JP2015501289A - スクリーニング方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
1)示差的バイオパンニング、その後
2)標的対非標的の特異性についてのスクリーニング、その後
3)より少ない数のクローンのサンガー法による従来の配列決定。
1.高レベル、中間的レベルおよび低レベルで発現される示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体を含有するための、示差的バイオパンニングによる抗体プールの作製。
2.中間的発現および低発現の表面受容体に対して特異的である抗体を特定するために越えなければならない、配列決定された抗体クローンの数についてのより低い閾値が存在すること。
3.このより低い閾値を超えた場合、増大する数の抗体クローンの配列決定により、中間的発現および低発現の表面受容体に対して特異的である特定された抗体の数が増大する。
4.中間的発現およびより低発現の表面受容体に対して特異的である抗体の、示差的発現の抗体プールにおける包括的特定は、大規模シーケエンシングを必要とする。
(a)示差的バイオパンニングを、少なくとも1つの抗リガンドを単離するように抗リガンドのライブラリーに対して行う工程;および
(b)ハイスループット配列決定を工程(a)の期間中に単離される抗リガンドに対して行う工程を含む方法が提供される。
(c)確認スクリーニングを前記示差的発現リガンドに対する抗体特異性について行う工程を含むことができる。
(i)抗リガンドのライブラリーを提供するサブ工程;
(ii)サブトラクターリガンド構築物に固定されるか、または組み込まれるリガンドを含むリガンドの第1の集団を提供するサブ工程;
(iii)標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる、工程(ii)と同じリガンドを含むリガンドの第2の集団を提供するサブ工程;
(iv)前記集団における前記サブトラクターリガンド構築物および前記標的リガンド構築物の量を、示差的発現標的リガンドに対する抗リガンドの単離を可能にするように、普遍的な質量作用の法則
A、B、C、Dは反応における関与物(反応物および生成物)であり、
a、b、c、dは、釣り合った化学式のために必要な係数である)
から導かれる1つまたは複数の式を使用して求めるサブ工程;
(v)工程(iv)において求められるような前記量のサブトラクターリガンド構築物を提供するサブ工程;
(vi)工程(iv)において求められるような前記量の標的リガンド構築物を提供するサブ工程;
(vii)前記標的リガンド構築物に結合する抗リガンドを、サブトラクターリガンド構築物に結合する抗リガンドから単離するための分離手段を提供するサブ工程;
(viii)(i)の前記ライブラリーを、リガンドに対する抗リガンドの結合を可能にするために、(v)および(vi)によって提供される前記リガンド構築物にさらすサブ工程;および
(ix)前記分離手段を使用して、前記標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる前記リガンドに結合する抗リガンドを単離するサブ工程
を含むことができる。
bA=結合した抗リガンド
A=抗リガンドの総数
T=リガンドの総数
C=アボガドロ定数(6.022×1023粒子/モル)
V=反応体積(リットル)
Kd=平衡解離定数)
bAp=結合した抗リガンド
Tp=Cp上のリガンドの数
Ts=Cs上のリガンドの数
Cp=標的リガンド構築物の数
Cs=サブトラクターリガンド構築物の数
A=抗リガンドの総数
T=リガンドの総数
C=アボガドロ定数(6.022×1023 粒子/モル)
V=反応体積(リットル)
Kd=平衡解離定数)
(i)呈示のためのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸がファージ内にクローン化される;
(ii)クローン化された核酸が、ファージのコートタンパク質の1つ(典型的には、繊維状ファージの場合にはp3コートタンパク質またはp8コートタンパク質)のコートアンカー部分に融合して発現し、その結果、外来のタンパク質またはポリペプチドがファージの表面に呈示される;
(iii)所望される性質を有するタンパク質またはポリペプチドを呈示するファージがその後、(例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって)選別され、それにより、配列決定し、増殖させ、他の発現系に移すことができる遺伝子型(表現型に関連づけられる遺伝子型)がもたらされる。
