JP5830249B2 - 癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定方法及びコンピュータプログラム - Google Patents

癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定方法及びコンピュータプログラム Download PDF

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Description

本発明は、ＧＳＴπの発現量に基づいた、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定する方法及びコンピュータプログラムに関する。
癌の一般的な治療法の一つに化学療法があり、各種の抗癌剤投与が行われている。しかしながら、癌の種類や患者個々人の差により有効な抗癌剤は異なり、また、抗癌剤は治療域と有害域がオーバーラップする場合が多い。従って、効果的でない抗癌剤を投与した場合は、癌の再発可能性が高まるばかりか、抗癌剤の副作用により患者の体力が低下し、次に有効な別の抗癌剤を投与しても十分な効力を発揮できない恐れがある。このことから、安全性を確保しつつ有効性を得るために、投与前に有効な抗癌剤を正確に特定する薬剤反応性を予想するシステムの開発が切望されている。
従来、癌に対する抗癌剤の感受性検査としては、患者から単離した癌細胞に様々な抗癌剤を接触させ、癌細胞の増殖抑制等を指標としてその癌細胞に有効と思われる抗癌剤を特定する方法が採用されてきた。しかしながら、このような試行錯誤的方法では、検査結果が十分に臨床治療効果に反映しないばかりか、抗癌剤治療に大量の癌細胞が必要となる。そのため、治療効果の低い抗癌剤の投与による再発の問題、及び大量の癌細胞の採取による患者への負担の問題が有った。
アンスラサイクリン系抗癌剤は、トポイソメラーゼIIのＤＮＡの再結合を阻害することで、アポトーシスを誘導する抗癌剤である。アンスラサイクリン系抗癌剤は、臨床上高く評価され、乳癌等の化学療法において汎用されている。しかしながら、他の抗癌剤と同様に、心毒性、白血球減少等の重大な副作用を引き起こす恐れがある。従って、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定方法の確立は非常に重要である。
グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼπ(ＧＳＴπ)は、ヒトのグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ファミリーに属する酵素のうち、ＧＳＴＰ１遺伝子にコードされた分子量約２２．５ｋＤａのタンパク質である。ＧＳＴπは、還元型グルタチオン(ＧＳＨ)と抗癌剤との抱合体形成を触媒することにより、抗癌剤の毒性を弱めることに関与している。そのため、一般的にＧＳＴπが高発現している癌細胞は、ＧＳＴπが低発現している癌細胞に比べ、抗癌剤に対する耐性が高まることが知られている。例えば、非特許文献１には、一般的にＧＳＴπが高発現している癌細胞は、ＧＳＴπが低発現している癌細胞に比べ、アンスラサイクリン系抗癌剤に対する耐性が高まることが報告されている。
Andrew H., et al. ROLE OF GLUTATHIONE S-TRANSFERASE P1, P-GLYCOPROTEIN AND MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN 1 IN ACQUIRED DOXORUBICIN RESISTANCE.Int.J.Cancer:92,777-783(2001)
本発明は、乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定する方法、及びその方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
上述のように、従来、ＧＳＴπが高発現している癌細胞は、アンスラサイクリン系抗癌剤に対する耐性が高まると考えられていた。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、ＧＳＴπが高発現している乳癌の癌細胞は、乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いことを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、乳癌の癌細胞を含む生体試料に含まれる、ＧＳＴπの発現量を測定する工程と、測定工程で得られたＧＳＴπの発現量と第１の閾値とを比較し、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上の場合に、生体試料に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する工程と、を含む、生体試料に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定する方法を提供する。
また、本発明は、コンピュータを、乳癌の癌細胞を含む生体試料に含まれる、ＧＳＴπの発現量を取得する取得手段と、ＧＳＴπの発現量と第１の閾値とを比較する比較手段と、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上の場合に、生体試料中に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する判定手段と、判定結果を出力する出力手段、として機能させるためのコンピュータプログラムを提供する。
本発明によれば、患者に大きな負担をかけることの無い、客観的かつ正確な、乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定する方法を提供することができる。また、本発明によれば、前述の感受性の判定方法を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを提供することができる。
また、本発明の方法及びコンピュータプログラムによれば、乳癌の癌患者から採取された乳癌の癌細胞におけるＧＳＴπの発現量に基づいて、乳癌の癌患者に対する、アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性を判断できる。そのため、患者への有効なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与が可能となるばかりで無く、不要なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与を回避することができる。結果として、本発明によれば、患者の副作用による負担を低減することが可能となる。
生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定するコンピュータによる一実施形態を示す。 ＧＳＴπの発現量を用いた、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を高いと判定するコンピュータにおける判定フローを示す。 ＧＳＴπの発現量及びＣＤＫ１比活性値／ＣＤＫ２比活性値を用いた、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定するコンピュータにおける判定フローを示す。 ＧＳＴπの発現量及びＣＤＫ１比活性値／ＣＤＫ２比活性値を用いた、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高い又は低いと判定するコンピュータにおける判定フローを示す。 実施例１において、２９種の乳癌細胞株におけるＩＣ５０の結果及びＧＳＴπの発現量を示す図である。 実施例２において、９つの臨床検体のうち、非再発検体及び再発検体におけるＧＳＴπの発現量を示す図である。 実施例３において、２７種の乳癌細胞株におけるＩＣ５０の結果、ＧＳＴπの発現量及びＣＤＫ２の比活性値／ＣＤＫ１の比活性値の値を示す図である。
本実施形態において、癌細胞は、特に制限されるものではない。例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌および白血病細胞等の癌細胞が挙げられる。本実施形態では、癌細胞は、乳癌の癌細胞が好ましい。
本実施形態において、癌患者は、特に制限されるものではない。例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、皮膚癌および白血病細胞等の癌患者が挙げられる。本実施形態では、癌患者は、乳癌の癌患者が好ましい。
本実施形態において、生体試料は、ヒト等の動物から採取された複数の細胞を含む試料であれば特に限定されない。例えば、血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、及び手術や生検により被験者から採取した細胞や組織などが挙げられる。また、被検者から採取した細胞や組織を培養して得られた試料を生体試料として用いることもできる。
本実施形態において、アンスラサイクリン系抗癌剤は、抗癌作用を有するアンスラサイクリン化合物であれば、特に制限されない。例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン、イダルビシンが挙げられる。本実施形態では、アンスラサイクリン系抗癌剤は、ドキソルビシンが好ましい。
