JP5046574B2 - 抗がん剤治療の有効性予測方法 - Google Patents

Description

本発明は、個々のがん患者に対する抗がん剤治療の有効性を高確率で予測することができる抗がん剤治療の有効性予測方法及び当該予測方法をコンピュータに実行させるためのプログラムに関する。

がんの治療方法の一つとして、抗がん剤治療方法がある。しかし、がんの病態は、その種類、発症部位あるいは進行度等により様々であり、こうした多様性と患者個人の応答性の違いは、抗がん剤治療が有効な患者だけでなく、有効でない患者も多く存在する原因となっている。抗がん剤が効かない患者に抗がん剤を投与し続けることは、その抗がん剤の副作用による悪い面だけがクローズアップされることになり、患者には苦痛を強いるだけに成りかねない。
このため、抗がん剤投与の初期段階で患者に対する抗がん剤の有効性を高率に予測することが求められている。

現在、抗がん剤に対する感受性を予測する方法としては、例えば特許文献１に、感受性の違いが遺伝子多型にあるとして、被検細胞のＢＣＲＰの遺伝子多型を同定する、被検細胞の抗がん剤に対する感受性判定方法が開示されている。

ＢＣＲＰは、ＡＢＣトランスポータの１つで、抗がん剤の耐性に関与していることが知られており、またこのＢＣＲＰの発現の個人差が一塩基多型にあることが知られている。このようなことから、特許文献１に開示の感受性判定方法は、患者由来のがん細胞からＤＮＡの塩基配列を調べ、ＢＣＲＰの遺伝子多型を同定し、感受性、副作用の程度を判定するという方法である。

また、特許文献２に、培養がん細胞株の抗がん剤感受性と該細胞のインタクトな状態における遺伝子発現プロファイルに基づき抗がん剤適合性マーカー遺伝子を特定し、特定した抗がん剤適合性マーカー遺伝子に相当する遺伝子の発現量を測定して、未知検体の抗がん剤適合性予測方法が開示されている。

この方法では、検体中のがん細胞において、相対的発現量が高い遺伝子群が特定の抗がん剤に対して相関が高いマーカー遺伝子群と一致する率が高ければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性であると予測し、検体中のがん細胞において相対的発現量が高い遺伝子群が特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と全く一致しなければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性が低いと予測するものである。

しかし、この方法で適合と判定されたものであっても、抗がん剤治療が実際に有効であるか否かは８０％程度であるといわれている。有効性が８０％というのは、治療に踏み切るにあたっての指標としては、決して高いといえない。かなりの確実性をもって有効であるといった指標が与えられることが患者にとっては重要である。

一方、がん抑制遺伝子産物であるｐ５３やＲＢタンパク質（網膜芽細胞腫タンパク、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞周期制御に関与することが知られ、細胞周期タンパク質とがんとの関係について、近年、研究が進められている。

特許文献３には、細胞周期関連タンパク質を少なくとも２種以上測定し、細胞周期プロファイリングを行なうことにより、薬剤耐性試験及び予後診断が可能となるということは示唆されているが、その具体的方法、効果については一切開示されていない。

特開２００３−１９９５８５号 特開２００３−３０４８８４号 ＷＯ２００４／０７６６８６

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、特定の抗がん剤治療の有効性を高確率で予測でき、しかも患者の個体差も考慮することにより、予測結果と実際の治療効果との一致率が高い抗がん剤治療の有効性予測方法、及び当該予測方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供することにある。

本発明者らは、抗がん剤投与を行なった後に患者から採取された腫瘍細胞について、細胞周期関連タンパク質の活性値、発現量、活性値と発現量との比などのパラメータを解析し、これらのパラメータと実際に抗がん剤治療を行なったときの効果との関係を鋭意検討した結果、本発明を完成した。

すなわち、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、第1パラメータと、第1閾値とを比較する工程（第1比較工程）；
第2パラメータと、第2閾値とを比較する工程（第2比較工程）；及び
前記第１比較結果および前記第2比較結果に基づいて、生体に対する抗がん剤治療の有効性を予測する工程；
を含み、
前記第1パラメータおよび前記第2パラメータは、抗がん剤を少なくとも一度投与した生体から採取した乳がん細胞のCDK1の活性値と発現量との比（CDK1比活性）、CDK2の活性値と発現量との比（CDK2比活性）、およびp21の発現量から選択された、それぞれ異なるパラメータであり、
前記第1パラメータが前記CDK1比活性であり、前記第2パラメータが前記CDK2比活性である場合、前記予測工程において、前記第2パラメータが前記第2閾値以上であると前記有効性が高いと予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値以上であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が中程度と予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が低いと予測し、
前記第1パラメータが前記CDK1比活性であり、前記第2パラメータが前記p21発現量である場合、前記予測工程において、前記第1パラメータが前記第1閾値以上であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が高いと予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が中程度と予測し、前記第2パラメータが前記第2閾値以上であると前記有効性が低いと予測し、
前記第1パラメータが前記CDK2比活性であり、前記第2パラメータが前記p21発現量である場合、前記予測工程において、前記第1パラメータが前記第1閾値以上であると前記有効性が高いと予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が中程度と予測し、前記第2パラメータが前記第2閾値以上であると前記有効性が低いと予測する方法である。

本発明は、前記第１パラメータ、前記第２パラメータとは異なる第３パラメータと、該第３パラメータに対応する閾値とを比較する第３比較工程をさらに含み、前記予測工程において、第１比較結果、第２比較結果及び第３比較結果に基づいて、前記生体を、抗がん剤治療の有効性の程度が異なる四群の何れかに分類してもよい。
すなわち、本発明の別の見地の抗がん剤治療の有効性予測方法は、第3パラメータと、第3閾値とを比較する第3比較工程をさらに含み、
前記第1パラメータが前記CDK2比活性であり、前記第2パラメータが前記p21発現量であり、前記第3パラメータが前記CDK1比活性であり、
前記予測工程が、前記第1比較結果、前記第2比較結果、および前記第3比較結果に基づいて、前記生体に対する抗がん剤治療の有効性を予測する工程であり、
前記予測工程において、前記第1パラメータが前記第1閾値以上である場合に前記有効性が高いと予測し、
前記第1パラメータが前記第1閾値以上であり、且つ前記第3パラメータが前記第3閾値以上である場合に前記有効性が中程度であると予測し、
前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、前記第2パラメータが前記第2閾値未満であり、且つ前記第3パラメータが前記第3閾値未満である場合に前記有効性がやや低いと予測し、
前記第2パラメータが前記第2閾値以上である場合に前記有効性が低いと予測する。

