백질) 중 하나의 코트-앵커링 파트에 융합되어, 외래 단백질 또는 폴리펩타이드가 파아지의 표면에 디스플래이된다.

(iii) 그 다음, 원하는 특성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 디스플래이하는 파아지가 선별되고(예, 친화 크로마토그래피에 의해), 이에 따라 시퀀싱되고, 복제되고 및 다른 발현 시스템으로 옮겨질 수 있는 (표현형에 연결된) 유전자형이 제공된다.

변형적으로, 외래 단백질 또는 폴리펩타이드는 박테리오파아지 코트 내에 단일 가닥 핵산으로 패키징될 수 있는 파아지미드 벡터(phagemid vector)(즉, 파아지 및 플라스미드로부터 유래된 복제 오리진을 포함하는 벡터)를 사용하여 발현될 수 있다. 파아지미드 벡터가 이용될 경우에, "헬퍼 파아지(helper phage)"가 파아지미드 핵산의 복제 및 패키징 기능을 제공하기 위해 사용된다. 결과적으로 형성된 파아지는 (헬퍼 파아지에 의해 암호화된) 와일드 타입 코트 단백질 및 (파아지미드에 의해 암호화된) 변형 코트 단백질 모두를 발현하나, 변형 코트 단백질은 파아지 벡터가 사용될 경우에만 발현된다.

생물학적으로 관련된 분자들을 바인딩하는 리간드들을 분리하기 위한 파아지 디스플래이의 사용은 Felici et al .(1995), Katz(1997) 및 Hoogenboom et al.(1998)에서 리뷰되었다. 예를 들어, 세포 표면 리셉터 또는 DNA와 같은 다른 표적들을 바인딩하는 폴리펩타이드들에 대해 선별하기 위해 여러 무작위 조합의 펩타이드 라이브러리가 구성되었다(Kay 및 Paul, (1996)).

단백질 및 다중 결합 단백질이 기능성 분자로서 성공적으로 파아지-디스플래이되었다(Chiswell 및 McCafferty, (1992)). 또한, 기능성 항체 프래그먼트(예, Fab, 단일 사슬 Fv[scFv])가 발현되었으며(McCafferty et al. (1990),; Barbas et al.(1991),; Clackson et al .(1991)), 그리고 인간 고 친화성 항체 프래그먼트가 분리되었기 때문에 인간 모노클로날 항체 기술의 단점의 일부가 대체되었다(Marks et al .(1991) 및 Hoogenboom 및 Winter(1992)).

파아지 디스플래이의 원리 및 실시에 대한 추가 정보는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된, Phage display of peptides and proteins : a laboratory manual Ed Kay, Winter 및 McCafferty(1996)에 제공된다.

항-리간드 라이브러리는 항체 및 항원 바인딩 변이체, 이의 유도체 또는 프래그먼트; 조작된 가변 표면을 갖는 스캐폴드 분자; 리셉터; 및 효소로부터 선택된 적어도 하나로부터 구성될 수 있다.

차등 발현 리간드는 항원; 리셉터 리간드; 및 탄수화물; 단백질; 펩타이드; 리피드; 폴리뉴클레오타이드; 무기 분자 및 컨주게이티드 분자로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 효소 표적물로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 리간드 및 (차등 바이오패닝 단계의) 그 분리 수단을 상기 리간드 구조물에서 표적 리간드의 발현에 영향을 미치는 자극에 노출시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 의해 식별되는 선별된 항-리간드는 후속적으로, 질병의 치료, 이미징, 진단 또는 예상을 위해 의약용 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 항체에 기반한, 가장 중요하게는 인간 항체에 기반한 항-리간드는 우수한 치료 잠재력을 갖는다.

따라서, 본 발명의 제 2 견지로, 본 발명에 따른 방법에 의해 원하는 특성을 갖는 항-리간드를 식별한 다음, 상기 항-리간드를 약학적으로 허용되는 캐리어에 첨가하는 것을 포함하는 약학 조성물 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 제 3 견지로, 제 2 견지의 방법에 의해 제조된 약학 조성물을 의약용으로 사용하는 용도가 제공된다. 상기 약학 조성물은 또한 질병의 예방, 치료, 이미징, 진단 또는 예상을 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

정의

"바이오패닝(biopanning)"은, 한 멤버와 다른 멤버가 고 친화도로 바인딩하는 능력에 기초하여, 원하는 항-리간드 - 리간드-바인딩 쌍으로부터 하나의 멤버를 선별하는 방법을 의미한다.

"차등 바이오패닝(differential biopanning)"은, 한 멤버와 다른 멤버가 고 친화도로 바인딩하는 능력에 기초하여, 다른 양으로 또는 2 개의 다른 공급원(예, 서브트랙터/컨트롤 및 표적)에서 발현되는 원하는 항-리간드 - 리간드-바인딩 쌍으로부터 하나의 멤버를 선별하는 바이오패닝 방법을 의미한다.

"고 처리 시퀀싱(high throughput sequencing)"은, 다수의 분자를 시퀀싱 속도가 사실상 실현 가능하며, 현저히 보다 신속하고 저렴하도록, 다수의 서열을 동시에(최대 수백만) 시퀀싱하는 것을 의미함을 포함한다.

"확인 스크리닝(confirmatory screening)"은, 예를 들어, 플로우-사이토메트리, FMAT, ELISA, MSD 및 CBA와 같은 리간드/항-리간드 바인딩을 어드레싱하는 어느 어세이를 이용하여 표적 구조물 대 서브트랙터 구조물에 대한 분리된 항-리간드 풀 및/또는 각각의 항-리간드 클론의 특정 리간드 바인딩을 검출하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한, 항-리간드가 차등적으로 발현되는 리간드에 바인딩되는 것으로 식별되면, 리간드의 특성 및 아이덴티티 및 항-리간드와 리간드 사이의 바인딩 상호작용을 조사하는 것을 포함한다.

"리간드(ligand)"는, 리간드/항-리간드 바인딩 쌍 중 하나의 멤버의 의미를 포함한다. 리간드는 예를 들어, 상보적, 하이브리드된 핵산 2중 바인딩 쌍의 핵산 스트랜드들; 이펙터/리셉터 바인딩 쌍의 이펙터 분자; 또는 항원/항체 또는 항원/항체 프래그먼트 바인딩 쌍의 항원 중 하나일 수 있다.

"항-리간드(anti-ligand)"는, 리간드/항-리간드 바인딩 쌍의 반대되는 멤버의 의미를 포함한다. 항-리간드는 각각, 상보적, 하이브리드된 핵산 2중 바인딩 쌍의 핵산 스트랜드들; 이펙터/리셉터 바인딩 쌍의 이펙터 분자; 또는 항원/항체 또는 항원/항체 프래그먼트 바인딩 쌍의 다른 하나일 수 있다.

"항원(antigen)"은, 항체와 상호작용할 수 있는 분자 또는 화학 화합물이나 반드시 면역 반응을 생성할 필요가 없는 것을 의미함을 포함한다. 이러한 항원은 이에 한정하는 것은 아니나, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 리피드 또는 이의 컨주게이트를 포함한다.

"차등적으로 발현되는 리간드들(differentially expressed ligands)"은, 특정 조건/장소에서만 발현되며, 다른 조건이나 장소에서는 발현되지 않는 것들; 또는 표적 또는 서브트랙터 리간드가 표적 및 서브트랙터 리간드로부터 변형된 형태의 다른 것들을 포함하는, 표적 및 서브트랙터 공급원 사이에 다른 수준으로 발현되는 리간드들을 의미한다. 예를 들어, 일부 항원은 질병에 걸린 세포(예, 암 세포)의 세포 표면에서 고 발현되며, 이에 상응하는 건강한 세포(예, 비-암 세포)에서는 저 수준으로 또는 전혀 발현되지 않는다.

"저 발현 리간드(low expression ligands)"는, 저 수준으로, 즉, 예를 들어, 5,000 내지 20,000과 같이 세포당 20,000 미만의 복제수로 발현되는 리간드들을 의미하거나(이는 대부분의 와일드-타입 발현된 세포 표면 리셉터들을 포함한다), 또는 양성 리간드 집단 시료에서 어느 다른, 보다 고 발현되는 리간드의 1%미만의 빈도로 발생하는 리간드들을 의미한다.

"리간드 구조물(ligand construct)"은, 분리 수단과 연관된 표적 및/또는 서브트랙터 리간드를 포함하는 시스템을 의미한다.

용어 "항체 변이체(antibody variant)"는 이에 한정하는 것은 아니나, 면역글로블린 경쇄 및/또는 중쇄 가변부 및/또는 불변부의 파아지-디스플래이에 의해 생성된 단일 사슬 항체 분자, 또는 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 면역 어세이 형태로 항원에 바인딩할 수 있는 다른 면역 상호작용 분자와 같은, 어느 합성 항체, 재조합 항체 또는 항체 하이브리드를 칭하는 것으로 간주될 것이다.

