JP5758690B2 - 併用化学療法の奏効性判定方法、奏効性判定プログラム及び奏効性判定装置 - Google Patents
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Description
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1の比活性値及びCDK2の比活性値を取得する第1取得工程と、
上記生体試料中のGSTπの発現量を取得する第2取得工程と、
上記第1取得工程で取得したCDK1の比活性値及びCDK2の比活性値、並びに上記第2取得工程で取得したGSTπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程と
を有する併用化学療法の奏効性判定方法である。
上記判定工程は、上記算出工程で算出したリスクスコア及び上記第2取得工程で取得したGSTπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定するとよい。
リスクスコア=F(x)×G(y) ・・・(1)
(式(1)中、xは、CDK1の比活性値である。yは、CDK1の比活性値に対するCDK2の比活性値の比である。)
F(x)=a/(1+Exp(−(x−b)×c)) ・・・(2)
G(y)=d/(1+Exp(−(y−e)×f)) ・・・(3)
(式(2)及び(3)中、a〜fは定数である。)
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1及びCDK2の比活性値の情報を取得する機能と、
上記生体試料中のGSTπの発現量の情報を取得する機能と、
取得されたCDK1及びCDK2の比活性値の情報、並びにGSTπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する機能と
をコンピュータに実現させるためのプログラムである。
癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1の比活性値の情報、CDK2の比活性値の情報、及びGSTπの発現量の情報を取得する取得部と、
上記取得部によって取得されたCDK1の比活性値の情報、CDK2の比活性値の情報、及びGSTπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定部と
を備える。
上記判定部が、上記取得部によって取得されたCDK1の活性値と発現量からCDK1の比活性値を求め、CDK2の活性値と発現量からCDK2の比活性値を求め、求められたCDK1及びCDK2の比活性値、並びにGSTπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定してもよい。
当該奏効性判定方法は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1の比活性値及びCDK2の比活性値を取得する第1取得工程と、上記生体試料中のGSTπの発現量を取得する第2取得工程と、上記第1取得工程で取得したCDK1の比活性値及びCDK2の比活性値、並びに上記第2取得工程で取得したGSTπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する判定工程とを有する。また、上記CDK1の比活性値及びCDK2の比活性値から、上記式(1)を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含むことが好ましい。以下、各工程について詳述する。
第1取得工程は、癌患者から採取した癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1の比活性値及びCDK2の比活性値を取得する工程である。
当該奏効性判定方法における第2取得工程とは、GSTπの発現量を取得する工程である。
算出工程とは、上記第1取得工程で取得したCDK1の比活性値及びCDK2の比活性値から上記式(1)を用いてリスクスコアを算出する工程である。
本発明の判定工程は、上記第1取得工程で取得したCDK1の比活性値及びCDK2の比活性値、並びに第2取得工程で取得したGSTπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する工程である。
C:シクロフォスファミド
F:フルオロウラシル
E:エピルビシン(アンスラサイクリン系)
T:パクリタキセル又はドセタキセル(タキサン系)
次に、実施の形態1の併用化学療法の奏効性判定方法をコンピュータに実現させる形態を図1及び2を用いて説明する。先ず、図1のシステム100の構成を説明する。図1のシステム100は、コンピュータ1と、キーボード2と、マウス3と、CDK測定装置4と、GSTπ測定装置5と、表示装置6とを有する。コンピュータ1は、キーボード2、マウス3、CDK測定装置4、GSTπ測定装置5及び表示装置6のそれぞれと通信ケーブルによって接続されている。
