KR20190126070A - 치료제의 선택을 위한 신호전달 경로 활성을 측정하는 방법 - Google Patents

치료제의 선택을 위한 신호전달 경로 활성을 측정하는 방법 Download PDF

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KR20190126070A
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랜스 가빈 랭
브라이언 프란시스 설리반
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셀퀴티 인크.
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Abstract

대상체로부터 수득된 이환 세포 샘플에서 다중 신호전달 경로의 기능적 상태를 동시에 결정하는 방법으로서, 대상체의 세포에서 최고 수준의 비정상적인 활성을 갖는 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제를 대상체에서의 치료 용도로 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 신호전달 경로가 대상자의 이환 세포 샘플에서 초민감한지 여부를 결정하고, 또한 대상체에서 치료 용도로 효과적인 표적화된 치료제의 선택을 허용하는 방법이 제공된다. 선택된 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 방법도 또한 제공된다.

Description

치료제의 선택을 위한 신호전달 경로 활성을 측정하는 방법
관련 출원
본 출원은 2017년 3월 20일자로 출원된 미국 가출원 제62/473,936호 및 2017년 11월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/587,572호의 우선일의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
암은 중요한 의료 문제이며, 미국 남성과 여성의 약 40%가 그들의 일생 중 일부 시점에서 암으로 진단될 것으로 추정된다. 다양한 유형의 암에 대해 다양한 치료 옵션이 이용가능하지만, 모든 환자가 모든 치료에 반응하지는 않을 것이라는 것은 분명하다. 치료적으로 유익하지 않는 것으로 판명된 환자에게 치료를 처방하는 것은 수많은 이유로 인해 해로울 수 있다. 예를 들어, 환자는 치료의 잠재적으로 유해한 부작용에 노출되어 임의의 치료적 이익을 받지 못할 것이다. 게다가, 환자는 치료적으로 보다 유익할 수 있는 대안 치료를 받는 것이 지연된다. 추가로, 의료 비용이 갈수록 커지고 있는 상황에서 비효과적인 치료는 재정적 부담이다. 따라서, 환자가 처방되기 전에 특정 환자에 대한 특정 치료의 유익한 이점을 평가하고 정확하게 예측하는 능력은 상당히 관심이 많다. 이러한 관심은 개인화된 의약(일명, 정밀 의약 또는 계층화된 의약이라고도 함) 주변의 전체 사업 영역을 창출했으며, 각각의 환자는 잠재적으로 그의 질환에 맞게 맞춤화된 치료 레지멘을 받을 수 있다. 그러나, 이러한 이상적인 접근법은 현재의 예후 도구 세트의 상당한 단점 때문에 주로 입증되지 않았다.
다양한 암을 포함하는, 다양한 유형의 질환에 대해 광범위한 유전적 데이터를 수집하고 분석했다. 적어도 두 가지 중요한 사실이 이 과정에서 부각되었다. 첫째, 유방암과 같은 "질환"은 이질적인 것으로 밝혀졌으며, 부분적으로는 한 개인의 유방암이 유전적 구성과 단백질 발현 수준에서 다른 개체의 동일한 암과 완전히 상이할 수 있기 때문에 유전적 및 단백질 "바이오마커"를 치료제에 대한 반응성의 잠재적 지표로서 확인한다. 그러나, 둘째, 현재의 선도 유전자 및 단백질 바이오마커의 검출은 대다수의 사례에서 치료 반응성에 대한 예측의 값이 낮다는 것이 밝혀졌다.
예를 들어, 각각의 환자가 상이하고 많은 시간 동안 치료법이 긍정적인 반응에 영향을 미치지 않는다는 인식에 대한 한 가지 반응은 동반 진단의 발전이었다. 이 유형의 진단 테스트는 동시대의 바이오마커 검출 도구를 사용하여 특정 약물에 반응할 가능성이 더 큰 환자를 식별하도록 설계된다. 이 테스트는 증가된 유전자 수, 유전자 돌연변이, 또는 특정 유전자의 변경된 발현 수준을 찾는 것을 포함한다. 예를 들어, 오늘날 많은 암은 질환과 연관된 특정 유전자 돌연변이 또는 과-발현된 수용체 단백질의 존재를 밝히기 위한 테스트의 도움으로 진단된다. 그러나, 대부분의 바이오마커 테스트는 질환 및 그것의 근본 원인에 대한 간접적인 및 추론적인 정보만을 제공한다. 따라서, 중요한 치료 반응을 예측할 때 대부분의 상기 테스트의 성공률은 종종 50% 미만이다.
환자의 세포에 의한 특정 유전자 또는 단백질 바이오마커의 발현을 단순히 검출하는 것이 치료 반응성의 매우 효과적인 예측변수가 아니라는 이러한 관측은 치료 요법 선택을 위한 더 효과적인 수단이 필요하다는 것을 입증한다. 특히, 의사는 현재 특정 환자의 세포가 어떻게 기능하고 있는지, 또는 적절하게 기능이 제대로 작동하지 않는지에 대한 지식이 부족하여 질환 치료에 이용가능한 많은 치료제 중 하나에 어떻게 반응할 것인지에 대한 지식이 부족하다. 그들은 비정상적인 유전자가 존재하는지 알 수 있지만 그것이 특정 환자의 질환 경과에 어떻게 영향을 미치는지 알지 못한다. 그들은 구체적으로 약물이 어떻게 활동해야 하는지를 알 수 있지만, 왜 특정 환자가 그 약물 활성에 반응이 없거나 저항성이 있을 수 있는지는 알 수 없다. 따라서 환자는 기능적 수준에서 그의 특정 질환 원인을 보다 정확하게 파악하고, 효과적인 치료 과정을 위해 보다 나은 의사 결정을 내릴 수 있어야 한다.
특정 환자의 세포가 기능하거나 기능부전인 방법을 다루기 위해 취해진 하나의 접근법은 신호전달 경로의 활성 또는 이의 결핍을 나타내는, 생체 반응 파라미터의 변화, 예컨대 세포 유착의 평가를 통해 환자의 세포에서 신호전달 경로의 활성을 조사하는 것이다. 이러한 접근법은 검사되는 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 표적화된 치료제의 효과에 대한 정확한 예측을 가능하게 한다(PCT 공개 공보 WO 2013/188500에 기재됨).
개체에 대한 치료제, 특히 표적화된 치료제의 유효성에 대한 대안적이고 더 나은 예후 지표를 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 표적화된 치료제로 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 표적화된 치료제의 선택은 환자의 세포에서 하나 이상의 신호전달 경로의 기능적 활성에 대한 깊이있는 정보를 제공하여 환자의 치료를 위한 가장 적절한 표적화된 치료제(들)의 개선된 선택을 하도록 한다.
본 발명의 일 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 환자의 암 세포에서 다중 (2개 이상의) 신호전달 경로의 기능적 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 다중 신호전달 경로의 기능적 활성은 환자의 암 세포에서 병렬적으로(즉, 동일한 세포 샘플의 서로 상이한 부분에서 개별적으로 다른 경로를 병렬적으로 평가함으로써) 또는 동시에(즉, 동일한 세포 내에서 동시에 상이한 경로를 평가함으로써) 또는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 평행적 분석 및 동시 분석의 조합에 의해 평가될 수 있다.
다중 신호전달 경로를 평가하는 이러한 접근법은 특이적 가장 활성인 신호전달 경로(들)의 확인 및 환자의 종양에서의 경로 활성화 또는 치료 중재 사이의 예기치 못한 동반상승효과를 개별적으로 또는 동시에, 종양내 여러 개의 상이한 신호전달 경로의 활성을 평가하고, 그 결과를 비교함으로써 가능하게 한다. 그 다음, 환자는 최고 수준의 활성을 갖는 신호전달 경로(들)에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제로 치료된다. 이 접근법은 환자의 세포내에서 단일 신호전달 경로만을 평가하는 방법을 개선한다. 단일 경로만 평가되고 그의 활성이 정상인 것으로 밝혀지면, 환자의 종양을 움직이는 비정상적인 신호전달 경로의 확인이 알려지지 않았다. 또한, 평가된 단일 경로가 비정상인 것으로 평가되면, 이 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제가 치료를 위해 선택될 것이다. 그러나, 이 단일 신호전달 경로의 비정상적인 활성은 이러한 비정상적인 신호전달 경로가 가장 중요한지에 대한 충분한 정보를 제공하지 못하며, 잠재적으로 더욱 또는 동등하게 비정상적인 신호전달과 관련하여 질환 과정(예를 들어, 종양의 성장)을 실제로 유도한다. 따라서, 환자에 대한 단일 경로만을 시험함으로써, 질환 과정을 약화시키는데 비효과적일 수 있거나 또는 상이한 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제보다 덜 효과적일 수 있는 표적화된 치료제가 선택될 수 있다. 게다가, 한 경로의 비정상적인 활성은 두번째 경로의 비정상적인 신호전달의 결과일 수 있으며, 또는 다중 경로를 시험함에 의해서만 개별 환자에 대해 가장 정확한 표적화된 치료가 결정될 수 있도록 경로가 동반상승작용으로 또는 누화 또는 다른 생화학적 기전으로 연결될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 환자의 암 세포의 동일한 샘플에서 다수의 신호전달 경로를 개별적으로 또는 동시에 평가함으로써, 질환을 유도하고 최고 수준의 활성을 갖는 신호전달 경로가 확인될 수 있으며, 그것에 의해 최고 수준의 활성을 갖는 환자의 암 세포에서 신호전달 경로를 표적으로 하는 치료제(들)의 선택, 또는 최고 수준의 활성을 갖는 환자의 암 세포에서 신호전달 경로를 표적으로 하는 2종 이상의 치료제의 선택이 가능해진다.
게다가, 본 발명의 선택 방법은 환자의 세포에서 신호전달 경로의 활성 수준을 결정하기 때문에, 단순히 특정 치료제가 활성인지 아닌지를 결정할 수 없고, 본 발명의 선택 방법은 상기 방법에서 시험된 특정 치료제뿐만 아니라 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 제제의 패널내에서 적어도 하나의 표적화된 치료제를 치료적 용도로 선택하도록 한다. 따라서, 본 발명의 선택 방법은 단일 제제를 단독으로 시험하는 것보다 선택을 위한 포텐셜 치료제의 더 큰 패널의 확인을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 선택 방법의 사용을 통해 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제(본 명세서에 상세히 기재됨)를 사용함으로써 어느 신호전달 경로가 환자의 암 세포에서 질환을 일으키는지를 결정할 수 있다. 치료적으로 사용될 표적화된 치료제(들)의 최종 선택은 환자의 질환을 유발하는 것으로 결정된 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 시험관내에서 시험된 제제(들)와 동일하거나 상이한 제제일 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
각각의 세트가, 표적화된 치료제인 제1 제제 및 상기 제1 제제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 적어도 하나의 활성제인 제2 제제를 포함하는, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 상기 샘플을 접촉시키는 단계로서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트가 상이한 신호전달 경로에 영향을 주어, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
각각의 제1 제제 또는 각각의 제2 제제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 대해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플에서 세포 유착 또는 부착의 변화가 발생했는지 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 투여된 표적화된 치료제가 낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트(들)로부터의 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 보다 치료적으로 활성인 것을 나타내는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
각각의 세트가, 적어도 하나의 표적화된 치료제인 제1 제제 및 상기 제1 제제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 적어도 하나의 활성제인 제2 제제를 포함하는, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 상기 샘플을 동시에 접촉시키는 단계로서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트가 상이한 신호전달 경로에 영향을 주어, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
각각의 제1 제제 또는 각각의 제2 제제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 대해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플에서 세포 유착 또는 부착의 변화가 발생했는지 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 투여된 표적화된 치료제가 낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트(들)로부터의 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 보다 치료적으로 활성인 것을 나타내는 단계.
따라서, 시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 산출하는 한 쌍의 제제는 어떤 약물 전달 경로가 쌍으로 된 제제의 신호전달 경로 활성과 비교하여 어떤 신호전달 경로가 대상체의 암 세포를 유도하는지(즉, 어떤 경로가 질환 과정과 관련하여 가장 활성이 있는지)를 나타낸다. 이어서 상기 대상체에게 투여하기 위해 선택되는 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 수득한 쌍으로 된 제제로부터의 제1 제제(즉, 시험관내 시험에서 제1 제제로서 사용된 표적화된 치료제는 상기 대상체에게 투여하기 위해 선택될 수 있음) 또는 최고 출력 값을 수득한 쌍으로 된 제제로부터의 제1 제제와 상이한 제제일 수 있으며, 또는 여전히 최고 출력 값을 수득한 쌍으로 된 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는(예를 들어, 선택적으로 영향을 주는) 표적화된 치료제이다.
일 구현예에서, 샘플은 쌍으로 된 제제의 2개 이상의 세트, 예컨대 쌍으로 된 제제의 10개 이상의 세트와 접촉되며, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 신호전달 경로에 영향을 미친다. 적합한 신호전달 경로 및 쌍으로 된 제제의 세트 및 신호전달 경로가 본 명세서에 개시되어 있다(예를 들어, 표 2, 12, 13).
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로 이외의 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미친다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 c-Met/HGF 신호전달 경로, 에스트로겐 수용체(ER) 신호전달 경로, FGFR 신호전달 경로 또는 PDGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미친다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트가 에스트로겐 수용체(ER) 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 ER 신호전달 경로 이외의 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미친다. 예를 들어, 일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트가 ER 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트가 IGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미친다.
일 구현예에서, 적어도 2개의 표적화된 치료제는 상기 대상체에게 투여된다: (ⅰ) 시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 한 세트로부터의 표적화된 치료제 및 (ⅱ) 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 표적화된 치료제가 치료적으로 활성임을 나타내는 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제로부터의 적어도 하나의 추가의 표적화된 치료제. 일 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 표적화된 치료제는 활성화제에 의해 개시된 신호전달 활성을, 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 50% 초과 변화시키는 것으로 결정된다. 또한, 다양한 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험된 제제의 쌍으로 된 세트에서 사용되는 동일한 표적화된 치료제, 또는 대안적으로 시험관내에서 시험되지만, 시험관내에서 시험된 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는(예를 들어, 선택적으로 영향을 미치는) 상이한 표적화된 치료제일 수 있다.
적합한 신호전달 경로뿐만 아니라 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에서 사용하기에 적합한 표적화된 치료제 및 활성제가 본 명세서에 상세히 기재되어 있다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서도 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 초-민감성 환자의 세포내 신호전달 경로를 확인하는 단계, 및 그 다음 상기 초-민감성 신호전달 경로에 영향을 미치는 표적화된 치료제로 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 초-민감성 경로는 신호전달 경로 활성제(예를 들어, 수용체 리간드)와 같은 매우 낮은 수준의 세포 입력만이 매우 높은 수준의 경로 활성화 또는 반응성을 유발할 수 있는 경로이다(예를 들어, 90% 세포 출력). 암 세포에 추가의 비정상적인 신호전달 경로가 있어도, 초-민감성인 환자의 암 세포내 신호전달 경로가 질환 과정(예를 들어, 종양 성장)을 유도하는 것과 관련이 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이를 호출하는 환자의 암에서 신호전달 경로를 확인하는 것은 초-민감성이며, 이 신호전달 경로를 표적으로 하는 표적화된 치료제를 선택하는 것은 치료적으로 효과적인 치료법을 선택하는 효과적인 수단이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 신호전달 경로가 하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 것으로 결정된, 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 활성제와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플의 일부가 고농도의 활성제와 접촉되고, 상기 샘플의 일부가 저농도의 활성제와 접촉되는, 단계;
저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
상기 연속 측정의 수학적 분석에 의해 상기 활성제에 대한 상기 신호전달 경로의 민감성을 결정하는 단계; 및
신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감성일 때 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하여, 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성을 나타내는 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 및 및 활성제와 접촉하지 않은 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
활성제와 접촉하지 않은 샘플의 부분과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 활성제와 접촉된 샘플의 부분에서 일어났는지 여부를 특징짓는 활성제에 대한 샘플의 연속적 측정 민감도 및 활성제에 대한 출력값을 수학적 분석에 의해 결정하는 단계;
신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성 상태임을 나타내는, 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감성일 때, 또는 활성제에 대한 출력 값이 사전-결정된 컷-오프 값보다 클때, 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 고농도의 활성제는 EC90이고 저농도의 활성제는 EC10이다. 일 구현예에서, 81 미만의 EC90:EC10 비율은 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감성인 것을 나타낸다.
일 구현예에서, 활성제에 대한 신호전달 경로의 민감도는 힐(Hill) 계수를 결정하기 위해 힐 방정식을 사용하여 결정된다. 일 구현예에서, 1보다 큰 힐 계수 값은 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감하다는 것을 나타낸다.
다양한 적합한 신호전달 경로, 활성제 및 표적화된 치료제가 본 명세서에 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 첫째, 신호전달 경로가 초-민감성인 환자 그룹의 동일한 신호전달 경로에 대하여 (예를 들어, 5, 10, 20, 40, 50 또는 그 이상의) 특정 수준의 활성(예를 들어, 평균, 평균치, 상위 사분위수 등)에 대응하는 특정 신호전달 경로의 활성에 대한 컷-오프 값을 측정하는 단계를 포함한다. 컷-오프 값 이상인 신호전달 경로 활성 수준을 갖는 환자는 컷-오프 값 이상의 활성을 갖는 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제로 치료될 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 단일 표적화된 치료제가 억제할 수 있는 적어도 2개의 신호전달 경로 활성제에 의해 환자의 세포에서 동시에 개시되는 활성의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 하나의 신호전달 경로의 활성이 하나 이상의 세포 표면 수용체에 의해 개시되는 또 다른 경로 및 공유 경로 노드를 통과하는 상기 신호로부터의 업스트림, 다운스트림, 측면, 누화, 피드백, 또는 피드포워드 활성에 의해 유도될 수 있기 때문에, 이러한 공유 경로 노드 또는 노드들의 조합을 표적으로 하는 치료의 길항제 효과를 평가하는 것이 유리하다. 이러한 접근법은 공유된 다운스트림 경로 노드(예를 들어, AKT, PI3K, MEK, ERK, mTOR)를 표적으로 하는 치료제가 다중 세포 표면 수용체의 다운스트림의 신호전달 경로 활성에 미치는 영향의 측정을 허용한다. 세포 표면 수용체의 다운스트림에 있는 환자의 세포에서 2개 이상의 신호전달 경로 활성제의 동시 효과를 평가함으로써, 이 접근법은 한 쌍의 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제가 환자의 세포에 미치는 효과를 평가하는 방법을 개선한다. 추가로, 본 발명은 다수의 노드 또는 표적(예를 들어, 네라티닙, 둘리고투주맙, 크리조티닙, 파조파닙, 픽틸리십)에 결합하고, 조절하는 것으로 알려져 있고 발견될 수 있는 치료제를 포함한다. 본 발명은 이러한 유형의 조합 치료제를 확인하고 그것들로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 큰 환자들과의 매칭에 이상적이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 신호전달이 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
세포 유착 또는 부착 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 적어도 하나의 삼중항 세트의 제제와 접촉된 샘플을 생성하도록, 상기 샘플을 적어도 하나의 삼중항 세트의 제제와 접촉시키는 단계로서, 각각의 삼중항 세트는 제1 제제 표적화된 치료제 및, 표적화된 치료제가 다뤄지도록 의도되는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 적어도 2개의 제2 제제 활성제를 포함하는, 단계;
제1 제제 표적화된 치료제와, 또는 각각의 제2 제제 활성제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 대하여, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플내 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제와, 또는 각각의 제2 제제 활성제 단독과 접촉되는 샘플과 비교하여, 제제의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 세포 유착 또는 부착의 변화가 일어나는지의 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 치료적으로 활성임을 나타내는, 출력 값이 사전-결정된 컷-오프 값보다 큰 경우 제제의 삼중항 세트로부터의 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계.
일 구현예에서, 제1 제제 표적화된 치료제는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정되며, 이는 제1 제제 표적화된 치료제에 의해 영향을 받은 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 활성임을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 샘플은 2개 이상의 제2 제제 활성제가 다루는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 적어도 2개의 제1 제제 표적화된 치료제와 접촉된다.
다양한 적합한 신호전달 경로, 활성제 및 표적화된 치료제가 본 명세서에 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 하나의 신호전달 경로 활성제에 의해 환자의 세포에서 개시되고 활성제와 동일한 근사치 결합 부위를 직접 표적화하지 않는 표적화된 치료제에 의해 억제된 활성의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 두개 이상의 신호전달 경로가 수렴, 누화 및 피드백 루프의 여러 지점과 상호연결될 수 있기 때문에 활성제 결합 부위(예를 들어, 세포 표면 수용체)에서 개시되는 경로 활성을 억제하도록 설계된 표적화된 치료제가 신호전달 경로 활성을 억제하는 가장 효과적인 방법이 아닐 수 있다. 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성이 활성제와 동일한 근사치 결합 부위를 직접 표적화하는 매칭하는 신호전달 경로 억제제에 의해 억제될 수 없는 경우, 활성제의 결합 부위와 상이한 결합 부위를 표적으로 하는 요법은 개시된 신호전달 경로 활성을 억제할 수 있다. 이 접근법은 활성화제의 결합 부위에 대한 결합 부위 다운스트림(예를 들어, AKT, PI3K, MEK, ERK, mTOR), 결합 부위 업스트림(예를 들어, RAS, RAF), 또는 결합 부위 측면(예를 들어, 헤지혹, 노치, Wnt, c-MET, ALK, AXL, FGFR)을 표적화하는 치료제가 활성화제에 의해 개시되는 신호전달 경로 활성에 미치는 영향을 측정하도록 한다. 환자의 세포에서 활성제 제제의 활성화 결합 부위에 대해 신호전달 경로 억제제 다운스트림, 업스트림 또는 측면의 효과를 평가함으로써, 이러한 접근법은 한 쌍의 신호전달 경로 활성제의 효과를 평가하는 방법을 개선시키며, 표적화된 치료제는 환자 세포내 동일한 근사치 결합 부위를 갖는다. 추가로, 본 발명은 다수의 노드 또는 표적에 결합하고 그를 조절하는 것으로 알려져 있고 밝혀질 수 있는 치료제를 포함한다. 따라서, 활성제 제제와 상이한 결합 부위에 결합하는 표적화된 치료제로 환자를 치료하면 탁월한 효능 및 더 우수한 임상 결과를 유도할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 신호전달이 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
(i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 활성제와 동일한 신호전달 경로에는 영향을 미치지만 활성화 결합 부위의 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서 제2 제제 표적화된 치료제와 샘플을 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 상기 제1 제제 및 상기 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 제1 제제 및 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
제2 제제 표적화된 치료제가 영향을 주는 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷-오프 값 이상인 단계.