「バイオパンニング」によって、本発明者らは、所望の抗リガンド−リガンド結合対から一方のメンバーを、もう一方のメンバーに対して大きい親和性により結合するその能力に基づいて選別する方法を意味する。
aA+bB→cC+dD
その系が所与の温度において平衡状態であるならば、下記の比は定数である:
A、B、C、Dは、反応における関与物(反応物および生成物)である;
a、b、c、dは、釣り合った化学式のために必要な係数である;
この場合、定数が、([ ]によって示される)濃度に関して計算され、KはMc+d−(a+b)の単位を有する。
ガンB細胞対Jurkat T細胞の示差的バイオパンニング(「BnonT」)による抗体プールの作製
本実験において、およそ1010個の遺伝子型非重複結合体を含む非常に多様化されたn−CoDeRライブラリーに由来する2×1013個のファージ粒子が、Bリンパ腫細胞株のRamos細胞全体と混合され(陽性選別)、また、T白血病細胞株Jurkatに由来する形質膜または粗膜小胞と混合される(陰性選別)。T細胞白血病細胞株(Jurkat)と比較してBリンパ腫細胞株(Ramos)において特有に発現される抗原に対して特異的である結合体が、選択的に単離されるべきものである。
異なる選別ラウンドで使用するための細胞数を、(国際公開WO2004/023140)において教示されるように計算した。計算のために使用した反応パラメーターは、図2に示される通りであった。
細胞培養
Jurkat T細胞株(クローンE6−1)およびRamos Bリンパ腫細胞株を、10%のFCS(Ramos細胞のみについては熱不活化された)、10mMのHEPESおよび1mMのピルビン酸ナトリウムが補充されるRPMI1640において、加湿雰囲気中、37℃で培養した。細胞を1〜2×106細胞/mlで維持した(Jurkatについては1×106細胞/ml未満)。
Jurkat細胞の培養
Jurkat E6−1細胞を、10%のウシ胎児血清(Gibco、ロット番号:1128016)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco)および10mM Hepes緩衝液(Gibco)が補充される、Glutamax Iを伴うRPMI−1640(Gibco、#61870−010)において、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃で、1×105細胞/ml〜1×106細胞/mlの間の細胞密度で維持した。最後の継代培養において、細胞を2×106の最大密度に到達させ、その時点で細胞を集めた。
1.細胞を、チューブアダプターに入れられた500ml遠心分離機用チューブ(Corning、#431123)における遠心分離(1500rpm、15分、4℃)によって培養から集めた。
2.上清を捨て、0.145MのNaClにおいて洗浄した。細胞懸濁物をプールし、細胞を計数し(合計で5×109個の細胞)、遠心分離を繰り返した。
3.細胞の破壊を、氷上で10分間〜30分間、1mM NaHCO3/1.5mM MgAc(pH7.4)における低浸透圧ショックによって行い、続く窒素キャビテーションを、0℃で15分間、40bar(4000kPa)でYedaプレス機において行った。細胞濃度は5×107細胞/mlを越えなかった。
4.破壊後、150μlの0.5M EDTAを、1mMの最終EDTA濃度を得るようにホモジネート懸濁物に加えた(EDTAの添加により、膜小胞の凝集が防止される)。
5.A)粗膜単離:ホモジネート(50ml)を1900g(SS34ローターにおいて4000rpm)で10分間遠心分離して、未破壊細胞および核を除き、上清を採取した。脆い核は崩壊しやく、これにより、DNAの漏出および凝集を引き起こすので、ペレットの洗浄および再度の遠心分離を避けた;または
B)形質膜単離:10mlの37.2%スクロースを38.5mlのBeckman超遠心分離チューブ(6本)の底部で層にし、上記工程2からの27ml(各チューブ)の細胞ホモジネートを上部に注意深く層にした。チューブを、スィングアウトSW28ローター(39mlの公称容量、6本)において27000rpmで、4℃で2時間45分にわたって遠心分離した。形質膜を、スクロースクッションとサンプル相との相間の白色バンドとしてチューブから単離し、PMをプールし、35mlチューブ(4本)の間で分割し、TE緩衝液(1mM Tris/0.25Mスクロース/0.25M EDTA緩衝液)で希釈して35mlの総体積にした。
6.超遠心分離を、Beckmanタイプ45.Tiローター(公称容量、94ml Nalgeneチューブ、6本)において、4℃で1時間、40,000rpm(およそ200,000xg)で行った。