[測定用試料の調製]
(試薬の調整)
コンプリート溶解液:
コンプリート錠(Roche社)1錠を2mLの超純水に溶解し、調製した。
50mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM EDTA(pH8.0)、50mM NaF、1mM Na3VO4、0.1% NP−40(CALBIOCHEM社)を最終濃度として含む溶液中に、コンプリート溶解液が25倍希釈されるよう添加し、調製した。
乳癌患者からマンモトームにより採取した腫瘍細胞塊を、チューブ内で緩衝液Aに懸濁した。緩衝液Aは、4mm角相当の腫瘍細胞塊に400μL、3mm角相当の腫瘍細胞塊に200μL、中間の大きさの腫瘍細胞塊に300μL添加した。電動ホモジナイザーを用いて、上記腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。上記細胞可溶化液を4℃で15000rpm、5分間遠心分離し、得られた上清を測定用試料として用いた。なお、上記乳癌患者から採取した腫瘍細胞塊は合計112検体であった。
(試薬及び標準品の調整)
トリス緩衝生理食塩水(TBS):
10×TBS(2−Amino−2−hydroxymethy−1,3−propanediol 250mM、NaN3 0.1%(w/v)、NaCl 1.5Mを最終濃度として含み、HClを用いてpH7.4に調製した溶液)を10倍希釈して、TBSを調製した。
上述のTBS中に、ウシ血清アルブミンBSA(Proliant Health & Biologicals社)を最終濃度が4%(w/v)、NaN3を最終濃度が0.1%(w/v)となるように溶解し、ブロッキング試薬を調製した。
Block Ace(粉末)(大日本住友製薬社)を最終濃度が3.2%(w/v)、NaN3を最終濃度が0.1%(w/v)となるように超純水に溶解した溶液に、抗CDK1抗体を12μg/mLとなるように溶解し、抗CDK1抗体試薬を調製した。同様に、抗CDK1抗体に代えて、抗CDK2抗体を7.5μg/mLとなるように溶解し、抗CDK2抗体試薬を調製した。
上述のTBS中に、BSAを最終濃度が1%(w/v)、NaN3を最終濃度が0.1%(w/v)となるように溶解した溶液に、ビオチン化抗ウサギIgG抗体(Southern Biotech社)を8μg/mLとなるように溶解し、2次抗体試薬を調製した。
上述のTBS中に、BSAを最終濃度が1%(w/v)、NaN3を最終濃度が0.1%(w/v)となるように溶解した溶液に、Fluorescein−StreptAvidin(Vector社)を10μg/mLとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調製した。
3−Morpholinopropanesulfonic acid 100mM、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含み、NaOHを用いてpH7.9となるよう調製した。
上述のTBS中に、Sucrose 876.4mM、BSA 0.005%(w/v)、NP40 0.005%、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、発現量用CDK標準品緩衝液を調製した。
上述のTBS中に、BSA 0.005%(w/v)、NP40 0.005%、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、CDK1/2発現量BG測定用標準品を調製した。
CDK1/cyclinB1, active(Millipore社)を発現量用CDK標準品緩衝液に添加し、10μg/mLとなるように希釈した。この希釈液3mLを発現量用CDK標準品緩衝液95mLに添加し、CDK1発現量測定用標準品を調製した。
cdk2(Santa Cruz社)を発現量用CDK標準品緩衝液に添加し、10μg/mLとなるように希釈した。この希釈液1.3mLを発現量用CDK標準品緩衝液98mLに添加し、CDK2発現量測定用標準品を調製した。
フィルタープレート(MultiScreen HTS PSQPlates)を30%エタノールで親水処理後、TBSを各ウェル200μL添加し、吸引することで洗浄を行った。各測定用試料を各ウェルに100μL添加し、吸引により水分を除去した。次に、TBSを各ウェル300μL添加して吸引する洗浄を行った。その後、ブロッキング試薬を各ウェル100μL添加し、吸引した。ブロッキング試薬を吸引後、抗CDK1抗体試薬(1次抗体試薬)を各ウェル50μL添加し、吸引した。再度抗CDK1抗体試薬を各ウェル50μL添加し、23℃で2時間静置した。その後、吸引により1次抗体試薬を除去した。次に、TBSを各ウェル300μL添加して吸引する洗浄を4回行った。洗浄後、2次抗体試薬を各ウェル50μL添加し、吸引した。再度2次抗体試薬を各ウェル50μL添加し、23℃で45分間静置した。その後、吸引により2次抗体試薬を除去した。次に、TBSを各ウェル300μL添加して吸引する洗浄を2回行った。洗浄後、蛍光標識試薬を各ウェル100μL添加し、吸引した。次に、TBSを各ウェル300μL添加して吸引する洗浄を4回行った。洗浄後、蛍光増強試薬を各ウェル200μL添加し、吸引した。その後、フィルタープレートを乾燥させた。