용어 "항체 유도체(antibody derivative)"는 항체의 프래그먼트(예, Fab 또는 Fv 프래그먼트), 또는 다른 펩타이드나 폴리펩타이드, 라지 캐리어 단백질 또는 고형 지지체(그중에서도 예를 들면, 아미노산 티로신, 리신, 글루탐산, 아스파트산, 시스테인 및 이의 유도체, NH₂-아세틸기 또는 COOH-말단 아미노기)에 대한 항체 결합을 촉진시키는 하나 이상의 아미노산 또는 다른 분자의 첨가에 의해 변형된 항체 분자와 같이, 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 면역 어세이 형태로 항원에 바인딩할 수 있는 어느 변형 항체 분자를 칭한다.

"밀도 원심분리(dendity centrifugation)"는, 밀도 차이에 따라 예를 들어, 세포, 세포 소기관 및 마크로분자와 같은 아이템들을 분리하는 것을 의미한다. 이러한 분리는 분리될 아이템들이 이를 통해 이들의 밀도에 기초하여 이동하는 적절한 용액의 밀도 구배를 이용한 원심분리에 의해 달성된다.

"질량 작용의 법칙(Law of Mass Action)"은 어느 환경하에서 적용가능한 자연 보편적인 법칙이다. 이 법칙은 하기 반응을 나타낸다:

aA + bB -> cC + dD

그리고, 만일 그 시스템이 주어진 온도에서 평형 상태인 경우에, 하기의 비가 상수이며,

여기서:

A, B, C & D = 반응에서 참여물(반응물 및 생성물)이며,

a, b, c & d = 밸런스드 화학 방정식에 필요한 계수이다.

그리고, 여기서 상기 상수는 농도([]로 표시됨)로 산출되고, K는 유닛 M ^c ^+d-(a+b) 를 갖는다.

본 발명의 특정 견지를 구현하는 실시예를 하기 도면을 참조하여 서술한다.

실시예 1 - 차등 바이오패닝과 후속 고 처리 시퀀싱의 결합은 예기치 않은 수의 차등 발현 표적 세포 표면 리셉터들에 특이적인 유니크 항체 클론들을 생성한다.

암 B 세포 대 Jurkat T 세포의 차등 바이오패닝("BnonT")에 의한 항체 풀의 생성

본 실험에서, 일부 10¹⁰ 유전자형 유니크 바인더를 포함하는 2x10¹³ 파아지 파티클을 전 B 림프종 세포주 Ramos 세포(양성 선별) 및 T 백혈병 세포주 Jurkat으로부터 얻어진 혈장 멤브레인 또는 크루드 멤브레인 소포(음성 선별)와 혼합한다. T 백혈병 세포주 Jurkat에 비해 B 림프종 세포주 Ramos 세포에서 독특하게 발현되는 항원들에 대해 특이적인 바인더들이 선별적으로 분리된다.

선별을 위한 양성 및 음성 세포 수 산출

다른 선별 라운드에 사용되는 세포수룰 WO 2004/023140에 교시된 바와 같이 산출하였다. 산출을 위해 사용된 반응 파라미터는 도 2에 나타낸 바와 같다.

양성 및 음성 세포수는, 3회의 선별 라운드 후에, B 세포에 독특하게 발현되는 항원에 특이성을 갖는 바인더들이 B 및 T 세포에서 동일한 밀도로 발현된 항원에 비해 10,000-배 풍부하도록 선택되었다.

선별 라운드 2 및 3에서 다양한 카테고리의 항원(양성 세포 풍부한 양성 세포 유니크, 또는 양성/음성 세포 통상 발현 항원)에 특이적인 파아지 바인더들의 입력 수는, 선별 라운드 1 및 2 후에 다양한 카테고리의 항원에 특이적인 용출된 파아지의 산출된 수와 증폭 인자(AF)를 곱하여 산출되었다.

증폭 인자는 관련 선별 라운드 후에 증폭된 파아지의 총 수를 이와 동일한 선별 라운드로부터 용출된 파아지의 총 수로 나눔으로써 획득되었다.

실험 방법

세포 배양

Jurkat T 세포주, 클론 E6-1, 및 Ramos B 림프종 세포주를 10%FCS(Ramos 세포에 대해서만 열-불활성화된), 10mM HEPES 및 1mM 소듐 피루베이트가 보충된 RPMI 1640에서, 37℃에서 가습 분위기에서 배양하였다. 세포들을 1-2x10⁶ cells/ml(Jurkat에 대해 <1x10⁶ cells/ml)로 유지하였다.

Jurkat T 세포 혈장 멤브레인 제조

Jurkat 세포 배양

Jurkat E6-1 세포들은 10% 우태혈청(Gibco, Lot no 1128016) 1mM 소듐 피루베이트(Gibco) 및 10mM Hepes 버퍼(Gibco)가 보충된 Glutamax I(Gibco, #61870-010)에서, 5% CO₂의 가습 분위기에서 37℃에서, 1x10⁵ 내지 1x10⁶cells/ml의 세포 밀도로 유지되었다. 최종 패시지에서, 세포들은 2x10⁶의 최대 밀도에 도달하도록 하였으며, 이 시점에서 세포들을 수거하였다.

세포 파괴

1. 세포들을 뉴브 어댑터에 놓인 500ml 원심분리 튜브(Corning, #431123)에서, 1500rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 배양물로부터 수거하였다.

2. 상층물을 버리고, 0.145M NaCl에서 세정하였다. 세포 현탁물을 모으고, 세포를 카운트하고(총 5x10⁹ cells), 원심분리를 반복하였다.

3. 1mM NaHCO₃, 1.5mM MgAc pH 7.4에서 얼음상에서 10-30분간 저삼투압 쇼크를 가하고, 후속적으로 Yeda 프레스, 40bar(4000kPa)에서 0℃에서 15분간 발생되는 질소 캐비테이션에 의해 세포 파괴를 수행하였다. 세포 농도는 5x10⁷ cells/ml을 초과하지 않았다.

4. 세포 파괴 후, 150㎕ 0.5M EDTA를 세포분쇄액 서스펜션에 첨가하여 1mM의 최종 EDTA 농도를 생성하였다(EDTA의 첨가는 멤브레인 소포의 응집을 억제한다).

5. A) 크루드 멤브레인 분리: 세포 분쇄액(50ml)을 1900g(SS34로터에서 4000rpm)에서 10분간 원심분리하여 파괴되지 않은 세포 및 핵을 제거하고, 상층물을 수집하였다. 펠렛의 세정 및 재-원심분리는, 부서지기 쉬운 핵이 파괴되어 DNA 결합 및 응집을 일으키기 때문에 피하였다; 또는

B) 혈장 멤브레인 분리: 10ml의 37.2% 수크로즈를 6x 38.5ml Beckman 초원심분리 튜브의 바닥에 쌓고, 상기 단계 2의 6x 27ml의 세포 분쇄액을 조심스럽게 상부에 쌓았다. 그 튜브를 스윙-아웃 SW28 로터(6x 39ml 규격 용량)에서 27000rpm에서 4℃에서 2시간 45분간 원심분리하였다. 혈장 멤브레인은 수크로즈 쿠션과 시료상 사이의 경계층의 백색 밴드로 분리되었으며, PM을 모으고, 4x 35ml 튜브에 나누고, 총 35ml의 부피로 TE 버퍼(1mM Tris/0.25M 수크로즈/0.25M EDTA 버퍼)에 희석하였다.

6. 초원심분리는 Beckman Type 45.Ti 로터(규격 용량 6x 94ml Nalgene 튜브)에서 40,000rpm(약 200,000xg)에서 4℃에서 1시간 수행하였다.

7. 상층물을 버리고, 1ml Finn 파이펫을 이용하여 어느 잔류 버퍼를 제거하였다. 혈장 멤브레인 펠렛은 금속 바로 튜브의 바닥에서 벗겨내고, 스몰 다운스 호모게나이저에 옮겼다. 펠렛화된 멤브레인은 10mM Hepes를 함유하는 총 부피 2.5ml TE 버퍼(10mM Hepes/1mM Tris/0.25M 수크로즈/0.25M EDTA 버퍼)에서 루즈 피팅 다운스 유리 피스톤으로 5-10회 스트로크에 의해 균질화하여 재현탁되었다. 일부 2x10⁹ Jurkat 세포로부터 유도된 멤브레인들은 거의 재현탁(TE) 버퍼의 ml당 재현탁될 수 있다.

단백질 농도 검출

단백질 농도 검출은 제조자의 지시에 따라 BCA 키트를 사용하여 수행하였다. 간략히, 이중 BSA 스탠다드를 2mg/ml BSA 모액의 PBS에 2-배 희석(10㎕ 시료 + 10㎕ 버퍼)에 의해 준비하였다. 스탠다드 커브를 생성하고, 이를 사용하여 멤브레인 시료의 총 단백질 농도를 검출하였다.