7.上清を捨て、残留する緩衝液をすべて、1mlのFinnピペットを使用して除いた。形質膜ペレットを、金属棒を用いてチューブの底部からかき取り、小型のdounceホモジナイザーに移した。ペレット化された膜を、10mMのHepesを含有する2.5mlの総体積のTE緩衝液(10mM Hepes/1mM Tris/0.25Mスクロース/0.25M EDTA緩衝液)における均質化を、ゆるくはまるDounceガラスピストンによる5回〜10回のストロークにより行うことによって再懸濁した。大まかには、およそ2×109個のJurkat細胞に由来する膜を1mlの再懸濁(TE)緩衝液あたり再懸濁することができる。
タンパク質濃度の決定を、BCAキットを製造者の説明書に従って使用して行った。簡単に記載すると、二重でのBSA標準物を、2mg/mlのBSAストック溶液のPBSにおける2倍希釈物(10μlサンプル+10μl緩衝液)によって調製した。標準曲線を、膜サンプルの総タンパク質濃度を求めるために作製し、使用した。
アルカリホスファターゼ溶液
基質溶液:
50mMのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.8)、1.0mMのMgCl2における10mlのホウ酸塩緩衝液につき1錠のp−NPP(1.5mg/mlの最終濃度)
三連でのサンプルを、50μlのサンプルを50μlの希釈緩衝液(50mMのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.8)、1.0mMのMgCl2)に移すことによってホウ酸塩/MgCl2緩衝液において希釈した。200μlの基質溶液(50mMのホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.8)、1.0mMのMgCl2において1.5mg/mlの最終濃度になるように10mlのホウ酸塩緩衝液につき1錠のp−NPP)を、それぞれの希釈物について3つのサンプルのうちの2つに加えた。その後、サンプルを37℃で60分以上インキュベーションした。上清の吸光度を410nmで測定し、基質が添加されなかった適切なコントロールウエル(例えば、総窒素キャビテーション細胞ホモジネートで、核および重いミトコンドリアが除かれたもの)からの値を差し引いた。結果をプロットし、分析した。
反応パラメーター
1回目の選別ラウンド
1.6mlの2%ミルク−PBS(CaおよびMgを含む)において2×1013の総pfuにまで増幅させた、1010個の遺伝子型非重複ファージミド粒子(Ampr)を含むn−CoDeR Lib2000ファージストック。
総反応体積:2.5ml
陽性−5×107個のRamos B細胞リンパ腫細胞
陰性−2×109個の細胞に由来するJurkat T細胞の粗膜
前回の選別ラウンドから溶出され、その後、増幅、沈殿化、および、100μlの2%ミルク−PBS(CaおよびMgを含む)における再懸濁が行われた1.5×1012個のファージ。
総反応体積:0.5ml
陽性−5×106個のRamos B細胞リンパ腫細胞
陰性−1×109個の細胞に由来するJurkat T細胞の粗膜小胞
100μlの2%ミルク−PBS(CaおよびMgを含む)に再懸濁される、前回の選別ラウンドから溶出され、増幅させた1×1012個のファージ。
総反応体積:0.5ml
陽性−5×106個のRamos B細胞リンパ腫細胞
陰性−1×109個の細胞に由来するJurkat T細胞の形質膜小胞
ファージストックを37℃で15分間あらかじめ温め、間欠的にボルテックス処理した。ファージストックをエッペンドルフ遠心分離器において最高速度で15分間遠心分離した。沈殿物が形成されていた場合、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、無脂肪乳に再懸濁して2%の最終濃度にした。
1.10mlの大腸菌HB101F’培養を、15μg/mlのテトラサイクリンを含有する10mlのLB(溶原培地)に50μlの一晩培養物を加えることによって使用の2.5時間前〜3時間前に開始した(1つをそれぞれ選別して増幅するために、そして、1つをOD600測定のために)。ODをおよそ2.5時間後に1つの培養物について調べた。
2.チューブに、OD600=0.5で、溶出ファージの半分を感染させた。
3.チューブを37℃および50rpmで30分間インキュベーションし、適切な表現型分類のために、37℃でさらに30分間インキュベーションした(200rpm)。
4.細菌を2060xg(3000rpm、Beckman GS−6)での10分間の遠心分離によって濃縮した(10ml)。
5.細菌を上清の一部(およそ3ml)に再懸濁し、100μg/mlのアンピシリン+15μg/mlのテトラサイクリン+1%グルコースを含有する大きい500cm2のLA(ルリア寒天)平板に広げた。