(試薬及び標準品の調整)
1M Tris−HCl:
2−Amino−2−hydroxymethy−1,3−propanediol 1M、NaN3 0.1%(w/v)を含み、HClを用いてpH7.4となるよう調製した。
1M Tris−HClを20倍希釈した溶液中に、NP40 0.1%、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降緩衝液を調製した。
プロテインAビーズ(GE Healthcare社)300μLを2mLエッペンドルフチューブに加え、免疫沈降緩衝液900μLを加えて転倒混和し、2000rpmで20秒間遠心分離を行って上清を除去する操作を2回行った。ここに免疫沈降緩衝液1080μLを添加し、20%プロテインAビーズ溶液を調製した。
1M Tris−HClを40倍希釈した溶液中に、Sucrose1M、NaCl 150mM、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、CDK抗体希釈液を調製した。
CDK抗体希釈液1.9mLに10% NaN3溶液(w/v)を190μL添加し、この溶液中に抗CDK1抗体(448μg/mL)を17.5mL添加して希釈した。この希釈液480μLに免疫沈降緩衝液840μLを添加し、抗CDK1抗体試薬を調製した。
CDK抗体希釈液1.6mLに10% NaN3溶液(w/v)を100μL添加し、この溶液中に抗CDK2抗体(360μg/mL)を8.3mL添加して希釈した。この希釈液240μLに免疫沈降緩衝液960μLを添加し抗CDK2抗体試薬を調製した。
1M Tris−HClを20倍希釈した溶液中に、NP40 1%、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液1を調製した。
1M Tris−HClを20倍希釈した溶液中に、NaCl 300mM、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液2を調製した。
1M Tris−HClを20倍希釈した溶液中に、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、免疫沈降洗浄液3を調製した。
1M Tris−HClを18.4倍希釈した溶液中に、NaN3 0.1%(w/v)、MgCl2 20mM、ATP−γS(CALBIOCHEM社)2mM、Histone H1(Roche社)0.2mg/mLを最終濃度として含むよう添加し、Kinase反応試薬を調製した。
3−Morpholinopropanesulfonic acid 2.2M、NaN3 0.1%(w/v)を含み、NaOHを用いてpH7.4となるよう調製した。
2.2M MOPS−NaOHを7.3倍希釈した溶液中に、EDTA 5mM、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、蛍光標識反応緩衝液を調製した。
5−(Iodoacetamido)fluorescein(Molecular Probes社)25mg、DMSO 6mLを蛍光標識反応緩衝液116mL添加し、蛍光標識試薬を調製した。
2.2M MOPS−NaOHを1.1倍希釈した溶液中に、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加した。この溶液498.95mL中にN−Acetyl−L−Cysteine 2.45gを溶解し、蛍光標識反応停止液を調製した。
10×TBS(2−Amino−2−hydroxymethy−1,3−propanediol 250mM、NaN3 0.1%(w/v)、NaCl 1.5Mを最終濃度として含み、HClを用いてpH7.4に調製した溶液)を10倍希釈して、TBSを調製した。
Blocking One(Nacalai Tesque社)を10倍希釈した溶液中に、NaN3 0.1%(w/v)を最終濃度として含むよう添加し、調製した。
1M Tris−HClを20倍希釈した溶液中に、Sucrose 810.7mM、Block Ace(大日本住友製薬社)1%(w/v)、NaCl 150mM、NaN3 0.1%(w/v)、NP40 0.1%を最終濃度として含むよう添加し、CDK1/2活性測定用標準品希釈液を調製した。