本実施形態は、癌細胞を含む生体試料に含まれるＧＳＴπの発現量を測定する工程（以下、「測定工程」ということがある）を含む。測定工程は、ＧＳＴπのタンパク又はｍＲＮＡの発現量を測定できる、公知の測定方法を用いて行えばよく、特に制限されない。公知の測定方法としては、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、２次元電気泳動法、プロテインチップによる解析法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、免疫蛍光法、ウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ＮＡＳＢＡ法及びＤＮＡチップによる方法等が挙げられる。本実施形態における、測定方法としては、ＧＳＴπのタンパクの発現量を測定する測定方法が好ましい。
本実施形態は、測定工程で得られたＧＳＴπの発現量が大きい場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する工程（以下、「判定工程」ということがある）を含む。
本実施形態において、ＧＳＴπの発現量の大小は、測定工程で使用した測定方法に応じ、ＧＳＴπの発現量を目視または数値化して、判定することができる。例えば、測定工程において、ＧＳＴπのタンパクの発現量をウエスタンブロッティング法で測定した場合、メンブレン上に出現したＧＳＴπのタンパクのバンドと、コントロールのバンドとを、目視で比較し、ＧＳＴπの発現量の大小を判定することができる。また、前述のメンブレン上に出現したＧＳＴπのタンパクのバンドを、イメージスキャナに取り込み、そのシグナル強度を解析することで、ＧＳＴπの発現量を数値化する。もしくは、測定工程において、ＧＳＴπのタンパクの発現量をフィルタープレートを用いて測定した場合、プレート上に出現したＧＳＴπのタンパクの蛍光と、コントロールの蛍光とを、目視で比較し、ＧＳＴπの発現量の大小を判定することができる。また、前述のプレート上に出現したＧＳＴπの蛍光を、イメージスキャナに取り込み、その蛍光強度を解析することで、ＧＳＴπの発現量を数値化する。そして、数値化したＧＳＴπの発現量と、所定の閾値（第１の閾値）とを比較することで、ＧＳＴπの発現量の大小を判定することもできる。本実施形態における判定工程は、数値化したＧＳＴπの発現量と、第１の閾値とを比較し、ＧＳＴπの発現量の大小を判定するほうが、客観性の観点から好ましい。
ここで、第１の閾値は、生体試料中に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判断する際の、ＧＳＴπの発現量の判定基準である。この第１の閾値は、測定工程で使用した測定方法に応じ、経験的に適宜設定することができる。例えば、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高い癌細胞を含む、複数の生体試料の、ＧＳＴπの発現量を測定する。同様に、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低い癌細胞を含む、複数の生体試料のＧＳＴπの発現量を測定する。得られた複数のＧＳＴπの発現量から、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高い癌細胞を含む生体試料と、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低い癌細胞を含む生体試料とを、区別可能なＧＳＴπの発現量の値を、第１の閾値として設定することができる。
なお、本実施形態において、測定工程は、さらに、癌細胞を含む生体試料に含まれるサイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）の比活性値と、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）の比活性値とを測定することができる。また、判定工程は測定工程で得られたＧＳＴπの発現量が大きい場合、または測定工程で得られたＣＤＫ２の比活性値／測定工程で得られたＣＤＫ１の比活性値（以下、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値ということがある）の値と第２の閾値を比較し、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値より大きい場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定することができる。このように、ＧＳＴπの発現量に加え、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を用いることで、より正確に、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定することができる。
ここで、ＣＤＫ１の比活性値とは、細胞に存在しているＣＤＫ１のうち、活性を示すＣＤＫ１の割合に相当する。ＣＤＫ１の比活性値は、具体的に、ＣＤＫ１の活性値／ＣＤＫ１の発現量により算出することができる。また、ＣＤＫ２の比活性値とは、細胞に存在しているＣＤＫ２のうち、活性を示すＣＤＫ２の割合に相当する。ＣＤＫ２の比活性値は、具体的に、ＣＤＫ２の活性値／ＣＤＫ２の発現量により算出することができる。
ＣＤＫ１の活性値及びＣＤＫ２の活性値は、例えば、ＣＤＫによってリン酸化される基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で表す）である。なお、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２がリン酸化する基質としては、例えば、ヒストンＨ１が挙げられる。
ＣＤＫ１の活性値及びＣＤＫ２の活性値は、公知のＣＤＫ活性測定方法によって測定することができる。公知のＣＤＫ活性測定方法としては、例えば、放射性物質による標識を用いる方法や、放射性物質による標識を用いない方法が挙げられる。放射性物質による標識を用いる方法としては、例えば、癌細胞を含む生体試料から試料を調製し、当該試料と32Ｐ標識したＡＴＰ（[γ−32Ｐ]ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に32Ｐを取り込ませ、32Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとにＣＤＫ１の活性値又はＣＤＫ２の活性値を定量する方法などが挙げられる。また、放射性物質による標識を用いない方法としては、例えば、米国公開２００２／１６４６７３号公報に記載の方法が挙げられる。米国公開２００２／１６４６７３号公報に記載の方法は、癌細胞を含む生体試料から試料を調製し、アデノシン５’-Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰγＳ）と基質タンパク質を反応させて、該基質タンパク質のセリン残基又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に蛍光標識物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基に基づく標識量（蛍光標識物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
活性測定に用いる試料は、測定対象となる癌細胞を含む生体試料からＣＤＫ１又はＣＤＫ２を特異的に採集することにより調製する。この場合、試料はＣＤＫ１又はＣＫＤ２のいずれかに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性化ＣＤＫ１以外のＣＤＫ１、または活性化ＣＤＫ２以外のＣＫＤ２が含まれることになる。例えば、ＣＫＤ１の場合は、サイクリン・ＣＤＫ１複合体にＣＤＫ１インヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ１抗体を用いた場合には、単体のＣＤＫ１、ＣＤＫ１とサイクリン及び／又はＣＤＫ１インヒビターの複合体、ＣＤＫ１とその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、ＣＤＫ１活性値は、ＣＤＫ１活性型、ＣＤＫ１不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。ＣＤＫ２の場合も、上述したＣＫＤ１の場合と同様の状態下で測定される。
ＣＤＫ１の発現量又はＣＤＫ２の発現量は、測定対象となる癌細胞を含む生体試料の可溶化液に含まれるＣＤＫ１量又はＣＤＫ２量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物からタンパク質質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０９７１号に開示の方法で測定することもできる。ＣＤＫ１及びＣＤＫ２は、それぞれに特異的な抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、ＣＤＫ１の場合は、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ１担体、ＣＤＫ１とサイクリン及び／又はＣＤＫ１インヒビターの複合体、ＣＤＫ１とその他の化合物との複合体を含む）を補足できる。ＣＤＫ２の場合も、上述したＣＫＤ１の場合と同様の手法でＣＤＫ２の発現量を測定できる。