前記抗がん剤は、Ｍ期細胞に対して有効な抗がん剤であることが好ましく、より好ましくはタキサン系抗がん剤である。

前記生体から採取した腫瘍細胞は、抗がん剤投与後、１０〜３０時間後の生体から採取したものであることが好ましい。

本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、コンピュータで実行することができる。従って、本発明は、上記本発明の予測方法の各工程をコンピュータに実行させるためのプログラム、すなわち抗がん剤を少なくとも１度投与した生体から採取した腫瘍細胞について測定されたサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）データ（必要に応じてＣＤＫインヒビターの発現量データを含む）から、前記生体に対する前記抗がん剤治療の有効性をコンピュータに予測させるためのプログラムをも含む。

本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、実際の抗がん剤治療効果の有無との相関性が大変高く、抗がん剤治療に踏み切るか否かの指標として優れている。また、抗がん剤に対する感受性を高率に予測判定することができる。さらに、治療に使用する抗がん剤を実際に少なくとも１回投与した後の腫瘍細胞を用いて判定しているので、薬物代謝酵素、薬物トランスポータ等の遺伝子多型に基づく患者の個体差を考慮した抗がん剤治療の有効性を予測することができる。

本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、抗がん剤を少なくとも一度投与した生体から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比からなるパラメータと、閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記生体の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。

本発明の方法で予測する治療の有効性には、術前療法、術後療法の双方が含まれる。術前療法では、原発巣が存在する状態で抗がん剤を投与し続けた結果、原発巣が縮小ないし消失する場合が有効となり、術後療法では、腫瘍の摘出手術を行なった後に抗がん剤を投与し続けた結果、再発しない場合が有効となる。術前療法は、腫瘍の摘出手術をすることなくがんを治療したい場合や、対象となる腫瘍細胞を縮小させて、摘出手術による治療を可能にしたい場合などに有効である。術後療法では、目に見えない転移などに対して、抗がん剤が有効であるかどうかが再発の有無となって現れる。

本発明の予測方法に用いられる検体となる腫瘍細胞は、抗がん剤を少なくとも１回投与された患者から採取した腫瘍細胞である。好ましくは、最初の投与から１０時間〜３０時間後、より好ましくは２０〜３０時間後に生検した細胞が用いられる。細胞増殖を阻害する薬剤である抗がん剤による細胞関連タンパク質の活性、発現量の変化は、抗がん剤投与から１０時間〜３０時間後に認められるようになるからである。また、抗がん剤投与から実際の腫瘍細胞に到達して細胞周期に変化をもたらすには、この程度の時間必要だからである。

投与される抗がん剤は、治療の有効性が判断される抗がん剤である。本発明の有効性予測方法が適用される抗がん剤は、癌腫に対して抗癌作用を有する薬剤だけでなく、その他の悪性腫瘍に対して抗腫瘍効果を発揮する薬剤をも含む。抗がん剤の種類は、特に限定しないが、好ましくはＭ期の細胞に対して有効な抗がん剤であり、より好ましくはタキサン系抗がん剤である。

ここで、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図１に示すように、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の４期に分けられる。Ｓ期はＤＮＡの複製期であり、Ｍ期は分裂期である。Ｇ１期は有糸分裂の完了からＤＮＡ合成の開始までの間で、Ｍ期にはいるための準備点検期である。Ｇ１期にある臨界点（動物細胞ではＲ点）をすぎると、細胞周期は始動し、通常途中でとまることなく、一巡する。Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、Ｇ１期からＳ期にはいる直前、Ｇ２期から有糸分裂への入り口である。特にＧ１期チェックポイントはＳ期開始の引き金をひくため、重要である。Ｇ１期のある点をすぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、Ｇ１期のＤＮＡ含量をもった休止期（Ｇ０）があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導により細胞周期内のＧ１期よりやや長い時間の後にＳ期へ進行することができる。

Ｍ期は、細胞の分裂増殖に関与する段階である。従って、Ｍ期細胞に作用する抗がん剤を投与すると、細胞分裂を阻害し、腫瘍細胞の増殖を阻止することができ、やがて腫瘍細胞数の減少、消失をもたらすことができる。

タキサン系抗がん剤は、微小管に結合し、微小管の重合促進、安定化をもたらし、細胞分裂を阻害すると考えられている。タキサン系抗がん剤としては、太平洋イチイの樹皮、ヨーロッパイチイの針葉の抽出物に由来する抗がん剤である、パクリタキセル、ドセタキセルなどが挙げられる。

本発明の有効性予測方法が適用されるがんは、癌腫だけでなくその他の悪性腫瘍をも含む。がんの種類としては、抗がん剤治療が適用され得るがんであれば特に限定されない。例えば、白血病や悪性リンパ腫などの造血器由来悪性腫瘍、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がんなどの上皮細胞由来の癌腫、骨肉腫や軟部肉腫などの肉腫等が挙げられる。乳がんに対する抗がん剤治療としては、例えばCMF療法（シクロフォスファミド、メトトレキシエート、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤を投与する療法、CE療法（シクロフォスファミド、エピルビシンの２剤を併用して投与する療法）、AC療法（ドキソルビシン、シクロフォスファミドの２剤を併用して投与する療法）、CAF療法（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法）、FEC療法(フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法)、トラスツズマブとパクリタキセルの２剤を併用して投与する療法、カペシタビンを投与する療法等が挙げられ、胃がんに対する抗がん剤治療としては、例えばFAM療法（フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンCの３剤を併用して投与する療法）、FAP療法（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シスプラチンの３剤を併用して投与する療法）、ECF療法（エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、マイトマイシンCとテガフールの２剤を併用して投与する療法、フルオロウラシルとカルムスチンの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、大腸がんに対する抗がん剤治療としては、例えばフルオロウラシルとロイコボリンの２剤を併用して投与する療法、マイトマイシンとフルオロウラシルの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、卵巣がんに対する抗がん剤治療としては、例えばTP療法（パクリタキセル、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、TJ療法（パクリタキセル、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CP療法（シクロフォスファミド、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CJ療法（シクロフォスファミド、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）等が挙げられる。

これらのうち、Ｍ期細胞に有効な抗がん剤、とりわけタキサン系抗がん剤が適用されるがんに対する抗がん剤治療の有効性予測に好適である。

判定の指標とするのは、上記生体から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択される１つ又は２つのパラメータである。活性値と発現量との比は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示されるＣＤＫ比活性であってもよいし、ＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値の値であってもよい。

サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）とは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、単独では活性をもたないが、サイクリンと結合して活性型となる。ＣＤＫは、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。ＣＤＫとしては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられるが、好ましくはＣＤＫ１、ＣＤＫ２である。

ＣＤＫ活性値とは、測定に供する試料中に含まれるＣＤＫにより基質に導入されたリン酸量に基づく値であり、リン酸量を測定する際に用いられた標識物（例えば^３２Ｐ、蛍光）の標準品の測定値から定量的に計算される値（単位をU（ユニット）で表す）である。具体的には、検体の細胞可溶化液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、^３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔^３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いて、基質蛋白質に^３２Ｐを取り込ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質蛋白質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。