일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험되는 동일한 제2 제제 표적화된 치료제이다. 대안적으로, 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험되는 제2 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 신호전달 경로의 동일한 지점에서 제2 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제이다(즉, 제1 제제 활성제의 활성화 결합 부위에 대한 다운스트림, 업스트림 또는 측면).
다양한 적합한 신호전달 경로, 활성제 및 표적화된 치료제가 본 명세서에 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
일 구현예에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위해 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 2개 이상의 신호전달 경로 활성제에 의해 환자의 세포에서 개시된, 및 활성제와 동일한 근사치 결합 부위를 직접 표적화하지 않는 활성의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 2개 이상의 신호전달 경로가 수렴, 누화 및 피드백 루프와 상호연결될 수 있기 때문에 각각의 활성제 결합 부위(예를 들어, 다른 세포 표면 수용체)에서 개시된 경로 활성을 억제하기 위해 설계된 표적화된 치료제가 신호전달 경로 활성을 억제하는 가장 효과적인 방법이 아닐 수 있다. 2개 이상의 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성이 활성제와 동일한 근사 결합 부위를 직접 표적화하는 2개의 매칭 신호전달 경로 억제제에 의해 억제될 수 없는 경우, 활성제의 결합 부위와 상이한 결합 부위가 상기 개시된 신호전달 경로 활성을 억제한다. 이 접근법은 다운스트림의 결합 부위(예를 들어, AKT, PI3K, MEK, ERK, mTOR), 업스트림(예를 들어, RAS, RAF) 또는 측면(예를 들어, 헤지혹, 노치, Wnt, c-MET, ALK, AXL, FGFR)이 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성을 갖는다. 환자의 세포에서 2개 이상의 활성제 제제의 활성화 결합 부위에 대한 신호전달 경로 억제제의 다운스트림, 업스트림 또는 측면의 효과를 평가함으로써, 이 접근법은 각각이 환자의 세포에서 동일한 근사치 결합 부위에 존재하는, 한 쌍의 신호전달 경로 활성제와 표적화된 치료제의 효과를 평가하는 방법을 개선시킨다. 또한, 본 발명은 다수의 노드 또는 표적에 결합하고 그를 조절하는 것으로 알려져 있고 발견될 수 있는 치료제를 포함한다. 따라서, 활성제 제제와 상이한 결합 부위에 결합하는 표적화된 치료제로 환자를 치료하면 탁월한 효능 및 더 나은 임상 결과를 유도할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
(i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 2개 이상의 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 활성제의 활성화 결합 부위의 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서, 2개 이상의 제1 제제 활성제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 제2 제제 표적화된 치료제를 샘플과 접촉시키는 단계로서, 세포 유착 또는 부착 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지를 특징짓는 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
제2 제제 표적화된 치료제가 영향을 주는 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷오프 값 이상인, 단계.
일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험되는 동일한 제2 제제 표적화된 치료제이다. 대안적으로, 또 다른 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험되는 제2 표적화된 치료제와 상이하지만, 시험된 제2 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로내 지점(즉, 제1 제제 활성제의 활성화 결합 부위에 대해 다운스트림, 업스트림 또는 측면)에서 제2 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제이다.
다양한 적합한 신호전달 경로, 활성제 및 표적화된 치료제가 본 명세서에 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위해 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 1개의 활성제 및 2개 이상의 치료제를 함유하는 한 세트의 제제를 사용하여 환자의 암 세포에서 하나의 신호전달 경로의 기능적 활성을 평가하는 단계로서, 활성제 및 치료제 중 하나가 동일한 신호전달 경로에 결합하고 다른 치료제(들)가 상이한 신호전달 경로 또는 세포 위치에 결합하는 단계를 포함한다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
상기 샘플을 적어도 하나의 삼중항 세트의 제제와 동시에 접촉시키는 단계로서, 각각의 삼중항 세트가 제1 제제 표적화된 치료제, 제1 제제가 다뤄지는 것으로 의도된 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 제2 제제 활성제 및, 제1 제제와 상이한 신호전달 경로 또는 제1 제제가 영향을 주는 신호전달 경로내 상이한 위치에 영향을 주는 제3 제제 표적화된 치료제를 포함하며, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 제1 제제가 영향을 미치는 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉한 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제 단독, 제2 제제 활성제 단독, 또는 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제 단독, 제2 제제 활성제 단독 또는 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제제의 삼중항 세트와 접촉된 샘플내에서 일어나는지의 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 상기 제1 제제 표적화된 치료제가 치료적으로 활성임을 나타내는, 사전-결정된 컷-오프 값보다 출력 값이 큰 경우, 제제의 삼중항 세트로부터의 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제, 제3 제제 표적화된 치료제 또는 제1 및 제3 제제 표적화된 치료제 모두이다. 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 제1 제제 및/또는 제3 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 상기 제1 제제 또는 제3 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
다양한 적합한 신호전달 경로, 활성제 및 표적화된 치료제가 본 명세서에 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
일 구현예에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다.
도 1은 비히클 대조군, 네라티닙 단독, 테포티닙 단독 또는 네라티닙 및 테포티닙을 조합투여한 C21 종양 세포를 이종이식한 마우스의 평균 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 세포(예를 들어, 암 세포) 내의 신호전달 경로 활성을 상세하게 조사하여 예를 들어 어떤 신호전달 경로가 정상적으로 활성 또는 비정상적으로 활성인지를 결정하는 능력을 제공하며, 시험된 경로 그룹 중으로부터의 신호전달 경로가 가장 활성적이며, 및/또는 신호전달 경로가 초-민감하다. 본 발명의 방법은 신호전달 경로의 활성에 대한 상세한 정보를 제공하기 때문에, 다양한 표적화된 치료제의 선택 및 치료 용도(즉, 투여)가 가능하다. 상기 방법이 신호전달 경로 자체의 상태를 평가하기 때문에, 치료 용도로 선택된 표적화된 치료제가 시험관내 방법으로 시험되는 동일한 표적화된 치료제일 필요는 없다. 오히려, 시험된 표적화된 치료제(예를 들어, 신호전달 경로내 동일하거나 상이한 지점)와 동일한 신호전달 경로를 표적화하는(예를 들어, 선택적으로 영향을 주는) 표적화된 치료제도 치료 용도로 선택될 수 있다. 더욱이, 신호전달 경로는 다수의 수렴 지점, 누화 및 피드백 루프, 및 경로 사이의 예기치 않은 동반상승 효과로 상호연결될 수 있으므로, 본 발명의 방법은 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치지만 경로내 상이한 지점 또는 결합 부위에 있는 표적화된 치료제 및 활성제 제제의 스크리닝을 허용하여, 그에 의해 표적화된 치료제로 치료적 중재를 위해 표적화하는 신호전달 경로 내의 가장 적절한 지점 또는 결합 부위를 결정할 수 있다.
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명을 통해 제시된다.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원, 공개 출원 및 다른 공보들은 전체적으로 참고로 편입된다. 본 부문에 제시된 정의가 본원에 참고로 편입된 특허, 출원, 공개 출원 및 다른 공보들에 제시된 정의와 상반되거나 그렇지 않으면 일치하지 않는 경우, 본 부문에 정의된 정의는 본 명세서에 참고로 편입된 정의를 우선한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 하기 정의를 갖도록 의도된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 대략, 정도로, 거의 또는 주위를 의미한다. 용어 "약"이 수치 범위와 관련하여 사용되는 경우, 제시된 수치의 위 및 아래 경계를 확장함으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 언급된 값의 위 및 아래의 수치를 10%의 변동으로 변경시키기 위해 사용된다. 일 양태에서, 용어 "약"은 사용되는 수의 수치의 ±20%를 의미한다. 따라서 약 50%는 45% ~ 55%의 범위를 의미한다. 여기에서 종점으로 인용된 수치 범위는 해당 범위 내에 포함된 모든 숫자와 분수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함함).
세포에 대한 참조와 함께 사용되는 경우 용어들 "활성제", "활성화하는", "활성화", "교란", "교란하는" 및 "작은 변화"는 시약, 승인된 의약품, 개발 중인 실험적 화합물 및 약물 유사 분자 및 실험적 약물, 유기 분자, 성장 인자, 신호전달 인자, 생화학물질, 핵산, 사이토카인, 케모카인, 또는 당업계에서 실시된 것으로 잘 알려진 세포에 대하여 효과를 갖는 단백질을 사용하여 세포의 생리적 조작의 특정 대상 또는 활성을 지칭한다. 상기 조작은 세포 생리 활성의 임의의 조절을 의미하며, 비제한적으로 상향 또는 하향-조절을 포함할 수 있다. 활성제 제제 또는 교란제는 추가로 하기 단일 제제 또는 이들의 조합물: 구성원 및 구성원의 조합 또는 이들 구성원 또는 하기 목록으로부터의 구성원의 조합을 비제한적으로 포함하는 특정 성장 인자: 혈관 내피 성장 인자, 포스파티딜 이노시톨, 표피 성장 인자 및 EGF 펩타이드 서열을 갖는 인자, 간세포 성장 인자, m-CSF, RANK 리간드, 종양 괴사 인자(TNF-α), 인슐린 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 간세포 성장 인자, 뉴레굴린 또는 신경 레굴린(regulins), 헤레굴린 및, 수용체의 ErbB 계열과 연관된 인자, 에스트로겐 및 그것의 호르몬 전구체 및 열화 생성물 (Ex. DHEA, 에스트론, 안드로스테네디온), 프로게스테론, 테스토스테론, 폴레이트, 아데노신 삼인산, AMP, 환형 AMP, 및 FAS 리간드, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 또는 환자 세포(특히 섬유모세포 및 상피세포)로부터 유래된 대상체의 혈장 또는 혈청 또는 상청액 분획과 같은 작은 변화의 세포 경로 또는 신호전달의 다른 제제, Na+, K+, Mg+, Cl-, Ca+2, 글루코스, 글루타민, 히스티딘, 만니톨, 및 트립토판, 항생제(라파마이신), 필수적인 및 비-필수 아미노산, 비타민, 다른 유기 화합물, 미량 미네랄 및 무기 염, 나트륨 세포레나이트, 혈청, 세포 추출물, 분별된 세포 추출물 또는 분별된 혈청, 세포외 신호전달 인자, 세포내 신호전달 인자, 인슐린, 트랜스페린, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 포스포포릴에탄올아민, 트리아이오도티로닌, 나트륨 피루베이트, 미토겐, 옥시토신, 이소프로테레놀, L-글루타민을 비제한적으로 포함할 수 있다.
용어 "접착"은 세포를 ECM 또는 다른 세포에 직접적으로, 간접적으로 및/또는 경로 통신에 의해 간접적으로 연결시키는 것을 담당하는 임의의 수의 분자를 포함하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인테그린은 세포골격 조직화, 세포 운동성, 세포주기의 조절, 인테그린 친화성 세포의 조절, 바이러스에 세포의 부착, 다른 세포 또는 ECM에 세포의 부착에 대한 책임이 있다. 인테그린은 또한 세포가 한 종류의 신호 또는 자극을 또 다른 세포내 및 세포간에 변형시키는 과정인 신호 형질도입을 담당한다. 인테그린은 ECM으로부터 세포로의 정보 및 세포로부터 다른 세포로 (예를 들어, 다른 세포상의 인테그린을 통해) 또는 ECM으로 정보를 형질도입할 수 있다. α- 및 β-서브유닛의 조합은 인테그린의 리간드 특이성을 결정한다. 많은 인테그린은 동일한 리간드에 대한 결합 특이성을 가지며, 그것은 인테그린 발현/활성화 패턴의 조합 및 생체내 상호작용을 구체화하는 리간드의 이용가능성이다. 접착력은 세포의 세포면적 또는 모집단 영역내 밀도를 변화시킬 수 있다. 접착력은 세포 또는 세포 모집단 내에서 양을 변화시킬 수 있다. 접착력은 접착 과정과 관련된 특이성 또는 단백질 유형에 의해 품질을 변화시킬 수 있다. 접착력은 극성을 변화시킬 수 있다.
용어 "분석" 또는 "분석하는"은 예를 들어 외인성 자극(예를 들어, 치료제 또는 리간드)으로 활성화시 세포의 광학적 또는 생체 임피던스 반응과 같은 표적의 존재, 부재, 양, 범위, 동력학, 동역학 또는 유형을 결정하기 위한 분석을 지칭한다.
용어들 "부착하다" 또는 "부착"은 예를 들어, 물리적 흡수, 화학 결합, 화학적 인력 및 유사한 프로세스, 또는 이들의 조합에 의해 표면에 연결된, 본 발명의 표면 개질제 물질, 세포, 리간드 후보 화합물 및 유사 독립체를 지칭한다. 특히, "세포 부착", "세포 유착" 또는 "세포 샘플 부착"은 배양 또는 세포 고착 물질 등과의 상호작용에 의한 세포의 결합 또는 표면과의 상호작용을 지칭한다.
용어 "부착 패턴"은 표면에 대한 세포 또는 세포 샘플의 관측가능한 특성 또는 연결 특성을 의미한다. 부착 패턴은 정량적일 수 있으며, 예를 들어, 부착 부위의 수일 수 있다. 부착 패턴은 또한 정성적일 수 있으며, 예를 들어 세포외 기질에 대한 바람직한 분자 부착 부위일 수 있다.
용어 "세포 부착 신호(Cell Attachment Signal, CAS)"는 마이크로플레이트의 웰에 놓고 임피던스 바이오센서로 분석했을 때 세포에 의해 생성된 세포 부착의 정량적 측정을 지칭한다. 전형적으로, 임의의 제제가 없는 세포의 CAS는 특정 신호전달 경로에게 영향을 주는 활성제 제제 단독의 존재하에 세포의 CAS 및/또는 특정 신호전달 경로의 특이적 억제제와 조합하여 특정 신호전달 경로에게 영향을 주는 활성제 제제의 존재하에 세포의 CAS와 비교될 수 있다. 전형적으로 세포의 CAS는 옴 단위로 측정된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 항체 단편을 포함한다.
항체는 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있으며, 이들의 항원-결합 단편일 수 있다. "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 다중특이적 항체, 예컨대 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 항체를 포함한다. "기능적 단편"은 실질적으로 전장 항체의 항원에 대한 결합을 유지하고 생물학적 활성을 유지한다. 항체는 개별 약물 분자가 별도로 달성할 수 있는 것보다 더 큰 효력, 특이성 및 효능을 달성하기 위해 공유 결합 또는 다른 부착을 통해 하나 이상의 다른 약물과 배합시킴으로써 "아암" 또는 "접합"될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "확인 제제"는 본 명세서에 기재된 x테스트에서 사용되는 관심 경로 활성을 파괴시키거나 영향을 미치는 것으로 알려진 소분자, 공지된 기능의 특이적 리간드, 또는 항체 또는 친화성/특이성 시약을 지칭한다. 이것은 테스트에 사용되어 활성제 제제가 관심 경로 활성과 직접 관련이 있는 활성을 구체적으로 개시하는 세포 샘플에 도입될 때 발생하는 특이적 작용 기전과 연관된 경로 활성의 양을 확인하고 정량화한다. 예를 들어, 활성제가 세포 표면 수용체에 대한 공지된 리간드인 경우, 확인 제제의 도입 후에 변경되는 본 명세서에 기재된 방법으로 측정된 활성은 이 방법이 분석하고자 하는 경로와 관련된 활성의 양을 나타낸다. 추가의 예에서, 리간드 결합 영역, 수용체 이량체화 영역 및 수용체 티로신 키나제 영역으로 이루어진 수용체의 경우에서와 같이, 활성제 제제는 수용체 리간드 결합 부위에 결합하는 리간드일 수 있다. 확인 제제는 리간드 결합에 앞서 또는 리간드 결합 후에, 즉 수용체 이량체화 또는 수용체 티로신 키나제 활성을 수용체 이량체화 이후에 방지하는 제제일 수 있다. 또한, 확인 제제는 관심 환자에게 활성화되거나 기능이상이 있는 다운스트림 신호전달 경로의 특정 부분을 정제하는 제제일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질 한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 모집단의 개별 항체가 동일한 모집단으로부터의 항체를 지칭한다. 단클론성 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 지향된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 포함하는 종래의 (다클론성) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지향된다. 개질제 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체 모집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "면역캡쳐 시약(immunocapture reagents)"은 임의의 유형의 항체를 지칭하며, RNA, DNA 및 염기의 합성 변이체를 함유하는 폴리머로 구성된 압타머, 또는 압타머 또는 시약이 제작되고 선택되어 또 다른 분자, 양, 및 또는 품질을 특이적으로 인식하고 결합시킨다.
용어 "배양"은 본 발명을 수행하기 위한 세포의 제조를 지칭한다. 상기 제제는 본 발명의 실시에 있어서 상이한 시간, 다양한 배지, 배지 보충물, 온도, 습도, CO2%, 종자 밀도, 세포 유형 순도 또는 혼합물의 다양한 조건 및 세포 배양의 당 분야의 당업자에게 공지된 다른 조건을 포함할 수 있다. 준비에는 세포가 번식하고, 휴지기가 되고, 노화되고, 및 세포주기의 여러 단계에서 진입, 합격 또는 확인되는 조건이 포함될 수 있다. 배양은 당업계에서 실시된 것으로 알려진 임의의 수의 배지 또는 보충물, 예컨대 비제한적으로 본 발명의 이상적인 실시를 허용하고 최적화하는, 비타민, 사이토카인, 성장 인자, 혈청(예시적인 공급원 동물이 소, 태아 소, 인간, 말 또는 다른 포유동물임), 대사물, 아미노산, 미량 미네랄, 이온, pH 완충액 및/또는 글루코스를 포함할 수 있다. 세포 배양은 본 발명에 의한 활성화 전 또는 후에 무혈청 및/또는 활성제없는 배지로 실시될 수 있다. 배양은 이상적으로 환자의 종양 미세환경을 모방하도록 설계된 조건을 포함할 수 있다. 배양 제제는 이상적으로 경로 활성의 효능작용 또는 길항작용의 측정을 허용하기 위해 특정 경로를 기저 또는 고조된 수준으로 위치시키도록 설계된 조건을 포함할 수 있다.
용어 "기본 배지"는 무기 염, 필수 아미노산, 글루코스, 비타민 및 pH 완충액을 잘 정의된 양으로 함유하는 배양 배지의 유형을 지칭하며, 이 방법은 분석을 위해 의도된 신호전달 경로를 자극하는 제제를 함유하지 않는다. 많은 기본 배지는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 DMEM, F12, MEM, MEGM, RPMI-1640 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, ErbB 신호전달 경로를 분석할 때, 기본 배지에는 ErbB 경로를 교란시키는 것으로 알려진 시약이 함유하지 않는다. 기본 배지는 세포 모집단이 생존가능하게 유지되고, 개별 세포 유형의 불균질성 및 세포주기의 다른 단계를 나타내는 세포의 정상적인 분포를 보유하도록 세포 배양을 유지하는데 사용된다. 이것은 이환 세포 샘플이 활성제 제제와 접촉하는 방법의 단계 바로 전에 본 명세서에 기재된 방법으로 대상체로부터 수득된 이환 세포 샘플을 배양하는데 사용된다.
물질에 적용될 때 용어 "신선한"은 아직 사용되지 않은 물질을 지칭한다. 따라서 신선한 기본 배지는 아직 사용되지 않은 기본 배지이다. 신선한 배지는 세포 배양액을 함유하는 용기에서 기본 배지의 용적을 증가시키기 위해 기본 배지에서 이미 배양된 이환 세포 샘플을 함유하는 용기에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 혈관내 이환 세포 샘플을 배양하는데 사용된 기본 배지의 일부는 세포 배양 용기로부터 제거되어 새로운 기본 배지로 대체될 수 있다. 두 경우 모두 세포 배양 용기의 총 기본 배지의 50% 이상이 신선한 기본 배지일 때 세포 배양 용기는 신선한 기본 배지를 함유하는 것으로 간주된다. 장시간(예를 들어, 72시간 이상) 동일한 기본 배지에서 배양된 세포는 개별 세포 유형의 불균질성을 잃어버릴 것이며, 세포의 대부분은 신호전달 경로 활성의 측정을 방해할 수 있는 G0/G1 세포주기 단계에 들어갈 수 있다. 새로운 배지에 배치된 세포 샘플은 새로운 배지에 맞추기 위해 일정 시간(예를 들어, 적어도 12시간)을 필요로 하므로, 세포 샘플은 최초 세포 샘플에서 발견된 개별 세포 유형의 불균질성과 세포주기의 상이한 단계를 나타내는 세포의 정상적인 분포를 반영한다.
용어 "완충액"은 pH 완충액과 등장액을 함유하는 용액을 지칭한다. 완충액은 전형적으로 세포 샘플을 굶기거나 세포가 휴지기 또는 노화에 들어가도록, 예컨대 세포가 세포주기 G0/G1에 있을때 사용된다.
"키메라" 항체(면역글로불린)는 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 중쇄 및/또는 경쇄의 부분을 함유하는 반면, 그러한 항체의 단편이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 사슬의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 상기 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동이다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된 항체"는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수령체 항체의 가변 도메인 초가변성 영역 잔기가 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 원하는 특이성, 친화성, 및 수용력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류로부터의 초가변성 영역으로 대체된 인간 면역글로불린(수용체 또는 수용체 항체)이다. 초가변성 영역은 서열에 의해 정의된 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, Kabat 1991, 1987, 1983 참고) 또는 구조에 의해 정의된 초가변성 루프(HVL)(예를 들어, Chothia 1987 참고), 또는 둘 모두일 수 있다.
"생체분자 코팅"은 자연 발생 생체분자 또는 생화학적 분자, 또는 하나 이상의 자연 발생 생체분자 또는 생화학물질로부터 유래된 생화학물인 분자를 포함하는 표면 상의 코팅이다. 예를 들어, 생체분자 코팅은 세포외 기질 성분(예를 들어, 파이브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 다른 당단백질, 펩타이드, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 빈트로넥틴, 세포간 CAMs, 혈관 CAMs, MAdCAMs), 또는 그의 유도체를 포함할 수 있거나, 자연 발생 생화학물질 라이신 및 오르니틴을 기반으로 하는 중합체 분자인, 생화학물, 예컨대 폴리라이신 또는 폴리오르니틴을 포함할 수 있다. 아미노산과 같은 자연 발생 생화학물질에 기반을 둔 중합체 분자는 자연 발생 생화학물질의 이성질체 또는 거울상 이성질체를 사용할 수 있다. 코팅물은 또한 세포 표면 수용체 또는 세포 표면 동족 결합 단백질 또는 상기 세포 표면 단백질에 대한 친화성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "기준선 측정"은 시험되는 세포의 세트에 대한 생리적 시작점을 지칭하며, 약물을 첨가하기 전의 일정 기간 동안의 측정 평과를 기반으로 한다. 이것은 외인성 활성화 전에 기저 세포 대사 측정 또는 CReMS 판독을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이는 외인성 활성화가 있거나 없는 정상적인 건강한 세포 대사 기능의 CReMS 측정을 비제한적으로 포함한다.