ここで、第２の閾値は、生体試料中に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判断する際の、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の判定基準である。この閾値は、測定工程で使用した測定方法に応じ、経験的に適宜設定することができる。例えば、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高い癌細胞を含む、複数の生体試料の、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を測定する。同様に、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低い癌細胞を含む、複数の生体試料のＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を測定する。得られた複数のＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値から、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高い癌細胞を含む生体試料と、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低い癌細胞を含む生体試料とを、区別可能なＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を、閾値として設定することができる。
本実施形態において、判定工程は、さらに、測定工程で得られたＧＳＴπの発現量が小さく、且つＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値と第２の閾値を比較し、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が閾値より小さい場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低いと判定することもできる。このように、ＧＳＴπの発現量とＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を用いることで、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低いと判定することもできる。結果として、患者への不要なアンスラサイクリン系抗癌剤の投与を回避することができる。
本実施形態において、コンピュータプログラムは、上記の生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定をコンピュータに実施させることができる。その具体的なコンピュータの一例を、図１に示す。
コンピュータ１００は、本体１１０と、表示部１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成されている。本体１１０は、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インターフェイス１１０ｆ、及び画像出力インターフェイス１１０ｈは、お互いにバス１１０ｉによってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等によって構成されており、ＣＰＵ１１０ａに実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭ等によって構成されている。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０ｂ及びハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１１０ａの作業領域として利用される。
ハードディスク１１０ｄは、オペレーティングシステム及びアプリケーションシステムプログラム等、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム１４０ａも、このハードディスク１１０ｄにインストールされている。
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によって構成されており、可搬型記憶媒体１４０に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。また、可搬型記憶媒体１４０には、コンピュータに判定に係るアプリケーションプログラム１４０ａが格納されており、ＣＰＵ１１０ａが可搬型記憶媒体１４０から当該アプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム１４０ａをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。
また、ハードディスク１１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェイス環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した判定に係るアプリケーションプログラム１４０ａは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
入出力インターフェイス１１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインターフェイス、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインターフェイス、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインターフェイス等から構成されている。入出力インターフェイス１１０ｆには、キーボード及びマウスからなる入力デバイス１３０が接続されており、ユーザが当該入力デバイス１３０を使用することにより、コンピュータ本体１１０にデータを入力することが可能である。
また、入出力インターフェイス１１０ｆには、測定装置２００が接続されている。これにより、コンピュータ本体１１０は、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して、ＧＳＴπの発現量を取得することが可能である。
画像出力インターフェイス１１０ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴ等で構成された表示部１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部１２０に出力するようになっている。表示部１２０は、入力された映像信号にしたがって、画像データを出力する。また、表示部１２０は、後述するＣＰＵ１１０ａから与えられた判定結果を出力する。
図２は、生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量による、上述の判定を実行するためのアプリケーションプログラム１４０ａの動作を示すフローチャートである。まず、測定装置２００により取得された生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量に関する情報が、入出力インターフェイス１１０ｆを介してコンピュータ本体１１０に入力される。ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量に関する情報に基づいて、ＧＳＴπ発現量を算出し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１）。ここで、生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量に関する情報として、後述する実施例１において蛍光強度測定装置（Plate Reader(Infinite F200、Tecan社製)）により測定された蛍光強度が、コンピュータ本体１１０に入力される。
ＣＰＵ１１０ａは、予めアプリケーションプログラム１４０ａのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶させていた閾値を呼び出して、この閾値とＧＳＴπの発現量との比較を実行する（ステップＳ２）。ここで、閾値は、後述する実施例１におけるGSTπ発現量の閾値３である。
次に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が閾値以上であるか否かを判断する(ステップＳ３)。
次に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が閾値以上である場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「高い」と判定する（ステップＳ４）。逆に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が閾値未満の場合、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定を「保留」とする（ステップＳ５）。ここで、後述する実施例１における２９種の乳癌細胞株のうち、９種の乳癌細胞株がアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「高い」と判定され、２０種の乳癌細胞株が「保留」と判定された。