活性測定に供する試料は、検体である細胞可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。

ＣＤＫ発現量とは、検体である細胞可溶化液に含まれる目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的の蛋白質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的の蛋白質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。

尚、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量（ＣＤＫ比活性）やＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値などで示される活性値と発現量との比は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、測定対象である腫瘍細胞が固有のものとして示す増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえ、検体の調製方法に依存しない。検体調製方法、特に生検材料から調製される検体（細胞可溶化液）は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響をうけやすい。従って、ＣＤＫ活性値と発現量との比を用いることにより、検体調製時に不可避の影響を控除することができ、タンパク質に着目した判定方法であっても、高精度に有効性を判定することができる。

以上のようなパラメータを所定の閾値と比較することにより抗がん剤治療の有効性を予測判定できる。ここで活性値、発現量および活性値と発現量との比から選択されるパラメータとは、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜選択されるパラメータである。このパラメータは、過去に抗がん剤治療が行われ、その結果が判明しているがん患者から抗がん剤治療の前に摘出されて保存されていた腫瘍細胞について、ＣＤＫの活性値と発現量を測定し、それぞれのパラメータについて、抗がん剤治療結果を解析し、抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータを抗がん剤の有効性判定に用いるパラメータとして選択したものである。

閾値と比較するパラメータは、所定のＣＤＫにおける１つのパラメータであってもよいし、２つのパラメータの組合せであってもよい。２つのパラメータを選択する場合、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較する。

本発明において用いられる閾値は、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜設定される値である。具体的には所定のがんに対して所定の抗がん剤を投与した抗がん剤治療結果と上記のパラメータとの関係を、多くの抗がん剤治療結果について調べ、多数の抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータに関して、その抗がん剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定された値である。好ましくは抗がん剤治療結果が全て有効であった場合のみを選択できるように閾値を設定する。このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値の設定が行われるため、確度の高い有効性の判定が可能となる。閾値の設定に用いる臨床治療結果の数を増加させることにより、有効性判定の確度を向上させることができる。なお、抗がん剤治療結果としては、所定の抗がん剤治療を続けることにより生じた腫瘍サイズの変化や、抗がん剤投与を５〜６年続けて再発の有無を調べた結果等が挙げられる。

以上のような抗がん剤治療の有効性予測方法は、ＣＤＫの種類により有効性が高いことを予測することができる。従来の予測方法よりも、抗がん剤治療の有効性が高いことについて、高確率で予測できるので、抗癌剤治療に踏み切るか否かの判断指標として、有用である。

本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、判定の指標となるＣＤＫが、１種類（第一ＣＤＫ）であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上（第二ＣＤＫ、第三ＣＤＫ・・・）であってもよい。また、ＣＤＫとサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の組み合わせを用いてもよい。

ここで、ＣＤＫインヒビターとは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群で、ＩＮＫ４ファミリーとＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに分類される。本発明の有効性予測方法では、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーが好ましく用いられ、特にｐ２１が好ましく用いられる。ｐ２１は、細胞増殖サイクルにおけるＧ１期及びＧ２期チェックポイントの双方で進行を阻害するインヒビターで、損傷したＤＮＡの修復のための時間を与えることができる。ＣＤＫインヒビターを判定の指標として用いる場合、ＣＤＫインヒビターのパラメータは、発現量である。

ＣＤＫインヒビター発現量とは、検体である細胞可溶化液に含まれる目的のＣＤＫインヒビター量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的の蛋白質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよい。目的の蛋白質（ＣＤＫインヒビター）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。目的のタンパク質と特異的に結合できるものであれば、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。例えば、ｐ２１を捕捉する場合、抗ｐ２１モノクローナル抗体、抗ｐ２１ポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。

判定の指標として２種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫと第二ＣＤＫ）を使用する場合、あるいは第一ＣＤＫ及び／又は第２ＣＤＫとＣＤＫインヒビターとの組み合わせを使用する場合、第一ＣＤＫについて選択されるパラメータ（第１パラメータ）と第１パラメータに対応する閾値との比較結果（第１比較結果）と、第二ＣＤＫ又はＣＤＫインヒビターについて選択される第２パラメータと該第２パラメータに対応する閾値との比較結果（第２比較結果）との組み合わせにより、抗がん剤治療の有効性の程度が異なる三群（例えば、抗がん剤に対する感受性高、中、低）に分類することができる（第２−１の有効性予測方法）。

さらに、前記第二ＣＤＫの活性値、発現量、活性値と発現量との比、及びＣＤＫインヒビターの発現量からなる群より選択される、前記第２パラメータとは異なる第３パラメータと、該第３パラメータに対応する閾値の比較工程（第３比較工程）を含み、前記第１比較工程、第２比較工程、第３比較工程それぞれの比較結果に基づいて、抗がん剤治療の有効性の程度が異なる四群（例えば、抗がん剤に対する感受性高、中、やや低、低）に分類してもよい（第２−２の有効性予測方法）。

尚、第二ＣＤＫについても、有効性の判定に用いるパラメータは、第１の有効性予測方法で用いた群、すなわち活性値、発現量、及び活性値と発現量の比から選択される。活性値と発現量の比は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示されるＣＤＫ比活性であってもよいし、ＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値の値であってもよい。

第２−１の有効性予測方法において、第２パラメータとして、第二ＣＤＫに係るパラメータを選択する場合、第１パラメータと同種類のパラメータ（例えば、第一ＣＤＫ、第二ＣＤＫのいずれも比活性）を選択してもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば、第一ＣＤＫについては比活性、第二ＣＤＫについては発現量）を選択してもよい。

第２−２の有効性予測方法の具体的態様としては、第一ＣＤＫについて選択される第１パラメータと閾値との第１比較工程、第二ＣＤＫについて選択される第２パラメータと閾値との第２比較工程、ＣＤＫインヒビターの発現量（第３パラメータ）と閾値との第３比較工程それぞれの比較結果に基づいて抗がん剤治療の有効性の程度が異なる四群に分類する方法；第一ＣＤＫについて選択される第１パラメータと閾値との第１比較工程、第二ＣＤＫについて選択される第２パラメータと閾値との第２比較工程、第２ＣＤＫについて選択される、第２パラメータとは異なる第３パラメータ（例えば、第２パラメータが第二ＣＤＫの発現量で、第３パラメータが第二ＣＤＫの比活性の組み合わせなど）と閾値との第３比較工程それぞれの比較結果に基づいて抗がん剤治療の有効性の程度が異なる四群に分類する方法が挙げられる。