용어 "세포 반응 측정 시스템" 또는 "CReMS"는 세포, 세포내 및 세포간, 세포와 계측 장치 간의 생리적 또는 세포 반응 파라미터의 변화를 정량적으로 측정할 수 있는 장치를 지칭한다. 구현예에서, 세포는 전체 표지없는 세포이다. 생리적 또는 세포 반응 파라미터의 변화는 피분석물, 예컨대 글루코스, 산소, 이산화탄소, 아민함유 물질, 예컨대 단백질, 아미노산 또는 세포외 기질 또는 세포 신호전달 분자, 또는 세포 증식, 세포 형태 또는 세포골격 재배열의 변화를 측정함으로써 측정된다. CReMS의 예로는 바이오센서가 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "CReMS 신호"는 세포가 화학-전기 CReMS에 의해 분석될 때 세포의 세포 생리적 변화의 척도로서 정의된다. CReMS 신호 및 CReMS 신호의 변화는 생리적 변화를 측정하는 특정 화학-전기 변환기와 관련하여 다양한 유닛을 가질 수 있다. 예를 들어, CReMS 신호는 비제한적으로, 세포 지수, 임피던스, 파장 단위, pH 단위, 전압, 전류 단위를 가질 수 있거나, 단위의 비율을 사용하여 무차원이 될 수 있다. 임의의 이들 유닛들은 시간 성분을 가질 수 있다. CReMS 신호는 생물학, 생화학 및 생물물리학 분야에서 당업자들에 의해 빈번하게 행해지는 해석을 명백하게 하기 위해 수학적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어 정규화, 기준선화, 곡선 뺄셈 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. CReMS 신호는 단일 시점, 또는 더욱 바람직하게는 세포 생리적 반응의 완전한 패턴을 나타내는 연속적인 일련의 시점에 걸쳐 측정될 수 있다.
용어 CReM "광학 신호"는 이 광자 결정 바이오센싱 CReMS에서 반사되어 세포가 정지할 때 측정된 파장 값 또는 파장 값의 변화로 정의된다. 변경 비율이 보고되면 무 차원이 될 수도 있지만, 단위는 전형적으로 피코미터(picometers) 또는 나노미터이다. "광학 신호"는 시간과 결합된 상기 단위로 표현될 수 있다. 빛의 반사 파장의 변화는 광자 결정 표면의 질량에 비례한다. 따라서, "광학 신호"는 CReMS의 세포 수를 정량적으로 측정한 것이다. 게다가, "광학 신호"는 예를 들어 세포 형태 변화, 세포 유착, 세포 생존력, 세포의 구조적 재배열이 파장 변화로 검출된 센서상의 질량 양의 차이로 이어지는 것과 같이 세포 생리적 상태의 척도이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 지수"는 임피던스의 측정치로서 정의되며, 예를 들어 10 kHz 및 고정된 전압의 고정 전기 주파수에서 측정함으로써 본 발명의 일례에 적용될 수 있다.
그리고, 하기 식에 의해 계산됨: 세포 지수i = (Rtn - Rt0)/F
식 중:
i = 1, 2 또는 3 시점
일례로, 기기가 10 kHz 주파수에서 작동할 때 F = 15 ohm,
Rt0는 시점 T0에서 측정된 배경 저항이다.
Rtn은 세포 첨가, 세포 생리 변화 또는 세포 활성화 후의 시점 Tn에서 측정된 저항이다.
세포 지수는 세포 상태를 나타내는, 측정된 전기 임피던스의 상대적 변화로서 유래된 무차원 파라미터이다. 세포가 존재하지 않거나 전극에 잘 부착되지 않으면, CI는 0이다. 동일한 생리적 조건 하에, 전극에 더 많은 세포가 부착되면, CI 값이 더 크다. 따라서 CI는 웰에 존재하는 세포 수의 정량적 측정 값이다. 또한, 세포 생리적 상태, 예를 들어 세포 형태, 세포 유착 또는 세포 생존력의 변화는 CI의 변화로 이어질 것이다.
용어 "측정량"은 임상 테스트에서 측정하고자 하는 양으로 정의된다. 본 명세서에 기재된 본 발명에 있어서, 측정하고자 하는 양은 활성화에 대한 세포의 생리적 반응의 변화이다. 활성화에 대한 세포의 생리적 반응 측정의 변화는 다양한 유클리드 수학 분석법을 사용하여 수학적으로 결정될 수 있으며, 정량적 테스트의 경우 수치로 보고되거나 정성적 테스트의 경우에는 양성 또는 음성 결과로 보고될 수 있다. 정량적 및 정성적 테스트 모두에서, 측정량(예를 들어, 테스트 결과)은 상이한 임상 결정 또는 해석이 이루어지는 값 이상 및 이하의 컷-오프 값과 비교된다.
용어 "출력 값"은 측정량의 한 유형이며, 선택적으로 신호전달 경로에 영향을 미치는 하나 이상의 활성제 제제 및/또는 활성제 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 하나 이상의 치료제와 접촉한 대상체의 생존가능한 세포 샘플에서 일어나는 세포 유착 또는 부착의 측정과 같은 CReMS 신호의 차이를 지칭한다. 출력 값은 일정 기간에 걸쳐 수득된 CReMS 신호의 다양한 유클리드 수학적 분석을 사용하여 도출될 수 있으며, 정량적 테스트의 경우 수치로 보고되거나, 정성적 테스트의 경우 양수 또는 음수 결과로 보고될 수 있다. 예를 들어, 활성제 제제 단독과 접촉된 대상체의 세포 샘플은 1,000 단위의 CReMS 신호를 생성할 수 있고, 활성제 제제 및 치료제와 접촉된 동일한 대상체의 세포 샘플은 100 단위의 CReMs 신호를 생성할 수 있다. 이 실시예에서의 출력 값은 활성제 제제 단독과 접촉된 세포 샘플 및 활성제 제제 및 치료제와 조합하여 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위의 차이인, 900 CReMS 신호 단위와 동일할 것이다. 정량적 및 정성적 테스트 모두에서, 출력 값(예를 들어, 테스트 결과)은 다른 임상적 결정 또는 해석이 이루어지거나 그 이하의 컷-오프 값과 비교될 수 있다.
용어 "출력 값 백분율"은 하나 이상의 활성제 제제 또는 하나 이상의 치료제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 하나 이상의 활성제 제제 및 활성제 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 하나 이상의 치료제와 접촉된 환자 세포 샘플의 생존가능한 세포 샘플에서 발생하는 CReMS 신호의 변화율을 지칭한다. 예를 들어, 활성제 제제 단독과 접촉된 대상체의 세포 샘플은 1,000 단위의 CReMS 신호를 생성할 수 있고, 활성제 제제 및 치료제와 접촉된 동일한 대상체의 세포 샘플은 100의 CReM을 생성할 수 있다. 출력 값 백분율은 실시예에서 90%이며, 이는 활성제 제제 단독과 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위로 나눈, 활성제 제제 및 치료제 조합과 접촉된 세포 샘플 및, 활성제 제제 단독과 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위에 있어서의 차이이다. 정량적 및 정성적 검사 모두에서 출력 값 백분율은 컷오프 값 백분율과 비교될 수 있으며, 그 위에서, 및 그 아래에서 상이한 임상적 결정 또는 해석이 이루어질 수 있다.
용어 "기저 형태"는 제제, 활성제 또는 자극제를 도입하기 전에 세포 또는 세포 샘플의 형태 및 구조를 지칭한다.
용어 "세포 유착"("세포 접착", "세포 부착" 또는 "세포성 부착"과 상호 혼용하여 사용됨)은 세포와 다른 세포의 결합, 세포외 기질 성분과의 결합 또는 표면(예를 들어, 미세적정기 플레이트)과의 결합을 지칭한다.
용어 "바이오마커"는 가장 일반적인 의미에서 세포 또는 환자의 건강 상태 또는 질환 상태의 생물학적 척도를 지칭한다. 일반적인 바이오마커의 비-제한적인 목록은 포유동물에서 발견되는 생물학적으로 유도된 분자, 포유동물 세포 또는 조직의 생물학적 활성, 유전자 복제 수, 유전자 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 유전자 발현 수준, mRNA 수준, 스플라이스 변이체, 전사 변형, 후-전사 변형, 에피-유전자 변형, 세포 표면 마커, 단백질 또는 핵산(모든 형태의 기능적 RNA를 포함함)의 차별적인 발현, 핵산 증폭, 세포 형태, 번역후 변형, 단백질 절단, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 탈-유비퀴틴화, 대사물, 임의의 생합성 단계에서의 호르몬, 사이토카인, 케모카인 및 이들의 조합을 포함한다. 바이오마커의 서브셋은 병리학자가 질환을 진단하고 의사가 치료를 처방하는 것을 돕기 위해 진단 및 치료 선택 목적으로 사용된다. 바이오마커는 전형적으로, 고정된, 실장된 조직에서 유전자 복제 수, 유전자 돌연변이, 또는 단백질의 상태 또는 활성을 명시하지 않은 단백질의 수준을 측정한다. 본 발명은 살아있는 환자 세포 샘플로부터의 활성 또는 동적 결과인 생리적 반응 파라미터인 바이오마커의 새로운 유형을 포함한다.
용어 "바이오마커 상태"는 환자 또는 환자의 세포에서 바이오마커(들)의 평가를 지칭하며, 전형적으로 바이오마커가 존재할 때 "바이오마커 양성" 또는 바이오마커가 없는 경우 "바이오마커 음성"으로 보고된다. 단백질 수용체가 바이오마커(예를 들어, HER2/ErbB2 또는 ER)로 사용될 때, 바이오마커 양성 결과는 또한 과발현되거나 증폭되는 수용체라고도하며, 바이오마커 음성 결과는 정상적으로 발현된 또는 비-증폭된 수용체로 칭한다. 바이오마커 또는 바이오마커 시그니처가 질환 진행의 예후 지표이거나 치료 효능을 예측하는 질환의 경우, 현재의 임상 실시는 바이오마커 또는 그의 관련 돌연변이의 양의 측정에 의존하여 환자를 바이오마커 음성 또는 양성으로 분류함으로써 환자 진단을 개선한다. 환자를 치료하기 위해 약물 치료제의 선택을 안내하기 위해 종종 바이오마커 상태의 결정이 사용된다. 바이오마커 양성 및 바이오마커 음성 환자를 구별하는데 사용되는 바이오마커 측정의 컷오프 값은 바이오마커에서 바이오마커까지 다양하다. 바이오마커가 약물 표적 일 때, 컷오프 값은 그 이상에서는 환자가 바이오마커를 표적으로 하는 치료제를 받고, 그 이하에서는 환자가 바이오마커를 표적으로 하는 치료제를 받지 못하는 조건이다. 임상 시험은 전형적으로 바이오마커의 임상적 관련성을 확인하는데 요구된다.
용어 "바이오센서"는 세포의 피분석물 또는 피분석물 변화 또는 세포의 생리 조건의 변화를 측정하는 디바이스를 지칭한다. 구현예들에서, 바이오센서는 전형적으로 3개의 부분을 포함한다: 피분석물(비제한적인 예, 예컨대 세포외 기질, 세포 신호전달 분자, 또는 세포 증식, 조직, 세포, 대사물, 이화대사물, 생체분자, 이온, 산소, 이산화탄소, 탄수화물, 단백질 등)를 결합 또는 인식하는 생물학적 성분 또는 요소, 검출기 요소(광학, 압전, 전기 화학, 온도계 또는 자기와 같은 물리화학적 방식으로 작동) 및 두 성분과 관련된 변환기.
용어 "광학 바이오센서"는 빛의 형광, 흡수, 투과율, 밀도, 굴절률 및 반사를 측정하는 디바이스를 지칭한다. 구현예들에서, 광학 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서의 분자 인식 또는 분자 활성화 이벤트를 정량화가능한 신호로 변환하기 위한 광학 변환기를 포함할 수 있다. 또한, 구현예는 광결정 디바이스, 광학 도파관 디바이스 및 표면 플라즈몬 공명 디바이스를 포함할 수 있다.
용어 "임피던스 바이오센서"는 임피던스(Z)가 옴의 법칙(Z = V/I)에 의해 기재된 바와 같이 전압 대 전류의 비율과 관련된 실제 환자 세포의 복잡한 임피던스 변화(델타 Z 또는 dZ)를 측정하는 디바이스를 지칭한다. 그것은 세포와의 전극 인터페이스에서 국소 이온성 환경에 민감하고, 전압 및 전류 변동의 함수로서 이러한 변화를 감지한다. 정상적인 기능 또는 그의 활성화의 결과로서의 세포의 생리적 변화는 전극 주변의 전류 흐름에 대한 정량화가능한 변화를 초래하고, 측정된 신호의 규모 및 특성에 영향을 미친다. 구현예들에서, 임피던스 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서의 분자 인식 또는 분자 활성화 이벤트를 정량화가능한 신호로 변환하기 위한 전극 또는 전기 회로를 포함할 수 있다. 구현예에서, ISFET 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서의 피분석물 인식 또는 세포 활성화 이벤트를 정량화가능한 신호로 변환하기 위한 이온 선택적 전계 효과 전기 변환기를 포함할 수 있다. ISFET 바이오센서내 피분석물 농도가 변하면, 트랜지스터의 전류가 변화하여 정량화 신호가 생성된다.
용어 "세포 신호전달"은 세포내 또는 세포간 정보 전달을 지칭한다. 세포 신호전달은 세포 사이의 직접적인 접촉 또는 다른 세포에 의해 흡수되는 한 세포로부터의 물질 방출에 의해 달성될 수 있다. 세포간 신호전달은 두 분자(예를 들어, 리간드 및 수용체) 사이의 상호작용을 통해 일어날 수 있다. 수용체 결합은 세포내 신호전달(예를 들어, 세포내 생화학적 변화의 개시 또는 막 전위의 변형)의 캐스케이드를 유발할 수 있다.
용어 "신호전달 경로"는 세포 표면 수용체, 핵 수용체, 신호 조절 단백질 및 세포내 신호전달 성분을 포함하여, 세포내 또는 세포간 정보 통신 또는 전달에 관련된 일련의 세포 성분을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특정 "신호전달 경로"는 세포내 신호전달의 캐스케이드를 유발하는 세포 표면 수용체에 따라, 또는 세포내 신호전달에 관련된 임의의 성분에 따라 명명될 수 있다. 예를 들어, EGFR에 대한 EGF의 결합은 MAPK 및/또는 PI3K를 포함할 수 있는 신호전달 경로 활성화를 개시한다. 따라서, 용어들 "EGFR 신호전달 경로", "MAPK 신호전달 경로" 및 "PI3K 신호전달" 경로 각각은 EGF와 EGFR의 결합에 의해 개시되는 신호전달 경로를 포괄하는데 사용될 수 있다.
용어들 "신호전달 활성", "경로 활성", "세포 신호전달 활성" 및 "신호전달 경로 활성"은 상호 혼용하여 사용되며, 신호전달 경로의 비정상적 또는 정상 기능 중에 발생하는 이벤트를 지칭한다. 신호전달 활성은 주로 하나의 세포 표면 수용체(예를 들어, EGF 경로를 개시하는 EGF 수용체)와 주로 연관된다. 그러나, 한 경로에서 신호전달 활성은 신호전달 경로의 세포 표면 수용체의 업스트림, 다운스트림 또는 측면에 있는 다른 신호전달 경로로부터의 경로 구성원과 관련된 신호전달 활성에 의해 유도될 수 있다. 이것은 여러 경로 수렴 지점, 경로 사이의 누화 및 경로 사이의 피드백 루프가 한 경로로부터의 신호전달 활성이 다른 경로의 신호전달 활성에 영향을 줄 수 있도록 하는 신호전달 활성의 상호연관성을 반영한다(Giulliano 등, 유방암에서 에스트로젠 수용체와 인간 표피 성장 인자 수용체 2 신호전달 경로 사이의 양방향성 누화: 분자 기반과 임상적 함축, 유방 관리 (Basel), 2013 Aug; 8(4): 256-262). 따라서 종양이 2개 이상의 상호연결된 경로로부터의 신호전달 활성에 의해 유도되는 암 환자는 비정상적으로 기능하는 경로의 활성화 지점과 다른 표적에 결합하는 표적 치료에 반응할 수 있다. 암의 특성과 복잡성으로 인해, 암 환자 신호전달 경로 기능이상은 건강한 정상 모집단에서는 통상적으로 기재되지 않은 다른 경로와의 고유한 상호연결을 포함할 수 있다.
용어 "HER 계열-관련된 신호전달 경로"는 HER 계열 수용체(HER1/ErbB1/EGFR, HER2/ErbB2, HER2/ErbB3 및 HER4/ErbB4)를 통한 신호전달과 관련된 세포내 신호전달 경로를 지칭한다. HER 계열 수용체 및 각각의 수용체에 결합하는 것으로 공지된 상응하는 리간드의 비-제한적인 예가 하기 표 1에 요약되어 있다:
Figure pct00001
HER2/ErbB2가 특정 리간드를 갖는 것으로 알려져 있지 않지만, 예를 들어, HER1/HER3 리간드를 조합하여 사용함으로써 HER2에 의한 신호전달 활성이 평가될 수 있다는 것은 당 업계에 공지되어 있다.
용어 "ER-관련된 신호전달 경로"는 ERα 및 ERβ를 포함하여 에스트로겐 수용체(ER)를 통한 신호전달과 연관된 세포내 신호전달 경로를 지칭한다. ER에 대한 공지된 리간드(ER의 알파 또는 베타 동형체에 대한 친화도가 다를 수 있음)는 에스트라디올, 에스트론, 랄록시펜, 에스트리올 및 게니스테인을 포함한다.
용어 "세포골격 조직화"는 세포의 내부 스캐폴드의 배열을 지칭한다. 세포의 세포골격은 세포질 또는 막 요소 및/또는 세포내 소기관을 지지하는 역할을 하는 필라멘트를 포함한다. 세포골격은 또한 세포의 형상을 유지하는데 도움이 된다.
용어 "세포 증식"은 세포 성장 및 세포 분열의 결과로서 세포 수의 증가를 지칭한다.
용어 "세포 생존"은 대사, 성장, 운동, 생식, 일부 형태의 반응성 및 순응성과 같은 특정 기능을 수행할 수 있는 능력을 특징짓는 세포의 생존력을 지칭한다.
용어 "효능"은 특정 개입이 유익한 결과를 생성하는 정도를 지칭한다. 구현예들에서, 개입은 치료제, 예컨대 소분자 또는 항체 또는 공지된 단백질에서 개입을 위한 높은 친화도 및 특이성을 갖는 유기 시약의 표적화된 펩타이드일 수 있다. 유익한 결과는 비제한적으로, 증상의 억제, 세포 성장의 감소, 세포 살상의 증가, 객관적인 종양 반응, 환자의 생존 기간의 증가, 환자의 무진행 생존 기간의 증가, 환자의 무병 생존 기간 증가, 염증의 감소 및 면역 반응의 증가를 포함한다.
"세포외 기질 성분"은 동물의 세포외 기질에서 발생하는 분자이다. 그것은 임의의 종 및 임의의 조직 유형의 세포외 기질의 성분일 수 있다. 세포외 기질 성분의 비-제한적인 예는 라미닌, 콜라겐, 파이브로넥틴, 다른 당단백질, 펩타이드, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸 등을 포함한다. 세포외 기질 성분은 또한 성장 인자를 포함할 수 있다.
용어 "전반적인 표현형"은 전체적으로 세포 또는 세포 샘플의 관측가능한 특성의 복수 또는 복합체를 지칭하고, 행동의 발달, 생화학적 또는 생리적 특성, 현상학, 행동 및 생성물을 반영한다. 전반적인 표현형은 비제한적으로, 세포 크기, 세포 형상, 특유의 돌출부, 결과물, 퍼짐, 부착 세포 밀도, 세포골격 배열, 세포 증식 패턴, 수용체 식균작용, 또는 부착 반점 수, pH 변화, 대사물의 흡수 또는 유출, 신호전달 단백질 및 성장 인자, 산소, CO2, 글루코스, ATP, 및 이온, 예컨대 마그네슘, 칼슘, 칼륨을 포함할 수 있다.
용어 "사건 특이성"은 세포의 특정 특성을 물리적으로 관측하는 것을 의미한다. 이러한 특정 특성은 특정 활성제 또는 치료제에 대한 세포의 의도된 및/또는 기대된 생리적 반응의 일부로서 특정 세포 기능, 외인성 활성화 또는 경로 효능작용/길항작용과 관련된다. 활성제 및 치료제는 세포골격 구조 또는 세포 경로와 같은 세포 기능의 특정 양태에 영향을 미치도록 표적화되는 것으로 알려질 수 있다. 물리적으로 관측가능한 사건은 활성제 또는 치료제의 존재하에 세포에서 물리적으로 관측가능한 사건이 세포상의 활성제 또는 치료제의 의도된 및/또는 기대된 효과를 반영하기 때문에, 사건 특이성(event specificity)이라고 불리운다. 예를 들어, 부착 바이오센서 유형의 CReMS에서 대부분의 세포 샘플에 빈블라스틴을 첨가하면 신호가 크게 감소한다. 빈블라스틴은 세포 세포골격 스캐폴딩 장애물질이다. 신호 감소는 세포 형상의 소실과 미세소관 분자에서의 약물 작용에 의해 야기된 부착과 관련이 있는 세포의 물리적으로 관측가능한 사건이다.