そして、ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介して、表示部１２０に出力する（ステップＳ６）。
なお、本実施形態において、ＧＳＴπの発現量は、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得されたが、これに限定されるものではなく、例えば、ＧＳＴπの発現量は、操作者による入力により、入力デバイス１３０から取得されるようにしてもよい。
本実施形態におけるコンピュータプログラムは、ＧＳＴπの発現量に加えて、さらに、ＣＤＫ２の比活性値／ＣＤＫ１の比活性値（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）の値を用いて、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定をコンピュータに実施させることができる。
図３は、ＧＳＴπの発現量及びＣＤＫ１比活性値／ＣＤＫ２比活性値により、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定するアプリケーションプログラム１４０ａの動作を示すフローチャートである。まず、測定装置２００により取得された生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量に関する情報が、入出力インターフェイス１１０ｆを介してコンピュータ本体１１０に入力される。ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量に関する情報に基づいて、ＧＳＴπ発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量を算出し、それぞれＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ７）。ここで、生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量に関する情報として、後述する実施例３において蛍光強度測定装置(Plate Reader(Infinite F200、Tecan社製)により測定された蛍光強度が、コンピュータ本体１１０に入力される。
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＡＭ１１０ｃに記憶されているＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量から、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を算出する（ステップＳ８）。
ＣＰＵ１１０ａは、予めアプリケーションプログラム１４０ａのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶させていた第１の閾値及び第２の閾値を呼び出して、第１の閾値とＧＳＴπの発現量、及び第２の閾値とＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値との比較を実行する。（ステップＳ９）。ここで、第１の閾値としては、後述する実施例３におけるGSTπ発現量の閾値３である。また、第２の閾値としては、後述する実施例３におけるＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の閾値７．４１である。
次に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上、またはＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値以上であるか否かを判断する(ステップＳ１０)
次に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上である場合、またはＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値以上である場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「高い」と判定する（ステップＳ１１）。逆に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値未満である場合、またはＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値未満である場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定を「保留」とする（ステップＳ１２）。ここで、後述する実施例３における２７種の乳癌細胞株のうち、１６種の乳癌細胞株がアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「高い」と判定され、１１種の乳癌細胞株が「保留」と判定された。
そして、ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介して、表示部１２０に出力する（ステップＳ１３）。
さらに、本実施形態におけるコンピュータプログラムは、ＧＳＴπの発現量に加えて、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を用いて、さらに、アンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「低い」癌細胞を、判定することもできる。
図４は、ＧＳＴπの発現量及びＣＤＫ１比活性値／ＣＤＫ２比活性値により、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高い又は低いと判定するアプリケーションプログラム１４０ａの動作を示すフローチャートである。まず、測定装置２００により取得された生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量に関する情報が、入出力インターフェイス１１０ｆを介してコンピュータ本体１１０に入力される。ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπ発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量に関する情報に基づいて、ＧＳＴπ発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量を算出し、それぞれＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１４）。ここで、生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπの発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量に関する情報として、後述する実施例３において蛍光強度測定装置(Plate Reader(Infinite F200、Tecan社製)により測定された蛍光強度が、コンピュータ本体１１０に入力される。
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＡＭ１１０ｃに記憶されているＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量から、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を算出する（ステップＳ１５）。
ＣＰＵ１１０ａは、予めアプリケーションプログラム１４０ａのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶させていた第１の閾値及び第２の閾値を呼び出して、第１の閾値とＧＳＴπの発現量、及び第２の閾値とＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値との比較を実行する。（ステップＳ１６）。ここで、第１の閾値としては、後述する実施例３におけるGSTπ発現量の閾値３である。また、第２の閾値としては、後述する実施例３におけるＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の閾値７．４１である。
次に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値未満、かつＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値未満であるか否かを判断する(ステップＳ１７)。
ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値未満、かつＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値未満である場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「低い」と判定する（ステップＳ１８）。逆に、ＣＰＵ１１０ａは、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上の場合、又はＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値以上の場合に、生体試料に含まれる癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「高い」と判定する（ステップＳ１９）。ここで、後述する実施例３における２７種類の乳癌細胞株のうち、７種の乳癌細胞株がアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「低い」判定され、２０種の乳癌細胞株がアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が「高い」と判定された。
そして、ＣＰＵ１１０ａは、上記のいずれかの判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介して、表示部１２０に出力する（ステップＳ２０）。
なお、本実施形態において、ＧＳＴπの発現量、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量は、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得されたが、これに限定されるものではなく、例えば、ＧＳＴπの発現量は、操作者による入力により、入力デバイス１３０から取得されるようにしてもよい。
なお、本実施形態において、ＧＳＴπの発現量は、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得されたが、これに限定されるものではなく、例えば、ＧＳＴπの発現量は、操作者による入力により、入力デバイス１３０から取得されるようにしてもよい。
（参考例１）
＜乳癌細胞株の培養＞
ヒト乳癌細胞株であるＡＵ５６５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３５１）、ＢＴ−２０細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１９）、ＢＴ−４７４細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２０）、ＢＴ−５４９細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２２）、ＨＣＣ１５６９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３３０）、ＨＣＣ１９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３３６）、Ｈｓ５７８Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２６）、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３０）、ＺＲ−７５−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５００）、ＺＲ−７５−３０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０４）、ＨＣＣ１４１９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３２６）、ＨＣＣ２０２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３１６）、ＢＴ−４８３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２１）、ＣＡＭＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２１）、ＨＣＣ１９５４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３３８）、ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、Ｔ−４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３３）、ＨＣＣ１５００細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３２９）、ＨＣＣ１４２８細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３２７）、ＨＣＣ１８０６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３３５）、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２８）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２７）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２９）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３１）、ＵＡＣＣ−８１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８９７）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２４）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３０）、ＵＡＣＣ−８９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９０２）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、ＡＴＣＣ推奨の培養条件に従って培養した。
表１に、各細胞株のＡＴＣＣ推奨の培養条件である基本培地、基本培地におけるFBS(ウシ胎仔血清)パーセント濃度、培地への添加物及び培養環境を示す。
Figure 0005830249
（参考例２）
＜測定用試料の作成＞
参考例１に示される２９種の各乳癌細胞株を、参考例１の培養条件にて15cmディッシュ中の培地にそれぞれ播種して、７０〜８０％コンフレントとなるように培養した。培養後、15cmディッシュから培地を除去し、リン酸緩衝化生理的食塩水10ｍLを15cmディッシュに入れ、当該リン酸緩衝化生理食塩水で15cmディッシュ内の細胞を洗浄した。次に、15cmディッシュ内の細胞に、トリプシン-EDTA溶液(0.05％トリプシン、0.53ｍM EDTA)3ｍLを添加し、37℃で5−10分インキュベーションし、細胞をフラスコから剥がした。このフラスコに、10mＬ以上の培地を添加して、トリプシンによる反応を停止させ、細胞を回収した。
回収した細胞を、マイクロチューブにそれぞれ移した。次に各マイクロチューブに可溶化試薬(50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA(pH8.0)、50mM NaF、1mM Na3VO4、0.1% NP40、0.2% protease inhibitor cocktail(sigma社))を液中のタンパク濃度が終濃度2ug/uLとなるように150 - 250μL分注した。次にマイクロチューブをホモジナイザーに設置した後にホモジナイズし、微量高速遠心機CF15RX（日立社製）で4℃下、15000rpm、5分間遠心分離した。次に、マイクロチューブの上清を氷上に静置した1.5ｍLマイクロチューブに移し、測定用試料とした。
（実施例１）
＜GSTπ発現量による癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定＞
生体試料に含まれる癌細胞のＧＳＴπ発現量による癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定を、以下のように検討を行った
＜ＩＣ５０の測定＞
参考例１に示される２９種の各乳癌細胞株を、０nM、２５０ｎM、５００ｎM、７５０ｎM、１０００ｎM、２０００ｎMとする濃度のドキソルビシンを含む培地で、２枚のマイクロプレート上に５０００ｃｅｌｌｓ／１００ｕＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養した。
次に、各濃度のドキソルビシンを含む培地を調製し、培地交換を行った。マイクロプレートのうち１枚は、培地交換直後にCelltiter Glo Luminescent Cell Viavility Assay(Promega社製:Cat#G7571)を用いて、細胞の増殖測定を行った。残りの１枚は培地交換後、参考例１に示される培養条件下で７２時間培養した後にCelltiter Glo Luminescent Cell Viavility Assay(Promega社製:Cat#G7571)を用いて、細胞の増殖測定を行った。
測定された生細胞数に基づき、ドキソルビシンで処理していない培地における生細胞数／ドキソルビシンで処理して得られた培地中における生細胞数×１００＝５０となるドキソルビシンの濃度（ＩＣ５０）を求めた。
ここで、ＩＣ５０の中央値（median）である３９２ｎＭを閾値とし、閾値以上を示す乳癌細胞株を非感受性株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株を感受性株とした。