第２の有効性予測方法において、第一ＣＤＫ、第二ＣＤＫのいずれか一方がＣＤＫ１又はＣＤＫ２であることが好ましい。より好ましくは、第一ＣＤＫと第二ＣＤＫの組み合わせが、ＣＤＫ１とＣＤＫ２の組み合わせの場合である。

判定の指標として２種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫと第二ＣＤＫ）を使用する場合、あるいは第一ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの組み合わせを使用する場合について、第２の有効性予測方法では各比較工程の結果の組み合わせに基づいて予測したが、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、各パラメータについての比較工程を順番に行ない、先の比較結果に応じて、次の比較工程を行なう方法であってもよい（第３の有効性予測方法）。

すなわち、第３の有効性予測方法では、抗がん剤を少なくとも一度投与した生体から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値、発現量、活性値と発現量との比、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量からなる群より選択される少なくとも一つの第１パラメータと、該第１パラメータに対応する閾値とを比較する工程（第１比較工程）；得られた比較結果（第１比較結果）に基づいて、前記生体に対する前記抗がん剤治療の有効性を予測する工程（第１予測工程）；第１予測工程において抗がん剤治療の有効性の予測判定が確定されなかった腫瘍細胞について、第一ＣＤＫの活性値、発現量、活性値と発現量との比、第一ＣＤＫとは異なる種類の第二ＣＤＫの活性値、発現量、活性値と発現量との比、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量からなる群より選択される、前記第１パラメータとは異なる少なくとも一つの第２パラメータと、該第２パラメータに対応する閾値とを比較する第２比較工程；及び得られた第２比較結果に基づいて前記生体に対する抗がん剤治療の有効性を予測する第２予測工程；を含む（第３−１の有効性予測方法）。

さらに、前記第２予測工程において抗がん剤治療の有効性の予測判定が確定されなかった腫瘍細胞について、第一ＣＤＫの活性値、発現量、活性値と発現量との比、前記第二ＣＤＫの活性値、発現量、活性値と発現量との比、及びＣＤＫインヒビターの発現量からなる群より選択される、前記第１パラメータ及び前記第２パラメータとは異なる第３パラメータと、該第３パラメータに対応する閾値とを比較する第３比較工程；及び得られた第３比較結果に基づいて前記生体に対する抗がん剤治療の有効性を予測する工程；
をさらに含んでもよい（第３−２の有効性予測方法）。

第３−１の有効性予測方法では、第１比較工程で、判定指標としてＣＤＫインヒビターが選択された場合（第１パラメータがＣＤＫインヒビターの発現量の場合）には、第２比較工程で第一ＣＤＫ又は第二ＣＤＫに係るパラメータが第２パラメータとして選択されることになる。

あるいは、第１比較工程で第一ＣＤＫに係るパラメータが選択された場合（第１パラメータが第一ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選ばれる少なくとも１つのパラメータの場合）には、第２比較工程で、第一ＣＤＫ、第二ＣＤＫ、又はＣＤＫインヒビターに係るパラメータで第１パラメータと異なるパラメータが第２パラメータとして選択される。すなわち、第２パラメータが第一ＣＤＫに係るパラメータの場合には、第１パラメータと異なるパラメータ（例えば第１パラメータが第一ＣＤＫの発現量の場合には、第２パラメータは第一ＣＤＫの活性値又は活性値と発現量との比など）が選択され、第２パラメータがＣＤＫインヒビターに係るパラメータの場合には第１パラメータの種類（活性値、発現量、又は活性値と発現量との比のいずれか）にかかわらずＣＤＫインヒビターの発現量が第２パラメータとなり、第２パラメータが第二ＣＤＫに係るパラメータの場合には、第一ＣＤＫで選択されたパラメータの種類と同じ（例えば、第１パラメータが第一ＣＤＫの発現量で、第２パラメータが第二ＣＤＫの発現量など）であっても、異なっていてもよい。

第３−２の有効性予測方法では、第１比較工程で、判定指標としてＣＤＫインヒビターが選択された場合（第１パラメータはＣＤＫインヒビターの発現量の場合）には、第２比較工程で第一ＣＤＫ又は第二ＣＤＫに係るパラメータが第２パラメータとして選択され、第３比較工程で、第一ＣＤＫ又は第二ＣＤＫに係るパラメータであって、第２パラメータと異なるパラメータが第３パラメータとして選択される。すなわち、第２パラメータと同種類のＣＤＫを用いた場合（例えばいずれも第一ＣＤＫ）にはパラメータの種類が異なり（例えば第２パラメータが第一ＣＤＫの発現量で、第３パラメータが第一ＣＤＫの活性値など）、第２パラメータと異なる種類のＣＤＫを用いた場合（例えば、第２パラメータが第一ＣＤＫに係るパラメータで、第３パラメータが第二ＣＤＫに係るパラメータ）、パラメータの種類は同じであっても（例えば、第２パラメータ、第３パラメータいずれも発現量など）、異なってもよい（例えば第２パラメータが第一ＣＤＫの発現量で、第３パラメータが第二ＣＤＫの活性値など）。

要するに、第１パラメータ、第２パラメータ、第３パラメータとして、判定の指標に用いるタンパク質（第一ＣＤＫ、第二ＣＤＫ、又はＣＤＫインヒビターのいずれか）、あるいはパラメータの種類（発現量、活性値、又は発現量と活性値との比）のいずれかが異なっていればよい。

但し、第３の有効性予測方法においても、２種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫ及び第二ＣＤＫ）を選択されることが好ましく、そのいずれか一方がＣＤＫ１又はＣＤＫ２であることが好ましい。より好ましくは、第一ＣＤＫと第二ＣＤＫの組み合わせが、ＣＤＫ１とＣＤＫ２の組み合わせの場合である。

以上のような本発明の第２の有効性予測方法及び第３の有効性予測方法は、予測の正答率を上げる点で有効である。さらに第１の有効性予測方法で有効性の予測判定が確定できない場合であっても、第２の有効性予測方法、第３の有効性予測方法を用いることにより有効性を判定することができることがある。

また、抗がん剤治療の効き方にも、さらに病状が悪化することを防止するレベルと、腫瘍を縮小、さらには消失させて、病状を快方に向かわせることができるレベルとに分類することができ、第２の有効性予測方法により、抗がん剤治療の効き方のレベルを加味した予測を行なうこともできる。

さらに、第３の有効性予測方法では、所望の有効性についての結論を確定することができた場合、次の比較工程を行なわずに済むので、かかる意味において、処理が簡便になる。

第３−２の有効性予測方法の一例として、図２に示す決定木について説明する。
まず第１のＣＤＫの比活性について所定の閾値と比較する（ステップ＃１）。閾値以上であった細胞については「感受性高」であると予測判定を確定させる。
ステップ＃１で閾値未満であり、感受性の予測判定が確定されなかった細胞については、ＣＤＫインヒビター発現量について閾値と比較する（ステップ＃２）。閾値以上であった細胞については「感受性低」であると予測判定を確定させる。
ステップ＃２で閾値未満であった細胞について、さらに第二ＣＤＫの比活性について閾値と比較する（ステップ＃３）。ステップ＃３で閾値以上であった細胞については「感受性中」、閾値未満であった細胞については「感受性やや低」と、それぞれ予測判定を確定させる。