용어 "동반상승효과" 또는 "동반상승작용"은 두개 이상의 활성제 및/또는 두개 이상의 치료제로 세포 샘플을 테스트할 때 측정된 CReMS 신호, 출력 값 또는 출력 값 백분율이 세포 샘플이 활성제 제제 및/또는 치료제로 개별적으로 시험될 때 수득된 대응 측정치의 합보다 큰 테스트 결과를 지칭한다. 2개의 활성제 제제와 접촉된 세포 샘플에 2종의 치료제를 동시에 첨가하여 각각의 치료제가 2개의 동시 활성제 제제로 개별적으로 시험될때 수득된 CReMS 신호, 출력 값 또는 출력 값의 합보다 더 큰 CReMS 신호, 출력 값 또는 출력 값 백분율을 생성할 때 동반상승작용이 발생한다. 예를 들어, 세포 샘플에서, 세포 샘플의 부분이 활성제 제제 EGF 및 HGF의 조합으로 시험되고, EGFR 억제제 단독으로 시험된 후 측정된 출력 값은 250과 동일하다. 동일한 세포 샘플의 상이한 부분이 활성제 제제(EGF 및 HGF)와 HGFR 억제제만을 동일한 조합으로 시험될 때 출력 값은 150이다. 그러나, 동일한 세포 샘플의 상이한 부분이 활성제 제제 EGF 및 HGF 및 EGFR과 HFGR 억제제의 조합으로 시험된 후 측정된 출력 값은 900이며, 또는 각각의 억제제가 2개의 활성제 제제로 단독으로 시험된 테스트로부터의 2개의 출력 값의 합(250 + 150)보다 500 더 크다. 두 치료제를 개별적으로 검사하지 않고 조합하여 시험했을 때 수득된 더 높은 출력 값은 두 치료제가 활성제 제제로 활성화된 신호전달 경로에 대해 동반상승작용 억제성 효과를 가짐을 시사한다. 동반상승효과는 따라서 신호전달 경로가 단독으로 활성화되거나 억제될 때 관측될 수 없는 세포 신호전달 활성의 변화를 설명한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "임피던스"는 방정식: 임피던스(옴) = 전압(볼트)/전류(암페어) 또는 Z = V/I에 의한, 전압 및 전류와 관련된 물리 법칙으로 정의된다.
치료 또는 치료의 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완동물, 예컨대개, 말, 고양이, 소 등을 포함하여 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
용어 "마이크로캔틸레버 디바이스", "마이크로캔틸레버 어레이" 또는 "마이크로캔틸레버 장치"는 적어도 하나의 캔틸레버, 그의 용도에 따라 바-형상, V-형상 또는 다른 형상을 가질 수 있는 가요성 빔을 포함하는 CREMS 기기의 유형을 지칭한다. 마이크로캔틸레버의 한쪽 끝은 지지대에 고정되고 다른 쪽 끝은 자유롭게 세운다. 마이크로캔틸레버는 자연 공명 주파수와 매칭될 수 있는 위상차 신호를 검출하기 위해 전기 방법을 사용하여 농도를 측정할 수 있다(2000년 3월 28일자 미국 특허 제6,041,642호에 기재된 예, 참고로 편입됨). DNA, RNA 또는 단백질과 같은 거대분자 생체분자와 같이 공지된 분자가 배치된 마이크로캔틸레버의 공명 특성의 변화를 이용하는 표적 종의 농도 측정. 편향은 광학 및 압전 방법을 사용하여 측정된다.
용어 "정상 기능"은 신호전달, 복제, 접촉 억제 손실 및 비정상적인 유전자 복제 및 증폭의 비천연 수준으로부터 세포가 기능을 상실하는 것을 방지하는 확인 및 균형의 정의된 시스템을 갖는 세포내 경로를 지칭한다. 많은 경우에, 일부 휴지기 또는 안정된 기초 상태에서 시작하는 경로로, 경로 구성원의 EC50 농도에서 소량의 활성제를 첨가하면 세포 시스템이 활성제를 인식하고 경로 활성을 개시한 다음 활성제 효과를 하향조절하여 다른 세포 기능과 균형을 유지함에 따라 작은 일시적 효과만 가질 것이다. 이환 기능은 종종 활성제에 대한 과도 반응, 경로에 따른 하이퍼/하이포 활성, 활성제 효과를 수용하기 위한 부적절한 경로간 활성 및 최소 활성제 효과를 하향조절하지 못하는 것으로 인식될 수 있다. 또한, 일부 이환 상태로는 일부 경로 구성원의 기본 상태가 경로로 도달할 수 없다. 이러한 시스템은 구성적으로 활성화된 것으로 설명된다.
용어 "정상적인 기준 간격"은 건강한 대상체(예를 들어, 관심 질환이 없는 사람)의 모집단으로부터 수득된 값의 명시된 백분율을 둘러싸는 것으로 추정되는 2개의 숫자, 상한 및 하한 참조 한도를 포함하는 간격과 그 사이의 간격으로 정의된다. 대부분의 피분석물에 대해, 기준 하한과 상한은 각각 기준 모집단에 대한 테스트 결과 분포의 2.5번째 및 97.5번째 백분위 수로 추정된다. 어떤 경우에는 단 하나의 의학적 중요성이 있는 참조 한도가 하나뿐이며, 일반적으로 상한은 97.5번째 백분위 수이다. 기준 간격의 한도의 추정치에 대한 신뢰 구간은 기준 모집단의 랜덤 샘플링 - 일반적으로 약 120명의 기준 대상체를 가정하여 구성될 수 있다. 각각의 신뢰 구간의 폭은 관측된 기준값의 분포뿐만 아니라 기준 대상체의 수에 따라 달라진다.
정상적인 기준 범위 컷오프는 기준 개체 선택 과정, 그 기준 개체에 적용된 분석 방법에 의해 결정되고 설정되며, 임상 실험실 표준 연구소 승인 지침 EP28-A3C "임상 실험실의 기준 간격 정의, 설정 및 확인"에 의해 정의된대로 데이터 수집 및 분석으로 결론지어지며, 그의 내용물은 전체적으로 참고로 편입된다.
일 구현예에서, 기준 개체는 질환, 특히 모든 형태의 암이 없는 개체일 것이다. 정상적인 기준 간격은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 정상 기준 개체를 시험함으로써 결정될 것이다. 정상 기준 간격의 상한은 정상인 상한치 경로 활성을 나타낸다. 일 구현예에서, 양성 및 음성 테스트 결과를 구별하는 컷오프 값은 정상 기준 간격의 상한과 동일할 것이다. 다른 구현예에서, 컷오프 값은 정상 기준 간격의 상한에 임의의 값, 임의로 조합된 값, 모든 값 또는 하나의 배수, 조합 값 또는 모든 값, 즉 검출 한계, 블랭크 한계, 정량 한계, 측정량의 표준 편차를 합한 것이다.
질환이 없는 기준 개체 그룹은 관심 질환 이외의 다양한 특성에 의해 추가로 정의될 수 있다. 예를 들어, 유방암에 대한 본 발명의 용도에서, 질환이 없는 기준 여성 그룹은 모든 하기 특성: 폐경 전 또는 후, 수유 또는 비-수유, 아이 출산, BRCA 유전자 돌연변이, 당뇨병 유무, BMI(체질량 지수)에 따라 결정되는 비만, 호르몬 또는 다른 약물 중독과 같은 약리적 제제로부터의 금단, 알코올과 같은 식이 물질로부터의 금단 및 암의 가족력 중 임의의 것, 조합 또는 전부를 포함하도록 추가로 정의될 수 있다.
용어 "비정상 신호전달 경로", "비정상적인 신호전달 경로" 또는 "기능이상 신호전달 경로"는 상호 혼용하여 사용되며, 정상 기능을 수행할 수 있는 세포의 능력을 손상시키는 방식으로 파괴된 세포 신호전달 경로를 지칭한다. 세포 신호전달 파괴 및 그로 인한 기능이상의 근원은 전형적으로 신호전달 경로의 정상 기능을 방해하는 게놈 또는 단백체의 손상 결과이다. 이 손상은 DNA 복제의 오류, 특정 DNA 염기의 고유 화학적 불안정성, 종양 미세환경, 동적 시스템 조정 또는 선택, 또는 대사 과정에서 생성되는 자유 라디칼에 의한 공격과 같은 내인성 과정의 결과일 수 있다. 일부 불활성화 돌연변이는 게놈 완전성 유지를 담당하는 유전자에서 발생하여 추가의 돌연변이의 획득을 촉진한다. 세포 조절의 게놈 수준에 영향을 미치는 추가 기전은 특정 유전자의 발현이 히스톤 단백질의 기능 변화에 의해 변경된 후 성유전적 기전을 포함한다. 에피게놈 기능은 질환 병인 및 번식에 참여하는 조건을 포함하여 많은 상이한 환경 조건에 대해 고도로 적응적이거나 반응적임이 입증되었다. 경로 기능이상에 대한 다양한 RNA-기반 기전이 전사, 후-전사, 번역 및 번역후 수준에서 기재되어왔다.
또한, 단백질 수준에서 경로 기능이상의 많은 작용은 세포 분자 생물학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 경로 기능이상은 경로 구성원 또는 구성원 또는 보조인자(들)의 과다 또는 과소 발현, 비천연 세포 유형 또는 세포 위치에 존재하는 단백질 활성, 경로 교차-반응성으로도 알려진 비천연 경로 구성원과의 단백질 상호작용, 기능이상 피드백 또는 피드포워드 루프 또는 번역후 변형의 결과일 수 있다. 경로 기능 이상은 또한 단백체, 프로테아솜, 키노메, 대사체, 핵 단백질 및 인자, 세포질 단백질 및 인자, 또는 미토콘드리아 단백질 및 인자의 활성의 결과일 수 있다.
기능이상 경로를 갖는 세포를 복제하면, 그의 자손에게 비정상을 전할 수 있어 세포가 이환될 가능성이 높아진다. 생존 세포에서 세포 신호전달 경로의 활성을 분석함으로써, 세포의 신호전달 경로가 정상적으로 기능하는지 비정상적으로 기능 하는지를 결정할 수 있다.
용어들 "초-민감성 신호전달 경로" 또는 "과반응 신호전달 경로"는 상호 혼용하여 사용되며, 신호전달 경로 활성제(예를 들어, 수용체 리간드 농도 차이 1 nM 내지 10 nM)와 같이, 단지 매우 저수준의 세포 입력 차이가 저수준의 활성(예를 들어, 10% 세포 출력)을 매우 고수준의 경로 활성화 반응성(예를 들어, 90% 세포 출력)으로 변화시킬 수 있는 세포 신호전달 경로를 지칭한다. 전형적으로, 초-민감성 또는 과반응 신호전달 경로내 성분(예를 들어, 효소)은 활성을 10%에서 90% 최대 반응으로 유도하기 위해 자극이 81-배 미만 증가한다면, 초-민감성 또는 과반응으로 간주된다. 신호전달 경로의 초 민감성은 Ferrell, J.E. 및 Ha, S.H. (2014) Trends in Biochem . Sci . 39:496-503; Ferrell, J.E. 및 Ha, S.H. (2014) Trends in Biochem . Sci . 39:556-569; Ferrell, J.E. 및 Ha, S.H. (2014) Trends in Biochem. Sci . 39:612-618; Huang, C.Y. 및 Ferrell, J.E. (1996) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 93:10078-10083; Kim, S.Y. 및 Ferrell, J.E. (2007) Cell 128:1133-1145; Trunnell, N.B. 등 (2011) Cell 41:263-274에 기재되어 있으며, 전체적으로 참고로 편입된다.
본원에서 상호 혼용하여 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그것의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체에 편입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 후, 예를 들어 표지와의 콘주게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어, "캡", 유사체에 의한 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오타이드의 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예컨대 예를 들어, 하전되지않은 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등) 및 하전된 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)를 갖는 변형들, 펜던트 부분, 예컨대 예를 들어, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-라이신, 등)을 함유하는 변형들, 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌, 등)를 갖는 변형들, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속, 등)를 갖는 변형들, 알킬화제를 함유하는 변형들, 변형된 연결기(예를 들어, 알파 아노머성 핵산, 등)를 갖는 변형들, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 또한 당에 통상 존재하는 임의의 하이드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체되고, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가의 연결기를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 1 내지 20개의 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티로 인산화되거나 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기로 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 탄소환형 당 유사체, 알파-아노머성 당, 에피머 당류, 예컨대 아라비노오스, 자일로스 또는 릭소스, 파이라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환형 유사체 및 염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 포함하는 당 업계에 일반적으로 공지된 리보오스 또는 데옥시리보스 당류의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대안적인 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), "(O)NR.sub.2("아미데이트"), P(O)R', P(O)OR', CO 또는 CH.sub.2("포름아세탈")로 대체된 구현예를 포함하며, 여기에서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 선택적으로 에테르(--O--) 연결, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜을 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하는, 본 명세서에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드 또는 단백질을 지칭하며, 펩타이드, 올리고머, 단백질 등을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연, 변형 또는 합성 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 자연적으로, 예컨대 번역 후 가공에 의해, 또는 화학적으로, 예컨대 아미드화, 아실화, 가교결합 등에 의해 변형될 수 있다.
용어 "석영 결정 진동자/미량천칭"은 측정하고자 하는 바이러스 또는 기타 작은 물체와 같은 작은 질량의 첨가로 인해 방해받을 때 압전 석영 결정의 빈도 변화를 측정함으로써 질량을 측정하는 CREMS 디바이스의 한 유형이다. 빈도 측정은 고정밀도로 쉽게 이루어지므로, 작은 질량을 쉽게 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "샘플"은 본 개시내용의 장치, 마이크로플레이트 또는 방법을 사용하여 단리, 조작, 측정, 정량화, 검출 또는 분석될 모이어티를 함유할 수 있는 모든 것을 지칭한다. 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 생체액 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생체액의 예로는 세포 배양 배지, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 객담, 뇌 척수액, 눈물, 점액, 양수 등과 같은 배지에서의 세포 현탁액이 포함된다. 생물학적 조직은 일반적으로, 결합체, 상피, 근육 및 신경 조직을 포함하여 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조의 구조적 물질 중 하나를 형성하는 세포간 물질과 함께 특정 종류의 세포 집합체이다. 생물학적 조직의 예로는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별 세포가 포함된다. 생물학적 샘플은 세포 현탁액, 생물학적 분자(예를 들어, 단백질, 효소, 핵산, 탄수화물, 생물학적 분자에 결합하는 화학적 분자)를 함유하는 용액을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "세포 샘플"은 세포가 대상체의 생체액, 배설물 또는 조직으로부터 단리된, 특정 대상체로부터 단리된 세포를 지칭한다. 조직으로부터 단리된 세포는 종양 세포를 포함할 수 있다. 조직으로부터 단리된 세포는 균질화된 조직 및 세포 추출물, 및 이들의 조합을 포함한다. 세포 샘플은 비제한적으로, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 정장, 정액 혈장, 전립선 액, 사정전 유체(쿠퍼액), 배설물, 눈물, 타액, 땀, 생검, 복수, 뇌척수액, 림프, 골수, 또는 모발로부터의 단리를 포함한다.
용어 "CELx" 테스트는 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법의 다양한 구현예를 지칭한다.
용어 "이환 세포 샘플"은 질환의 특징을 갖는 질환 또는 세포 부위로부터의 복수의 세포를 지칭한다.
용어 "건강한 세포 샘플"은 세포가 시험되는 질환이 없는 조직으로부터 유래되지 않았거나 추출되지 않은 세포 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 특정 대상체가 대상체의 유방암에 대한 치료제의 효과에 대해 시험될 때, 비-암성 세포 또는 비-유방 조직으로부터의 세포는 "건강한" 것으로 간주된다. 용어 "건강한 세포 샘플"은 대상체의 전체 건강 상태에 대한 결정 또는 반영이 아니다. 정상적인 기준 간격을 도출하기 위해, 사용되는 건강한 세포 샘플은 시험되는 질환이 없는 대상체에서 수득되는 경우가 종종 있다.
용어 분석적 "민감도"는 테스트 또는 검출 한계를 지칭하며, 제로와 구분되는 가장 낮은 양으로 정의된다.(예를 들어, 제로 대조군의 평균값보다 95% 신뢰 구간 또는 2 표준 편차(SD)가 통상적으로 사용됨).
용어 임상 "민감도"는 테스트가 양성인 표적 상태에 있는 대상체의 비율 또는 관심 상태가 존재할 때 테스트가 양성인 빈도를 지칭한다. 테스트의 임상적 "민감도"는 계산: 100% x TP/(TP+FN)으로 제공된 정확도의 추정치로 정의되며, 여기서 TP는 시험 결과에 대한 진정한 양성 사건의 수이고, FN은 거짓 음성 사건, 부정확하게 음성으로 결정된 사건의 수이다.
임상적 "특이성"은 테스트가 음성인 표적 상태가 없는 대상체의 비율 또는 관심 상태가 부재할때 테스트가 음성인 빈도를 지칭한다. 임상 특이성은 계산: 100% x TN/(FP+TN)으로 추정되며, 여기서 TN은 시험 결과에 대한 진정한 음성 사건의 수이고, FP는 거짓 양성, 부정확하게 양성으로 결정된 사건의 수이다.
용어 "표면 플라즈몬 공명 디바이스"는 국소 굴절률 변화를 감지하여 금속 표면에서 생체분자의 결합 사건을 측정하는 광학 바이오센서 유형의 CReMS를 지칭한다.
용어 "치료제"는 유기체(인간 또는 비인간 동물)에 투여될 때, 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약리학적, 면역원성 및/또는 생리적 효과를 유도하는 임의의 합성 또는 자연 발생 생물학적 활성 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 이 용어는 단백질, 펩타이드, 호르몬, 핵산, 유전자 작제물 등과 같은 분자를 포함하여 약물, 백신 및 생물 약제로 종래에 간주되는 화합물들 또는 화학물질을 포괄한다. 상기 제제는 수의과, 응용 및 예컨대, 식물에 의한 농업 및 기타 분야에서 의학적으로 사용되는 생물학적 활성제일 수 있다. 용어 치료제도 또한 비제한적으로, 약제; 비타민; 미네랄 보충제; 질환 또는 병의 치료, 예방, 진단, 치유 또는 완화에 사용되는 물질; 신체의 구조 또는 기능에 영향을 미치는 물질; 또는 사전결정된 생리적 환경에 놓여진 후에 생물학적으로 활성이거나 더 활성이 되는 프로-약물(pro-drugs)을 포함한다. 치료제는 비제한적으로, 항암 치료제, 항정신병약, 항염증제 및 항생제를 포함한다.
용어들 "세포독성 요법" 및 "화학요법"은 하나 이상의 치료제에 의한 요법을 지칭하며, 여기서 상기 제제는 이환 세포(및 가능하게는 비-이환 세포)에 대해 비-특이적이거나 비-표적화된 세포독성을 나타낸다.
용어들 "표적화된 치료제", "표적화된 경로 약물", "경로 약물" 또는 "표적화된 약물"은 질환 과정에 관여하여 그에 의해 그것의 활성을 조절하는 특정 생체분자(예를 들어, 단백질)에 선택적으로 결합하도록 설계된 치료 용량을 갖는 임의의 분자 또는 항체를 지칭한다. 표적화된 치료제가 결합할 수 있는 생체분자의 비-제한적인 예는 세포-표면 수용체 및 세포간 및 세포내 신호전달 경로 성분을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 치료를 위해 대상체에게 투여되는 "표적화된 치료제"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 시험관내에서 대상체 세포내 신호전달 경로의 상태를 결정하기 위해 시험되는 동일한 표적화된 치료제, 또는 대안적으로 치료를 위해 투여되도록 선택되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험된 것과 상이한 표적화된 치료제일 수 있지만, 시험관내에서 시험된(예를 들어, 시험된 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로의 지점 또는 노드에 영향을 미치는) 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다(예를 들어, 선택적으로 영향을 미친다).
용어들 "HER2 요법" 또는 "HER2-표적 요법"은 비제한적으로, 예를 들어, HER2 분자 및/또는 신호전달 경로(들)을 표적으로 하는 항체 및 소분자를 포함하는, HER2 분자 및/또는 신호전달 경로(들)을 특이적으로 표적화하도록 설계된 하나 이상의 치료제를 사용하는 요법을 지칭한다. 이러한 HER2 요법은 HER1 및 HER2 둘다, HER1, HER2, 및 HER4, 또는 HER3 단독을 표적으로 하는 요법과 같이 HER 계열의 다른 구성원을 표적으로 할 수도 있다.
용어들 "ER 요법", "ER-표적 요법" 또는 "호르몬 요법"은 비제한적으로, 방향화효소 억제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 및 선택적 에스트로겐 수용체 하향조절인자를 포함하는, ER 분자 및/또는 신호전달 경로를 특이적으로 표적화하도록 설계된 하나 이상의 치료제를 사용하는 요법, 뿐만 아니라 사이클린-의존적 키나제 CDK4 및 CDK6를 억제하는 요법과 상기 요법과의 조합을 지칭한다.
용어들 "항-증식성 약물", "항-증식성 제제" 또는 "세포자멸사 유도 약물"은 세포 분열을 감소시키거나 세포 성장을 감소시키거나 세포를 죽이는 기능을 하는 치료적 수용력을 갖는 임의의 분자 또는 항체를 지칭한다. 많은 경우에, 이들 약물의 활성은 정상 세포 과정에 관여하는 광범위한 종류의 생체분자(예를 들어, DNA 삽입)를 지향하므로, 약물은 세포 질환 상태에 대해 덜 판별될 수 있다.
용어 "치료적으로 활성"은 대상체의 암 세포가 소분자 또는 항체 또는 표적화된 펩타이드 또는, 알려진 단백질에 개입하기 위한 높은 친화도 및 특이성을 갖는 임의의 유기 시약과 같은 표적화된 치료제와 접촉할 때 발생하는 신호전달 경로에 대한 효과를 지칭한다. 치료적으로 활성인 표적화된 치료제는 표적화된 치료제가 영향을 미치도록 의도된 신호전달 경로(들)에 영향을 주는 것이다. 다른 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포에서 보다 치료적으로 활성인 표적화된 치료제는 다른 치료제가 영향을 주고자 하는 신호전달 경로 상에 다른 치료제가 갖는 것보다 영향을 줄 수 있는 신호전달 경로에 더 큰 효과를 갖는 것이다. 적어도 특정 암에서 2개 이상의 신호전달 경로가 수렴, 누화 및 피드백 루프의 여러 지점과 상호연결되어 하나의 경로만 억제하면 다른 (상호 경로)를 통해 신호전달의 유지를 초래할 수 있다는 증거가 있다(예를 들어, Saini, K.S. 등(2013) Cancer Treat. Rev. 39: 935-946 참고). 하나의 신호전달 경로의 활성이 다른 신호전달 경로의 활성에 영향을 줄 수 있기 때문에, 표적화된 치료제는 표적화된 치료제의 결합 부위와 간접적으로 관련된 신호전달 활성을 방해할 수 있다. 이러한 경우, 표적 요법은 그 표적화된 치료제 결합 부위와 직접적으로 연관되지 않은 경로에 대한 신호전달 활성을 억제하는 것으로 밝혀지면 치료적으로 활성인 것으로 간주될 수 있다.