＜ＧＳＴπの発現量の測定＞
使用する試薬は、以下のように調製した。
ＧＳＴπの発現量の測定に用いた試薬を以下に示す。
(1)ブロッキング試薬
Block Ace(粉末)(大日本住友製薬社製)を、最終濃度が4%となるように超純水に溶解し、ブロッキング試薬を調製した。

(2)一次抗体試薬
10倍希釈したブロッキング溶液に、GSTπ抗体(BD Transduction社)を、5ug/mLとなるように溶解し、一次抗体試薬を調整した。

(3) トリス緩衝生理食塩水（TBS）
10×TBS solution（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol: 30.28g, NaCl: 87.7g, 6N HCl: 110g / L） を10倍希釈して、TBSを調製した。

(4)二次抗体試薬
TBSに、ウシ血清アルブミンBSAを、最終濃度が1%となるように超純水に溶解し、TBS(1% BSA)を調製した。得られたTBS(1% BSA)に、Goat Anti-Mouse IgG(H+L) -BIOT Human/Mouse(Southern Biotech社製)を、30ug/mLとなるように溶解し、二次抗体試薬を調整した。

(4)蛍光標識試薬
上述のTBS(1% BSA)に、Fluorescein StreptAvidin (Vector社製)を、10μg/mLとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調整した。
ＧＳＴπの発現量は、以下のように測定した。フィルタープレート（Multi Screen HTS PSQ Plates）に、参考例２の通り調整した、参考例１に示される２９種の乳癌細胞株の各測定用試料を10μg/well分注し、吸引により水分を除去した後、ブロッキング剤試薬を１００μL/well分注し吸引した。
吸引後、1次抗体試薬を５０μL/well分注しすぐに吸引後、再び５０uL/well分注し、２時間静置した後に吸引し１次抗体を除去した。次に、TBS 300μL/well分注して吸引する洗浄を4回行った。洗浄後、2次抗体試薬を５０μL/well分注しすぐに吸引後、再び50uL/well分注し、１時間静置した後に吸引し2次抗体を除去した。次に、TBS ３００μL/well分注し、吸引する洗浄を２回行った。洗浄後、標蛍光標識試薬を１００μL/well分注し、直後に吸引した。次に、TBS ３００μL/well分注して吸引する洗浄を４回行った後、フィルタープレートを乾燥させた。
乾燥後、InfiniteF200(Tecan社製)で蛍光強度を測定した。ここで、各測定用試料のGSTπの発現量は、キャリブレーターとしてGSTP1 recombinant Protein(Abnova社 Cat No.H00002950-P01)を0ng/100uL/well、10ng/100uL/well、30ng/100uL/well、50ng/100uL/wellの各濃度となるようにフィルタープレート上に載せ、InfiniteF200(Tecan社製)で蛍光強度を測定して作成された検量線を用いて算出した。
ここで、GSTπの発現量の閾値を３とし、閾値以上を示す乳癌細胞株をGSTπ高発現株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株をGST低発現株とした。
本実施例の結果を、図５に示す。
図５に示される結果から、２９種の乳癌細胞株のうち、ＧＳＴπ高発現株の細胞株はドキソルビシンに対する感受性が高い傾向にあった。結果として、癌細胞のGSTπの発現量が大きい場合、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定できることが示された。
（実施例２）
＜再発検体及び非再発検体におけるＧＳＴπ発現量＞
次に、アンスラサイクリン系抗癌剤を含む化学療法を受ける前の乳癌患者９検体のＧＳＴπ発現量から、術後にアンスラサイクリン系抗癌剤を含む化学療法を受けた再発検体及び非再発検体におけるＧＳＴπ発現量の傾向を調べた。
前記９検体は、手術切除された乳癌を含む腫瘍組織であり、測定時まで-８０℃で冷凍保存されていた。９検体のうち、再発検体は５検体、非再発検体は４検体であった。
なお、無病再発期間は、再発検体でそれぞれ２１０日、３１８日、５６６日、７６１日、１３７７日であり、非再発検体でそれぞれ１５９４日、１５９９日、１８３５日、２０２４日であった。
＜測定用試料の調製＞
９検体は、以下の通り可溶化処理を行い、測定用試料とした。
各検体をドライアイス上に置いたシャーレ上で4mm角程度、または3mm角程度に切断し、マイクロチューブにそれぞれ移した。
次に各マイクロチューブに可溶化試薬(50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA(pH8.0)、50mM NaF、1mM Na3VO4、0.1% NP40、0.2% protease inhibitor cocktail(sigma社))を、4mm角相当の検体で400μL、3mm角相当の検体で300μLそれぞれ分注した。次にサンプルチューブをホモジナイザーに設置した後にホモジナイズし、微量高速遠心機CF15RX（日立社製）で4℃下、15000rpm、5分間遠心分離した。次に、サンプルチューブの上清を氷上に静置した1.5ｍLマイクロチューブに移し、測定用試料とした。
＜ＧＳＴπの発現量の測定＞
上記の方法で調製した９検体の測定用試料を、実施例１記載の方法により測定した。
本実施例の結果を、図６に示す。なお、図６は箱ひげ図を表している。
図６に示される結果から、９検体のうち、再発検体はGSTπの発現量が低く、非再発検体はGSTπの発現量が高い傾向にあることが示された。結果として、この傾向は、実施例１の結果における、GSTπ高発現株がアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いことと、対応することが示唆された。
（実施例３）
＜GSTπ発現量及びＣＤＫ2比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値による癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定＞
次に、生体試料に含まれる癌細胞のGSTπ発現量とＣＤＫ2比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を組み合わせた、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤の感受性の判定を検討した。
＜ＩＣ５０の測定＞
参考例１に示される２９種の各乳癌細胞株を、実施例１に記載の方法により測定した。ここで、ＩＣ５０の中央値（median）である３９２ｎＭを閾値とし、閾値以上を示す乳癌細胞株を非感受性株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株を感受性株とした。
＜ＧＳＴπの発現量の測定＞
参考例１に示される２９種の各乳癌細胞株を、実施例１に記載の方法により測定した。ここで、GSTπの発現量の閾値を３とし、閾値以上を示す乳癌細胞株をGSTπ高発現株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株をGST低発現株とした。
＜CDK1及びCDK2の活性値の測定＞
使用する試薬は、以下のように調製した。
(1)メンブレン洗浄液
10x TBS solution 100mL
超純水 900mL
(2)免疫沈降緩衝液
1M Tris-HCl(pH7.4) 10.0mL
10% NP-40 Alternative PROTEIN GRADE(CALBIOCHEM社製) 2.0mL
10% アジ化ナトリウム溶液 1.9mL
超純水 QS-200mL
(3)CDK抗体希釈液
Sucrose(キシダ化学社製) 17.1g
1M Tris-HCl(pH7.4) 1.25mL
3M NaCl溶液 2.5mL
10% アジ化ナトリウム溶液 470μL
超純水 QS-50ｍL
(4)坑CDK1抗体試薬
CDK抗体希釈液 1.9mL
抗CDK1抗体(448μg/ｍL) 17.5ｍL
10％アジ化ナトリウム溶液 190μL
免疫沈降緩衝液 840μL
(5)抗CDK2抗体試薬
CDK抗体希釈液 1.6ｍL
抗CDK2抗体(360μg/ｍL) 8.3mL
10％アジ化ナトリウム溶液 100μL
免疫沈降緩衝液 960μL
(6)バックグラウンド用抗体試薬
CDK抗体希釈液 9.5mL
Rabbit IgG(CALBIOCHEM社製)(12.5mg/mL) 440μL
免疫沈降緩衝液 960μL
(7)免疫沈降洗浄液1
1M Tris-HCl(pH7.4) 25.0mL
10% NP-40 Alternative PROTEIN GRADE(CALBIOCHEM社製) 50.0mL
10% アジ化ナトリウム溶液 4.7mL
超純水 QS-500mL
(8)免疫沈降洗浄液2
1M Tris-HCl(pH7.4) 12.5mL
3M NaCl溶液 25.0mL
10% アジ化ナトリウム溶液 2.2mL
超純水 QS-250mL
(9)免疫沈降洗浄液3
１M Tris-HCl(pH7.4) 12.5mL
10% アジ化ナトリウム溶液 2.3mL
超純水 QS-250ｍL
(10)Kinase反応試薬
超純水 17.9mL
1M Tris-HCl(pH7.4) 1.22mL