혈장 멤브레인 활성(알칼린 포스파타아제 어세이에 의한)

알칼린 포스파타아제 용액

기질 용액:

50mM 소듐 보레이트 버퍼(pH 9.8), 1.0mM MgCl₂에 함유된 10ml 보레이트 버퍼당 1 정제 p-NPP(1.5mg/ml 최종 농도)

50㎕ 시료를 50㎕ 희석 버퍼(50mM 소듐 보레이트 버퍼(pH 9.8), 1.0mM MgCl₂)에 옮김으로써 3중 시료를 보레이트/MgCl₂ 버퍼에 희석하였다. 200㎕ 기질 용액(50mM 소듐 보레이트 버퍼(pH 9.8), 1.0mM MgCl₂에 1.5mg/ml 최종 농도로 함유된 10ml 보레이트 버퍼당 1 정제 p-NPP)을 각 희석에 대해 3 시료 중 2 시료에 첨가하였다. 그 다음, 시료들을 37℃에서 60분간 배양하였다. 상층물의 흡광도를 410nm에서 측정하고, 기질이 첨가되지 않은 적절한 컨트롤 웰(들)(예, 총 질소 캐비테이티드 세포 분쇄액, 핵 및 헤비 미토콘드리아 제외된 것)로부터 얻어진 값을 감하였다.

선별 공정: 차등 바이오패닝 프로토콜

반응 파라미터

1차 선별 라운드

10¹⁰ 유전자형 유니크 파아지미드 파티클을 포함하는 n-CoDer Lib2000 파아지 쇼크(Amp')를 1.6ml 2% 밀크-PBS(Ca 및 Mg 함유)에서 2x10¹³ 총 pfu로 증폭하였다.

총 반응 부피 2.5ml

양성 - 5x10⁷ Ramos B 세포 림프종 세포

음성 - 2x10⁹ cells로부터 유도된 Jurkat T 세포 크루드 멤브레인

2차 선별 라운드

그 다음, 이전 선별 라운드로부터 용출된 1.5x10¹² 파아지를 증폭하고, 침전시키고, 100㎕ 2% 밀크-PBS(Ca 및 Mg 함유)에 재현탁하였다.

총 반응 부피 0.5ml

양성 - 5x10⁶ Ramos B 세포 림프종 세포

음성 - 1x10⁹ cells로부터 유도된 Jurkat T 세포 크루드 멤브레인

3차 선별 라운드

1x10¹² 파아지를 100㎕ 2% 밀크-PBS(Ca 및 Mg 함유)에 재현탁된 이전 선별 라운드로부터 용출 및 증폭하였다.

총 반응 부피 0.5ml

양성 - 5x10⁶ Ramos B 세포 림프종 세포

음성 - 1x10⁹ cells로부터 유도된 Jurkat T 세포 혈장 멤브레인 소포

방법

파아지 스톡을 37℃에서 15분간 예열하고, 간헐적으로 보텍싱하였다. 파아지 스톡을 에펜도르프 원심분리기에서 최고 속도로 15분간 원심분리하였다. 침전물이 형성되면, 상층물을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 무지방 밀크에 2%의 최종 농도로 재현탁하였다.

2x10⁹ 세포(1x10⁹ cells 바이오패닝 라운드 2 및 3)로부터 얻어진 컨트롤 Jurkat 세포 혈장 멤브레인 제조물을 얼음상에서 해동하였다. (또한 단백질 농도 측정을 위해 10㎕를 남겨두었다.) 해동된 혈장 멤브레인 제조물을 파아지 스톡을 가하고, 파이펫으로 혼합하여 재현탁시킨 다음, 얼음상에서 15분간 배양하였다.

5x10⁷(5x10⁶ cells 바이오패닝 라운드 2 및 3) Ramos 세포를 1200rpm, 4℃에서 6분간 원심분리하였다.

상층물을 버리고, 밀크-파아지-음성 세포 멤브레인 모액에 재현탁된 Ramos 세포들을 10℃에서 배양하고, 4시간 동안 느린(엔드-오버-엔드) 로테이션을 가하였다.

세포/세포 멤브레인/파아지 배양물을, 1ml 100%(트립판 블루 스테인드) Ficoll을 바닥에 함유하며, 2% BSA/PBS(Ca 및 Mg 함유)에 함유된 40% Ficoll Paque Plus 9ml이 적층된 15ml Falcon 튜브에 옮겼다. 그 튜브를 1500rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 튜브 벽으로부터 세포들을 이탈시키기 위해 180° 회전시키고 추가로 1분간 원심분리하였다.

전 Ramos 세포 및 바인딩된 파아지를 함유하는 경계층은 주사기 및 고 게이지 니들(예, Microlance 3 - 19GA11/2 1,1x40 TW PM)을 이용하여 조심스럽게 흡입되었다. 니들은 니들의 경사면 말단이 위로 향하게 하여 세포를 함유하는 경계층 바로 아래에 삽입되었다. 세포층을 수집하고(약 150㎕), 입구 구멍에 반대되는 튜브의 플라스틱을 통해 니들을 통과시켰다. 주사기의 내용물을 새 튜브에 축출하고, 새 PBS를 (여전히 튜브를 관통한 상태로 있는) 니들내로 흡입하여 2회 세정하였다. 수거된 세포 현탁물을 500㎕의 PBS-2% BSA에 재현탁하고, 세정을 반복하고, 적정을 위해 상층물을 모았다.

세포들을 1ml PBS에 재현탁하고, 새 15ml 에펜도르프 튜브에 옮겼으며, 이는 4℃에서 10분간 1260rpm에서 원심분리되었다. 상층물을 파이펫을 이용하여 제거하고, 적정을 위해 상층물을 모았다.

PBS에 함유된 150㎕의 76mM 시트르산(pH 2.5)의 첨가 후, 5분간 실온에서 배양하여 세포들로부터 파아지를 용출하였다. 그 혼합물을 200㎕의 1M Tris-HCl(pH 7.4)의 첨가에 의해 중화하였다. 그 다음, 그 세포들을 원심분리하고 용출된 파아지를 모았다.

세포들을 1ml 트립신에 재현탁하고, 새 튜브에 옮기고, 10분간 배양한 다음, 40㎕ 1mg/ml 아프로티닌으로 불활성화하였다. 세포들을 원심분리하고, 적정을 위해 상층물을 모았다.

선별 라운드 1 및 2에 후속된 라지 플래이트에서의 증폭

1. 15㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 10ml LB(용원성 브로스)에 50㎕의 밤새 배양한 배양물을 첨가하여, 사용전 2.5-3시간에 10ml E.coli HB101F' 배양을 시작하였다(증폭하고자 하는 각 선별을 위한 것 하나 + OD600 측정을 위한 것 하나). OD를 약 2.5시간 후에 한 배양물에서 체크하였다.

2. 그 튜브를 OD₆₀₀ = 0.5에서 용출된 파아지의 반으로 감염시켰다.

3. 상기 튜브를 37℃ 및 50rpm에서 30분간 배양하고, 적절한 페노타이핑을 위해 추가로 37℃ 및 200rpm에서 30분간 배양하였다.

4. 박테리아를 2060xg(3000rpm Beckman GS-6)에서 10분간 원심분리하여 농축하였다(10ml).

5. 박테리아를 상층물의 일부(약 3ml)에 재현탁하고, 100㎍/ml 앰피실린 + 15㎍/ml 테트라사이클린 + 1% 글루코즈를 함유하는 라지 500㎠(luria agar) 플래이트에 스프레딩하였다.

6. 플래이트를 30℃에서 밤새 배양하였다.

7. 플래이트당 100㎍/ml 앰피실린 및 15㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 5ml의 LB를 첨가하고 스크래핑하여 플래이트로부터 박테리아를 수집하였다. 플래이트를 기울여 용액을 흡입하였다.

8. 추가의 상기 3ml LB 배지로 플래이트를 세정하고, 50ml Falcon 튜브에 1차 박테리아 서스펜션을 모았다.

9. 실온에서 Beckman GS6에서 2100xg/3000rpm으로 10분간 원심분리하여 박테리아를 농축하고, 100㎍/ml 앰피실린 및 15㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 1ml의 LB에 재현탁하였다.

10. 500㎕ 50% 글리세롤을 1ml 박테리아 서스펜션에 첨가하고, 그 글리세롤 스톡을 -80℃로 동결하였다.

11. 100㎍/ml 앰피실린 및 15㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 2 x 10ml LB를 단계 10의 글리세롤 스톡 2.5㎕(5㎕)로 감염시키고, OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 성장시켰다.

12. 6x10⁹ PFU의 R408 헬퍼 파아지를 배양물 ml당 첨가하고, 그 배양물을 37℃ 및 50rpm에서 30분간 배양하였다.

13. IPTG 용액을 100μM(즉, 10ml 배양물당 0.5M 스톡 2㎕)의 최종 농도로 첨가하고, 그 배양물을 25℃ 및 175rpm에서 밤새 배양하였다.

증폭된 파아지 스톡의 수거 및 침전

1. 실온에서 2100xg(3000rpm, Beckman GS-6에서)에서 10분간 박테리아를 펠렛화하고, 상층물을 0.2㎛ 멸균 필터를 통해 멸균 여과하였다.