図２に示す決定木において、採用する第一ＣＤＫ及び第二ＣＤＫの組み合わせは、抗がん剤の種類により適宜選択されるが、タキサン系抗がん剤の場合、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の組み合わせを用いることが好ましい。また、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の組み合わせを用いることが好ましい。また、ＣＤＫインヒビターとしてはｐ２１を用いることが好ましい。

このような決定木によれば、抗がん剤に対する感受性を高（ＴｙｐｅＩ）、中（ＴｙｐｅＩＩ）、やや低（ＴｙｐｅＩＩＩ）、低（ＴｙｐｅＩＶ）の４段階で予測することができる。また、第１比較工程で高感受性と判定されたものは、他の比較工程を行なわないので、処理が簡便になる。

尚、図２において、第一ＣＤＫ、ＣＤＫインヒビター、第二ＣＤＫの順にそれぞれ閾値との比較を行なっているが、これに限定されず、比較の順番を適宜変更してもよい。

また、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法では、ＣＤＫインヒビターの発現量と対応する閾値との比較のみを行い、抗がん剤治療の有効性を予測してもよい。この比較結果を用いると、抗がん剤投与の有効性が低いか否かを判定することができる。この比較結果に基づいて抗がん剤投与の有効性が低いと判定された場合は、抗がん剤の投与を中止することができ、薬効の低い患者に対する副作用などの身体的負担や治療費などの経済的負担を軽減することが可能となる。従って、上述の第３の有効性予測方法において、第１パラメータとしてＣＤＫインヒビターの発現量を選択した場合で、有効性が低いとの判定を予測結果として採用する場合、第２の比較工程に進まなくてもよい。一方、ＣＤＫインヒビターの発現量と閾値との比較結果に基づいて抗がん剤投与の有効性が低くないと判定された場合は、上述した有効性予測方法の何れかを用いてさらに詳細に抗がん剤投与の有効性を予測することができる。

以上のような本発明の有効性予測方法では、少なくとも１回、判定対象となる抗がん剤を投与した細胞に着目してＣＤＫを見ているので、単に腫瘍細胞の種類として抗がん剤に対する感受性を判断するだけでなく、さらに感受性の個体差として最終的には抗がん剤治療の効果の差違となって現れる、薬物代謝活性の差違などを加味して感受性を判定することができる。従って、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法によれば、薬物代謝酵素、薬物トランスポータなど、遺伝子多型に依拠する薬物動態の個人差を考慮した、高精度な有効性予測結果を得ることができる。

尚、上記本発明の予測方法は、コンピュータにおいて実行されることができる。以下、本発明の方法を実行するためのコンピュータシステム（図３）及び動作フロー図（図４及び図５）に基づいて説明する。

図３に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本発明のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けのメモリ１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、メモリ１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェース１１０ｆ、画像出力インターフェース１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。

図４は、第２の予測方法を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。パラメータとして、ＣＤＫ２比活性値、ｐ２１発現量、及びＣＤＫ１比活性値の場合を例に、以下、説明する。

まず、入力デバイス１３０により検体のＣＤＫ２比活性値、ｐ２１発現量およびＣＤＫ１比活性値が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１０）。ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていたＣＤＫ２比活性値に対応する閾値、ｐ２１発現量に対応する閾値およびＣＤＫ１比活性値に対応する閾値を呼び出して、これらの閾値とパラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１１）。次に、ＣＰＵ１１０aは、比較結果に基づいて予測判定を行う（ステップＳ１２）。具体的には、ＣＰＵ１１０aは、ＣＤＫ２比活性値とそれに対応する閾値との比較結果（以下、第１比較結果）がＨｉｇｈ、ｐ２１発現量とそれに対応する閾値との比較結果（以下、第２比較結果）がＬｏｗ、ＣＤＫ１比活性値とそれに対応する閾値との比較結果（以下、第３比較結果）がＨｉｇｈの場合には、ＴｙｐｅＩ（感受性高）であると判定する。また、ＣＰＵ１１０aは、第１比較結果がＬｏｗ、第２比較結果がＬｏｗ、第３比較結果がＨｉｇｈの場合には、ＴｙｐｅＩＩ（感受性中）であると判定し、第１比較結果がＬｏｗ、第２比較結果がＬｏｗ、第３比較結果がＬｏｗの場合には、ＴｙｐｅＩＩＩ（感受性やや低）であると判定し、第１比較結果がＬｏｗ、第２比較結果がＨｉｇｈ、第３比較結果がＬｏｗの場合には、ＴｙｐｅＩＶ（感受性低）であると判定する（以上の予測結果の分類については、後述の表１参照）。そして、ＣＰＵ１１０aは、上記の予測判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１３）。

尚、上記実施形態においては、パラメータデータを、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではない。例えば、発現量や活性値を測定する測定装置から入出力インターフェイス１１０ｆを介してパラメータデータを取得するようにしてもよい。また、パラメータデータとして、ＣＤＫ１の比活性値およびＣＤＫ２の比活性値を入力したが、ＣＤＫ１の発現量と活性値およびＣＤＫ２の発現量と活性値を入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれらの値からＣＤＫ１の比活性値およびＣＤＫ２の比活性値を算出して、この値を閾値との比較に用いてもよい。さらに、上記実施形態においては、ＣＤＫとしてＣＤＫ１およびＣＤＫ２を用い、ＣＤＫインヒビターとしてｐ２１を使用した場合について説明したが、本発明の第２の有効性予測方法の実行のためのプログラムは、これに限定されない。

図５は、第３−２の有効性予測方法の一実施形態を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。図２に示した決定木を実行する場合を例に、以下、具体的に説明する。

まず、入力デバイス１３０により検体のＣＤＫ２比活性値、ｐ２１発現量およびＣＤＫ１比活性値が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ２０）。
ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていたＣＤＫ２比活性値に対応する閾値を呼び出して、この閾値と第１パラメータデータであるＣＤＫ２比活性値との比較を実行する（ステップＳ２１）。第１パラメータデータが閾値以上の場合には、判定結果である「感受性高」をＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに、画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に「感受性高」を出力する（ステップＳ２２）。第１パラメータデータが閾値未満の場合には、ＣＰＵ１１０ａは予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていたｐ２１発現量に対応する閾値を呼び出して、この閾値と第２パラメータデータであるｐ２１発現量との比較を実行する（ステップＳ２３）。第２パラメータデータが閾値以上の場合には、判定結果である「感受性低」をＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに、画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に「感受性低」を出力する（ステップＳ２４）。第２パラメータデータが閾値未満の場合には、ＣＰＵ１１０ａは予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていたＣＤＫ１比活性値に対応する閾値を呼び出して、この閾値と第３パラメータデータであるＣＤＫ１比活性値との比較を実行する（ステップＳ２５）。第３パラメータデータが閾値以上の場合には、判定結果である「感受性中」をＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに、画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力し（ステップＳ２６）、第３パラメータデータが閾値未満の場合には、判定結果である「感受性やや低」をＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに、画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ２７）。