10% アジ化ナトリウム溶液 200μL
1M 塩化マグネシウム溶液 450μL
25mM ATP-γS溶液 1.8ｍL
5mg/mL Histone H1溶液 900μL
(11)蛍光標識反応緩衝液
2.2M MOPS-NaOH(pH7.4) 34.1mL
0.5M EDTA(pH8.0) 2.5mL
10% アジ化ナトリウム溶液 2.1mL
超純水 QS-250ｍL
(12)蛍光標識試薬
5-(Iodoacetamido)fluorescein(Molecular Probes社製) 25mg
DMSO 6mL
蛍光標識反応緩衝液 116mL
(13)蛍光標識反応停止液
2.2M MOPS-NaOH(pH7.4) 455mL
N-Acetyl-L-Cysteine(Nacalai Tesque社製) 2.45g
10％ アジ化ナトリウム溶液 450μL
超純水 43.5ｍL
(14)蛍光増強試薬
Blocking One(Nacalai Tesque社製) 100mL
10% アジ化ナトリウム溶液 10mL
超純水 890ｍL
CDK１及びCDK２の活性値は、以下のように測定した。
フィルタープレート(Millipore社製)に20％Beads Sol.(プロテインAビーズ300μL、免疫沈降緩衝液900μL)を30μL/well分注し、さらに坑CDK1抗体試薬、坑CDK2抗体試薬、バックグラウンド用抗体試薬をそれぞれ対応するwellに90μL分注した。次に、参考例２の通り調整した、参考例１に示される２９種の乳癌細胞株の各測定用試料を30μL/well分注し、PlateShaker(SHK-10、増田理化工業)で４℃、2時間攪拌し、CDK１と抗CDK１抗体、CDK2と抗CDK2抗体をそれぞれ反応させた。
反応後、以下のように洗浄を行った。各well内の試薬を吸引した後、免疫沈降洗浄液１を200μL/well分注し、吸引した。次に、免疫沈降洗浄液２を200μL/well分注し、吸引した。次に、免疫沈降洗浄液３を200μL/well分注し、吸引した。
洗浄後、Kinase反応試薬を50μL/well分注し、Plate Shaker(SI-300C、AS ONE社製)で37℃、900rpm、1時間攪拌した。さらにフィルタープレートを上述のPlate Shakerから取り出し、当該フィルタープレート下部に回収用プレート(Bibby Sterilin社製)をセットし、遠心機(BECKMAN COURTER社 AllegraTM 6KR Centrifuge)で４℃、2000rpm、５分間遠心分離した。
遠心分離後、上述の回収用プレートに回収された活性測定反応物を、さらに反応用プレート(Applied Biosystem社製)に14μL/well移し変え、蛍光標識試薬を14μL/well分注した。分注後、遮光してPlate Shakerで２５℃、400rpm、20分間攪拌した。
攪拌後、反応用プレートに蛍光標識反応停止液を200μL/well分注し、反応用プレートの各ウェルの液を、さらに測定用フィルタープレート(Millipore社製)上に100μL/well移し変えた。次に、測定用プレートは、各ウェルの全液を吸引後、メンブレン洗浄液を200μL/well分注して吸引する洗浄を２回行った。洗浄後、蛍光増強試薬を200μL/well分注して吸引する操作を５回行い、乾燥させた。
乾燥後、Plate Reader(Infinite F200、Tecan社製)を用いて、測定用プレートの蛍光分析を行い、各測定用試料におけるCDK1の活性値及びCDK2の活性値を検量線に基づいて算出した。なお、検量線は、３種類の濃度とするそれぞれのタンパク質(Recombinant CDK1/cyclin B1,active、またはRccombinant CDK2/cyclin E,active)を含む溶液を、上記の方法で蛍光分析を行なうことによって作成した。測定されるCDK１活性及びCDK2の活性１U（ユニット）は、前記タンパク質１ngの時の蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
＜CDK1及びCDK2の発現量の測定＞
使用する試薬は、以下のように調製した。
(1)ブロッキング試薬
BSA 10.0g
10x TBS solution 25mL
超純水 212.8g
10% アジ化ナトリウム水溶液 2.25mL
(2)メンブレン洗浄液
10x TBS Solution 100mL
超純水 900mL
(3)抗CDK1抗体試薬
Block Ace(大日本住友製薬社製) 2.4g
超純水 72.3g
10％ アジ化ナトリウム水溶液 750μL
抗CDK1抗体(0.455mg/mL)(終濃度12μg/mL) 1.98mL
(4)抗CDK2抗体試薬
Block Ace(大日本住友製薬社製) 2.4g
超純水 72.4g
10％ アジ化ナトリウム水溶液 750μL
抗CDK2抗体(0.306mg/mL)(終濃度7.5μg/mL) 1.94mL
(5)2次抗体試薬
BSA 2.5ｇ
10x TBS solution 25mL
超純水 216.3g
10% アジ化ナトリウム水溶液(終濃度0.1%) 2.21mL
ビオチン化抗ウサギIgG(Southern Biotech社)(500μg/mL、終濃度8μg/mL) 4.00mL
(6)蛍光標識試薬
BSA 2.5g
10x TBS solution 25mL
超純水 217.8g
10% アジ化ナトリウム水溶液(終濃度0.1%) 2.23mL
Fluorescein-StreptAvidin(Vector社製)(1mg/mL、終濃度10μg/mL) 2.50ml
(7)蛍光増強試薬
3-Morpholinopropanesulfonic acid(NW.209.25)(同仁化学研究所社製)41.9g
アジ化ナトリウム 2.0g
6N 水酸化ナトリウム溶液 34g
超純水 QS-2L
(8)測定用試料希釈液(1回目)
メンブレン洗浄液 900μL
10% NP-40 Alternative PROTEIN GRADE(CALBIOCHEM社製) 100μL
(9)測定用試料希釈液(2回目)
メンブレン洗浄液 19.9mL
10% NP-40 Alternative PROTEIN GRADE(CALBIOCHEM社製) 100μL
CDK１及びCDK２の発現量は、以下のように測定した。
参考例２に従い調整した、参考例１に示される２９種の乳癌細胞株の測定用試料をメンブレン洗浄液475μL、測定用試料希釈液300μL、測定用試料25μLとなるように希釈した。次にフィルタープレートに、希釈した測定用試料を100μL/well分注して吸引した。
吸引後、フィルタープレートにメンブレン洗浄液を300μL/well分注し、再度吸引して洗浄を行った。
次に、フィルタープレートにブロッキング試薬を100μL/well分注し、その後吸引することにより、ブロッキングした。
フィルタープレートのＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応するwellに、ＣＤＫ１抗体試薬とＣＤＫ２抗体試薬をそれぞれ50μL/well分注して吸引した後、再度ＣＤＫ１抗体試薬とＣＤＫ２抗体試薬をそれぞれ50μL/well分注し、Plate Shaker(SI-300C、Tecan社製)上で23℃、2時間静置して反応させた。次に、well内の試薬を吸引し、メンブレン洗浄液を300μL/well分注し、吸引し洗浄を行った。洗浄は4回行った。
洗浄後、フィルタープレートのＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応するwellに、上記のＣＤＫ１抗体試薬とＣＤＫ２抗体試薬の分注と同様の方法で２次抗体試薬による処理を行い、１次抗体と２次抗体を反応させ、洗浄を行った。ここでの静置時間は45分間とし、洗浄は２回行った。
フィルタープレートに蛍光標識試薬を100μL/well分注し、吸引した。さらに、メンブレン洗浄液を300μL/well分注し、吸引し洗浄を行った。洗浄は4回行った。次に、フィルタープレートに蛍光増強試薬を200μ/well分注し、吸引後、乾燥させた。
乾燥後、Plate Reader(Infinite F200、Tecan社製)を用いて、測定用プレートの蛍光分析を行い、各測定用試料におけるCDK1の発現量及びCDK2の発現量を検量線に基づいて算出した。なお、検量線は、４種類の濃度とするそれぞれのタンパク質(10% NP-40 Alternative PROTEIN GRADE(CALBIOCHEM社製)、CDK1/CyclinB1,active(UPSTATE社製)、またはcdk2(1-298)(SantaCruz社製))を含む溶液を、上記の方法で蛍光分析を行なうことによって作成した。
＜CDK1及びCDK2の比活性値の算出＞
CDK１及びCDK２の比活性値は、以下のように測定した。上述の方法で測定したCDK１の活性値、CDK1の発現量、CDK2の活性値及びCDK2の発現量から、下記式：
CDK１比活性値＝CDK１活性値／CDK１発現量
CDK２比活性値＝CDK2活性値／CDK２発現量
によりCDK１比活性値(mU/ng)及びCDK2比活性値(mU/ng)を求め、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値を算出した。