2. 동일한 선별로부터 얻어진 튜브를 모으고, ¼ 용량 파아지 침전 버퍼를 첨가하고, 4℃에서 적어도 4시간 동안 배양하여 파아지를 침전시켰다.

3. 그 튜브를 4℃ 및 13000xg에서 30분간 원심분리하였다.

4. 펠렛을 100㎕ PBS에서 4℃에서 밤새 완전히 재현탁시켰다.

글리세롤 스톡을 위한 플래이트에서의 증폭, 및 (선별 라운드 3 이후) 미니프렙을 위한 밤새 배양

1. 15㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 10ml LB에 50㎕의 밤새 배양한 배양물을 첨가하여, 사용전 2.5-3시간에 10ml E.coli HB101F' 배양을 시작하였다(증폭하고자 하는 각 선별을 위한 것 하나 + OD600 측정을 위한 것 하나). OD를 약 2.5시간 후에 한 배양물에서 체크하였다.

4. 200㎍/ml 앰피실린을 함유하는 10ml의 따뜻한 LB 배지를 첨가하고, 감염된 박테리아를 각각 10ml의 2파트로 나누었다.

5. 그 2개의 튜브 중 하나에, 박테리아를 2100xg(3000rpm Beckman GS-6)에서 실온에서 10분간 원심분리하여 농축하고(10ml), 소량으로 재현탁하고, 500㎠ LA 플래이트(100㎍/ml 앰피실린 + 15㎍/ml 테트라사이클린 + 1% 글루코즈)에 스프레딩하였다.

6. 미니프렙: 나머지 10ml을 스핀 다운하고, 0.1% 글루코즈 및 100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 6ml LB에 재현탁하고, 30℃, 175rpm에서 밤새 배양하였다.

11. 키트 제조자(BioRad)의 프로토콜에 따라 3ml의 배양물로부터 미니프렙을 제조하여 정제된 파아지-항체 DNA를 획득하였다.

BnonT 차등 바이오패닝에 의해 생성된 풀에서 항체 다양성을 직접 평가하기 위해, 4-5-4 기술(Margulies et al., 2005)을 사용하였으며, 차등 선별된 항체 풀에서 유니크 CDRH3 변이체들의 수를 측정하여 항체 다양성을 평가하였다.

4-5-4 기술에 의한 딥 시퀀싱을 3 라운드의 차등 바이오패닝("BnonT") 이후에 얻어진 정제된 파아지-항체 DNA에서 수행하였으며, 이로써 총 22,497 유니크 서열을 확인하였다(표 2). 대조적으로, 동일한 BnonT 차등 바이오패닝으로부터 얻어진 파아지-항체 DNA의 Sanger 시퀀싱을 이용한 통상적인 스크리닝은 단지 8개의 유니크 항체 클론을 확인하였다(표 1)

차세대 딥 시퀀싱은 표적 대 비-표적 세포의 차등 바이오패닝에 의해 생성된 항체 풀에서 예기치 않게 많은 항체 서열 다양성을 밝혀내었다.

서열당 복제물	식별된 유니크 서열의 수
서열당 복제물	"BnonT	"DnonT
≥1	22497	68060
>1	5353	25141
>5	1589	6904
>10	996	4107
>20	593	2344
>30	419	1638
>40	318	1274
>50	258	1058
>100	136	517
>200	52	225

기존에 보고된 출원인의 발견(Fransson et al, 2006)과 함께 이러한 관찰은, BnonT 차등 선별된 클론들의 대다수(>99%)가 암 B 세포 차등 발현 표면 리셉터에 특이적이었음을을 나타내며, 이는

a) 차등 선별된 항체 풀이 실제로 매우 다양화되었으며, 그리고

b) 차등 바이오패닝과 고-처리 시퀀싱을 결합함으로써, 식별될 수 있는 차등 발현된 표면 리셉터들에 특이적인 유니크 항체 클론들의 수가 통상적인 스크리닝 접근법에 의해 달성되는 것보다 상당히 정도로 더 많음을 입증한다.

차등 바이오패닝 후에 고-처리 시퀀싱이 다양한 타입의 표적 세포에 의해 차등적으로 발현되는 다양한 표면 리셉터들에 특이적인 상당한 수의 항체들을 생성하는데 재현가능하게 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 새로운 차등 바이오패닝/딥 시퀀싱 반응을 수행하였으며, 이번에는 상기 패닝 반응 "DnonT"에서 표적 세포로서 전립선 암 DU-145 세포를 사용하고, 비-표적 세포로서 T 세포를 사용하였다.

다시, 차등 바이오패닝은 항체의 풀에 특이적인 고 표적 세포를 생성하였다(도 3). 4-5-4 기술에 의한 딥 시퀀싱을, 차등 바이오패닝의 2 라운드(DU-145 vs T) 후에 획득된 정제된 파아지-항체 DNA에 대해 수행하였으며, 이로써 각각 총 68,060 유니크 서열을 확인하였다(표 2).

이러한 항체 서열의 대다수는, DU-145 대 T 세포에 대한 바인딩에 대해 >1400 무작위 피킹된 항체 클론들의 스크리닝에 의해(도 3b), 그리고 인 실리코(in silico) 산출에 의해(도 9) 나타난 바와 같이 표적 세포 차등 발현 항원에 특이적인 것으로 보였다.

a) 고 다양화 인간 항체 라이브러리를 위한 차등 바이오패닝의 적용 후 b) 차등 바이오패닝에 의해 생성된 항체 풀의 딥 시퀀싱의 결합은, 통상의 스크리닝 접근법에 의해 이루어지는 것보다 상당히 더 많은 수의 표적 세포 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론들을 재현가능하게 생성하는 것으로 결론지어졌다.

실시예 2 - 차등 바이오패닝과 후속 고 처리 시퀀싱의 결합은 보다 낮게 발현되는 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 것들을 포함하여 질적으로 유니크한 항체 클론들의 풀을 생성한다.

질량 작용의 법칙을 적용하여, WO 2004/023140 및 Frendeus(2006)에 기술된 바와 같이 인 실리코 산출을 수행하였으며, 이는, 본 출원에서 수행된 바와 같이(표적으로서 암 B 세포 또는 전립선 암세포를 이용한 실시예 1에 예시된 바와 같이) 차등 바이오패닝을 적용한 경우에, 선별된 항체 풀에서 회수된 항체 클론들의 빈도는 a) 표적 세포 대 비-표적 세포 표면에서 이들의 표적 리셉터들의 절대적 및 상대적 발현 및 b) 표적 표면 리셉터들에 대한 이들 각각의 친화도와 직접 비례하는 것을 보여준다.

이러한 산출은 또한, 지배적인 일반 견지(Hoogenboom, 2002)(Liu et al., 2004; Mutuberria et al., 1999; Osbourn et al., 1998)와 상반적으로, 저 발현(예, 세포당 20,000미만의 리셉터로 발현하는) 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론뿐만 아니라 중 발현(예, 세포당 20,000-50,000 리셉터로 발현하는) 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론이 본 명세서에 상술한 바와 같은 차등 바이오패닝에 의해 선별될 수 있으며, 선별될 것이며, 그리고 고 발현 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론들에 비해 극적으로 보다 낮은 빈도일지라도 용출된 항체 풀에서 존재할 것임을 입증한다(도 2 및 9).

연속 차등 바이오패닝 및 딥 시퀀싱에 의해 생성되는 항체 풀이, 저 및 중 수준으로 발현하는 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론들을 함유하는 점에서 유니크하며, 그리고 시퀀싱의 심도(즉, 분석되는 항체 클론 서열들의 수)를 증가시키는 것이 표적 (vs 비-표적) 세포에서 감소(저) 수준으로 발현되는 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체들을 식별해 낼 수 있음을 입증하기 위해 여러 시도들이 현재 사용되었다.

우선, 차등 바이오패닝에 의해 선별된 항체 풀이 저 및 중 차등 발현 표면 리셈터들에 특이적인 항체 클론들을 함유하고 있음을 입증하였다(도 4, 5 및 6).

차등 선별된 항체 풀을, 표적 세포 대 비-표적 세포에 의해 차등 발현되는 것으로 입증된, 그리고 스캐차드 조사구 및 FACS 분석에 의해 표적 세포에서 저 내지 중 수준으로 발현되는 것으로 입증된(도 4 및 5 TBG), 표면 리셉터들의 세포외 도메인(ECD)으로 하나의 추가적 선별에 가함으로써, CD24, CD130 및 HER2 표면 리셉터들에 특이적인 항체 클론들을 포함하는 차등 발현 항체 풀로부터 차등 저 및 중 발현 표면 리셉터들에 특이적인 여러(12) 항체 클론들을 분리하였다(도 6).