尚、上記実施形態においては、パラメータデータを、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではない。例えば、発現量や活性値を測定する測定装置から入出力インターフェイス１１０ｆを介してパラメータデータを取得するようにしてもよい。また、パラメータデータとして、ＣＤＫ１の比活性値およびＣＤＫ２の比活性値を入力したが、ＣＤＫ１の発現量と活性値およびＣＤＫ２の発現量と活性値を入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれらの値からＣＤＫ１の比活性値およびＣＤＫ２の比活性値を算出して、この値を閾値との比較に用いてもよい。さらに、上記実施形態においては、ＣＤＫとしてＣＤＫ１およびＣＤＫ２を用い、ＣＤＫインヒビターとしてｐ２１を使用した場合について説明したが、本発明の第３−２の有効性予測方法の実行のためのプログラムは、これに限定されない。

さらにまた図５は、第３−２の有効性予測方法の場合のフローを示す図であったが、第３−１の有効性予測方法の場合には、第３パラメータと閾値との比較（ステップＳ２５）に進むことなく、第２パラメータが閾値未満の場合に基づく予測結果が出力されることになる。

はじめに、下記実施例で用いた測定方法について説明する。
〔測定方法〕
（１）ＣＤＫ活性の測定
目的とする腫瘍細胞を含む組織の検体から、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全蛋白質量が１００μｇとなる量を加えた。これに、活性測定しようとするＣＤＫに特異的抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社のポリクローナル抗ＣＤＫ１抗体又はポリクローナル抗ＣＤＫ２抗体）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社製）を加えて４℃で１時間反応させた後、ビーズを緩衝液（０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄し、１５μｌのキナーゼ緩衝液中に再懸濁させて、目的のＣＤＫが結合したビーズを含む試料を得た。

この試料においては、ＣＤＫ単体、サイクリン結合した活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体の全て（以下、これらを区別しないときは「ＣＤＫ群」という）が、ＣＤＫ特異的抗体に捕捉され、ビーズに結合した状態となっている。このような試料中のＣＤＫ群の活性を、下記方法により測定した。

ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応する基質であるヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー製）１０μｇ、５ｍＭのアデノシン５’−Ｏ−（８−チオ３リン酸）（ＡＴＰ−γＳ、シグマ社製）、及び緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む基質溶液を調製し、この基質溶液を上記ＣＤＫ試料液に加えて５０μｌとし、３７℃で１０分間振とうしてインキュベートした。下記式に示すように、基質のセリン又はスレオニン残基が、活性型ＣＤＫによりリン酸化され、モノチオリン酸化基質が得られる。

反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心して、ビーズを沈殿させ、モノチオリン酸を溶解した上澄み液１８μｌを採取した。この上澄み液１８μｌに、１５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．２、５ｍＭのＥＤＴＡを含む結合緩衝液１５μｌを加えた。さらに、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で暗所において９０分間室温にてインキュベートすることにより、モノチオリン酸化基質のチオリン酸中の硫黄をビオチン化標識した。ヨードアセチルビオチンとチオリン酸との反応の停止は、６−メルカプトエタノールの添加により行った。

ビオチン標識されたチオリン酸化基質０．４μｇを、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦ膜上に添加し、吸引した。得られた膜を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックし、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター製）を３７℃で１時間反応させた。その後、膜を５０ｍＭ ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０分間３回洗浄した。洗浄後、膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）により分析した。活性は、検量線に基づいて算出した。

尚、検量線は、既存量のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）をＰＶＤＦ膜上に吸着させ、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）で測定することにより作成した。従って、測定されるＣＤＫ活性１Ｕは、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。

（２）ＣＤＫ発現量の測定
ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に浸漬して初期化したＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたスロットブロッターの各ウェル（２×２×３ｍｍ、許容量１００μｌ）に、目的の腫瘍細胞を含む組織の検体（細胞可溶化液）を５０μｌずつ注入して、ＣＤＫ発現量の測定用の試料とした。各ウェルにはいっている各試料には、タンパク質が総量で５〜１５μｇずつ含まれている。

注入後、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引し、膜に試料を吸着させた。

次いで、試料に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体又はウサギ抗ＣＤＫ２抗体（一次抗体）の溶液を、各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。

次に、ビオチン化した抗ウサギ抗体（二次抗体）の溶液を各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。

ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン試薬を４０μｌずつ注入し、約３０分間室温で静置して、二次抗体をＦＩＴＣで標識した。ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。

ＰＶＤＦメンブレンをプレートからとりはずし、蒸留水で洗浄し、約１５分間室温で乾燥させた後、膜に吸着されたタンパク質の蛍光強度を、イメージアナライザ（バイオラッド社）によって分析、測定し、予め作成した検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識された蛋白質（ＣＤＫ１又はＣＤＫ２）を定量（ＣＤＫ個数に対応する量を標準蛋白質の重量（ｎｇ）で換算）した。このようにして測定されるＣＤＫ量は、細胞中に存在しているＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体など）の総量である。

尚、検量線は、０．００１％のＮＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ中に、５種類の濃度の純品の組換えＣＤＫタンパク質の溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度と量の関係を表すことにより標準曲線を作成した。

（３）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性及びＣＤＫ発現量の測定値から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量

（４）ｐ２１の発現量
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭｐ２１ＷＡＦ１ ＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。

ＷＡＦ１スタンダード（２０ユニット／ｍｌのｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅされたＷＡＦ１）を、検体である細胞可溶化液で段階的に希釈したＷＡＦ１試料液（ＷＡＦ１スタンダードと検体の混合液）を調製する。なお、各試料液において、細胞可溶化液は４倍以上希釈されたものとなっている。
ＷＡＦ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（一次抗体）を固定した９６穴プラスチックウエルに、上記ＷＡＦ１試料液及びＷＡＦ１スタンダードのみをそれぞれ１００μｌ／ウェルで加える。ウェルプレートをシールし、室温で２時間インキュベートして、一次抗体と反応させた。
洗浄用バッファー（２０倍濃縮液２５ｍｌを、４７５ｍｌの脱イオン水に加えて調製）、３回洗浄した後、検出用抗体（ビオチン化抗ＷＡＦ１モノクローナル抗体）を１００μｌ／ウェルを加え、ウェルプレートをシールして、室温で１時間、反応させた。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン希釈液１００μｌ／ウェルを加え、緩やかに攪拌し、プレートをシールして、室温で３０分間反応させた後、未反応のペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを除去した。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、各ウェルに、基質溶液（色素源基質）１００μｌ加え、室温で３０分間、暗所で反応させる。３０分後、各ウェルに、停止液（２．５Ｎ硫酸）１００μｌ加えて、反応を停止させ、各ウェルの吸光度を、プレートリーダーを用いて、４５０／５４０ｎｍで計測した。
ＷＡＦ１スタンダードよりなる検量線から、ＷＡＦ１試料液中のｐ２１ＷＡＦ１濃度を計算した。