폴리펩타이드의 "변이체"는 기준 서열과 상이한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 기준 서열은 전장 천연 폴리펩타이드 서열 또는 전장 폴리펩타이드 서열의 임의의 다른 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 서열은 가변 도메인 중쇄 또는 가변 도메인 경쇄 컨센서스 서열이다. 폴리펩타이드 변이체는 일반적으로 기준 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
B. 다중 신호전달 경로를 측정하는 방법
본 발명의 일 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 환자의 암 세포에서 다중(2개 이상의) 신호전달 경로의 기능적 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 이 접근법은 종양 내 몇 가지 상이한 신호전달 경로의 활성을 동시에 평가하고 결과를 비교함으로써, 환자의 종양을 운전하는 특정의 가장 활성인 질환 신호전달 경로의 확인을 가능하게 한다. 그 다음, 환자는 최고 수준의 활성을 갖는 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제로 치료된다. 치료에 사용되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 신호전달 경로의 기능적 상태를 결정하기 위해 시험된 동일한 표적화된 치료제일 수 있거나, 또는 대안적으로 치료에 사용되는 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험되었지만 시험관내에서 시험된 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 상이한 제제일 수 있다.
환자의 세포에서 다양한 신호전달 경로의 활성에 대한 정보가 병렬로 얻어지도록 (각각의 경로를 개별적으로 테스트하기 위해 환자의 세포 샘플의 상이한 부분을 사용하여) 환자의 암 세포에서 한 번에 하나씩 다중 신호전달 경로가 검사될 수 있다. 다중 상이한 경로의 이러한 평행 분석으로부터의 결과는 어느 표적화된 치료제/활성제 쌍이 시험된 쌍의 최고, 출력 값을 유도하는지 및 표적화된 치료제가 치료적으로 활성인지를 결정하기 위해 비교될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 다중 표적화된 치료제/활성제 쌍(각각의 쌍이 상이한 신호전달 경로에 영향을 미침)(하위 섹션 F에서 더 논의됨)과 샘플을 동시에 접촉시킴으로써 동반상승효과 확인의 이점에 대하여, 다중 신호전달 경로를 동일한 세포 샘플에서 동시에 검사할 수 있다. 이들 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 실시예 1(다중 상이한 신호전달 경로의 병렬 분석) 및 실시예 3(다중 상이한 신호전달 경로의 동시 분석)에 추가로 기재되어 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계:
상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
상기 샘플을 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각각의 세트는 표적화된 치료제인 제1 제제 및 상기 제1 제제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 활성제인 제2 제제를 포함하고; 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트가 상이한 신호전달 경로에 영향을 주어, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
각각의 제1 제제 또는 각각의 제2 제제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 투여된 표적화된 치료제가 낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포의 신호전달 경로에서 보다 치료적으로 활성인 것을 나타내는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 표적화된 치료제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
상기 샘플을 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각각의 세트는 표적화된 치료제 및 상기 표적화된 치료제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 활성제를 포함하고, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트가 상이한 신호전달 경로에 영향을 주어, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
각각의 표적화된 치료제 또는 각각의 활성제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 표적화된 치료제 또는 활성제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 표적화된 치료제를 확인하는 단계로서, 상기 표적화된 치료제가 낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 보다 치료적으로 활성인 것을 나타내는 단계.
일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제(들)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제(들)과 상이하지만, 상기 제1 제제(들)과 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
다양한 구현예에서, 샘플(예를 들어, 세포 샘플의 상이한 부분)은 쌍으로 된 제제의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개 이상의 세트와 접촉되고, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 신호전달 경로에 영향을 미친다. 일 구현예에서, 샘플은 쌍으로 된 제제의 10개 이상의 세트와 접촉된다. 활성제 또는 치료제는 세포 샘플의 동일한 부분에 2개 이상의 제제의 풀로서 동시에 적용될 수 있다. 일 구현예에서, 표 16에 제시된 11개의 상이한 신호전달 경로는 예를 들어 표 16에 제시된 활성제 및 표적화된 치료제의 쌍으로 된 세트를 사용하여(실시예 1에서 추가로 기재됨) 병행하여 시험된다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 세트는 하나의 표적화된 치료제 및 하나 이상의 활성제를 포함하며, 이들 활성제 각각은 표적화된 치료제가 다뤄지는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 세트는 하나의 표적화된 치료제 및 2개의 상이한 활성제를 포함하며, 이들 각각은 표적화된 치료제가 다뤄지는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 구현예는 또한 하기 하위 섹션 D에서 더욱 기재된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 세트 및 신호전달 경로는 하기 표 2로부터 선택된다:
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일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro 3, Mer, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, 녹사, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, 크렙스(Krebs) 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민(lamins), ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, 프린지(Fringe), 푸린(Furin), 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린(cofilin), CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미친다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 표 12에 제시된 쌍으로 된 제제의 세트로부터 선택된다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제 및 신호전달 경로는 하기 하위 섹션 및 실시예에서 추가로 기재된다.
또 다른 양태에서, 대상체의 암 세포에서 다중 신호전달 경로의 평가를 포함하는 방법은 상기 대상체에게 투여하기 위한 다중 표적화된 치료제(즉, 병용 요법을 위한 표적화된 치료제의 조합)의 선택을 추가로 포함할 수 있다. 적어도 특정 암에서 2개 이상의 신호전달 경로가 수렴, 누화 및 피드백 루프의 여러 지점과 상호연결되어, 단 하나의 경로만 억제하면 다른 경로를 통해(상호 경로) 신호전달을 여전히 유지할 수 있다는 증거가 있다(예를 들어, Saini, K.S. 등 (2013) 암 Treat. Rev. 39:935-946 참고). 따라서, 대상체의 암 세포에서 치료적으로 활성인 것으로 결정된 다중 표적화된 치료제에 의한 다중 경로의 표적화는 우수한 효능 및 더 나은 임상 결과로 이어진다. 게다가, 합리적 조합 표적 치료법의 사용이 항암제 내성의 지속적인 도전에 대한 해결책으로 제안되었다(예를 들어, Al-Lazikani. B. 등 (2012) Nature Biotechnol. 30:679-692 참고).
따라서, 또 다른 구현예에서, 대상체의 암 세포에서 다중 신호전달 경로의 평가를 포함하는 방법은, 활성으로서 확인하는 단계 또는 상기 대상체에게 적어도 2개의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다: (i) 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 표적화된 치료제, 및 (ⅱ) 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 적어도 하나의 추가의 치료제. 예를 들어, 일 구현예에서, 적어도 2개의 치료제는 각각의 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정된다.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
대상체의 암 세포에서 다중 신호전달 경로의 평가, 샘플 준비 및 배양을 포함하는 방법의 경우, 세포 유착 또는 부착 및 수학적 분석에 대한 연속적인 모니터링은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 제제의 각각의 쌍으로 된 세트에서의 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합이다. 적합한 활성제의 예는 하기 하위 섹션 및 실시예에서 추가로 기재된다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 적합한 암은 하기 하위 섹션에 기재된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 세포의 배양 조건 및 배양은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
C. 신호전달 경로 초-민감도의 측정 방법
본 발명의 일 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 비정상적으로 초-민감한 환자의 세포에서 신호전달 경로를 확인하는 단계, 및 그 다음, 상기 초-민감한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제로 그 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 초-민감한 경로는 매우 낮은 수준의 세포 입력만의 변화, 예컨대 신호전달 경로 활성제(예를 들어, 1 nM에서 10 nM까지의 수용체 리간드 농도 변화)가 낮은 수준(예를 들어, 세포 출력의 10%)의 경로 활성화로부터 매우 높은 수준의 경로 활성화 민감성(예를 들어, 90% 세포 출력)으로의 변화를 야기할 수 있는 경로이다. 비정상적으로 초-민감한 환자의 암 세포에서의 신호전달 경로는 비록 암 세포에 추가의 비정상적인 신호전달 경로가 있어도 질환 과정(예를 들어, 종양 성장)을 유도하는데 관여할 가능성이 있다. 따라서, 비정상적으로 초-민감한 환자의 암 호출에서 신호전달 경로를 확인하고, 그 다음 이 신호전달 경로를 표적으로 하는 표적화된 치료제를 선택하는 것은 치료적으로 효과적인 치료 레지멘을 선택하는 효과적인 수단이다. 이 방법의 비제한적인 예시적인 구현예가 실시예 2에 추가로 기재된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 신호전달 경로는 하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 것으로 결정된 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 활성제와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플의 일부는 고농도의 활성제와 접촉되고, 상기 샘플의 일부는 저농도의 활성제와 접촉되는 단계;
저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
상기 연속 측정의 수학적 분석에 의해 상기 활성제에 대한 상기 신호전달 경로의 민감성을 결정하는 단계; 및
신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성임을 나타내는, 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감할 때 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 및 활성제와 접촉되지 않은 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
활성제와 접촉되지 않은 샘플의 부분과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 활성제와 접촉된 샘플의 부분에서 일어났는지 여부를 특징짓는 활성제에 대한 샘플의 연속 측정 민감도 및 활성제에 대한 출력 값을 수학적 분석에 의해 결정하는 단계;
신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성임을 나타내는, 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감한 경우 또는 활성제에 대한 출력 값이 사전-결정된 컷오프 값보다 큰 경우, 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 표적화된 치료제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 활성제와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 샘플의 일부는 고농도의 활성제와 접촉되며, 샘플의 일부는 저농도의 활성제와 접촉되는 단계;
저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
상기 연속적 측정의 수학적 분석에 의해 활성제에 대한 상기 신호전달 경로의 민감도를 결정하는 단계; 및
신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성임을 나타내는, 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감한 경우 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 표적화된 치료제를 확인하는 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 및 활성제와 접촉되지 않은 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
활성제와 접촉되지 않은 샘플의 부분과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 활성제와 접촉된 샘플의 부분에서 일어났는지 여부를 특징짓는 활성제에 대한 샘플의 민감도 및 활성제에 대한 출력 값을 상기 연속적 측정의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계;
신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성임을 나타내는, 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감한 경우 또는 활성제에 대한 출력 값이 사전-결정된 컷오프 값보다 큰 경우, 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 표적화된 치료제를 확인하는 단계.
일 구현예에서, 활성제의 고농도는 EC90(즉, 유효 농도 90)이고, 활성제의 저농도는 EC10(즉, 유효 농도 10)이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, EC90은 대상체의 세포 상에서의 활성제에 대한 최대 반응의 90%를 제공하는 활성제의 농도이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, EC10은 대상체 세포 상에서의 활성제에 대한 최대 반응의 10%를 제공하는 활성제의 농도이다. 일 구현예에서, 81 미만의 EC90:EC10 비율은 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감하다는 것을 나타낸다.
다른 구현예에서, 고농도의 활성제는 저농도의 활성제보다 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배 이상, 80배 이상이다.
또 다른 구현예에서, 고농도의 활성제는 사용된 유일한 농도이며, 본 명세서에 기재된 임의의 구현예에 의해 초-민감하지 않은 작은 모집단의 환자와 초-민감한 작은 모집단의 환자의 결과를 비교하여 결정된다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 신호전달 경로 초민감도를 측정하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정되는 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 활성제와 샘플을 접촉시키는 접촉 단계를 (배양 단계와 세포 유착 또는 부착을 연속 측정하는 단계 사이에) 포함하며, 상기 사용된 활성제의 농도는 신호전달 경로의 초민감성을 확인하기 위해 결정된 농도이다.
일 구현예에서, 활성제에 대한 신호전달 경로의 민감도는 힐(Hill) 방정식을 사용하여 힐 계수를 결정하여 결정된다.
힐 방정식은 당 업계에 공지되어 있으며, 가장 단순하게 하기와 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00003
및
Figure pct00004
식 중:
ㆍ 입력 은 입력 농도이다. 그것은 많은 상이한 형태, 예컨대 pM, nM, μM, mM, M, ng/mL, % 등으로 표현될 수 있다.
ㆍ K 0.5 는 반-최대 농도 상수이다. K half라고도 칭할 수 있다. 그것은 50% 완전한 반응을 일으키는 기질 농도이다.
n 은 힐 계수이다.
일 구현예에서, 1보다 큰 힐 계수 값은 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감하다는 것을 나타낸다.
힐 방정식은 대안적인 방식으로 표현된다.
Figure pct00005
여기서,
θ - 경로에서 유래된 활성의 분수
[L] - 자유(미결합된) 리간드(활성제) 농도
K d - 리간드-수용체 복합체의 결합 속도
Figure pct00006
에 대한 리간드-수용체 복합체의 해리 속도의 비와 동일한 질량 작용의 법칙으로부터 유도된 겉보기 해리 상수(해리에 대한 평형 상수).
n - 힐 계수
당업자는 상기 방정식이 선형 플롯을 생성하는,
Figure pct00007
대 log L의 선형 플롯을 생성하는데 유용하며, 여기서 기울기는 n, 힐 계수임을 알 것이다.
당업자는 또한 EC90/EC10 < 81이 초민감성 신호전달 사례를 나타내고, EC90/EC10 비가 작을 수록 초민감성이 커짐을 알 것이다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGFR, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, lamins, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER 계열 신호전달 경로이다. 일 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로는 HER2 신호전달 경로이다. 일 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로는 HER3 신호전달 경로이다. 일 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로는 EGFR 신호전달 경로이다. 일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER3 신호전달 경로이고, 초민감도는 활성제 제제로서 상이한 농도의 뉴레굴린을 사용하여 시험된다(실시예 2에 추가로 기재됨). 또 다른 구현예에서, 신호전달 경로는 EGFR 신호전달 경로이며, 활성제 제제로서 상이한 농도의 암피레굴린, 베타쿨룰린, HB-EGF 또는 TGF-알파를 사용하여 초민감도가 시험된다(실시예 2에 추가로 기재됨).
일 구현예에서, 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제 및 신호전달 경로는 하기 하위 섹션 및 실시예에 추가로 기재된다.
일 구현예에서, 제제의 각각의 쌍으로 된 세트에서 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합이다. 적합한 활성제의 예는 하기 하위 섹션 및 실시예에 추가로 기재된다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로 적합한 암은 하기 하위 섹션에서 설명한다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 세포의 배양 조건 및 배양은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
D. 동일한 신호전달 경로의 다중 활성제를 사용하는 방법
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 단일 표적화된 치료제가 억제할 수 있는 적어도 2개의 신호전달 경로 활성제에 의해 환자의 세포에서 동시에 개시되는 활성의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 신호전달 경로 활성은 하나 이상의 세포 표면 수용체에 의해 개시된 업스트림 활성에 의해 유도될 수 있으므로, 그러한 경로 노드를 표적으로 하는 요법의 길항제 효과를 평가하는 것이 유리하다. 예를 들어, 이러한 접근법은 다운스트림 경로 노드(예를 들어, AKT, PI3K, MEK, ERK, mTOR)를 표적으로 하는 치료제가 다중 세포 표면 수용체의 다운스트림에 신호전달 경로 활성을 주는 영향의 측정을 허용한다. 신호 활성화 지점의 다운스트림에 있는 환자의 세포내 2개 이상의 신호전달 경로 활성제의 동시 효과를 평가함으로써, 이 접근법은 한 쌍의 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제가 환자의 세포에 미치는 영향을 평가하는 방법을 개선한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
상기 샘플을 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉시키는 단계로서, 각각의 삼중항 세트는 제1 제제 표적화된 치료제 및 표적화된 치료제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 적어도 2개의 제2 제제 활성제를 포함하며, 세포 유착 또는 부착 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제 또는 제2 제제 활성제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포 샘플에 비해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플내 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제 또는 제2 제제 활성제 단독과 접촉되는 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제제의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 일어나는지의 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는, 출력 값이 사전-결정된 컷오프 값보다 클 때 제제의 삼중항 세트로부터 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 상기 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 표적화된 치료제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
세포 유착 또는 부착 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록, 상기 샘플을 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉시켜, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플을 제조하는 단계로서, 각각의 삼중항 세트는 상기 표적화된 치료제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 표적화된 치료제 및 적어도 2개의 활성제를 포함하는 단계;
표적화된 치료제 또는 각각의 활성제 단독과 접촉되는 대상으로부터 수득된 생존 암 세포의 샘플에 대해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계 ;
표적화된 치료제 또는 활성제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 제제의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 세포 유착 또는 부착의 변화가 일어나는지 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는, 상기 결과 사전-결정된 컷오프값보다 큰 경우 제제의 삼중항 세트로부터 표적화된 치료제를 확인하는 단계.
일 구현예에서, 표적화된 치료제(예를 들어, 제1 제제 표적화된 치료제)는 표적화된 치료제에 의해 영향을 받은 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정된다. 또 다른 구현예에서, 표적화된 치료제(예를 들어, 제1 제제 표적화된 치료제)는 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1,HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, N옥사, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체(IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER 계열 신호전달 경로이다. 일 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로는 HER2 신호전달 경로이다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287(AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, a BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, an 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제 및 신호전달 경로는 하기 하위 섹션 및 실시예에 추가로 기재된다.
일 구현예에서, 제제의 각각의 삼중항 세트내 각각의 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합이다. 제제의 삼중항 세트의 특정 구현예에서, 제제의 삼중항 세트 중 하나는 HER3(PI3K) 경로에 영향을 주는 활성제 NRG1이고, 제제의 삼중항 세트 중 하나는 HGF 경로에 영향을 주는 활성제 HGF이고, 제제의 삼중항 세트 중 하나는 PI3k 경로 노드를 표적으로 하고 HER3 및 HGFR 경로 모두에 영향을 미치는 치료제, 타젤리십이다. 적합한 활성제의 추가 예는 하기 하위 섹션 및 실시예에 추가로 기재된다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로 적합한 암은 하기 하위 섹션에 추가로 기재된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 세포의 배양 조건 및 배양은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
E. 신호전달 경로 내의 다른 결합 부위를 표적으로 하는 방법
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 신호전달 경로를 자극하는데 사용된 활성제와 동일한 또는 상이한 신호전달 경로 내의 상이한 지점 또는 노드 또는 결합 부위에 영향을 주는 표적화된 치료제를 평가하는 단계를 포함한다. 암 환자의 치료를 위해 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 하나 이상의(예를 들어, 2개) 신호전달 활성제에 의해 환자의 세포에서 개시된, 및 활성제와 동일한 근사치 결합 부위를 직접 표적화하지 않는 표적화된 치료제에 의해 억제된 활성의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 2개 이상의 신호전달 경로가 수렴, 누화 및 피드백 루프의 여러 지점과 상호연결될 수 있기 때문에 활성제 결합 부위(예를 들어, 세포 표면 수용체)에서 개시되는 경로 활성을 억제하도록 설계된 표적화된 치료제가 신호전달 경로 활성을 억제하는 가장 효과적인 방법이 아닐 수 있다. 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성이 활성제와 동일한 근사치 결합 부위를 직접 표적화하는 매칭하는 신호전달 경로 억제제에 의해 억제될 수 없는 경우, 활성제의 결합 부위와 상이한 결합 부위를 표적화하는 치료법은 개시된 신호전달 경로 활성을 억제할 수 있다. 이 접근법은 활성화제의 결합 부위에 대한 결합 부위 다운스트림(예를 들어, AKT, PI3K, MEK, ERK, mTOR), 결합 부위 업스트림(예를 들어, RAS, RAF), 또는 결합 부위 측면(예를 들어, 헤지혹, 노치, Wnt, c-MET, ALK, AXL, FGFR)을 표적화하는 치료제가 활성화제에 의해 개시되는 신호전달 경로 활성에 미치는 영향을 측정하도록 한다. 환자의 세포에서 활성제 제제의 활성화 결합 부위에 대해 신호전달 경로 억제제 다운스트림, 업스트림 또는 측면의 효과를 평가함으로써, 이러한 접근법은 한 쌍의 신호전달 경로 활성제의 효과를 평가하는 방법을 개선시키며, 표적화된 치료제는 환자 세포내 동일한 근사치 결합 부위를 갖는다. 추가로, 본 발명은 다수의 노드 또는 표적에 결합하고 그를 조절하는 것으로 알려져 있고 밝혀질 수 있는 치료제를 포함한다. 따라서, 활성제 제제와 상이한 결합 부위에 결합하는 표적화된 치료제로 환자를 치료하면 탁월한 효능 및 더 우수한 임상 결과를 유도할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 신호전달이 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
(i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 활성제와 동일한 신호전달 경로에는 영향을 미치지만 활성화 결합 부위의 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서 제2 제제 표적화된 치료제와 샘플을 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 상기 제1 제제 및 상기 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 제1 제제 및 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
제2 제제 표적화된 치료제가 영향을 주는 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷-오프 값 이상인 단계.
일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제2 제제 표적화된 치료제이다. 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제2 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 상기 제2 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 다루고자 의도된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 표적화된 치료제를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
(i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 활성제와 동일한 신호전달 경로에는 영향을 미치지만 활성화 결합 부위의 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서 제2 제제 표적화된 치료제와 샘플을 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 상기 제1 제제 및 상기 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 제1 제제 및 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 제2 제제 표적화된 치료제를 치료적으로 활성인 것으로 확인하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷오프값 이상이며, 및/또는 제2 제제 표적화 치료제가 대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인, 단계.
신호전달 경로 내의 상이한 결합 부위(예를 들어, 점 또는 노드)를 프로빙하기 위한 이들 방법의 또 다른 구현예에서, 각각 신호전달 경로 또는 관심 대상 내의 활성화 결합 부위를 갖는 다중 활성제 제제(2개 이상)가 활성제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치지만 활성제의 활성화 결합 부위에 대한 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서 작용하는 표적화된 치료제와 조합하여 사용된다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
(i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 2개 이상의 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 2개 이상의 제1 제제 활성제와 동일한 신호전달 경로에는 영향을 미치지만 활성제의 활성화 결합 부위의 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서 제2 제제 표적화된 치료제와 샘플을 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 상기 제1 제제 및 상기 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 제1 제제 및 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는, 컷-오프 값보다 같거나 큰 경우, 제2 제제가 표적화된 치료제가 영향을 주는 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제2 제제 표적화된 치료제이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제2 표적화된 치료제와 상이하지만, 상기 제2 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 표적화된 치료제를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
(i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 2개 이상의 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 2개 이상의 제1 제제 활성제와 동일한 신호전달 경로에는 영향을 미치지만 활성제의 활성화 결합 부위의 결합 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에서 제2 제제 표적화된 치료제와 샘플을 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 상기 제1 제제 및 상기 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 및 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 제2 제제 표적화된 치료제를 치료적으로 활성인 것으로 확인하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷오프값 이상이며, 및/또는 제2 제제 표적화 치료제가 대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인, 단계.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택된다.
이들 방법의 다양한 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, PDGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민스, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 제1 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합이다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세히 기재된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로 적합한 암은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세히 기재된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 세포의 배양 조건 및 배양은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세히 기재된다.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428(BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제 및 신호전달 경로는 하기 하위 섹션 및 실시예에 추가로 기재된다.