ここで、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の閾値を７．４１とし、閾値以上を示す乳癌細胞株を、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値高値株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株をＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値低値株とした。
なお、本実施例において、参考例１に示される２９種の各乳癌細胞株の測定用試料のうち、MDA-MB-415とUACC812の２細胞株でＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性値を算出できなかった。従って、前記２細胞株を除く27種の各乳癌細胞株に関する結果を、図７に示す。
図７に示される結果から、２７種の乳癌細胞株のうち、ＧＳＴπ高発現株またはＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値高値株はドキソルビシンに対する感受性が高い傾向にあった。結果として、癌細胞のGSTπの発現量が大きい場合または癌細胞のＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値が閾値より大きい場合に、癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定できることが示された。また、ＧＳＴπ低発現株かつＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性低値株はドキソルビシンに対する感受性が低い傾向にあった。結果として、癌細胞のGSTπの発現量が小さい場合、かつ癌細胞のＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値が閾値より小さい場合に、アンスラサイクリン系抗癌剤に対する感受性が低いと判定できることが示された。
（実施例４）
＜GSTπ発現量とＣＤＫ2比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の組み合わせ効果の検討＞
次に、実施例３により得られたデータに基づいて、ＧＳＴπの発現量とＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値とを組み合わせた判定の効果を、ＧＳＴπの発現量単独による判定結果、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値単独による判定結果、ＧＳＴπの発現量及びＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の組み合わせによる判定結果を用いて検討を行った。
＜ＧＳＴπの発現量単独による検討＞
実施例３における、27種の各乳癌細胞株に関するＧＳＴπの発現量とIC50との結果を、表２に示す。ここで、GSTπ発現量の閾値を8.05とし、閾値以上を示す乳癌細胞株を感受性株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株を非感受性株とした。
また、表２に示される結果におけるオッズ比は4.8、ロジスティック回帰によるPは0.15、ROC解析によるAUCは0.604であった。
Figure 0005830249
実施例３における、27種の各乳癌細胞株に関するCDK２比活性値／CDK１比活性値の値とIC50との結果を、表３に示す。ここで、CDK２比活性値／CDK１比活性値の値の閾値を13.0とし、閾値以上を示す乳癌細胞株を感受性株とし、閾値未満を示す乳癌細胞株を非感受性株とした。
また、表３に示される結果におけるオッズ比は12.0、ロジスティック回帰によるPは0.0117、ROC解析によるAUCは0.712であった。
Figure 0005830249
＜ＧＳＴπ発現量及びＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値の組み合わせによる検討＞
実施例３における、27種の各乳癌細胞株に関するGSTπ発現量とCDK２比活性値／CDK１比活性値の値との組み合わせと、IC50の結果を、表４に示す。ここで、GSTπ発現量の閾値8.05以上またはCDK２比活性値／CDK１比活性値の値の閾値13.0以上を示す乳癌細胞株を感受性株とし、GSTπ発現量の閾値8.05未満かつCDK２比活性値／CDK１比活性値の値の閾値13.0未満を示す乳癌細胞株を非感受性株とした。
また、表４に示される結果におけるオッズ比は30.0、ロジスティック回帰によるPは0.0004、ROC解析によるAUCは0.819であった。
Figure 0005830249


表２から表４及び得られた結果から、リスク比に相当するオッズ比を比較すると、各々、単独での予想のオッズ比よりも、GSTπ発現量とCDK2比活性値/CDK1比活性値の値を組み合わせたオッズ比のほうが、単独での予想のオッズ比を足し合わせた以上に高値であった。この結果から、GSTπ発現量とCDK2比活性値/CDK1比活性値の値を組み合わせることによって、相乗的に癌細胞のアンスラサイクリン感受性への感受性の判定能が向上することが示唆された。

Claims (8)

  1. 乳癌の癌細胞を含む生体試料に含まれる、ＧＳＴπの発現量を測定する工程と、
    測定工程で得られたＧＳＴπの発現量と第１の閾値とを比較し、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上の場合に、生体試料に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する工程と、
    を含む、生体試料に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性を判定する方法。
  2. アンスラサイクリン系抗癌剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキザウノマイシン又はイダルビシンである、請求項１に記載の方法。
  3. アンスラサイクリン系抗癌剤が、ドキソルビシンである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 測定工程は、さらに、乳癌の癌細胞を含む生体試料に含まれる、ＣＤＫ１の比活性値と、ＣＤＫ２の比活性値とを測定し、
    判定工程は、測定工程で得られたＣＤＫ２の比活性値／測定工程で得られたＣＤＫ１の比活性値（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）の値と第２の閾値を比較し、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値以上の場合に、生体試料に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 判定工程は、測定工程で得られたＧＳＴπの発現量が第１の閾値未満、且つＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値未満の場合に、生体試料に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低いと判定する、請求項４に記載の方法。
  6. コンピュータを、
    乳癌の癌細胞を含む生体試料に含まれる、ＧＳＴπの発現量を取得する取得手段と、
    ＧＳＴπの発現量と第１の閾値とを比較する比較手段と、
    ＧＳＴπの発現量が第１の閾値以上の場合に、生体試料中に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する判定手段と、
    判定結果を出力する出力手段、
    として機能させるためのコンピュータプログラム。
  7. コンピュータを、さらに、ＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量から、ＣＤＫ２の比活性値／ＣＤＫ１の比活性値（ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値）の値を算出する算出手段として機能させ、
    取得手段は、さらに、乳癌の癌細胞を含む生体試料中のＣＤＫ１の活性値、ＣＤＫ１の発現量、ＣＤＫ２の活性値及びＣＤＫ２の発現量を取得し、
    比較手段は、さらに、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値と第２の閾値とを比較し、
    判定手段は、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値以上の場合に、生体試料中に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が高いと判定する、
    請求項６に記載のコンピュータプログラム。
  8. 判定手段は、さらに、ＧＳＴπの発現量が第１の閾値未満、且つＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の値が第２の閾値未満の場合に、生体試料中に含まれる乳癌の癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性が低いと判定する、
    請求項７に記載のコンピュータプログラム。
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