각 리셉터에 대한 분리된 하나의 항체는 IgG 형태로 전환되어, 스캐차드 및 FACS 분석에 사용되었으며, 이는 6,000 - 100,000 리셉터/세포의 발현 수준을 나타내었다(표 3, 도 4 및 5).

3개의 표면 리셉터들에 대한 항체를 이용한 DU145 세포의 스캐차드 분석은 6,000 - 100,000 리셉터/세포의 발현 수준을 나타낸다.

리셉터	항체 KD(nM)	에피토프/세포
CD130	0.8	6,300
CD24	5.6	8,400
HER-2	47	110,000

실험 방법

표면 리셉터들의 세포외 도메인( ECD )을 이용한 선별

반응 파라미터

2라운드의 차등 바이오패닝(DU-145 vs T, "DnonT") 후에 용출 및 증폭된 파아지를 PBS에 침전 및 재현탁하였다. 100㎕(2.4x10₁₁ 파아지에 상응함)를 3차 선별 라운드에 사용하였다.

총 반응 용량 1.0ml

선별시, 파아지는 3개의 표면-국소 단백질 CD24, CD130 및 HER2에 대한 바인더들이 풍부하였다.

방법 - ECD 선별

50pmole의 각 단백질(상기 참조)을 사용하여 0.1M 소듐 카보네이트 버퍼(pH 9.5) 1ml의 반응 용량에서 4 폴리스티렌 볼(Polysciences, cat no 17175-100)을 코팅하였다. 코팅은 실온에서 1시간 동안 회전 교반하에 에펜도르프 튜브에서 수행하고, 그 다음 회전없이 4℃에서 밤새 배양 단계를 수행하여 이루어졌다.

코팅된 볼을, 1ml TPBSB-3%(3% BSA, 0.05 Tween-20 및 0.02% NaN₃)로 1회 세정하고, 실온에서 1시간 동안 회전 교반하면서 1ml TPBSB-5%(5% BSA, 0.05% Tween-20 및 0.02% NaN₃를 함유하는 PBS)로 1시간 배양 단계에 의해 블로킹하였다. 1ml TPBSB-3%로 세정한 후에, 볼을 새 에펜도르프 튜브에 옮기고, 파아지를 상기 블로킹된 볼에 (1ml TPBSB-3%의 총 용량으로) 첨가하였다. 그 혼합물을 회전 교반하면서 4℃에서 밤새 배양하였다.

바인딩되지 않은 파아지를 제거하기 위해, 볼을 1ml TPBSB-3%로 3회 세정한 후에, 10ml TPBS(0.05% Tween-20 및 0.02% NaN₃를 함유하는 PBS)로 3회 세정하고, 10ml PBS로 3회 세정하였다. TPBS 세정 전에, 여과기를 이용하여 볼을 수집하고, 새 50ml 튜브에 옮기고, 여기서 모든 후속 세정 단계를 수행하였다. 세정 절차를 촉진하기 위해, 각 세정 단계는 실온에서 회전 교반하에 3분 배양 단계가 후속되었다.

세정된 볼을 여과기를 이용하여 수집하고, 새 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 바인딩된 파아지를, 실온에서 30분간 회전 교반하에 400㎕ 0.5% 트립신으로 배양한 다음, 40㎕ 아프로티닌(2mg/ml)을 첨가하여 트립신을 불활성화하여 용출하였다. 용출된 파아지를 함유하는 트립신/아프로티닌 혼합물을 에펜도르프 튜브에 옮기고, 볼을 200㎕ PBS로 세정하였으며, 이는 후속적으로 용출된 파아지와 함께 모아졌으며, 총 640㎕의 용량을 형성하였다.

글리세롤 스톡을 위한 플래이트에서의 증폭 및 미니프렙을 위한 밤새 배양

상기 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다.

파아지 - 바인딩된 형태로부터 가용성 scFv 형태로의 전환

이는 scFv 프래그먼트가 파아지미드(Amp^R)로부터 제한되고, 카나마이신 내성을 암호화하는 유전자를 운반하는 벡터 pKscFv-3xFH로 삽입되는 전환 방법이다.

재료:

AvrII(4 U/㎕, New England Biolabs Cat No R0174)

10xNEBuffer2(New England Biolabs Cat No B7002S)

MQ 워터

SfiI(20 U/㎕, New England Biolabs Cat No R0123)

10xBSA(MQ 워터에 10배 희석된 100xBSA New England Biolabs Cat No B9001S)

QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen Cat No 28104)

SfiI/AvrII 다이제스티드 pKscFv 3xFH

T4 DNA Ligase(1U/ml, Invitrogen Cat No 15224-017)

5x T4 DNA 라이게이즈 버퍼(Invitrogen, Cat No P/N Y90001)

파아지미드 DNA 의 다이제스션

파아지미드 미니프렙을 이용한 다이제스션 반응 준비:

2㎍ 파아지미드 미니프렙

1㎕

4U AvrII

2㎕

1x 10xNEBuffer2

MQ H₂O 총 용량 20㎕으로 채움

37℃에서 2시간 동안 배양

SfiI 다이제스션 진행. 상기로부터 얻어진 다이제스션 혼합물에 하기 첨가:

1㎕

1x 10xNEBuffer2

3㎕

1x 10xBSA

1㎕

20U SfiI

5㎕ MQ H₂O

30㎕ 총 용량

50℃에서 2시간 동안 배양

QIAquick PCR 정제 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 다이제스션된 DNA를 정제한다. 50㎕ 물을 사용하여 용출한다. 40ng/㎕의 총 농도로 약 50㎕가 회수된다(100% 회수율로 추정).

라이게이션

하기의 라이게이션 혼합물을 준비한다:

0.6㎕

60ng SfiI/AvrII 다이제스션된 pKscFv 3xFH

6㎕

240ng SfiI/AvrII 다이제스션/정제된 파아지미드 미니프렙

5㎕

1x 5x라이게이즈 버퍼

1㎕

1U T4 DNA 라이게이즈

12.4㎕ MQ H₂O

25㎕ 총 용량

16℃에서 밤새 배양

사용 전까지 -20℃ 보관

형질전환

상기 생성된 라이게이트를 E.coli TOP10에 형질전환하였다.

화학적으로 형질전환성 TOP10 세포의 한 튜브(100㎕/튜브)/라이게이트를 얼음상에서 해동하였다. 10ng 라이게이트를 튜브마다 첨가하고, 그 튜브들을 얼음상에서 30분간 배양하였다.

그 다음, 튜브들을 42℃(워터 배스)에서 90초간 배양하고, 얼음상에서 5분간 더 배양하였다.

900㎕ LB를 각 튜브에 첨가하고, 그 튜브들을 37℃, 1시간, 200rpm에서 배양하였다.

각 튜브의 내용물을 하나의 500㎠ LA 플래이트(100㎍/ml 카나마이신 + 1% 글루코즈)에 스프레딩하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니 피킹

Genetix "Q-bot" 콜로니 피킹 시스템을 이용하여, 라지 LA 플래이트에서부터 3x384 웰 마이크로타이터 플래이트/선별(총 9 플래이트)의 각 선별(CD24, CD130 및 HER2)로부터 총 1152 콜론을 피킹하였다.

1. LB 배지, 20㎍/ml의 카나마이신 및 글루코즈 1%를 혼합한다.

2. 플래이트(Greiner Flat 384 well 781101)를 배지로, 60㎕/well로 채운다.

3. 프로토콜에 따라 Q-Bot를 이용하여 콜로니를 피킹한다.

384 웰 형태에서 클론들의 발현

1. 발현 플래이트(Greiner Flat 384 well 781101)를 카나마이신 20㎍/ml를 포함하는 배지 50㎕/well로 채운다.

2. 발현 플래이트에 마스터 플래이트로부터 얻어진 5㎕/well로 접종한다.

3. 발현 플래이트를 37℃, 600rpm에서 3.5시간 동안 배양한다.

4. 카나마이신 20㎍/ml 및 2.5mM IPTG를 포함하는 배지 10㎕/well로 scFv의 생성을 유도한다.

5. 발현 플래이트를 37℃, 600rpm에서 10시간 동안 배양한다.

6. 발현 플래이트를 +4℃에 보관한다.

클론들 384웰의 스크리닝

재료:

CD24-GST(0.11mg/ml), Abnova Cat No H00000943-H01

HER-2-Fc(PBS에 함유된 0.1mg/ml), R&D Systems Cat No 1129-ER

CD130(0.2mg/ml), R&D Systems Cat No 228-GP

인간 IgG(6.2 mg/ml), Sigma Cat No I2511

Anti His-HRP, R&D Systems Cat No MAB050H

Anti FLAG-AP, Sigma Cat No A9469

Fish gelatin, Sigma Cat No G7765

Supersignal ELISA Pico, Thermo Scientific Cat No 37069

Tropix CDP Star Emerald II, Applied Biosystems Cat No T2388C

절차:

1일 코팅

1. 플래이트(Greiner 384 웰 플래이트 화이트 HB 781074)를 하기로 코팅한다:

0.1M 소듐 카보네이트(pH 9.5) 50㎕/well에 희석된

CD24 0.4 pmole/well

HER2 0.8 pmole/well

CD130 0.9 pmole/well

hIgG (non-target) 1 pmole/well

상기 플래이트를 +4℃에서 밤새 배양한다.