〔実施例１：マウス異種移植片における抗がん剤治療有効性と有効性予測判定の関係〕
（１）検体の調製
５種類のヒト由来乳がん培養細胞（細胞Ａ〜Ｅ）を、４６匹のマウス（Ｎｏ．１〜４６）の背中の皮下に移植し、２１〜２８日間飼育して、乳がん細胞を生着させた。このようにして得られた、乳がん細胞の担がんマウスＮｏ．１〜４６に、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）を１回投与した。投与２４時間後、マウスの背中から２．５ｍｍ×２．５ｍｍの組織片（約５０ｍｇ）を切り取り、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて上記組織片をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、上清（細胞可溶化液）を、検体として用いた。

（２）担がんマウスの抗がん剤治療効果
（１）で用いた細胞Ａ〜Ｅを４６匹のマウス（Ｎｏ．１〜４６）の皮下にそれぞれ移植し、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）／日で、１日１回、５日間、投与した。投与開始から１１日目までの腫瘍サイズを測定し、サイズの変化に応じて、抗がん剤治療の有効性レベルを、ＴｙｐｅＩ（感受性高：抗がん剤に対する感受性が高いもので、パクリタキセル投与により腫瘍がほぼ消失）、ＴｙｐｅＩＩ（感受性中：抗がん剤に対する感受性は中程度で、パクリタキセル投与により腫瘍サイズが縮小する）、ＴｙｐｅＩＩＩ（感受性やや低：抗がん剤の感受性が低いもので、パクリタキセル投与によって腫瘍サイズの増大が抑制される）、ＴｙｐｅＩＶ（感受性低：抗がん剤の感受性が低いもので、パクリタキセル投与によっても腫瘍サイズが増大し続ける）に分類した。この結果、表１に示すように、細胞ＡはＴｙｐｅＩ、細胞Ｂ及びＣはＴｙｐｅＩＩ、細胞ＤはＴｙｐｅＩＩＩ、細胞ＥはＴｙｐｅＩＶに分類された。ここでの分類結果は、下記表１の「細胞」の列に示される。

（３）ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性、ｐ２１発現量の測定及び閾値の設定
（１）で調製した検体について、先に述べた測定方法に従って、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２それぞれについて、活性及び発現量を測定し、ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性を求めた。また、先に述べた測定方法に従って、ｐ２１の発現量を測定した。これらの測定結果を下記表１に示した。

測定結果より、（２）における分類結果に対して最も高い正答率で予測判定できるような閾値を設定した。即ち、ＣＤＫ２比活性の閾値は３４１．３〜４０７．１の間で設定することができ、ここでは４００に設定した。ｐ２１の発現量の閾値は８．７７〜１０．９６の間で設定することができ、ここでは１０に設定した。ＣＤＫ１比活性の閾値は１０．７６〜１０．８３の間で設定することができ、ここでは１０．８に設定した。表１には、閾値未満の値を示す場合は「Ｌｏｗ」と示し、閾値以上の値を示す場合は「Ｈｉｇｈ」と示した。

（４）予測判定

表１より、ＣＤＫ２比活性と閾値との比較結果のみを用いて予測判定を行った場合、１００％の確率でＴｙｐｅＩの細胞をＴｙｐｅＩと判定することができた。これは、この比較結果を用いることによりＮｏ．１〜４６の中から抗がん剤投与の有効性が特に高いと予測される群を確実に選別できたことを示す。

また、ｐ２１発現量と閾値との比較結果のみを用いて予測判定を行った場合、１００％の確率でＴｙｐｅＩＶの細胞をＴｙｐｅＩＶと判定することができた。これは、この比較結果を用いることによりＮｏ．１〜４６の中から抗がん剤投与の有効性が特に低いと予測される群を確実に選別できたことを示す。

また、ＣＤＫ１比活性と閾値との比較結果のみを用いて予測判定を行った場合、９６％の確率でＮｏ．１〜４６をＴｙｐｅＩ及びＴｙｐｅＩＩの群と、ＴｙｐｅＩＩＩ及びＴｙｐｅＩＶの群とに分類することができた。これは、この比較結果を用いることによりＮｏ．１〜４６を、抗がん剤投与の有効性が比較的高い群と抗がん剤投与の有効性が比較的低い群に高確率で二分することができたことを示す。

このように、ＣＤＫ２比活性と閾値との比較結果、ｐ２１発現量と閾値との比較結果及びＣＤＫ１比活性と閾値との比較結果の何れかを用いることにより、高率に腫瘍細胞に対する抗がん剤の有効性を予測することができた。

表１より、ＣＤＫ２比活性と閾値との比較結果及びｐ２１発現量と閾値との比較結果を組み合わせて予測判定を行った場合、１００％の確率でＮｏ．１〜４６をＴｙｐｅＩの群、ＴｙｐｅＩＩ及びＴｙｐｅＩＩＩの群、ＴｙｐｅＩＶの群、の３群に分類することができた。

また、ＣＤＫ２比活性と閾値との比較結果及びＣＤＫ１比活性と閾値との比較結果を組み合わせて予測判定を行った場合、１００％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩの群を選別することができ、９６％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＩの群を選別することができ、９２％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＩＩ及びＴｙｐｅＩＶの群を選別することができた。この場合、全体の正答率は９６％であった。

また、ｐ２１発現量と閾値との比較結果及びＣＤＫ１比活性と閾値との比較結果を組み合わせて予測判定を行った場合、９７％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩ及びＴｙｐｅＩＩの群を選別することができ、８６％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＩＩの群を選別することができ、１００％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＶの群を選別することができた。この場合、全体の正答率は９６％であった。

このように、ＣＤＫ２比活性と閾値との比較結果、ｐ２１発現量と閾値との比較結果及びＣＤＫ１比活性と閾値との比較結果から選択される２つの比較結果を用いることにより、抗がん剤投与の有効性の程度が異なる三つの群に高確率で分類でき、腫瘍細胞に対する抗がん剤の有効性を予測することができた。