6.平板を30℃で一晩インキュベーションした。
7.細菌を、100μg/mlのアンピシリンおよび15μg/mlのテトラサイクリンを含有する5mlのLBを平板あたり加え、かき取ることによって平板から集めた。平板を傾け、溶液を吸引した。
8.平板を、さらに3mlの上記のようなLB培地により洗浄し、50mlのFalconチューブにおいて最初の細菌懸濁物と一緒にプールした。
9.細菌を室温における2100xg/3000rpm(Beckman GS6)での10分間の遠心分離によって濃縮し、100μg/mlのアンピシリンおよび15μg/mlのテトラサイクリンを含有する1mlのLBに再懸濁した。
10.500μlの50%グリセロールを1mlの細菌懸濁物に加え、このグリセロールストックを−80℃で凍結した。
11.100μg/mlのアンピシリンおよび15μg/mlのテトラサイクリンを含有する2つの10ml LBに、工程10のグリセロールストック2.5μl(5μl)を感染させ、OD600=0.5まで増殖させた。
12.6×109PFUのR408ヘルパーファージを1mlの培養物あたり加え、培養物を37℃および50rpmで30分間インキュベーションした。
13.IPTG溶液を100μMの最終濃度に加え(すなわち、10mlの培養物あたり、0.5Mストックからの2μl)、培養物を25℃および175rpmで一晩インキュベーションした。
1.細菌を、室温で10分間、2100xg(3000rpm、Beckman GS−6において)でペレット化し、上清を0.2μmの無菌フィルターに通して無菌濾過した。
2.同じ選別に由来するチューブをプールし、ファージを1/4量のファージ沈殿緩衝液の添加および4℃における少なくとも4時間のインキュベーションによって沈殿させた。
3.チューブを4℃および13000xgで30分間遠心分離した。
4.ペレットを、4℃で一晩、100μlのPBSに完全に再懸濁させた。
1.10mlの大腸菌HB101F’培養を、15μg/mlのテトラサイクリンを含有する10mlのLBに50μlの一晩培養物を加えることによって使用の2.5時間前〜3時間前に開始した(1つをそれぞれ選別して増幅するために、そして、1つをOD600測定のために)。ODをおよそ2.5時間後に1つの培養物について調べた。
2.チューブに、OD600=0.5で、溶出ファージの半分を感染させた。
3.チューブを37℃および50rpmで30分間インキュベーションし、適切な表現型分類のために、37℃でさらに30分間インキュベーションした(200rpm)。
4.200μg/mlのアンピシリンを含有する10mlの温LB培地を加え、感染させた細菌を、各10mlの2つの部分に分割した。
5.2つのチューブの一方において、細菌を、室温における2100xg/3000rpm(Beckman GS−6)での10分間の遠心分離によって濃縮し(10ml)、小体積で再懸濁し、500cm2のLA平板(100μg/mlのアンピシリン+15μg/mlのテトラサイクリン+1%のグルコース)に広げ、30℃で一晩インキュベーションした。
6.ミニプレップ:もう一方の10mlを遠心沈殿させ、0.1%のグルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含有する6mlのLBに再懸濁し、30℃で一晩インキュベーションした(175rpm)。
7.細菌を、100μg/mlのアンピシリンおよび15μg/mlのテトラサイクリンを含有する5mlのLBを平板あたり加え、かき取ることによって平板から集めた。平板を傾け、溶液を吸引した。
8.平板を、さらに3mlの上記のようなLB培地により洗浄し、50mlのFalconチューブにおいて最初の細菌懸濁物と一緒にプールした。
9.細菌を室温における2100xg/3000rpm(Beckman GS6)での10分間の遠心分離によって濃縮し、100μg/mlのアンピシリンおよび15μg/mlのテトラサイクリンを含有する1mlのLBに再懸濁した。
10.500μlの50%グリセロールを1mlの細菌懸濁物に加え、このグリセロールストックを−80℃で凍結した。
11.精製されたファージ−抗体DNAを、キット製造者(BioRad)のプロトコルに従って3mlの培養物からミニプレップを調製することによって得た。
a)示差的選別された抗体プールは実際に、非常に多様化されていた;および、
b)示差的バイオパンニングおよびハイスループット配列決定を組み合わせることによって、特定することができる、示差的発現表面受容体に対して特異的である非重複抗体クローンの数は、従来のスクリーニングアプローチによって達成される桁数よりも大きい桁数である。