F. 다중 신호전달 경로의 동시 활성화 및 억제
표적화된 치료제가 게놈 또는 조직학적 분석을 사용하여 선택되는 경우, 이들은 종종 일반적으로 개별 환자에게 한 번에 하나씩 처방되고, 결과 치료된 질환 환자 모집단의 적은 비율만이 단일 표적화된 치료제가 영향을 미치고자 하는 질환 과정을 갖는 세포를 가질 수 있다. 이것은 시장에서 많은 효과적인 표적화된 치료법의 사용을 제한하거나 표적화된 치료제가 샘플 시장에 필요한 규제 승인을 얻지 못하게 한다. 제약 회사와 의사의 한 가지 반응은 표적화된 치료제의 조합을 테스트하는 것이었다. 두 가지 이상의 표적화된 요법으로 환자를 치료하기 위한 많은 시도가 진행되고 있는데, 각각의 표적 치료법은 단일 환자에서 기능이상 신호전달의 상이한 양태에 영향을 미치고자 하는 것이다. 이들 중 많은 것들도 성공하지 못한다. 그 환자에게 조합 요법을 투여하기 전에 환자를 위한 표적화된 요법의 조합을 평가하기 위한 객관적인 임상적 조치는 현재까지는 없었다. 2개 이상의 기능이상 신호전달 이슈가 그 환자에게 존재하는지, 2개 이상의 표적화된 치료제가 유효한지 여부를 결정하기 위한 객관적인 방법이 없는 경우 여러 문제가 발생한다. 결합된 표적화된 치료제를 갖는 환자의 치료와 관련하여 본 발명이 다루기 위해 설계된 다양한 쟁점에 대한 설명이 본 명세서에 기재되어 있다.
단일 제제로 처방된 2개 이상의 표적화된 치료제가 질환 모집단의 별개의 개별 하위 그룹에서만 실제로 치료적으로 활성인 경우, 총 모집단내 결과는 표적화된 치료제 중 하나만을 사용하여 치료한 동일한 모집단에 비해 2개 이상의 치료제로 치료된 환자에서 더 큰 것으로 추정될 수 있다. 예를 들어, 각각의 2개의 표적화된 요법이 개별적으로 처방되었을 때 환자 모집단에 대해 객관적인 반응률이 10%인 경우 병용 요법을 처방할 때 객관적인 반응률은 20%까지 증가할 수 있다. 결과적으로 표적화된 치료제의 조합을 투여받는 모집단에 대한 결과는 시장에서 각각의 치료제의 사용을 증가시키거나, 또는 치료제 중 하나만이 그렇지 않으면 승인을 얻었을 경우 병용 치료에 대한 규제 승인을 얻기에 충분할 수 있다. 전체적으로 모집단의 개선된 결과에도 불구하고, 모집단의 많은 또는 모든 환자는 종양 세포에서 치료적으로 활성이 없는 적어도 하나의 치료제를 받을 수 있으며, 작지만 여전히 상당한 비율의 모집단이 2개의 치료제를 받을 수 있으며, 이중 어떤 것도 그의 종양 세포에서 치료적으로 활성이다. 결과는 병용 투여시 모든 환자에게 해로울 위험이 증가한다는 것이다. 따라서, 이 접근법은 단 하나의 표적화된 치료제로 치료받았을 때보다 더 많은 수의 환자에게 치료적 이점이 없고, 종종 독성이 있고 부작용이 없는 표적화된 치료제를 투여할 수 있다. 따라서, 모집단에서 성공 확률을 높이기 위해 환자에게 2개 이상의 표적화된 치료제를 처방하는 것이 유리할 수 있지만, 특히 조합된 표적화된 치료제의 치료의 경우에 표적화된 치료제를 사용하여 개별 환자의 치료를보다 정확하게 지정하는 대안적인 접근법이 요구된다.
본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 표적화된 치료제가 환자의 세포에서 치료적으로 활성인지 여부를 선험적으로 결정하여 환자를 치료하는데 사용되는 표적화된 치료제의 선택을 개선시킬 수 있게 한다. 본 발명의 일 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 하나 이상의 표적화된 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 조합된 및 동시 효과를 평가하는 단계를 포함하는데, 적어도 2개의 활성제 및 적어도 2개의 치료제를 함유하는 쌍으로 된 제제의 세트는 다중 신호전달 경로의 활성을 갖는다. 이러한 접근법은 2개 이상의 경로의 신호전달 활성이 상호연결되고 예기치 않게 강하게 동반상승작용이 있는 경우에 단일 경로의 신호전달 활성에 대한 하나 이상의 활성제와 및 치료제의 쌍으로 된 세트의 효과를 평가하는 방법보다 유리하다.
첫째, 환자의 종양 세포에서 다중 경로가 질환 과정을 유도하는 신호전달 경로(들)을 확인하는 목적으로 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 개별적으로 평가될 때, 하나의 신호전달 경로의 활성이 또 다른 신호전달 경로의 활성에 미치는 영향을 평가할 수 없다. 2개 이상의 상호연결된 신호전달 경로에 의해 유도된 종양이 있는 환자에서, 각각의 경로의 비정상적인 신호전달 활성은 다른 경로로부터의 피드백, 피드포워드 또는 누화 활성에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 주로 하나의 세포 표면 수용체(예를 들어, EGF 경로를 개시하는 EGF 수용체)와 관련된 신호전달 경로 활성은 상이한 세포 표면 수용체(예를 들어, EGF 경로 활성을 개시하는 HGF 수용체)와 관련된 활성에 의해 유도될 수 있다. 그 결과, 환자의 종양 세포가 단일 경로(예를 들어, EGF 리간드 및 EGF 억제제)에만 영향을 미칠 수 있는 활성제 및 치료제의 쌍으로 된 세트와 접촉하면, 측정된 신호전달 활성은 포텐셜 피드백, 측면, 피드포워드 또는 누화 효과를 반영하지 않을 것이며, 또 다른 경로가 그 경로(예를 들어, EGF) 위에 있을 수 있다. 이러한 경우, 활성제 및 치료제의 쌍으로 된 세트로 개별적으로 하나 이상의 신호전달 경로를 활성화 및 억제하는 것은 가장 치료적으로 활성인 제제의 선택으로 이어지지 못할 수 있다. 이러한 경우, 환자의 생존가능한 종양 세포에서 2개 이상의 상이한 신호전달 경로에 대해 2개 이상의 활성제 및 2개 이상의 치료제의 세트의 조합된 기능적 활성을 평가하는 객관적인 방법을 갖는 것이 유리하다.
이 접근법은 적어도 2개의 상이한 경로의 신호전달 활성에 대한 2개의 상이한 결합 부위(예를 들어, EGFR, HGFR, HER3, PI3K)를 표적으로 하는 적어도 2개의 상이한 치료제의 효과의 측정을 허용한다. 한 쌍의 활성화 및 치료제 세트로 한번에 하나씩 다중 신호전달 경로의 기능적 활성을 측정하는 대신에, 이 접근법은 환자의 생존가능한 종양 세포를 2개 이상의 활성제 제제 및 동시에 2개 이상의 치료제와 동시에 접촉시키고 2개 이상의 신호전달 경로의 결과적인 기능적 활성을 측정한다. 예를 들어, EGF 및 HGF 경로(즉, 각각 HER 계열 신호전달 경로 및 c-Met/HGF 신호전달 경로)가 기능적으로 상호연결되어 있지만, EGF 리간드 및 EGFR 억제제를 쌍으로, HGF 리간드 및 HGFR 억제제가 쌍으로 된 세트로 별도로 평가된 경우, 각각의 쌍으로 된 세트에 대하여 유래된 신호전달 감쇠의 출력 값은 50% 미만일 수 있다. 이것은 EGF 및 HGF 억제제가 환자의 암 세포에서 치료적으로 활성적이지 않아서 환자를 치료하기 위해 선택되지 않았음을 시사한다. 그러나, EGF 및 HGF 경로의 기능적 활성을 환자의 종양 세포를 HGF 및 EGF 리간드와 동시에 및 HGFR 및 EGFR 억제제와 동시에 접촉시킴으로써 평가한다면, 쌍으로 된 제제의 조합된 세트에 대한 출력 값의 감쇠는 50%보다 훨씬 더 클 수 있다. 이것은 EGFR과 HGFR 억제제의 조합이 환자의 암 세포에서 치료적으로 활성을 가지므로 환자를 치료하기 위해 선택될 것임을 시사한다. 따라서, 다수의 경로를 개별적으로 평가하는 것보다는 다수의 경로를 개별적으로 평가함으로써, 본 발명의 사용은 표적화된 치료적 조합의 확인이 다수이지만 별개의 표적화된 치료제 기능적 평가에 기초하여 선택된 조합보다 더 많은 치료적 활성을 유일하게 가능하게 한다.
둘째로, 환자의 세포에서 신호전달 경로에 대한 다수의 활성제 및 치료제의 효과를 동시에 평가함으로써, 각각의 경로에서 평가된 2개 이상의 치료제 각각의 효능이 치료제가 별도로 평가되는 것과 관련하여 증폭되는지 결정할 수 있다. 현재, 2개 이상의 표적화된 치료제 각각에 대해 처방된 투약량은 표적화된 치료제가 단일 제제로 처방되는 경우 처방된 것과 동일한 투약량이다. 본 발명을 사용할 때, 환자의 세포에서 다중 활성제 및 치료제의 동시 평가는 2개 이상의 표적화된 치료제의 조합이 개별적으로 사용되는 표적화된 치료제 중 임의의 것보다 치료적으로 더욱 활성일 것이며, 조합으로 평가되는 2개 이상의 표적화된 치료제는 보다 강력하게 기능하고, 따라서 기능적으로 동반상승작용적이다. 2개 이상의 표적화된 치료제가 동반상승작용적으로 기능하는 경우에, 주어진 출력 값을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 평가될 때 환자의 세포에 접촉하는 1개 또는 2개 모두의 표적화된 치료제의 농도는 각각의 표적화된 치료제가 환자의 세포에 별도로 접촉했을 때 요구되는 것보다 적다. 예를 들어, 2개의 상호연결된 경로의 기능적 활성을 개별적으로 평가하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 각각의 경로의 출력 값을 최대화하는데 필요한 환자의 세포에 접촉하는 각각의 표적화된 치료제의 농도는 500 나노몰일 수 있다. 그러나, 동일한 2개의 상호연결된 경로의 기능적 활성이 동시에 평가되는 경우, 조합된 경로의 출력 값을 최대화하는데 필요한 환자의 세포에 동시에 접촉하는 하나 또는 두개의 표적화된 치료제의 농도는 경로를 개별적으로 평가할 때 요구된 농도보다 90% 적은 50 나노몰일 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법이 2개 이상의 표적화된 치료제의 조합이 환자의 세포에서 동반상승작용적으로 작용한다는 것을 나타내는 경우, 환자를 효과적으로 치료하는데 필요한 각각의 표적화된 치료제의 투약량은 환자를 단 하나의 표적화된 치료제로 치료할 때 요구되는 투약량보다 적을 수 있다. 기능적으로 동반상승작용인 2개 이상의 표적화된 치료제를 확인하고, 저용량의 각각의 치료제로 원하는 치료적 활성이 제공될 수 있는지 확인하기 위해, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 몇 가지 추가적인 이점을 제공한다. 첫째, 거의 모든 표적화된 치료제는 독성을 가지며, 안전성-관련된 부작용을 환자에게 제공하기 때문에 환자에게 원하는 임상적 이득을 제공하는 최저 투약량의 가능한 약물을 처방하는 것이 유리하다. 둘째, 표적화된 치료제의 안전성 및 독성 부작용이 종종 부가적이기 때문에, 많은 환자들은 각각의 표적화된 치료제에 대한 권장 투약량 수준이 독립형으로 처방된 것과 같을 때 두 가지 표적화된 치료법으로 치료를 용인할 수 없다. 2개 이상의 표적화된 치료제가 환자의 종양 세포에서 기능적으로 동반상승작용임을 선험적으로 결정함으로써, 각각의 표적화된 치료제의 더 적은 용량이 그들을 치료하기 위해 선택될 수 있고, 더 큰 용량의 2개 이상의 치료제를 용인할 수 없는 환자에 대한 부작용 가능성을 감소시켜서, 이들에 의한 치료로부터 이점을 얻을 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
상기 샘플을 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 동시에 접촉시키는 단계로서, 각각의 세트가 적어도 하나의 표적화된 치료제인 제1 제제, 및 제1 제제가 다뤄지는 것으로 의도된 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 제2 제제를 포함하며, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 신호전달 경로에 영향을 선택적으로 미치며, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉한 샘플을 생성하는 단계;
각각의 제1 제제, 또는 각각의 제2 제제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플내에서 일어나는지의 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트(들)로부터의 표적화된 치료제보다 상기 투여된 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 치료적으로 활성임을 나타내는, 시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 다루고자 하는 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 표적화된 치료제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
상기 샘플을 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 동시에 접촉시키는 단계로서, 각각의 세트가 적어도 하나의 표적화된 치료제, 및 표적화된 치료제가 다뤄지는 것으로 의도된 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 적어도 하나의 활성제를 포함하며, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 신호전달 경로에 영향을 미치며, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉한 샘플을 생성하는 단계;
각각의 표적화된 치료제 또는 각각의 활성제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
표적화된 치료제 또는 활성제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플내에서 일어나는지의 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터 표적화된 치료제를 확인하는 단계로서, 이는 표적화된 치료제가 낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트(들)로부터의 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 보다 치료적으로 활성임을 나타내는, 단계.
일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트의 제1 제제(들)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제(들)과 상이하지만, 상기 제1 제제(들)과 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
환자의 세포에서 다중 신호전달 경로를 평가하는 방법은 동일한 세포 샘플에서 다중 상이한 신호전달 경로의 동시 평가와 세포 샘플의 상이한 부분을 사용하는 다중 상이한 신호전달 경로의 병행 평가를 조합할 수 있다. 세포 샘플의 상이한 부분을 사용하는 다중 상이한 신호전달 경로의 병행 평가는 상기 하위 섹션 B에서 추가로 기재된다. 예를 들어, X, Y 및 Z로 지정된 3개의 상이한 신호전달 경로에 대해, 환자의 세포 샘플의 상이한 부분이 하기와 같이 하나 이상의 표적화된 치료제/활성제 쌍("TT/A 쌍"으로 언급됨)과 접촉될 수 있다: (i) 경로 X에만 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍: (ii) 경로 Y에만 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍; (ⅲ) 경로 Z에만 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍; (ⅳ) 경로 X에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍 및 경로 Y에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍; (v) 경로 X에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍 및 경로 Z에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍; (vi) 경로 Y에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍 및 경로 Z에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍; 및 (vii) 경로 X에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍, 경로 Y에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍 및 경로 Z에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍. 그리고나서, 최고 출력 값을 갖는 샘플은 표적화된 치료제가 환자의 암 세포에서 가장 활성임을 결정한다. 예를 들어, 경로 X에 영향을 미치는 하나의 TT/A/ 쌍 및 경로 Z에 영향을 미치는 하나의 TT/A 쌍과 접촉된 샘플이 시험된 모든 샘플의 최고 출력 값을 나타낼 경우, 그 다음 환자는 2개의 상이한 표적화된 치료제, 즉 경로 X에 영향을 미치는 치료제 및 경로 Z에 영향을 미치는 치료제를 투여받았다(상기 2개의 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험된 동일한 제제일 수 있거나, 대안적으로 경로 X 및 Z에도 영향을 미치는 상이한 제제일 수 있다). 다중 경로의 동시 및 병행 평가, 이에 기초한 가장 적합한 표적화된 치료제(들) 치료 레지멘의 선택을 조합하는 상기 분석의 비제한적인 특정 예가 실시예 3에 추가로 기재되어 있다.
일 구현예에서, TT/A 쌍은 표적화된 치료제가 다뤄지고자 하는 동일한 신호전달 경로에 각각의 활성제가 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 하나의 표적화된 치료제 및 하나 이상의 활성제를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, TT/A 쌍은 표적화된 치료제가 다뤄지고자 하는 동일한 신호전달 경로에 각각의 활성제가 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진, 하나의 표적화된 치료제 및 2개의 상이한 활성제를 포함한다.
일 구현예에서, 환자의 세포 샘플의 상이한 부분은 다중 TT/A 쌍과 접촉되며, 시험된 하나 이상의 표적화된 치료제의 농도는 동일한 부분 사이에서 다양하며, 그럼으로써 환자의 세포에서 가장 효과적인 표적화된 치료제(들)의 농도를 결정한다. 예를 들어, 환자의 세포 샘플의 일부는 신호전달 경로 X에 영향을 미치는 TT/A 쌍 및 제1 농도의 신호전달 경로 Y에 영향을 주는 TT/A 쌍과 동시에 접촉될 수 있으며, 환자 세포 샘플의 또 다른 부분은 신호전달 경로 X에 영향을 미치는 TT/A 쌍 및 제2 농도에서 신호전달 경로 Y에 영향을 미치는 TT/A 쌍과 동시에 접촉될 수 있다. 일 구현예에서, 시험된 표적화된 치료제 중 단지 하나의 농도는 다양하다(예를 들어, 신호전달 경로 X에 영향을 미치는 TT/A 쌍으로부터의 TT 농도는 변화됨). 또 다른 구현예에서, 시험된 표적화된 치료제 중 2개 이상의 농도는 다양하다(예를 들어, 신호전달 경로 X에 영향을 미치는 TT/A 쌍으로부터의 TT 농도는 다양하고, 신호전달 경로 Y에 영향을 미치는 TT/A 쌍으로부터의 TT 농도도 또한 다양하다). 이러한 분석은 어떤 표적화된 치료제가 환자의 세포에서 가장 효과적일뿐만 아니라 어느 농도가 가장 효과적인지를 그에 의해 결정할 수 있다. 일 구현예에서, 2개 이상의 표적화된 치료제의 조합에 대해 확인된 효과적인 농도는 하나 이상의 표적화된 치료제 단독의 효과적인 농도와 상이하다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이 및 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 효과적인 농도가 500 나노몰인 표적화된 치료제 단독은 상이한 신호전달 경로를 표적으로 하는 제2 표적화된 치료제와 조합하여 시험했을 때 50 나노몰(즉, 10배 더 낮은 농도)에서 효과적임이 실증되었다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 세트 및 신호전달 경로는 표 2 또는 표 12에 제시된 제제의 쌍으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro 3, Mer, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, lamins, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미친다.
또 다른 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로 이외의 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 예를 들어, 일 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 c-Met/HGF 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 에스트로겐 수용체(ER) 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 FGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 PDGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다.
또 다른 구현예에서, 에스트로겐 수용체(ER) 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 ER 계열 신호전달 경로 이외의 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 예를 들어, 일 구현예에서, ER 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, ER 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 IGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다.
또 다른 구현예에서, pan HER 신호전달 경로 억제제를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 c-Met/HGF 억제제를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, HER1/HER3 신호전달 경로의 억제제(들)를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 c-Met/HGF 억제제를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, pan HER 신호전달 경로 억제제를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 PI3K 억제제를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다. 또 다른 구현예에서, HER1/HER3 신호전달 경로의 억제제(들)를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 PI3K 억제제를 포함하는 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트와 조합하여 시험된다.
일 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 표 12에 제시된 쌍으로 된 제제의 세트로부터 선택된다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제 및 신호전달 경로는 하기 하위 섹션 및 실시예에서 추가로 기재된다.
샘플 준비 및 배양, 세포 유착 또는 부착의 지속적인 모니터링 및 수학적 분석은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로 적합한 암은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 세포의 배양 조건 및 배양은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 제제의 각각의 쌍으로 된 세트의 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합이다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제, 신호전달 경로 및 표적화된 치료제/활성제 쌍은 상기 하위 섹션 B, 하기 하위 섹션 및 실시예에서 추가로 기재된다.
G. 특이적 및 비특이적 치료제의 조합으로 경로를 평가하는 방법
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 환자의 치료를 위한 하나 이상의 치료제를 선택하는데 사용되는 방법은 하나의 활성제 및 2개 이상의 치료제를 함유하는 제제의 세트를 사용하여 환자의 암 세포에서 하나의 신호전달 경로의 기능적 활성을 평가하는 단계를 포함하며, 상기 활성제와 하나의 치료제는 동일한 신호전달 경로에 결합하고 다른 치료제(들)은 상이한 신호전달 경로 또는 세포 위치에 결합한다.
신호전달 경로가 수렴, 누화 및 피드백 루프의 여러 지점을 통해 다른 신호전달 경로 및 세포 활성에 상호연결되기 때문에 활성제 결합 부위(예를 들어, 세포 표면 수용체)에서 개시된 경로 활성을 억제하기 위해 설계된 표적화된 치료제는 그 경로와 관련된 신호전달 활성의 대부분을 억제하기에 충분하지 않을 수 있다. 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성의 대부분이 활성제와 동일한 근사치 결합 부위를 직접 표적으로 하는 매칭하는 신호전달 경로 억제제에 의해 억제될 수 없는 경우, 활성제의 결합 부위와 상이한 결합 부위를 표적으로 하는 치료법은 환자의 세포에서 개시된 신호전달 경로의 대부분이 억제될 수 있도록 표적 요법의 효능을 증진시킬 수 있다. 따라서, 활성화 및 치료제의 결합 부위와 상이한 결합 부위에 결합하는 치료제의 첨가는 표적화된 치료제의 활성화된 신호전달 활성을 억제하는 능력을 동반상승작용으로 증가시킬 수 있다. 이 접근법은 활성제 제제의 결합 부위에 대한 다운스트림의 결합 부위(예를 들어, AKT, PI3K, MEK, ERK, mTOR, DNA 염기, 핵산, 미세소관, 퓨린), 업스트림(예를 들어, ER, RAS, RAF), 또는 측면(예를 들어, 헤지혹, 노치, Wnt, c-MET, ALK, AXL, FGF)을 표적으로 하는 치료의 효과를 측정할 수 있게 하며, 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성을 가지며, 활성제 제제와 동일한 근사치 결합 부위에 결합하는 표적화된 치료제 활성제에 의해 억제된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하면, HGF(MET 리간드)에 의해 개시된 MET 신호전달 경로 활성의 40%만이 환자의 종양 세포가 MET 표적화 치료제인, 테포티닙과 접촉할 때 억제될 수 있다. 그러나 환자의 세포를 팔보시클립, CDK4/6 억제제와 같은 치료제와 접촉시키면 HGF에 의해 개시된 MET 신호전달 활성의 80%가 억제될 수 있다. 이 접근법은 환자의 세포에서 활성제와 치료제의 쌍으로 된 세트의 활성화 및 억제 결합 부위에 대한 부위 다운스트림, 업스트림 또는 측면에 결합하는 치료제의 존재 여부를 평가함으로써 환자의 세포에만 존재하는, 한 쌍의 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제의 효과를 평가하는 방법을 개선시킨다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계:
상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제, 제1 제제가 다뤄지고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 제2 제제 활성제 및 제1 제제가 영향을 미치는 신호전달 경로내 상이한 위치 또는 제1 제제와 상이한 신호전달 경로에 영향을 미치는 제2 표적화된 치료제를 상기 샘플과 동시에 접촉시킴으로써, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 제1 제제가 영향을 미치는 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제또는 제2 제제 활성제 단독, 또는 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 표적화된 치료제또는 제2 제제 활성제 단독, 또는 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
상기 제1 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는, 상기 출력 값이 사전-결정된 컷-오프값보다 큰 경우 제제의 삼중항 세트로부터의 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제이다. 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 상기 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제3 제제 표적화된 치료제이다. 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제3 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 제3 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제 둘 모두는 제1 제제 표적화된 치료제 및 제3 제제 표적화된 치료제이다. 또 다른 구현예에서, 제1 제제 표적화된 치료제 및 제3 제제 표적화된 치료제와 상이한 2개의 표적화된 치료제가 상기 대상체에게 투여되지만, 상기 2개의 투여된 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제 및 제3 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암 세포에서 다루고자 의도된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 표적화된 치료제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 샘플을 동시에 접촉시키는 단계로서, 각각의 삼중항 세트는 제1 표적화된 치료제, 제1 제제가 다루고자 의도되는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 제2 제제 활성제 및 제1 제제와 상이한 신호전달 경로 또는 제1 제제가 영향을 주는 신호전달 경로내 상이한 위치에 영향을 미치는 제3 제제 표적화된 치료제를 포함하며, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 제1 제제가 영향을 미치는 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제 단독, 제2 제제 표적화된 치료제 단독 및 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
제1 제제 표적화된 치료제 단독, 제2 제제 표적화된 치료제 단독 및 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 일어났는지 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력 값을 상기 연속적 측정의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
상기 출력 값이 상기 제1 제제 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 사전-결정된 컷오프 값보다 클 때, 상기 제제의 삼중항 세트로부터 제1 제제 표적화된 치료제를 확인하는 단계.