CDK1/2活性測定用標準品希釈液中に、Recombinant CDK1/cyclin B1, active(Millipore社)3ng/μL、Recombinant CDK2/cyclin E, active(Millipore社)1ng/μLを最終濃度として含むよう希釈し、CDK1/2活性測定用標準品を調製した。
フィルタープレート(MultiScreen HTS FilterPlates)の各ウェルに20% プロテインAビーズ溶液を30μL、抗CDK1抗体希釈液を90μL、各測定用試料を30μL添加した。これを4℃で120分間攪拌し、測定用試料中のCDK1と抗CDK1抗体とを反応させた。反応後、吸引により水分を除去した。次に、免疫沈降洗浄液1を各ウェル200μL添加し、吸引してビーズを洗浄した。続いて免疫沈降洗浄液2を各ウェル200μL添加し、吸引してビーズを洗浄した。更に、免疫沈降洗浄液3を各ウェル200μL添加し、吸引してビーズを洗浄した。これにより、抗CDK1抗体を介して各測定試料中のCDK1が結合したセファロースビーズをフィルタープレート上に得た。
CDK1及びCDK2の比活性は、下記のように算出した。
各測定用試料について、検量線から算出したCDK1活性をもとに、測定用試料1μL中に含まれるCDK1活性(A)を算出した。また、各測定用試料について、検量線から算出したCDK1発現量をもとに、測定用試料1μL中に含まれるCDK1発現量(B)を算出した。CDK1比活性は、A/Bにより算出した。CDK2についても同様に比活性の算出を行った。
[GSTπの発現量の測定に用いる試薬の調製]
GSTπの発現量を測定するために、ブロッキング試薬、トリス緩衝生理食塩水(TBS)、1次抗体試薬、2次抗体試薬及び蛍光標識試薬を調製した。それぞれの試薬の調製法を以下に示す。
Block Ace(粉末)(大日本住友製薬社)を、最終濃度が4%となるように超純水に溶解し、ブロッキング試薬を調製した。
ブロッキング試薬を10倍希釈して調製したブロッキング溶液に、抗GSTπ抗体(BD Transduction社)を、5μg/mLとなるように溶解し、1次抗体試薬を調製した。
10×TBS(2−Amino−2−hydroxymethyl−1,3−propanediol 30.28g、NaCl 87.7g、6N HCl 110gを超純水に添加し、最終量を1Lとした溶液)を10倍希釈して、TBSを調製した。
TBSに、ウシ血清アルブミンBSAを、最終濃度が1%となるように超純水に溶解し、TBS(1%BSA)を調製した。得られたTBS(1%BSA)に、Goat Anti−Mouse IgG(H+L)−BIOT Human/Mouse(Southern Biotech社)を、30μg/mLとなるように溶解し、2次抗体試薬を調製した。
上述のTBS(1%BSA)に、ストレプトアビジン−FITC(Vector社)を、10μg/mLとなるように溶解し、蛍光標識試薬を調製した。
フィルタープレート(Multi Screen HTS PSQ Plates)を30%エタノールで親水処理後、各測定用試料を各ウェルに10μg添加し、吸引により水分を除去した。なお、測定用試料としては、上記第1取得工程において調製した試料を用いた。その後、ブロッキング試薬を各ウェル100μL加え吸引した。ブロッキング試薬を吸引後、1次抗体試薬を各ウェル50μL添加しすぐに吸引した。吸引後、再び1次抗体試薬を各ウェル50uL添加し2時間静置した。その後、吸引により1次抗体試薬を除去した。次に、TBSを、各ウェル300μL添加して吸引する洗浄を4回行った。洗浄後、2次抗体試薬を各ウェル50μL添加しすぐに吸引した。吸引後、再び2次抗体試薬を各ウェル50uL添加し1時間静置した。その後、吸引により2次抗体試薬を除去した。次に、TBSを各ウェル300μL添加し、吸引する洗浄を2回行った。洗浄後、蛍光標識試薬を各ウェル100μL添加しすぐに吸引した。次に、TBSを各ウェル300μL添加して吸引する洗浄を4回行った後、フィルタープレートを乾燥させた。
得られたCDK1及びCDK2の比活性値を用いて、下記式に基づきリスクスコア(RS)を算出した。
G(y)=0.25/(1+Exp(−(y−1.0)×6)
RS=3000×F(x)×G(y)
x=log(CDK1比活性値)
y=log(CDK2比活性値)−log(CDK1比活性値)
上記乳癌患者に対して、マンモトーム生検の後、週1回のパクリタキセル投与(T)を12サイクル、21日毎の5−FU、エピルビシン及びシクロフォスファミド投与(FEC)を4サイクル行い、病理学的腫瘍消失の有無を評価した。この評価において、病理学的完全奏効(pCR)となった患者を奏効例とした。
ROC曲線のAUC、並びにAUCのP−valueは、リスクスコアとGSTπを組み合わせることにより、リスクスコア、GSTπそれぞれを単独で用いた場合と比較して大幅に改善が認められた。これらの結果から、リスクスコアとGSTπの組み合わせはT−FEC後pCR予測に有用であると考えられる。