質量作用の法則を適用して国際公開WO2004/023140およびFrendeus(2006)に記載されるように行われるインシリコ計算は、(ガンB細胞または前立腺ガン細胞を標的として使用する実施例1において例示されるように)本出願において行われるような示差的バイオパンニングを適用するとき、選別された抗体プールにおける回収された抗体クローンの頻度が、a)標的細胞表面対非標的細胞表面におけるそれらの標的化された受容体の絶対的および相対的な発現、ならびに、b)標的化された表面受容体に対するそれらのそれぞれの親和性の直接的な関数となるであろうことを教示する。
表面受容体の細胞外ドメイン(ECD)を用いた選別
反応パラメーター
2回の示差的バイオパンニング(DU−145対T、「DnonT」)の後で溶出および増幅されたファージを沈殿させ、PBSに再懸濁した。100μl(2.4×1011個のファージに対応する)を3回目の選別ラウンドにおいて使用した。
総反応体積:1.0ml
50pmoleの各タンパク質(上記参照)を使用して、4つのポリスチレン球体(Polysciences、カタログ番号:17175−100)を1mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)の反応体積において被覆した。被覆を、転倒回転とともに室温で1時間、エッペンドルフチューブにおいて行い、そして、続く一晩のインキュベーション工程において、回転を伴うことなく4℃で行った。
本方法のこれらの局面を実施例1に記載されるように行った。
これは、scFvフラグメントがファージミド(AmpR)から制限され、カナマイシン抵抗性をコードする遺伝子を運ぶベクター(pKscFv−3xFH)に挿入される変換方法である。
AvrII(4U/μl、New England Biolabs、カタログ番号R0174)
10×NEBuffer2(New England Biolabs、カタログ番号B7002S)
MQ水
SfiI(20U/μl、New England Biolabs、カタログ番号R0123)
10×BSA(100×BSA(New England Biolabs、カタログ番号B9001S)、MQ水で10倍希釈したもの)
QIAquick PCR精製キット(Qiagen、カタログ番号28104)
SfiI/AvrII消化のpKscFv3xFH
T4 DNAリガーゼ(1U/μl、Invitrogen、カタログ番号15224−017)
5×T4 DNAリガーゼ緩衝液(Invitrogen、カタログ番号P/N Y90001)
・消化反応液を、ファージミドのミニプレップを使用して調製する:
2μg ファージミドのミニプレップ
1μl→4U AvrII
2μl→1× 10×NEBuffer2
MQ H2O 20μlの総体積にまで
・37℃で2時間インキュベーションする。
・SfiI消化を続ける。上記からの消化ミックスに、下記を加える:
1μl→1× 10×NEBuffer2
3μl→1× 10×BSA
1μl→20U SfiI
5μl MQ H2O→30μlの総体積
・50℃で2時間インキュベーションする。
・下記のライゲートミックスを組み立てる:
0.6μl→60ng SfiI/AvrII消化のpKscFv3xFH
6μl→240ng SfiI/AvrII消化/精製されたファージミドのミニプレップ
5μl→1× 5×リガーゼ緩衝液
1μl→1U T4 DNAリガーゼ
12.4μl MQ H2O→25μlの総体積
・16℃で一晩インキュベーションする。
・使用まで−20℃で貯蔵する。
上記で作製されたライゲート体を大腸菌TOP10に形質転換した。
合計で1152個のコロニーを、Genetix“Q−bot”コロニー採取システムを使用して、大きいLA平板から、選別物あたり3つの384ウエルマイクロタイタープレート(合計で9個のプレート)に、それぞれの選別物(CD24、CD130およびHER2)から採取した。
1.LB培地(20μg/mlのカナマイシンおよび1%のグルコース)を混合する。
2.プレート(Greiner Flat 384ウエル、781101)を培地で満たす(60μl/ウエル)。
3.コロニーを、Q−Botをプロトコルに従って用いて採取する。
1.発現用プレート(Greiner Flat 384ウエル、781101)を、カナマイシン(20μg/ml)を含む培地(50μl/ウエル)で満たす。
2.発現用プレートに、マスタープレートから5μl/ウエルを接種する。
3.発現用プレートを、37℃、600rpmで3.5時間インキュベーションする。
4.scFvの産生を、カナマイシン(20μg/ml)および2.5mMのIPTGを含む10μl/ウエルの培地により誘導する。
5.発現用プレートを37℃で10時間インキュベーションする(600rpm)。
6.発現用プレートを+4℃で貯蔵する。
材料:
CD24−GST(0.11mg/ml)、Abnova、カタログ番号H00000943−H01
HER−2−Fc(0.1mg/ml、PBSにて)、R&D Systems、カタログ番号1129−ER
CD130(0.2mg/ml)、R&D Systems、カタログ番号228−GP
ヒトIgG(6.2mg/ml)、Sigma、カタログ番号I2511
抗His−HRP、R&D Systems、カタログ番号MAB050H
抗FLAG−AP、Sigma、カタログ番号A9469
サカナゼラチン、Sigma、カタログ番号G7765
Supersignal ELISA Pico、Thermo Scientific、カタログ番号37069
Tropix CDP Star Emerald II、Applied Biosystems、カタログ番号T2388C
1日目 被覆
1.プレート(Greiner 384ウエルプレート(白色)、HB781074)を、0.1M炭酸ナトリウム(pH9.5)に希釈された下記により被覆する(50μl/ウエル):
CD24(0.4pmole/ウエル)
HER2(0.8pmole/ウエル)
CD130(0.9pmole/ウエル)
hIgG(非標的)(1pmole/ウエル)。
プレートを+4℃で一晩インキュベーションする。
2.プレートを1×PBS/0.05%(v/v)Tween−20により3回洗浄する。
3.PBS+0.05%Tween−20+0.45%サカナゼラチンを加える(40μl/ウエル)。
4.発現させたscFv(10μl/ウエル)を加え、プレートを室温で1時間インキュベーションする。
5.プレートを上記のように洗浄する。
6.PBS+0.05%Tween−20+0.45%サカナゼラチンで希釈された二次抗体、すなわち、1:4000で希釈されたα−HIS−HRPを、CD24被覆プレート、CD130被覆プレートおよびhIgG被覆プレートに、1:25000で希釈されたα−FLAG−APをHER2被覆プレートおよびhIgG被覆プレートに加え(50μl/ウエル)、プレートを室温で1時間インキュベーションする。注意:hIgGについては2倍のプレート。
7.プレートを上記のように洗浄する。プレートを20mM Tris−HCl/10mM MgCl2(pH9.8)により3回洗浄する。
8.基質を加える;
抗His−HRPを有するプレートには、20mM Tris−HCl/10mM MgCl2(pH9.8)において1:20で希釈されるPierce Supersignal ELISA Picoを加え(50μl/ウエル)、プレートを室温で10分間インキュベーションする。
抗Flagを有するプレートには、20mM Tris−HCl/10mM MgCl2(pH9.8)において1:20で希釈されるTropix CDP Star Emerald IIを加え(50μl/ウエル)、プレートを室温で30分間インキュベーションする。
9.プレートを読み取る。
材料
Jurkat細胞
DU145細胞
トリプシン−EDTA(Invitrogen、カタログ番号25300−054)
rh−IFN−γ(R&D Systems、カタログ番号285−IF)
マウスIgGブロック(Jackson Immunoresearch、カタログ番号015−000−002)
FACS緩衝液(Gibco、カタログ番号14040、CaおよびMgを含まないPBS+0.5%BSA)。
Zenon Alexa Fluor647 ヒトIgG標識キット(Invitrogen、カタログ番号Z25408)
DU145細胞を250IEのINF−γにより24時間刺激した。細胞を、細胞解離緩衝液を用いて集めた。
細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、ブロッキング処理を、氷上で10分間、FACS緩衝液における50μg/mlのマウスIgGを使用して行った。一方で、抗体を、製造者の説明書に従って、Zenon AF647により標識した。
INF−γ刺激
DU145細胞を250IEのINF−γにより24時間刺激した。細胞を、細胞解離緩衝液を用いて集めた。
抗体を、遊離型のヨウ素と、酸化剤試薬Iodogen(1,3,4,6−テトラクロロ−3α,6α−ジフェニルグリコルリ、Thermo scientific)により予備被覆された試験管とを製造者の説明書に従って使用して125Iにより標識した。簡単に記載すると、200μgの抗体をPBS中で10分間標識し、遊離型のヨウ素を、小さい使い捨て脱塩カラム(NAP5、GE Healthcare Life science)を使用して除いた。標識された抗体は、ペーパークロマトグラフィーにより推定される場合、およそ2.5μCi/μg抗体の比活性を有し、1%未満の遊離型のヨウ素を含有した。