表１より、ＣＤＫ２比活性と閾値との比較結果、ｐ２１発現量と閾値との比較結果及びＣＤＫ１比活性と閾値との比較結果を組み合わせて予測判定を行った結果、１００％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩの群を選別することができ、９６％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＩの群を選別することができ、８６％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＩＩの群を選別することができ、１００％の確率でＮｏ．１〜４６の中からＴｙｐｅＩＶの群を選別することができた。この場合、全体の正答率は９６％であった。

このように、全ての比較結果を用いることにより、抗がん剤投与の有効性の程度が異なる四つの群に高確率で分類でき、腫瘍細胞に対する抗がん剤の有効性を予測することができた。

有効性予測判定結果と、実際の抗がん剤投与の結果との一致（正）、不一致（誤）の正解率を表２にまとめて示す。

〔実施例２：決定木に基づくマウス異種移植片における抗がん剤治療有効性と有効性予測判定の関係〕
ＣＤＫ２比活性、ｐ２１発現量及びＣＤＫ１比活性の測定結果と、それぞれの閾値との比較結果に基づき、図６に示すフローチャートに従ってパクリタキセルの感受性を予測判定した。図６においては、各検体についてステップ＃１でＣＤＫ２比活性を閾値４００と比較し、ＣＤＫ２比活性が４００以上であった検体をＴｙｐｅＩと判定した。ステップ＃１で抗がん剤有効性の判定が確定しなかった、ＣＤＫ２比活性４００未満の検体については、ｐ２１の発現量を閾値１０と比較した（ステップ＃２）。ｐ２１発現量が１０以上であった検体をＴｙｐｅＩＶと判定した。次に、ステップ＃２でも抗がん剤有効性の判定が確定しなかった、ｐ２１発現量１０未満の検体については、ＣＤＫ１の比活性を閾値１０．８と比較した（ステップ＃３）。ＣＤＫ１比活性が１０．８以上であった検体をＴｙｐｅＩＩ、１０．８未満であった検体をＴｙｐｅＩＩＩと判定し、全ての検体について予測判定を確定させた。

これらの判定結果と、実施例１の（２）の分類結果とを比較し、一致したものを「正」とし、不一致のものを「誤」とした。判定結果及び分類結果と判定結果との正誤は、表１の「予測判定」の列に示す通りである。全ての検体において、実施例１の判定結果と同様の結果が得られた。また、図６に示すフローチャートにおいて、各ステップの順番を如何なる順に変更しても同じ結果が得られることが確認された。

表１及び表２より、本実施例における正答率は９６％であり、従来の予測方法よりも高い正解率で予測することができ、さらに感受性の高いもの（ＴｙｐｅＩ）及び感受性の低いもの（ＴｙｐｅＩＶ）については、正答率１００％であった。
従って、本発明の有効性予測方法では、感受性の高いものについては、ほぼ１００％の確実性で抗がん剤治療の有効性を予測でき、さらに、抗がん剤により腫瘍が消失しないまでも、縮小して、摘出手術に踏み切ることができるかどうかの有効性予測についても、９０％以上の高確率で予測することができる。

本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法によると、個々の患者について、抗がん剤治療の有効性を高確率で予測することができるので、抗がん剤治療を行なうか否かの、有用な判断指標として、医療現場で利用できる。

細胞周期を説明するための図である。 本発明の有効性予測方法の一実施形態を説明するためのフローチャートである。 本発明の有効性予測方法を実行するシステムの一例を示すブロック図である。 本発明の有効性予測プログラムの一実施態様を説明するためのフロー図である。 本発明の有効性予測プログラムの一実施態様を説明するためのフロー図である。 実施例２の有効性予測方法で採用した判定のためのフローチャートである。

Claims (6)

1. 第1パラメータと、第1閾値とを比較する工程（第1比較工程）；
   第2パラメータと、第2閾値とを比較する工程（第2比較工程）；及び
   前記第１比較結果および前記第2比較結果に基づいて、生体に対する抗がん剤治療の有効性を予測する工程；
   を含み、
   前記第1パラメータおよび前記第2パラメータは、抗がん剤を少なくとも一度投与した生体から採取した乳がん細胞のCDK1の活性値と発現量との比（CDK1比活性）、CDK2の活性値と発現量との比（CDK2比活性）、およびp21の発現量から選択された、それぞれ異なるパラメータであり、
   前記第1パラメータが前記CDK1比活性であり、前記第2パラメータが前記CDK2比活性である場合、前記予測工程において、前記第2パラメータが前記第2閾値以上であると前記有効性が高いと予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値以上であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が中程度と予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が低いと予測し、
   前記第1パラメータが前記CDK1比活性であり、前記第2パラメータが前記p21発現量である場合、前記予測工程において、前記第1パラメータが前記第1閾値以上であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が高いと予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が中程度と予測し、前記第2パラメータが前記第2閾値以上であると前記有効性が低いと予測し、
   前記第1パラメータが前記CDK2比活性であり、前記第2パラメータが前記p21発現量である場合、前記予測工程において、前記第1パラメータが前記第1閾値以上であると前記有効性が高いと予測し、前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、且つ前記第2パラメータが前記第2閾値未満であると前記有効性が中程度と予測し、前記第2パラメータが前記第2閾値以上であると前記有効性が低いと予測する、
   抗がん剤治療の有効性予測方法。
2. 第3パラメータと、第3閾値とを比較する第3比較工程をさらに含み、
   前記第1パラメータが前記CDK2比活性であり、前記第2パラメータが前記p21発現量であり、前記第3パラメータが前記CDK1比活性であり、
   前記予測工程が、前記第1比較結果、前記第2比較結果、および前記第3比較結果に基づいて、前記生体に対する抗がん剤治療の有効性を予測する工程であり、
   前記予測工程において、前記第1パラメータが前記第1閾値以上である場合に前記有効性が高いと予測し、
   前記第1パラメータが前記第1閾値以上であり、且つ前記第3パラメータが前記第3閾値以上である場合に前記有効性が中程度であると予測し、
   前記第1パラメータが前記第1閾値未満であり、前記第2パラメータが前記第2閾値未満であり、且つ前記第3パラメータが前記第3閾値未満である場合に前記有効性がやや低いと予測し、
   前記第2パラメータが前記第2閾値以上である場合に前記有効性が低いと予測する、
   請求項1記載の抗がん剤治療の有効性予測方法。
3. 前記抗がん剤は、Ｍ期細胞に対して有効な抗がん剤である請求項1又は2に記載の抗がん剤治療の有効性予測方法。
4. 前記Ｍ期細胞に対して有効な抗がん剤は、タキサン系抗がん剤である請求項３に記載の抗がん剤治療の有効性予測方法。
5. 前記生体から採取した腫瘍細胞は、抗がん剤投与後、１０〜３０時間後の生体から採取したものである請求項１〜４のいずれかに記載の抗がん剤治療の有効性予測方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の各工程をコンピュータに実行させるためのプログラム。

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