2일

2. 플래이트를 1xPBS, 0.05%(v/v) Tween-20으로 3회 세정한다.

3. PBS+0.05% Tween-20+0.45% Fish 젤라틴, 40㎕/well을 첨가한다.

4. 발현된 scFv, 10㎕/well을 첨가하고, 상기 플래이트를 실온에서 1시간 배양한다.

5. 플래이트를 상술한 바와 같이 세정한다.

6. PBS+0.05% Tween-20+0.45% Fish 젤라틴에 희석된 2차 항체; CD24, CD130 및 hIgG로 코팅된 플래이트에 1:4000 희석된 α-HIS-HRP, HER2 및 hIG로 코팅된 플래이트에 1:25000 희석된 α-FLAG-AP를 50㎕/well 첨가하고, 플래이트를 실온에서 1시간 동안 배양한다. 비고: hIgG에 대해서는 이중 플래이트로 함.

7. 플래이트를 상술한 바와 같이 세정한다. 20mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂(pH 9.8)로 플래이트를 3회 세정한다.

8. 기질을 첨가하고;

플래이트에 항-His-HRP과 함께, 20mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂(pH 9.8)에 1:20으로 희석된 Topix CDP Star Emerald II를 50㎕/well 첨가하고, 플래이트를 실온에서 10분간 배양한다.

플래이트에 항-Flag와 함께, 20mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂(pH 9.8)에 1:20으로 희석된 Topix CDP Star Emerald II를 50㎕/well 첨가하고, 플래이트를 실온에서 30분간 배양한다.

9. 플래이트를 판독한다.

IFN -γ 자극 후 DU145 리셉터 발현의 FACS 분석

재료

Jurkat 세포

DU145 세포

Trypsin-EDTA(Invitrogen Cat No 25300-054)

rh-IFN-γ(R&D Systems Cat No 285-IF)

Mouse IgG Block(Jackson Immunoresearch Cat No 015-000-002)

FACS 버퍼(Gibco Cat No 14040 PBS w/o Ca 및 Mg + 0.5% BSA)

Zenon Alexa Fluor 647 Human IgG Labeling Kit(Invitrogen Cat No Z25408)

IFN -γ 자극

DU145 세포들은 250IE INF-γ로 24시간 자극되었다. 세포 해리 버퍼로 세포들을 수거하였다.

플로우 사이토미터 방법

세포들을 FACS 버퍼로 1회 세정하고, FACS 버퍼에 함유된 50㎍/ml 마우스 IgG를 이용하여 얼음상에서 10분간 블로킹을 수행하였다. 한편, 항체들은 제조자의 지시에 따라 Zenon AF 647로 표지되었다.

50㎕ 세포 서스펜션(약 500,000cells)을 FACS 튜브에 옮기고, 50㎕ 표지 항체를 첨가한 다음, 얼음상에서 1시간 동안 배양하였다.

그 다음, FACS 버퍼를 사용하여 세포들을 세정하고, 그 결과 얻어진 서스펜션을 플로우 사이토미터(BD Bioscience, FACS Calibur)에서 분석하였다.

IFN -γ 자극 후 DU145 리셉터의 스캐차드 분석

IFN -γ 자극

스캐차드 분석

제조자의 지시에 따라 유리 요오드 및 산화제 로도겐(1,3,4,6-테트라클로로-3α,6α-디페닐글리콜루리, Thermo scientific)으로 예비-코팅된 시험 튜브를 이용하여 ¹²⁵I로 항체를 표지하였다. 간략히, 200㎍의 항체를 PBS에 10분간 표지하고, 유리 요오드를 작은 일회용 탈염 컬럼(NAP 5, GE Healthcare Life science)을 이용하여 제거하였다. 표지된 항체는 약 2.5μCi/㎍ 항체의 특이 활성을 가졌으며, 종이 크로마토그래피로 측정시 1%미만의 유리 요오드를 함유하였다.

0.5x10⁶ 세포를 다른 농도의 ¹²⁵I-표지 항체로 2.5시간(아이스 배스에서) 배양하였다. 유리 논바인딩 항체(F)는 40% 피콜-쿠션을 통해 원심분리에 의해 세포 바인딩된 항체(B)로부터 분리되었으며, 시료들은 감마 카운터에서 분석되었다.

표 4

(도 6과 관련됨) 저 및 중 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체들의 포괄적 식별은 차등 선별된 항체 풀의 딥 시퀀싱을 필요로 한다.

상기 표는 시퀀싱된 항체 클론의 수와 비례하는, 각 발현 표면 리셉터에 특이적인 회수된 항체 클론의 수를 보여준다. 개별 항체 클론의 리셉터 특이성은 도 6에 기술된 바와 같이 검출되었다.

차등 선별 항체 풀로부터 96 클론의 유사한 스크리닝은 고 발현 표면 리셉터 ICAM-1에 특이적인 47 서열을 식별하였다(표 4).

본 발명자들은, 그 다음 각각, 고, 중 및 저 수준으로 발현된 표면 리셉터들에 특이적인 항체(서열)가 91,255 또는 813 랜덤 피킹된 항체 클론의 시퀀싱에 의해 식별되는지, 또는 그 이후에 ~290,000 랜덤 피킹된 항체 클론의 딥 시퀀싱에 의해 식별되는지 조사하였다.

CD54는 스캐차드 분석에 의해 250,000 copies/cell로 고 발현 표면 리셉터로서 확인되었다(데이터를 나타내진 않았음). 차등 선별된 항체 풀 "DnonT"로부터 96 클론의 스크리닝은 CD54에 특이적인 47 클론들을 확인하였다(표 4). 100,000 copies/cell을 갖는 HER2는 고 발현 표면 리셉터를 나타내며, 8,000 copies/cell을 갖는 CD24 및 6,000 copies/cell을 갖는 CD130은 저 발현 표면 리셉터를 나타낸다(표 4 및 5).

고 발현 표면 리셉터 ICAM-1에 특이적인 항체(서열)는 모든 스크리닝 방법에 의해 식별되었다(표 4 그리고 데이터를 나타내진 않았음). 이에 상반적으로, 저 발현 표면 리셉터에 특이적인 항체들은 최대 813 랜덤 피킹된 클론의 통상적 스크리닝에 의해 식별되지 않았다(표 4). 현저히, 그리고 아주 대조적으로, 저 발현 CD24 및 CD130 표면 리셉터에 특이적인 항체들은 딥 시퀀싱에 의해 식별되었다.

고, 중 및 저 발현된 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 회수된 항체들에 대한 시퀀싱 심도의 증가의 영향은 다음과 같이 조사되었다:

증가된 크기의 3개의 무작위 선별된 풀(각각, 91 클론들, 255 클론들 및 813 클론들)에서 항체 클론 서열을 검출하였다. 그 후, 3개의 모든 풀에서 발견된 클론들("풍부한 클론들(abundant clones)"), 보다 큰 2개의 풀에서만 발견된 클론들("덜 빈번한 클론들(less frequent clones)", 또는 가장 큰 풀에서만 발견된 클론들("드문 클론들(rare clones)")을 FACS에 의해 DU145 세포에 대한 바인딩에 대하여 분석하였다.

차등 선별 항체 풀에서 출현율이 감소하면서 풍부한 클론들, 덜 빈번한 클론들 및 드문 클론들에 의해 표적된 리셉터들의 평균 표적 발현 수준이 감소하였으며, 이는 시퀀싱 심도 증가로 인해 표적 (vs 비-표적) 세포에서 감소(저) 수준으로 발현되는 차등 발현 표면 리셉터들에 특이적인 항체들을 식별하였음을 입증한다.

실시예 3 - 차등 바이오패닝 식의 유도

질량 작용의 보편적 법칙(LMA)을 적용하여, 고 다양성의 디스플래이 라이브러리로부터 저 발현 리간드 및/또는 차등 발현 리간드에 대한 항-리간드를 분리하는데 필요한 리간드의 수를 산출할 수 있다.

LMA는 항-리간드 A와 이의 표적 리간드 T, 그리고 이들의 복합체 AT 사이의 비공유(수소 결합, 정전기 력, 반데르발스 또는 소수성력), 가역성 바인딩이 평형 상호작용 A + T

AT에 의해 주어지며, 평형 해리 상수 또는 친화도 Kd = [A][T]/[AT]를 가짐을 나타낸다.

표적 리간드(T)에 동일한 특이성을 갖는 항-리간드(A) 사이의 평형 상호작용은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

바인딩된 A(bA)

유리 A(fA) + 유리 T(fT)

이며, 그리고

를 갖는다.

총 A 또는 T는 유리 및 바인딩된 A 또는 T의 합인 것으로 알려져 있다.