일 구현예에서, 표적화된 치료제(예를 들어, 제1 제제 표적화된 치료제)는 표적화된 치료제에 의해 영향을 받은 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정된다. 또 다른 구현예에서, 표적화된 치료제(예를 들어, 제1 제제 표적화된 치료제)는 표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정된다.
일 구현예에서, 제1 제제 표적화된 치료제, 제2 제제 활성제 및 제1 및 제2 제제에 의해 영향을 받는 신호전달 경로는 표 2에 제시된 제제의 쌍으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 표 12에 제시된 쌍으로 된 제제의 세트로부터 선택된다.
제3 제제 표적화된 치료제는 제1 제제와 상이한 신호전달 경로 또는 제1 제제가 영향을 미치는 신호전달 경로내 상이한 위치에 영향을 비친다. 따라서, 일 구현예에서, 제1 제제 표적화된 치료제 및 제3 제제 표적화된 치료제는 상이한 신호전달 경로에 영향을 미친다. 또 다른 구현예에서, 제3 제제 표적화된 치료제는 제1 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치지만, 제1 제제가 영향을 주는 신호전달 경로 내의 상이한 위치에 영향을 미친다(예를 들어, 제3 제제 표적화된 치료제의 결합 부위는 제1 제제 표적화된 치료제의 결합 부위의 업스트림, 다운스트림 또는 측면에 있을 수 있음).
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro 3, Mer, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 제1 제제 표적화된 치료제는 MET 신호전달 경로(예를 들어, 테포티닙)에 영향을 미치고, 제2 제제 활성제는 MET 신호전달 경로(예를 들어, MET 리간드, 예컨대 HGF)를 활성화시키고, 제3 제제 표적화된 치료제는 EGFR 억제제(예를 들어, 에를로티닙)이다. 또 다른 구현예에서, 제1 제제 표적화된 치료제는 MET 신호전달 경로(예를 들어, 테포티닙)에 영향을 미치고, 제2 제제 활성제는 MET 신호전달 경로(예를 들어, MET 리간드, 에컨대 HGF)를 활성화시키고, 제3 제제 표적화된 치료제는 CDK4/6 억제제(예를 들어, 팔보시클립)이다.
샘플 준비 및 배양, 세포 유착 또는 부착의 지속적인 모니터링 및 수학적 분석은 하기 하위 섹션에서 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로 적합한 암은 하기 하위 섹션에 기재된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 세포의 배양 조건 및 배양은 하기 하위 섹션에 더욱 상세하게 기재된다.
일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 제제의 각각의 쌍으로 된 세트에서 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합이다.
다양한 적합한 표적화된 치료제, 활성제, 신호전달 경로 및 표적화된 치료제/활성제 쌍은 상기 하위 섹션 B, 하기 하위 섹션 및 실시예에서 추가로 기재된다.
H. 신호전달 경로, 활성제 및 표적화된 치료제
종종 환자가 특정 질환이나 병태로 진단받으면 다양한 치료 옵션이 있다. 어떤 경우에는 치료가 매우 비싸거나, 또는 치료와 관련된 부작용이 심할 수 있으므로 환자가 치료에 반응군 또는 비-반응군이 될 것 같은지를 아는 것이 유용하다. 또한 환자가 내성을 갖게 되면, 환자의 이환 세포가 내성을 갖게 되어 다른 치료법이 유효할 수 있다는 것을 아는 것이 유용하다.
특정 구현예에서, 일부 환자가 반응하고 다른 환자가 반응하지 않는 증상의 치료에 사용되는 임의의 치료제 또는 제제는 본 명세서에 기재된 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 암의 경우 수많은 상이한 키메라 및 인간화된 항체를 포함하여 수많은 표적화된 면역요법이 이용가능하다. 자기면역 상태의 경우, 염증성 사이토카인 또는 이들의 수용체를 표적으로 하는 분자가 분석될 수 있다. 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 제제의 예는 항-TNFα 제제, 인터페론 알파를 표적으로 하는 제제, 인터루킨 등이다. 면역억제제, 예컨대 코르티코스테로이드, 타크롤리무스(FK-506 또는 TACR)(T-세포 대사 및 증식 억제), 시롤리무스(SIRO/81768), 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF), 칼시뉴린 억제제(CI), 사이클로스포린(CsA), 및 라파마이신(mTOR 억제제).
다른 구현예에서, 상기 방법은 개별 대상체로부터의 이환 세포의 생리적 파라미터의 변화를 일으키는 능력에 대해 하나 이상의 치료제, 섭동 요법제(예를 들어, 활성제 제제), 확인제 또는 이들의 조합의 시험을 포함한다. 구현예들에서, 치료제는 또한 표지가 없다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 치료제는 동일한 환자로부터의 이환 세포의 별개의 샘플 상에 개별적으로 또는 조합하여 시험될 수 있다. 다른 치료제보다 낮은 용량에서 세포 반응 또는 생리적 특성에서 가장 큰 변화를 일으키는 치료제가 선택된다. 가장 큰 치료 효과를 제공하는 화합물의 조합이 결정될 수 있다. 구현예들에서, 상기 결정은 치료 지수 및 다른 개별적인 안전성 및 내성 효과를 결정하기 위해 환자의 건강한 세포 또는 비-이환 환자의 건강한 세포 또는 비-이환 환자 결과의 풀과 비교될 수 있다.
신호전달 경로 활성제 및 치료제에 의해 표적화된 경로의 예는 HER2, HER3, HER4, c-MET, HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, PDGFR, FLT3, Axl, SMO, Fz, γ-세크레타제, MAPK-PK, RAS/RAF, RHO 키나제, FAK1, MEK/MAPK, MAK, MKK, AKT, PIK3/PTEN, 및 VEGFR, 세포 유착, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, 노치, G1/S 전이 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 세포주기 조절과 관련된 세포 경로를 표적으로 한다. 세포주기 조절에 영향을 주는 예시적인 제제는 사이클린 의존성 키나제, CDK4, CDK6 및 사이클린(예를 들어, 사이클린 A, B, C, D, E 또는 F, 및 G1/S 사이클린) 및 BCR-ABL을 표적으로 하는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 방향화효소 효소를 표적으로 한다.
예시적인 구현예에서, 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제는 하기 세포 과정 중 적어도 하나에 관여하는 세포 경로 상에 작용한다: MAP 키나제 신호전달, 세포자멸사, PI3K/Akt/mTOR 신호전달, 염색질/후성유전적 조절, 세포 대사, 세포주기 조절, 면역학 및 염증, 발달 및 분화, 및/또는 세포골격 조절 및 부착.
예시적인 신호전달 경로 활성제 및 이들이 표적으로 하는 경로는 하기 표 3 내지 표 12에 제공되어 있다.
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치료제는 특정 세포 경로를 표적으로 하는 제제 및/또는 세포 증식을 억제하거나 세포 살상을 유발하는 제제를 비제한적으로 포함할 수 있다. 치료제가 표적으로 하는 경로의 예는 MAPK-PK, RAS/RAF, RHO, FAK1, MEK/MAPK, MAK, MKK, AKT, EGF 수용체, Her2 수용체, Her 3 수용체, Her 4 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, PDGF 수용체, GPER30, PIK3/PTEN, VEGF 수용체 경로 억제제, 세포 유착, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, 노치, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 세포주기 조절과 관련된 세포 경로를 표적으로 한다. 세포주기 조절에 영향을 주는 예시적인 표적화된 치료제는 CDK4, CDK6, PD-1 및 사이클린(예를 들어, 사이클린 A, B, C, D, E 또는 F 및 G1/S 사이클린)을 표적으로 하는 표적화된 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 치료제는 방향화효소 효소를 표적으로 한다.
다른 구현예에서, 치료제는 수많은 소분자 및 항체 약물, 예컨대 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 이들 치료제의 표적은 공지되어 있다. Chou 및 Talalay 방법(Chou, Cancer Res., 70(2): 440-446(2010))을 사용하여 치료제의 추가의 조합이 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료제는 세포 경로의 구성원인 세포 표면 수용체를 표적으로 한다. 이들 샘플은 치료제와 접촉된 후, 샘플이 경로의 활성제 제제 또는 교란제(perturbant)로 활성화될 수 있다. 다른 구현예에서, 활성제 제제 또는 교란제는 특정 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 포스파티딜 이노시톨, 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, m-CSF, RANK 리간드, 종양 괴사 인자(TNF-α), 뉴레굴린, 에스트로겐, 프로게스테론, 폴레이트, 아데노신 삼인산, 및 FAS 리간드, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 또는 세포 경로 또는 신호전달 섭동의 다른 제제, 예컨대 대상체의 혈장 또는 혈청, Na+, K+, Mg+, Cl-, Ca+2, 글루코스, 글루타민, 히스티딘, 만니톨, 및 트립토판, 항생제(라파마이신), 필수적인 및 비-필수 아미노산, 비타민, 다른 유기 화합물, 미량 미네랄 및 무기 염, 혈청, 세포 추출물, 분획된 세포 추출물 또는 분획된 혈청, 세포외 신호전달 인자, 세포내 신호전달 인자, 인슐린, 트랜스페린, 나트륨 셀레나이트, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 포스포포릴에탄올로아민, 트리이도티로닌, 나트륨 피루베이트, L-글루타민을 포함한다. 다른 구현예에서, 치료제는 세포 증식을 억제하고, 세포 사멸을 증가시키고, 이환 상태로 유도하는 신호에 대해 세포가 반응하지 않거나 덜 반응하게 함으로써 이환 세포에 영향을 주는 것들이다. 상기 치료제의 예로는 사이클로포스파마이드, 5-FU, 카페시타빈, 및 다른 피리미딘 약물, 다른 SN-38 대사물질 유사체(예를 들어, 이리노테칸), 탁솔 및 백금 함유 약물(예를 들어, 시스플라틴)이 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 이들 제제에 대한 샘플의 반응은 또한 세포 증식을 교란시키는 성장 인자 또는 항-세포자멸적 제제의 존재 또는 부재하에 측정될 수 있다. 세포 증식을 교란시키는 성장 인자는 성장 호르몬, 표피 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자, 간세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 신경 성장 인자 및 당업자에게 알려진 다른 것들을 포함한다. 항-세포자멸적 제제는 항-세포자멸적 단백질 또는 경로를 조절하는 화합물(예를 들어, Bcl-2 단백질 활성에 대한 탁솔 및 항-세포자멸적 Ras 신호전달 캐스케이드의 제어를 위한 게피티닙)을 포함한다.
ERα 신호전달 경로에 영향을 주는 적합한 활성제 제제는 당 업계에 공지되어 있고, 본 명세서에 개시되어 있으며, 예를 들어 에스트라디올이다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포는 선택적 에스트로겐 수용체 수용체 다운 조절인자와 같은 에스트로겐 관련 신호전달 경로 활성을 억제하는 확인 제제와 추가로 접촉된다. 또 다른 구현예에서, 암 세포는 ERα 신호전달 경로를 표적으로 하는 표적화된 치료제와 추가로 접촉되고, 세포 유착 또는 부착에 대한 표적화된 치료제의 효과가 측정된다. ERα 신호전달 경로를 표적으로 하는 적합한 표적화된 치료제는 당 업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 풀베스트란트 및 타목시펜과 같이 개시되어 있다. 이 방법은 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
ErbB 신호전달 경로에 영향을 주는 적합한 활성제 제제는 당 업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다. 일 구현예에서, 생존가능한 암 세포는 ErbB 관련 신호전달 경로 신호전달을 억제하는 것으로 알려진 확인 제제, 예컨대 2C4 마우스 단클론성 항체 또는 티로신 키나제 억제제와 접촉된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포는 ErbB 신호전달 경로를 표적으로 하는 표적화된 치료제와 추가로 접촉되고, 세포 유착 또는 부착에 대한 표적화된 치료제의 효과가 측정된다. ErbB 신호전달 경로를 표적으로 하는 적합한 표적화된 치료제는 당 업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다. 이 방법은 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하기 표 13은 ErbB 신호전달 경로 암을 치료하기 위한 경로, 약물 표적 및 표적화된 요법을 요약한 것이다.
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다양한 구현예에서, 신호전달 경로는 MAPK, RHO, AKT, FAK1, RAS/RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, 및 MEK로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 적합한 신호전달 경로는 본 명세서에 개시된 다른 신호전달 경로를 포함한다. 다양한 구현예에서, 활성제 제제는 예를 들어 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합일 수 있다.
표적화된 치료제의 비제한적인 예는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287 (AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428 (BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
I. 샘플 준비 및 배양
본 발명의 구현예들은 대상체의 이환 세포에 투여될 때 치료제의 유효성을 측정하거나, 유효성을 모니터링하거나, 또는 치료제의 용량을 확인하는 시스템, 키트 및 방법을 포함한다.
종래에, 질환은 질환이 영향을 미치는 조직 또는 장기에 의해 분류되어 왔다. 내재적 기전(예를 들어, 유전적, 자가면역 반응 등)에 대한 더 나은 지식으로 인해, 동일한 조직/장기에 영향을 미치거나 동일한 증상을 유발하는 질환은 상이한 원인을 가질 수 있고 불균질 유전자 발현 프로파일을 가질 수 있음이 이해된다. 또한, 많은 질환에서 치료제에 반응군 및 비-반응군이 있음이 밝혀졌다. 구현예들에서, 반응군 및 비-반응군이 확인되는 임의의 질환 유형은 약물의 특정 치료 약물 조합체가 특정 개체에게 효과적인지 여부를 예측 또는 예상, 예를 들어, 개체가 반응군 또는 비-반응군인지 여부를 결정하기 위해 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다.
본질적으로 불균질이며, 반응군 및 많은 비-반응군을 갖는 것으로 알려진 질환 유형의 일례는 암이다. 암은 전형적으로 조직 유형에 따라 분류된다. 그러나, 암의 불균질성에 대한 보다 정확한 설명은 상이한 암의 상이한 돌연변이에 반영된다. 암의 불균질성에 대한 더욱 더 정확한 설명은 특정 환자의 세포에서 돌연변이의 실제 기능적, 생리적 결과이다. 예를 들어, 유방암은 이 장기의 암을 일으키는 상이한 유형과 상이한 돌연변이를 가지고 있다. 결과 및 치료는 암을 유발하는 돌연변이가 기능의 이득(예를 들어, 단백질 생산을 증가시키는 원종양 유전자) 또는 기능 돌연변이의 소실(예를 들어, 종양 억제인자) 및 유전자 중 어느 것인가에 따라 달라질 수 있다. 특정 암의 불균질성으로 인해, 특정 치료제에 대한 불균질 반응이 있을 것으로 예상된다. 본 발명의 구현예는 특정 대상체의 암 세포를 치료제 또는 치료제 패널로 시험하여 특정 치료제 또는 특정 대상체의 암에 대한 가장 효과적인 치료제의 효능을 결정하여 대상체에 대한 치료를 선택하게 한다.
본 발명의 구현예들은 개별 대상체로부터의 암 세포의 이환 세포 샘플을 포함한다. 이러한 암 세포는 비제한적으로, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 부신피질 암종, 항문암, 맹장암, 별아교세포종, 기저 세포 암종, 간외 담도암, 방광암, 골암, 골육종, 악성 섬유질 조직구종, 뇌간 신경아교종, 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추신경계 배아 종양, 중추신경계 생식세포 종양, 두개인두종, 상의모세포종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 수질상피종, 유방암, 중간체 분화의 송과체 실질 종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 송과체아세포종, 기관지 종양, 유암종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 피부 T-세포 림프종, 관상 암종 원위치(DCIS), 자궁내막 암, 식도암, 　비강신경교세포종, 유잉 육종, 고환외 생식세포 종양, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 섬유질 조직구증, 담낭암, 위암, 위장 유암종, 위장 간질성 종양(GIST), 임신성 융모성 종양, 신경아교종, 모발 세포 백혈병, 심장 암, 간세포 암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두 암, 소도세포 종양, 카포시 육종, 신장 세포 암, 후두 암, 구순암, 간암, 상피내 소엽 암종(LCIS), 폐암, 머켈 세포 암종, 흑색종, 중피종, 입 암, 다발성 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두 암, 신경교세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강 암, 구강인두 암, 난소암, 췌장 암, 유두종증, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 인두 암, 크롬친화세포종, 송과체 실질, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 횡문근육종, 타액샘 암, 편평상피 세포 암종, 작은 장내 암, 고환암, 인후두암, 갑상선암, 요관 암, 요도 암, 자궁암, 질암, 외음부암, 및 윌름스 종양으로부터 유래될 수 있다.
자가면역 질환은 자체 항원에 대한 면역계 활성화로 인한 염증 증가를 특징으로 한다. 현재의 치료법은 B 세포와 같은 면역계 세포 및 항 TNFα와 같은 염증성 분자를 표적으로 한다. 치료법은 면역 조절제 또는 면역 억제제로서 광범위하게 특성화될 수 있다. 약물은 TNF 알파, 인테그린, 스핑고신 수용체 및 인터류킨과 같은 특정 분자로 표적화될 수 있다. 다른 약물은 코르티코스테로이드와 같은 항-염증제 역할을 한다. 또 다른 경우, 약물은 면역억제제 예컨대 머캅토퓨린 및 사이클로포스파마이드이다. 자가면역 상태와 관련하여, 말초 혈액 세포는 특정 치료제에 대한 반응을 검사할 수 있다. 다른 구현예에서, 염증 부위의 조직 샘플, 예를 들어, 류마티스성 관절염의 활막 조직 또는 궤양성 대장염의 결장 조직.
예를 들어, 류마티스 관절염 환자 중 일부는 항-TNFα 항체에 대하여 비-반응군인 것으로 알려져 있다. 일 구현예에서, 말초 혈액 세포는 RA를 가진 것으로 의심되는 환자로부터 수득될 수 있고, 환자의 TNF 수용체 및 관련 MAPK 경로의 세포 신호전달 능력의 감소는 환자가 면역조절제 또는 면역억제제 화합물에 대한 반응군 또는 비-반응군인지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 다른 치료제, 예컨대 IL-6, 인터페론 알파, 인터페론 감마 등을 표적으로 하는 것도 동일한 방식으로 시험될 수 있다. 다른 구현예에서, 다발성 경화증을 갖는 환자는 인터페론 베타에 대해 비반응군인 것으로 알려져 있다. 대상체로부터의 세포 샘플은 약물의 패널에 대해 시험되어, 어떤 약물이 세포의 생리적 파라미터의 변화를 유도함으로써 특정 대상체에게 효과적인지를 알 수 있다. 유리한 결과의 예는 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology(ACR)) 기준에 의해 결정된 바와 같이 세포 염증 파라미터의 감소 또는 혈액-뇌 장벽 기능을 강화시키기 위한 세포 유착의 증가이다.
다른 구현예에서, 환자는 미생물, 이물질 또는 외래 제제에 의한 세포 감염에 의해 유발되는 질환을 가질 수 있다. 미생물에 감염된 혈구 또는 조직 샘플은 다양한 항생제, 항바이러스제 또는 다른 치료제 후보물질에 대한 반응성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 기능을 감소시키는 C형 간염 감염을 위한 다수의 상이한 치료제가 있으며, 감염된 조직 샘플은 하나 이상의 치료제와 접촉될 수 있고, 세포 생리적 파라미터의 변화가 검출된다. 감염된 조직의 세포 생리적 파라미터의 변화를 제공하는 치료제 및/또는 최저 용량에서 세포 생리적 파라미터의 변화를 제공하는 치료제가 선택된다. 세포 생존의 증가 또는 세포 성장의 증가와 같은 결과는 유리한 것으로 간주될 것이다. 예컨대 치료제가 특정 수용체 유형 또는 세포 경로의 활성화를 통한 바이러스 유입을 차단함으로써 직접적으로 인간 세포에 영향을 주도록 설계된 다른 구현예에서, 환자 세포는 본 명세서에서 다른 구현예에 기재된 바와 같은 상기 치료제에 의한 수용체 결합 또는 경로 활성화에 대해 시험될 수 있었다.
구현예들에서, 세포 샘플은 치료가 시작되기 전, 치료 중, 치료 후, 차도 기간 동안, 및 재발시에 수득될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 치료 전, 치료 중, 환자가 내성을 나타낼 때, 및 재발할 때의 치료 효능을 예측하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 치료제 또는 제제의 조합에 대한 반응군 또는 비-반응군을 예측하는데 또한 유용하다.