普遍的な質量作用の法則(LMA)を適用して、低発現リガンドおよび/または示差的発現リガンドに対する抗リガンドを多様性の大きいディスプレーライブラリーから単離するために必要となるリガンドの数を計算することができる。
すなわち、[A](総A)=[fA]+[bA]、および、[T](総T)=[fT]+[bA]
A=抗リガンドAの総数
T=リガンドTの総数
V=反応体積(リットル)
C=アボガドロ定数(6.022×1023粒子/モル)
CP=標的リガンド構築物の数
CS=サブトラクターリガンド構築物の数
TP=CP上のTリガンドの数
TS=CS上のTリガンドの数
実施例1において例示される式は、第1のサブトラクターリガンドおよび第2の標的リガンドの両方の高い濃度を利用することが、低発現および示差的発現リガンドに対する特異性を有する抗リガンドの効率的な回収において、同様にまた、普通に発現されるリガンドに対する特異性を有する抗リガンドの軽減のために役に立つことを示す。
VP=球体積
すなわち、球の半径が小さいほど、リガンド/体積の比率が大きくなり、かつ、リガンドがより粒子状(懸濁物様)になる。
好ましい局面において、本発明は、それらの生来的形態での細胞表面抗原に対する特異性を有し、かつ、それらの性質(タンパク質、炭水化物、脂質、複合体)に依存しない抗リガンドを単離するために使用される。加えて、結合する抗原は、別の細胞タイプ(例えば、形質転換されたガン細胞、ウイルス/細菌/寄生虫/真菌感染細胞、または、コントロール細胞に対して他のアゴニスト刺激細胞もしくは感染活性化細胞)と比較して1つの細胞タイプにおいてアップレギュレーションされるか、または特有に発現される抗原である。
・非結合の抗リガンド、および、コントロール集団に見出されるリガンドに対する特異性を有する抗リガンドに由来する陽性リガンドに対して複合体化される抗リガンドの物理的かつ空間的な分離。
・Ficoll洗浄は剪断力を増大させる。したがって、そのような洗浄はより効率的であり、洗浄繰り返し(パンニングラウンド)がそれほど必要とされない;また、目的とする特異的に結合した(より高親和性の)抗リガンドの最小限の解離が存在する。
・細胞表面リガンドの形態/立体配座および/または組成を変化させるかもしれない細胞のタグ化または化学的修飾を必要としない(FACS(蛍光活性化細胞選別機)またはMACS(磁気活性化細胞選別機)に基づく競合的バイオパンニングを比較のこと)。
細胞全体を、より高密度の媒体においてもたらされる膜小胞によって置き換えることができ、これにより、一層より高濃度のリガンドを、平衡反応を損なうことなく利用することが可能になる。
本発明のさらなる実施形態が、調査対象の細胞集団の中におけるほんの少数の細胞において非常に低い密度で発現される細胞リガンドに対する特異性を有する抗リガンドを単離するために使用される場合がある。
本発明のさらなる実施例は、生物学的サンプル(例えば、血漿、尿、脳脊髄液)において異なる存在量で存在するリガンドに対する抗リガンドが、非常に多様化された分子ライブラリーから単離されることを可能にする。そのような抗リガンドは続いて、例えば、タンパク質発現分析および潜在的バイオマーカーの特定のために使用される場合がある。
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Claims (25)
- 少なくとも1つの示差的発現標的リガンドに対する少なくとも1つの抗リガンドを単離する方法であって、下記の工程:
(a)示差的バイオパンニングを、少なくとも1つの抗リガンドを単離するように抗リガンドのライブラリーに対して行う工程;および
(b)ハイスループット配列決定を工程(a)の期間中に単離される抗リガンドに対して行う工程
を含む方法。 - さらに、下記の工程:
(c)確認スクリーニングを前記示差的発現リガンドに対する抗体特異性について行う工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記示差的バイオパンニング工程が、下記のサブ工程:
(i)抗リガンドのライブラリーを提供するサブ工程;
(ii)サブトラクターリガンド構築物に固定されるか、または組み込まれるリガンドを含むリガンドの第1の集団を提供するサブ工程;
(iii)標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる、工程(ii)と同じリガンドを含むリガンドの第2の集団を提供するサブ工程;
(iv)前記集団における前記サブトラクターリガンド構築物および前記標的リガンド構築物の量を、示差的発現標的リガンドに対する抗リガンドの単離を可能にするように、普遍的な質量作用の法則
A、B、C、Dは反応における関与物(反応物および生成物)であり、