1 コンピュータ
2 キーボード
3 マウス
4 CDK測定装置
5 GSTπ測定装置
6 表示装置
11 入力ポート
12 CPU
13 HDD
14 RAM
15 出力ポート
Claims (9)
- 癌患者から採取した乳癌の癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1の比活性値及びCDK2の比活性値を取得する第1取得工程と、
上記生体試料中のGSTπの発現量を取得する第2取得工程と、
上記第1取得工程で取得したCDK1の比活性値及びCDK2の比活性値、並びに上記第2取得工程で取得したGSTπの発現量に基づいて、上記癌患者に対するアンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法の奏効性を判定する判定工程と
を有する併用化学療法の奏効性判定方法。 - 上記第1取得工程で取得したCDK1の比活性値及びCDK2の比活性値から下記式(1)を用いてリスクスコアを算出する算出工程をさらに含み、
上記判定工程は、上記算出工程で算出したリスクスコア及び上記第2取得工程で取得したGSTπの発現量に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する請求項1に記載の奏効性判定方法。
リスクスコア=F(x)×G(y) ・・・(1)
(式(1)中、xは、CDK1の比活性値である。yは、CDK1の比活性値に対するCDK2の比活性値の比である。) - 上記F(x)が下記式(2)で表され、G(y)が下記式(3)で表される請求項2に記載の奏効性判定方法。
F(x)=a/(1+Exp(−(x−b)×c)) ・・・(2)
G(y)=d/(1+Exp(−(y−e)×f)) ・・・(3)
(式(2)及び(3)中、a〜fは定数である。) - 上記判定工程は、上記リスクスコアと第1の閾値を比較し、上記GSTπの発現量と第2の閾値を比較し、上記比較結果に基づいて上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する請求項2又は請求項3に記載の奏効性判定方法。
- 上記判定工程は、上記リスクスコアが第1の閾値以下である場合又はGSTπの発現量が第2の閾値より大きい場合に、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性が低いと判定する請求項4に記載の奏効性判定方法。
- 癌患者から採取した乳癌の癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1及びCDK2の比活性値の情報を取得する機能と、
上記生体試料中のGSTπの発現量の情報を取得する機能と、
取得されたCDK1及びCDK2の比活性値の情報、並びにGSTπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対するアンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法の奏効性を判定する機能と
をコンピュータに実現させるための奏効性判定プログラム。 - CDK1及びCDK2の比活性値の情報を取得する機能が、CDK1の活性値と発現量からCDK1の比活性値を求め、CDK2の活性値と発現量からCDK2の比活性値を求め、求められたCDK1及びCDK2の比活性値をCDK1及びCDK2の比活性値の情報として取得する、請求項6に記載の奏効性判定プログラム。
- 癌患者から採取した乳癌の癌細胞を含む生体試料中のサイクリン依存性キナーゼ(CDK)1の比活性値の情報、CDK2の比活性値の情報、及びGSTπの発現量の情報を取得する取得部と、
上記取得部によって取得されたCDK1の比活性値の情報、CDK2の比活性値の情報、及びGSTπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対するアンスラサイクリン系抗癌剤及びタキサン系抗癌剤を用いる併用化学療法の奏効性を判定する判定部と
を備える併用化学療法の奏効性判定装置。 - 上記取得部が、CDK1の比活性値の情報としてCDK1の活性値と発現量を取得し、CDK2の比活性値の情報としてCDK2の活性値と発現量を取得し、
上記判定部が、上記取得部によって取得されたCDK1の活性値と発現量からCDK1の比活性値を求め、CDK2の活性値と発現量からCDK2の比活性値を求め、求められたCDK1及びCDK2の比活性値、並びにGSTπの発現量の情報に基づいて、上記癌患者に対する併用化学療法の奏効性を判定する、
請求項8に記載の奏効性判定装置。
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