즉, [A](총 A) = [fA] + [bA]이며, 그리고 [T](총 T) = [fT] + [bA]이다.

따라서, (I)에서 [fA]를 [A] - [bA]로 치환하고, [fT]를 [T] - [bA]로 치환하면 다음 식이 나온다.

이를 재배열하여 다음 식을 형성한다.

이 연립방정식은 다음과 같이 해답을 얻을 수 있다.

여기서, 네거티브 루트가 관련된 것인 경우에 다음과 같다:

파티클 수/몰당 파티클 수에 대한 농도(C)/부피 단위(V)를 치환하여 다음 식을 얻는다.

그리고, 다음과 같이 단순화된다.

여기서, A = 항-리간드 A의 총수

T = 리간드 T의 총수

V = 반응 부피(리터)

C = 아보가드로 상수(6.022x10²³ 파티클/몰)

LMA는 각 표적 리간드에 대해 주어진 친화도 및 특이성을 갖는 다양한 항-리간드들 사이의 각 반응에 적용되면, 선별 공정 이후에 리간드에 바인딩된 항-리간드의 수는 LMA 및 식 (III)을 적용하여 산출될 수 있다.

또한, 서브트랙터 또는 표적 리간드의 집단과 연관된 항-리간드들 사이에 질적인 차이가 없는 경우에, 즉, 상기 방법 중에 리간드의 물리-화학적 특성에 변화가 없는 경우에, 평형시 표적 리간드에 바인딩된 항-리간드의 수는 표적 리간드 구조물상의 표적 리간드 대 총 리간드(서브트랙터 및 표적 리간드)의 비를 곱한 바인딩된 항-리간드의 총수와 동일할 것이다:

대입하면 다음과 같다.

Cp = 표적 리간드 구조물의 수

Cs = 서브트랙터 리간드 구조물의 수

Tp = Cp상에 T 리간드의 수

Ts = Cs상에 T 리간드의 수

표적 및 서브트랙터 구조물이 혼합되면, 리간드의 총수는 다음과 같이 될 것이다:

그리고, 평형시 포지티브 구조물에 바인딩된 항-리간드(A)의 수(bAp)는 다음과 같이 주어진다:

또한, 식 (III) 및 (IV)의 조합으로 다음 식이 생성된다.

실시예 4 - 리간드 농도 최적화

실시예 1에 예시된 식은 1차 서브트랙터 리간드 및 2차 표적 리간드 모두의 고농도 이용은 저 발현 및 차등 발현 리간드에 특이성을 갖는 항-리간드의 효과적인 회수에 중요할 뿐만 아니라, 통상적으로 발현되는 리간드에 특이성을 갖는 항-리간드의 감소에 중요한 것임을 보여준다.

리간드 농도는 여러 수단에 의해 증가될 수 있다. 모든 경우에 리간드 농도는 리간드의 2차원 결합에서 서스펜션 또는 용액에서 해리된 리간드의 사용으로(3-차원) 이동함으로써 증가된다.

바인딩이, 세포 표면 리간드에 대한 것과 같이 이의 본래 형태로 사용되는 리간드에 따라 달라지는 경우에, 리간드 농도는 리간드 구조물 표면적 대 리간드 구조물 부피의 비를 증가시킴으로써 최대화된다.

예를 들어, 세포 표면 항원은 2차원 표면에 고정된 전 세포를 사용하는 것과 상반적으로, 서스펜션에 해리된 소 혈장 멤브레인 소포의 형태로 사용될 수 있다. 이는 서스펜션 또는 용액에서 리간드의 안정성을 증가시켜, 이에 따라 리간드-항-리간드 평형 상호작용의 부가적인 이점을 갖는다.

리간드 공급원이 구형(또는 실질적으로 구형) 형태인 경우에, 이는 수학적으로 하기 식에 의해 기술된다:

여기서 Ap = 구 면적(sphere area)

Vp = 구 부피(sphere volume)

즉, 구의 반지름이 작을수록, 리간드/부피의 비는 더 커지며, 리간드는 더욱 입자성(서스펜션성)이 된다.

실시예 5 - 바람직한 구현

바람직한 견지로, 본 발명은 세포 표면 항원에 특이성을 갖는 항-리간드를 이들의 본래 형태로 그리고 이들의 특성(단백질, 탄수화물, 리피드, 복합체)에 관계없이 분리하기 위해 사용된다. 또한, 바인딩된 항원들은 다른 것에 비해 하나의 세포 타입에서 상향조절되거나 독특하게 발현되는 것들이다(예, 형질전환된 암세포, 바이러스/미생물/기생충/균류 감염 세포 또는 컨트롤 세포에 비해 다른 아고니스트 자극되거나 감염 활성화된 세포).

항체 유래 항-리간드들(예, scFv-, Fab-, 또는 Fv-암호화 항-리간드)의 선별을 위해 사용될 경우에, 상기 방법은 상기 스크리닝 공정과 동시에, 세포 멤브레인에서 이의 본래 형태로 표적 항원과 반응하는 치료 항체 후보를 생성한다.

이러한 높은 농도의 항원이 필요한 경우에, 항원은 평형 반응을 악화시키지 않는 형태로 사용된다. 따라서, 항원은 최소한의 공간을 차지하며, 점도 및 전단력을 거의 증가시키지 않는 형태로 사용된다.

예를 들어, 세포 표면 항원들에 대한 항-리간드들을 찾으려할 경우에, 고 다양화된 분자 항-리간드 라이브러리의 멤버들과 혼합된 표적 전 세포 및 과잉의 서브트랙터 세포 멤브레인을 이용한 경합 바이오패닝 공정이 사용되며, 이후에 피콜 또는 퍼콜/소혈청알부민 구배에서의 밀도 분리 및 표적 세포 상향조절된 유니크 항원들에 특이적인 표적 세포 및 항-리간드들의 선별적 분리가 사용될 수 있다.

이 방법에서, 표적 리간드(항원) 집단은 전 세포(고 밀도)의 형태이며, 그리고 서브트랙터 리간드(항원)는 혈장 멤브레인 소포 또는 제핵 세포(저 밀도)의 형태이다.

표적 및 서브트랙터 항원 집단은 본 명세서에 기술된 식에 기초하여 조절된 방식으로 고 다양성 분자 라이브러리의 멤버들과 혼합된다.

예를 들어, 5x10⁷ 표적 전 세포가 1x10¹⁰ 서브트랙터 세포의 세포 멤브레인 소포와 혼합되며, 고 다양성 라이브러리로부터 얻어진 멤버들과 (전형적으로, 순수 항원에서 선별시 Kd=10^-8M의 항-리간드를 생성하는) 200의 항-리간드 특이 복제수로 혼합되고, 이는 표적 세포당 10,000 정도의 낮은 밀도에서 발현되는 것들을 포함하여 10 배이상의 상향조절된 항원들에 특이적인 항-리간드들을 분리하는 것으로 기대할 수 있다.

반응은 평형에 도달하도록 배양된다. 경합 바이오패닝 후에, 표적 집단에 바인딩된 라이브러리 멤버들은 바인딩되지 않은 항-리간드들 및 밀도 원심분리에 의해 컨트롤 서브트랙터 항원에 바인딩된 항-리간드들로부터 분리되고, 이는 고 발현 항원들에 특이적인 농축 파아지가 조사된 집단 중에 존재하도록 한다.

원하는 표적 항원 발현이 서브트랙터 집단에서 더 높은 경우에, 상기 공정은 서브트랙터 리간드 집단이 표적 리간드 집단이 되고, 그 반대도 마찬가지가 되도록 가역적이다.

차등 발현 및 유니크 리간드에 특이성을 갖는 항-리간드를 생성하는 것 외에, 밀도 구배에 다양한 밀도 분리 수단의 사용은 하기를 포함하는 여러 이점을 제공한다:

바인딩되지 않은 항-리간드 및 컨트롤 집단에서 발견되는 리간드에 특이성을 갖는 항-리간드로부터 양성 리간드와 복합된 항-리간드의 물리적 및 공간적 분리.

피콜 세정은 전단력을 증가시킨다. 따라서, 이러한 세정은 보다 효율적이며 덜 반복된 세정(패닝 라운드)이 요구되며; 관심있는 특이적으로 바인딩된(고 친화성) 항-리간드의 최소한의 해리를 나타낸다.

(FACS(형광 활성화 세포 분류기) 또는 MACS(자기 활성화 세포 분류기) 기반 경합 바이오패닝에 비해) 세포 표면 리간드 환경/형태 및/또는 조성을 변화시킬 수도 있는 세포의 태깅 또는 화학적 변형을 필요로 하지 않는다.

실시예 6 - 분리 수단으로서 모든 멤브레인 소포

전 세포들은 고 밀도 배지에서 생성된 멤브레인 소포로 대체될 수 있으며, 이는 보다 높은 농도의 리간드도 평형 반응에 타협하지 않고 이용가능토록 한다.