a、b、c、dは、釣り合った化学式のために必要な係数である)
から導かれる1つまたは複数の式を使用して求めるサブ工程;
(v)工程(iv)において求められるような前記量のサブトラクターリガンド構築物を提供するサブ工程;
(vi)工程(iv)において求められるような前記量の標的リガンド構築物を提供するサブ工程;
(vii)前記標的リガンド構築物に結合する抗リガンドを、サブトラクターリガンド構築物に結合する抗リガンドから単離するための分離手段を提供するサブ工程;
(viii)(i)の前記ライブラリーを、リガンドに対する抗リガンドの結合を可能にするために、(v)および(vi)によって提供される前記リガンド構築物にさらすサブ工程;および
(ix)前記分離手段を使用して、前記標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる前記リガンドに結合する抗リガンドを単離するサブ工程
を含む、いずれかの前記請求項に記載の方法。 - 前記ハイスループット配列決定工程が、454シーケンシング法、イルミナ法、SOLiD法またはHelicosシステムによって行われる、いずれかの前記請求項に記載の方法。
- 前記確認スクリーニング工程が、フローサイトメトリー、FMAT、ELISA、MSDまたはCBAによって行われる、いずれかの前記請求項に記載の方法。
- 前記リガンドが、前記標的構築物または前記サブトラクター構築物のどちらか一方において発現されない、請求項3に記載の方法。
- 前記抗リガンドを前記リガンドから遊離させるさらなる工程を含む、請求項3または6に記載の方法。
- 工程(ii)〜工程(ix)が、複数の異なるリガンドに対する複数の抗リガンドを単離するために並行して行われる、請求項3、6または7に記載の方法。
- 工程(ii)〜工程(ix)が1回または複数回繰り返される、請求項3または6〜8に記載の方法。
- 前記サブトラクター構築物または標的構築物の一方の量が前記サブトラクター構築物または標的構築物の他方の量を越えて提供される、請求項3または6〜9に記載の方法。
- リガンドの過剰が10倍〜1000倍の間であり、または、2倍〜10倍の間であり、または、1000倍〜1,000,000倍の間である、請求項10に記載の方法。
- 前記分離手段が、固体担体、細胞膜および/またはその一部分、合成膜、ビーズ、化学的タグおよび遊離型リガンドの少なくとも1つから選択される、請求項3または6〜12に記載の方法。
- 前記サブトラクター構築物および標的構築物の前記分離手段が異なる密度を有する、請求項3または6〜13に記載の方法。
- 前記サブトラクター構築物の前記分離手段が膜小胞または完全な細胞膜である、請求項3または6〜14に記載の方法。
- 工程(ix)が、密度遠心分離、固体担体隔離、磁気ビーズ隔離、化学的タグ結合および水相分配の少なくとも1つによって行われる、請求項3または6〜15に記載の方法。
- 工程(a)の前記ライブラリーが、抗リガンドを呈示する複数のライブラリーメンバーを含むディスプレーライブラリーである、いずれかの前記請求項に記載の方法。
- 前記ライブラリーがファージディスプレーライブラリーである、いずれかの前記請求項に記載の方法。
- 前記リガンドが、抗原;受容体リガンド;ならびに、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、無機分子およびコンジュゲート化分子からの少なくとも1つを含む酵素標的から選択される少なくとも1つである、いずれかの前記請求項に記載の方法。
- 前記抗リガンドライブラリーが、抗体、および、その抗原結合性の変化体、誘導体またはフラグメント;操作された可変表面を有する足場分子;受容体;ならびに酵素からの少なくとも1つから構築される、いずれかの前記請求項に記載の方法。
- 前記リガンドおよびその分離手段を、前記リガンド構築物における標的リガンドの発現に影響を及ぼす刺激にさらすさらなる工程を含む、請求項3または6〜20に記載の方法。
- 所望される特性を有する抗リガンドを、いずれかの前記請求項に記載される方法によって特定した後、前記抗リガンドを医薬的に許容されるキャリアに加えることを含む、医薬組成物を調製するための方法。
- 医療における使用のための、請求項22に記載される方法によって調製される医薬組成物。
- 疾患の予防、処置、画像化、診断または予後のための医薬品の製造における、請求項23に記載されるような医薬組成物の使用。
- 実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるような方法。
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