실시예 7 - 리간드 상향-/하향- 조절에 미치는 자극의 영향 테스트

본 발명의 다른 구현은 조사될 세포 집단내의 소수의 세포들에서만 매우 낮은 밀도로 발현되는 세포성 리간드에 특이성을 갖는 항-리간드를 분리하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 특정 자극은 혈액에 존재하는 알려지지 않은 세포 아집단에 존재하는 세포 표면 항원의 상향조절 또는 하향조절을 촉발하는 것으로 여겨질 수 있다.

이 자극에 노출된 전혈로부터 유래된 세포들은 자극 및 상기한 것과 유사한 경합 바이오패닝 반응에 노출되기 전에 전혈로부터 유래된 혈장 멤브레인과 혼합될 수 있다.

실시예 8 - 스크리닝 방법의 진단 사용

본 발명의 추가 실시예는 생물학적 시료(예, 혈장, 소변, 뇌척수액)에 다양한 존재비로 존재하는 리간드들에 대한 항-리간드들이 고 다양화 분자 라이브러리로부터 분리가능토록 한다. 이러한 항-리간드는 후속적으로, 예를 들어 단백질 발현 분석 및 잠재적 바이오마커의 확인을 위해 사용될 수 있다.

충분히 고 농도의 리간드가 사용될 경우에, 본 발명의 방법은 2개의 다른 시료에서 단백질 조성물에 비해 상향조절되거나 유니크 리간드에 대한 항-리간드를 선택적 분리를 가능케 한다. 이는 궁극적으로, 양성 리간드 집단내의 상대적 리간드 농도와 독립적인 방식으로, 다른 집단에 비해 한 집단에서 보다 풍부한 리간드에 특이적인 항-리간드의 분리를 가능케 한다.

후자를 수행하는데 필요한 리간드의 상당한 농도에 기인하여, 리간드는 바람직하게 서스펜션 또는 용액으로 사용되어야 한다. 예를 들어, 표적 집단 리간드는 관련 리간드의 파괴 및 박멸을 최소화하기 위해 여러 다른 위치에서 나뉘어지고 태깅될 수 있으며, 한편 서브트랙터 집단 리간드는 태깅되지 않거나 모의 처리(mock treated)될 수 있다. 양성 리간드 집단의 태깅은 예를 들어, 단지 카운터 태그 자기 비드와 복합된 태그 리간드를 이용한 양성 집단 리간드 및 양성 집단 리간드에 바인딩된 바인더의 후속적인 회수를 위한 수단을 제공한다.

이 방법의 적용은 특정 질병에 걸린 환자 집단으로부터 얻어진 혈장 시료를 모으고, 컨트롤 집단의 혈장 시료와 비교하는 것일 수 있다. 이 경우에, 환자 혈장 시료는 나뉘어지고 태깅되고, 컨트롤 집단은 태깅되지 않을 수 있다.

참고문헌

Claims

(a) 항-리간드의 라이브러리에서 차등 바이오패닝을 수행하여 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 단계; 및
(b) 단계 (a) 중에 분리된 항-리간드에서 고 처리 시퀀싱(high throughput sequencing)을 수행하는 단계
를 포함하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항에 있어서,
(c) 차등적으로-발현된 리간드에 특이적인 항체에 대한 확인 스크리닝을 수행하는 단계
를 더 포함하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 차등 바이오패닝 단계는
(i) 항-리간드의 라이브러리를 제공하는 단계;
(ii) 서브트랙터 리간드(subtractor ligand) 구조물에 고정되거나 편입된 리간드를 포함하는 제 1 리간드 집단을 제공하는 단계;
(iii) 표적 리간드 구조물에 고정되거나 편입된, 단계 (ii)에서와 동일한 리간드를 포함하는 제 2 리간드 집단을 제공하는 단계;
(iv) 차등 발현된 표적 리간드에 대한 항-리간드의 분리가 가능하도록 질량 작용의 보편적 법칙
로부터 유도된 하나 이상의 식을 이용하여 상기 집단들에서 서브트랙터 리간드 구조물 및 표적 리간드 구조물의 양을 측정하는 단계로서,
상기 식에서:
A, B, C & D = 반응에서의 참여물(반응물 및 생성물)
a, b, c & d = 밸런스드 화학 방정식에 필요한 계수인, 서브트랙터 리간드 구조물 및 표적 리간드 구조물의 양을 측정하는 단계;
(v) 단계 (iv)에서 측정된 서브트랙터 리간드 구조물의 양을 제공하는 단계;
(vi) 단계 (iv)에서 측정된 표적 리간드 구조물의 양을 제공하는 단계;
(vii) 서브트랙터 리간드 구조물에 바인딩된 항-리간드로부터 표적 리간드 구조물에 바인딩된 항-리간드를 분리하는 분리 수단을 제공하는 단계;
(viii) 단계 (v) 및 (vi)에 의해 제공된 리간드 구조물에 단계 (i)의 라이브러리를 노출시켜 리간드에 항-리간드를 바인딩시키는 단계; 및
(ix) 상기 분리 수단을 이용하여 상기 표적 리간드 구조물에 고정되거나 편입된 리간드에 바인딩된 항-리간드를 분리하는 단계
의 보조 단계들을 포함하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고 처리 시퀀싱 단계는 454 시퀀싱, 일루미나(Illumina), SOLiD 방법 또는 헬리코스(Helicos) 시스템에 의해 수행되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 확인 스크리닝 단계는 플로우-사이토메트리, FMAT, ELISA, MSD 또는 CBA에 의해 수행되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 리간드는 표적 구조물 또는 서브트랙터 구조물 중 하나에서 발현되지 않는 것인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 리간드로부터 상기 항-리간드를 방출시키는 단계를 더 포함하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii) 내지 (ix)는 병렬적으로 수행되어 복수의 다른 리간드들에 대한 복수의 항-리간드들을 분리하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii) 내지 (ix)는 1회 이상 반복되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
서브트랙터 구조물 또는 표적 구조물 중 하나의 양은 상기 서브트랙터 구조물 또는 표적 구조물의 나머지의 양을 초과하여 제공되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제10항에 있어서,
초과량의 리간드는 10 내지 1000배, 또는 2 내지 10배이거나, 또는 1000 내지 1,000,000배인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (iv)의 식은:

이거나
(여기서
bA = 바인딩된 항-리간드
A = 항-리간드의 총수
T = 리간드의 총수
C = 아보가드로 상수(6.022 x 10²³ 파티클/몰)
V = 반응 부피(리터)
K_d = 평형 해리 상수),
또는

(여기서
bA_p = 바인딩된 항-리간드
T_p = C_p에서 리간드의 수
T_s = C_s에서 리간드의 수
C_p = 표적 리간드 구조물의 수
C_s = 서브트랙터 리간드 구조물의 수
A = 항-리간드의 총수
T = 리간드의 총수
C = 아보가드로 상수(6.022 x 10²³ 파티클/몰)
V = 반응 부피(리터)
K_d = 평형 해리 상수)
인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
분리 수단은 고형 지지체, 셀 멤브레인 및/또는 이의 일부, 합성 멤브레인, 비드, 화학적 태그 및 유리 리간드 중 적어도 하나로부터 선택되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
서브트랙터 및 표적 구조물의 분리 수단은 다른 밀도를 갖는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
서브트랙터 구조물의 분리 수단은 멤브레인 소포(membrane vesicle) 또는 전세포(whole cell) 멤브레인인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
단계(ix)는 밀도 원심분리, 고형 지지체 격리, 자기 비드 격리, 화학 태그 바인딩 및 수상 파티셔닝 중 적어도 하나에 의해 수행되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)의 라이브러리는 항-리간드를 디스플래이하는 복수의 라이브러리 멤버들을 포함하는 디스플래이 라이브러리인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 라이브러리는 파아지 디스플래이 라이브러리인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드는 항원; 리셉터 리간드; 및 탄수화물; 단백질; 펩타이드; 리피드; 폴리뉴클레오타이드; 무기 분자 및 컨주게이티드 분자로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 효소 표적물로부터 선택된 적어도 하나인, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
항-리간드 라이브러리는 항체 및 항원 바인딩 변이체, 이의 유도체 또는 프래그먼트; 조작된 가변 표면을 갖는 스캐폴드 분자; 리셉터; 및 효소로부터 선택된 적어도 하나로부터 구성되는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제3항 및 제6항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리간드 및 그 분리수단을 상기 리간드 구조물에서 표적 리간드의 발현에 영향을 미치는 자극에 노출시키는 단계를 더 포함하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 원하는 특성을 갖는 항-리간드를 식별한 다음, 상기 항-리간드를 약학적으로 허용되는 캐리어에 첨가하는 것을 포함하는, 약학 조성물 제조 방법.
의약에 사용되는 제22항의 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
질병의 예방, 치료, 이미징, 진단 또는 예상을 위한 약제의 제조에 사용되는 제23항에 청구된 약학 조성물의 용도.
실시예 및 도면을 참고로 실질적으로 본 명세서에 기재된 방법.