특정 구현예에서, 세포는 임의의 종류의 고정제와 접촉 또는 고정제로 처리되지 않거나, 파라핀 또는 다른 물질 또는 임의의 검출가능한 표지에 포매되지 않는다. 다른 구현예에서, 바람직하게는, 세포는 전체, 생존 가능 및/또는 표지가 없는 상태로 유지된다. 따라서, 생존가능한 일차 세포가 세포 샘플로서 사용될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 이환 조직 및 건강한 조직 모두에 대해 세포 샘플이 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 샘플은 생존가능한 형태 및 고정된 형태로 제공된다. 고정된 형태로 제공되는 세포 샘플은 특히 추가의 바이오마커의 확인 및 상관 관계를 개선시키기 위해 본 명세서에 기재된 방법에 따라 분석되는 생존가능 세포와 비교하기 위한 대조군으로서의 역할을 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예들에서, 개별 대상체의 세포는 치료 효과를 결정하는데 사용된다. 세포는 잘 알려진 방법(즉, 면봉, 생검 등)에 의해 수집 및 단리될 수 있다. 이환 세포 및 비-이환 세포 모두 사용될 수 있다. 비-이환 세포는 음성 대조군, 기준선 지표, 경시적 측정에 대한 비교 등으로 사용될 수 있다. 동일한 대상체로부터의 조직 세포의 대조군 샘플이 또한 수득될 수 있다. 대조군 샘플은 상기 대상체의 다른 건강한 조직 또는 이환 조직 샘플과 동일한 장기로부터의 건강한 조직으로부터 취할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 건강한 조직은 질환없는 개체로부터 취할 수 있다. 이환 세포는 활성 질환이 있는 조직에서 추출한 세포이다. 일 구현예에서, 이환 세포는 유방암 세포와 같은 종양 세포일 수 있다. 암 세포는 반드시 종양에서 추출할 필요는 없다. 예를 들어, 백혈병성 세포는 백혈병 환자의 혈액으로부터 수집될 수 있다. 세포는 전이 부위, 순환하는 종양 세포, 원발성 종양 부위 및 재발성 종양 부위와 같은 상이한 조직 부위로부터 수집될 수 있고, 세포 반응성은 서로 비교될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이환 세포는 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환 부위로부터 추출될 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 조직 샘플 내의 세포의 수는 바람직하게는 적어도 약 5000개의 세포이다. 다른 구현예에서, 조직 샘플 중의 세포 수는 약 5000 내지 100만개의 세포 이상일 수 있다. 세포 샘플은 비제한적으로, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 정장, 정액 혈장, 전립선 액, 사정전 유체(쿠퍼액), 배설물, 눈물, 타액, 땀, 생검, 복수, 뇌척수액, 림프, 골수, 또는 모발로부터의 단리를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 세포 샘플은 환자 혈청, 그의 분획, 유기체, 섬유모세포, 기질 세포, 간엽 세포, 상피 세포, 백혈구, 적혈구, B 세포, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 또는 이들의 조합을 함유하거나, 이들로부터 유래될 수 있다.
일 구현예에서, 대상체로부터의 세포 추출은 (예를 들어, 실험실, 병원에서) 신호전달 경로 활성을 평가하는 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CReMS 시스템)과 동일한 위치에서 수행된다. 이와 같이, 세포는 잘 알려진 전달 매질에서 현탁 또는 보존되어, 대상체로부터 바이오센서까지의 시간을 연결시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 대상체로부터의 세포 추출은 신호전달 경로 활성을 평가하는 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CReMS 시스템)과 상이한 위치에 있다. 일단 수득된 세포 샘플은 세포 생존력을 유지하는 배지에서 유지된다. 분석 부위로 수송하는데 걸리는 시간의 길이에 따라 다양한 배지가 사용될 수 있다. 구현예들에서, 조직 샘플의 수송이 최대 10시간 필요로 할 때, 배지는 400 mosm/L 미만의 오스몰농도를 가지며, Na+, K+, Mg+, Cl-, Ca+2, 글루코스, 글루타민, 히스티딘, 만니톨, 및 트립토판, 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하며, 필수 아미노산을 함유하고, 및 인간 일차 세포의 증식 및 플레이팅 효율을 지원하기 위해 비-필수 아미노산, 비타민, 기타 유기 화합물, 미량 미네랄 및 무기 염류, 혈청, 세포 추출물 또는 성장 인자, 인슐린, 트랜스페린, 나트륨 셀레나이트, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 포스포포릴에탄올로아민, 트리아이오도티로닌, 나트륨 피루베이트, L-글루타민을 추가로 함유할 수 있다. 이와 같은 배지의 예는 셀시오(Celsior) 배지, 로스웰 파크 기념 연구소 배지(RPMI), 행크 완충 식염수 및 맥코이(McCoy) 5A, 이글의 필수 최소 배지(EMEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 라이보비츠 L-15, 또는 그의 변형을 일차 세포 케어의 실시를 위해 포함한다. 구현예들에서, 배지 및 컨테이너는 내독소가 없고 비발열성이며, DNase- 및 RNase-미함유이다.
다른 구현예에서, 개별 대상체의 조직 샘플로부터 수득된 이환 세포는 조직 샘플의 분쇄 및 효소 분해, 추출된 세포의 세포 유형별 분리 및/또는 추출된 세포의 배양을 포함하는 단계를 사용하여 추출된다. 배양 시약은 다양한 보충물, 예를 들어 환자 혈청 또는 환자 유래 인자를 포함할 수 있다.
추가의 양태는 개별 대상체에서 치료제의 효능을 결정하기 위해 후속적으로 사용될 수 있는 조직 샘플로부터 유기체를 추출하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 분쇄 및 효소 분해 단계를 포함한다. 추가의 양태는 개별 대상체에서 치료제의 효능을 결정하기 위해 후속적으로 사용될 수 있는 조직 샘플로부터 유기체를 배양하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 분쇄, 효소 분해, 세포 유형별 분리 및 배양 단계를 포함한다. 추가의 양태는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해 그렇게 단리된 세포의 특이적 재조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체로부터의 생존가능 세포 샘플에서 신호전달 경로 활성을 평가하기 전에, 세포는 먼저 혈청이 없는 배지 및 평가될 신호전달 경로(즉, 대상체의 세포에서의 유효성에 대해 평가되는 표적화된 치료제에 의해 다뤄지는 신호전달 경로)를 교란시킬 수 있는 임의의 제제에서 배양되어, 세포가 생리적 상태 및 경로 활성화와 관련하여 동기화된다. 특정 구현예에서, 세포 샘플은 혈청 및 성장 인자가 없는 배지에서 배양된다. 다른 구현예에서, 세포는 인간 일차 세포의 증식 및 플레이팅 효능을 지원하기 위해 기능 세포 환형 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 기능적 갑상선 수용체 및/또는 기능적 G-단백질-커플링된 수용체(또는 상기 언급된 특성 중 2개 또는 3개의 임의의 조합)를 유지하는 배지에서 배양된다.
일 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고, 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 항-세포자멸제의 비-제한적인 예는 키나제 억제제, 프로테아제 억제제, 스트레스 억제제, 사멸 수용체 억제제, 사이토크롬 C 억제제, 로우-연관된 키나제 억제제를 포함하는, 아노이키스 억제제, ALK5 억제제, 카스파제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 산화환원 완충제, 반응 산소 종 억제제, TNFα 억제제, TGFβ 억제제, 사이토크롬 C 방출 억제제, 칼슘 채널 활성화 없는 탄산탈수소효소 길항제, 인테그린 안정화제, 인테그린 리간드, Fas 억제제, FasL 억제제, Bax 억제제 및 Apaf-1 억제제를 포함한다.
일차 세포 샘플, 예를 들어 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포 샘플의 제조를 위한 추가의 적합한 배양 조건은 PCT 출원번호 PCT/US2016/057923호에 상세히 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
J. 샘플 분석
본 발명의 시스템 및 방법은 본원에서 세포 반응 측정 시스템(CReMS)으로 언급되는 시스템을 이용한다. CReMS는 세포, 세포내 및 세포간, 세포와 계측 장치 간의 생리적 파라미터의 변화를 정량적으로 측정할 수 있는 장치(예를 들어, 바이오센서)를 지칭한다. 생리적 파라미터의 변화는 (비-제한적인 예, 예컨대 세포외 기질, 세포 신호전달 분자, 또는 세포 증식, 조직, 세포, 대사물, 이화대사물, 생체분자, 이온, 산소, 이산화탄소, 탄수화물, 단백질 등을 포함하는) 피분석물의 변화를 측정함으로써 측정된다. 구현예들에서, 바이오센서는 단리된 전체의 표지없는 생존가능한 세포에서의 생리적 파라미터의 변화를 측정한다. 구현예들에서, 치료제 및/또는 활성제 제제의 유형으로 인한 예상되는 변화를 측정할 수 있는 바이오센서가 선택된다.
CReMS의 예로는 바이오센서가 있다. 바이오센서의 예로는 전기화학적 바이오센서, 전기 바이오센서, 광학 바이오센서, 질량 민감성 바이오센서, 열 바이오센서, 및 ISFET 바이오센서가 있다. 전기화학적 바이오센서는 전위차, 전류측정 및/또는 전압전류 특성을 측정한다. 전기 바이오센서는 표면 전도도, 임피던스, 저항 또는 전해질 전도도를 측정한다. 광학 바이오센서는 형광, 흡수, 투과율, 밀도, 굴절률 및 반사율을 측정한다. 질량 민감성 바이오센서는 압전 결정의 공명 빈도를 측정한다. 열 바이오센서는 반응열과 흡착열을 측정한다. ISFET 바이오센서는 이온, 원소 및 산소, 이산화탄소, 글루코스 및 생명 과학 분야의 기타 대사물과 같은 간단한 분자를 측정한다. 구현예들에서, 바이오센서는 임피던스 장치, 광자 결정 장치, 광학 도파관 장치, 표면 플라즈몬 공명 장치, 석영 결정 공명기/미량천칭 장치 및 마이크로캔틸레버 장치로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 구현예들에서, 광학 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서 분자 인식 또는 분자 활성화 이벤트를 변환하기 위한 광학 변환기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 장치는 임피던스 장치이다.
단백질 또는 기타 시험관내 생체분자 상호작용을 측정하는데 사용되는 바이오센서의 예에서, 특정 단백질 덩어리의 포착은 유의미한 생화학적 및 생체물리학적 값으로 변환된다. 포착된 특정 단백질의 분자량을 포함하는 포착된 질량을 갖는 간단한 계산을 적용하여, 몰수를 평가하여 평형 결합 상수 및 당 업계에 숙련된 사람들에게 알려진 다른 상호작용 기술 값을 유도한다. 세포 검정에 사용되는 바이오센서의 예에서, 세포 표면 상의 특이적인 접착 분자는 특정 세포 경로를 통해 외부 화학 물질 또는 다른 자극을 가하면 센서 및 기타 주변 세포의 표면에 가까운 부착 및 형태를 조절한다.
바이오센서는 자극에 반응하기 위해 이용되는 세포 내에서 자극 및 경로에 고유한 방식으로 선택될 수 있는 이러한 조절을 검출할 수 있다. 상기 세포 검정을 위한 바이오센서 결과는 적절하게 설계될 때 분자 및 기능적 측면에서 최상으로 정량적일 수 있다. 상기 바이오센서 결과는 추가 특이성을 위한 일시적인 반응 패턴일 수 있다. 세포내 특정 경로를 켜고 끄는 것으로 알려진 생 분자 활성제 또는 섭동제는 CReMS 바이오센서 신호의 특이성을 결정하기 위한 컨트롤로 사용될 수 있다. 바이오센서 결과의 일시적 반응의 곡선 디콘볼루션(예를 들어, 대조군 반응과의 비선형 유클리드 비교)을 위한 방법이 적용되어, 특정 세포 반응을 보다 미세하게 상세히 설명될 수 있다. 세포 바이오센서 검정에서 외부 자극을 적정하여 생화학적 및 생체물리학적 파라미터 설명을 추가로 제공할 수도 있다.
무표지 센서의 한 예는 고주파수 석영 진동자 또는 석영 결정 미량천칭(QCM) 또는 공명 캔틸레버이다. 공명기는 그의 표면 상에 패턴화된 금속 전극을 갖는 석영 결정을 포함한다. 석영 물질은 전압이 인가될 때 잘 특성규명된 공명 특성을 가지고 있다. 특정 주파수에서 전극에 교대 전압을 인가함으로써, 결정은 특성 주파수에서 진동할 것이다. 진동 주파수는 질량이 센서 표면에 포착될 때 정량적 방식으로 조절되며; 부가적인 질량은 낮은 공명기 주파수를 초래한다. 따라서 석영 진동자의 공명 주파수의 작은 변화를 측정함으로써 연구중인 생체분자 또는 세포에 표지를 부착하지 않으면서, 증착된 질량의 매우 작은 변화가 측정될 수 있다.
이온 선택적 전계 효과 트랜지스터(ISFET) 소자는 선택된 이온, 원소 및 산소, 이산화탄소, 포도당 및 생명 과학 분야의 기타 대사물과 같은 간단한 분자를 측정할 수 있는 소형화된, 나노 규모의 소자이다. 이들은 전기기계적 작동의 수준뿐만 아니라 생체적용 수준에서도 광범위하게 기재되었다. 현재까지는 특정 환자의 세포에 의해, 그의 반응 또는 저항성 또는 일시적인 패턴을 질환 과정에서의 치료적 개입으로 분별하는 용도로 설명되지 않았다.
광학 바이오센서는 센서 표면에 결합된 빛의 일부 특징에 있어서 측정가능한 변화를 일으키도록 설계되었다. 이 접근법의 이점은 여기 공급원(센서의 조명 공급원), 검출 변환기(반사되거나 투과된 광을 모으는 장치) 및 변환기 표면 자체 사이의 직접적인 물리적 연결이 필요없다는 점이다. 즉, 광학 바이오센서에 전기 연결을 할 필요가 없으므로 센서를 대부분의 생물학적 시스템을 안정화하고 연구하는데 필요한 유체와 인터페이스시키는 방법을 간소화한다. 질량을 직접 검출하는 대신, 모든 광학 바이오센서는 검출가능한 물질의 유전율에 의존하여 측정가능한 신호를 생성한다. 유전체 유전율의 변화는 자유 공간에서의 광속과 매체에서의 광속의 비율의 차이와 관련이 있다. 이 변화는 본질적으로 매질의 굴절률을 나타낸다. 굴절률은 형식적으로 매질의 유전 상수의 제곱근으로 정의된다(이 관계에 대한 보다 명확한 처리를 위한 Maxwell의 공식 참고). 광학 바이오센서는 단백질, 세포 및 DNA와 같은 모든 생물학적 물질이 자유 공간의 유전 상수보다 높은 유전 상수를 갖는다는 사실에 의존한다. 따라서, 이 물질들은 모두 그들을 통과하는 빛의 속도를 늦추는 고유 능력을 가지고 있다. 광학 바이오센서는 생물학적 물질을 포함하는 매질을 통해 빛의 전파 속도의 변화를 센서 표면 상에 포착되는 생물학적 물질의 양에 비례하는 정량화가능한 신호로 변환하도록 설계되었다.
다른 유형의 광학 바이오센서는 비제한적으로 엘립소미터, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 디바이스, 이미지형성 SPR 디바이스, 격자 커플링된 이미지형성 SPR 디바이스, 홀로그램 바이오센서, 간섭 바이오센서, 반사측정 간섭 분광법(RIFS), 비색계 간섭 바이오센서, 차이 간섭계, Hartman 간섭계, 이중 분극화 간섭계(DPI), 도파관 센서 칩, 통합된 입력 격자 커플러 디바이스, Chirped 도파관 격자 디바이스, 광자 결정 디바이스, 유도된 모드 공명 필터 디바이스 기반 목재 이상, 삼각형 은 입자 어레이를 포함한다. 또한, 비제한적으로 가시광선, 자외선, 근적외선 및 적외선을 포함하는 전자기 스펙트럼의 다양한 파장을 측정하는 장치를 추가로 포함한다. 작동 방식은 비제한적으로 산란, 비탄성 산란, 반사, 흡광도, 라만, 투과율, 횡 전기파 및 횡 자기파를 포함한다.
표면 플라즈몬 공명 장치는 국소 굴절률의 변화를 감지하여 금속 표면에서 생체분자의 결합 현상을 측정하는 광학 바이오센서이다. 일반적으로 고효율 SPR 기기는 오토-샘플링 로봇, 고해상도 CCD(전하-커플링된 디바이스) 카메라 및 플라스틱 지지체 플랫폼에 4개 이상의 어레이 세포가 포매된 금 또는 은-코팅된 유리 슬라이드 칩으로 구성된다. SPR 기술은 특정 금속 인터페이스, 특히 은 및 금에 여기될 수 있는 표면 플라즈몬(특수 전자기파)을 이용한다. 입사광이 임계각보다 큰 각도로 금속 인터페이스와 커플링되면, 반사광은 입사광으로부터 표면 플라즈몬으로의 에너지의 공명 전달에 의한 반사율의 급격한 감쇠(SPR 최소)를 나타낸다. 표면에서의 생체분자의 결합은 국소 굴절률을 변화시키고, SPR 최소값의 변화를 초래한다. SPR 신호의 변화를 모니터링함으로써 표면에서 결합 활성을 실시간으로 측정할 수 있다.
SPR 측정은 굴절률 변화를 기반으로 하기 때문에, 피분석물의 검출은 무표지이고 직접적이다. 피분석물은 임의의 특별한 특성 또는 표지(방사성 또는 형광성)을 필요로 하지 않으며, 다단계 검출 프로토콜을 필요로 하지 않고 직접 검출될 수 있다. 측정을 실시간으로 수행할 수 있으므로, 반응속도 데이터 및 열역학 데이터를 수집할 수 있다. 마지막으로, SPR은 광범위한 분자량 및 결합 친화도를 통해 다수의 피분석물을 검출할 수 있다. 따라서, SPR 기술은 세포 반응 측정 시스템으로 유용하다.
살아있는 환자 세포의 복소 임피던스 변화(델타 Z 또는 dZ)의 측정을 위한 CReMS는 임피던스(Z)가 옴의 법칙(Z = V/I)에 의해 기술된 바와 같이 전압 대 전류의 비와 관련된 본 구현예에 기재된다. 예를 들어, 환자 세포가 부착된 전극에 일정한 전압이 인가되어, 차동 주파수에서 세포 사이 및 세포를 통해 흐르는 전류를 생성한다. 이 CReMS는 세포와의 전극 인터페이스에서 국소 이온 환경에 민감하며, 이러한 변화를 전압 및 전류 변동의 함수로 감지한다. 정상적인 기능 또는 그의 활성화로 인한 세포의 생리적 변화는 전극 주변의 전류 흐름에 대한 정량화가능한 변화를 초래하고, 그와 같은 CReMS에서 측정된 신호의 규모 및 특성에 영향을 미친다.
특정 구현예에서, 바이오센서는 이벤트 특이성을 갖는 전반적인 표현형의 변화를 검출한다. 전반적인 표현형은 pH, 세포 유착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 세포 주기, 동화작용, 이화, 소분자 합성 및 생성, 턴오버, 및 호흡, ATP, 칼슘, 마그네슘, 및 다른 충전된 이온, 단백질, 특이적 경로 구성원 분자, 다양한 세포 구획에서의 DNA 및 또는 RNA, 게놈, 및 프로테오믹스, 번역후 변형 및 기전, 이차 메신저의 수준, 생리적 기능을 갖는 cAMP, mRNA, RNAi, microRNAs 및 다른 RNA, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 반응 파라미터를 포함한다. 이벤트 특이성과 관련하여, 상기 유형의 치료제 및/또는 활성제 제제에 대한 예상된 변화인 세포 샘플에서의 변화를 반영하는 세포 파라미터가 선택된다. 예를 들어, 치료제가 세포골격 요소를 표적으로 하는 것으로 알려진 경우, 그러한 제제와 접촉된 세포는 제제의 존재 하에서 세포 유착의 변화를 나타낼 것으로 기대된다.
다른 구현예에서, 부착 패턴의 변화는 세포 유착의 변화이다. 어떤 경우에는 세포 유착의 변화가 굴절률의 변화 또는 임피던스의 변화로 나타난다. 또 다른 구현예에서, 부착 패턴의 변화는 기저 형태의 변화, 세포 밀도의 변화, 또는 세포 크기 또는 세포 형상의 변화이다. 특정 구현예에서, 기저 형태의 변화는 세포 극성의 변화이다. 구현예에서, 세포 신호전달의 감소는 세포골격 조직화의 변화를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본원의 방법은 표지가 없고 실시간으로 측정할 수 있는 세포 샘플의 분석을 제공한다. 일 구현예에서, 분석된 세포 샘플은 표지가 없고, 생존가능하며, 세포를 고정시키는 임의의 처리를 받지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 키트에 사용되는 치료제 및/또는 활성제 제제는 또한 표지가 없다. 현재까지 효과적인 방법으로 치료 효능을 결정하는데 표지없는 방법이 적용되지 않았다.
무표지 검정은 표지 검정의 시간 및 오해 여지가 있는 합병증을 감소시킴으로써 스크리닝 캠페인의 시간과 비용을 줄일 수 있다. 유전자 발현, 유전자 돌연변이 및 단백질 기능을 확인하고 정량할 수 있는 검정은 대규모 병렬 처리가 가능한 포맷으로 수행된다. 수천에서 수백만의 단백질-단백질 또는 DNA-DNA 상호작용은 무표지 검정을 사용하여 보다 경제적으로 동시에 수행될 수 있다.
다양한 종류의 표지 방법과는 달리, 분자 상호작용을 검출할 수 있는 방법은 상대적으로 적고, 표지가 없는 세포 기능에 대해서는 훨씬 적다. 무표지 검출은 치료제 및 활성제 제제의 분자 접힘에 대한 표지의 효과, 세포에서의 활성 부위 차단, 또는 세포 내에 효과적으로 배치될 수 있는 실험에서 모든 분자에 동등하게 기능하는 적절한 표지를 찾을 수 없는 실험적 불확실성을 제거한다. 무표지 검출 방법은 검정 발달에 필요한 시간과 노력을 크게 간소화시키면서 켄칭, 유효 기간 및 배경 간섭으로부터 실험적 인공물을 제거한다.
표지는 생화학적 및 세포 기반 검정의 주류이다. 표지는 모든 검정 방법의 대부분을 차지하며, 살아있는 인간 세포에서 복잡한 동적 활성을 연구할 때 특히 여러 가지 문제를 극복해야 한다. 방사성 표지를 사용하면 다량의 오염 물질이 생성되며, 이를 사용하는 사람에게 (세포 수준에서) 해를 막기 위한 규제 방법이 있는 전문 시설에서 사용해야 한다. 형광단의 여기/방출 효율은 시간과 빛에의 노출에 의해 저하되며, 표지의 정확성과 정밀성을 떨어뜨리고 일시적 정보를 얻을 수 없도록 엔드 포인트 방식으로 한 번만 판독해야 한다. 모든 표지-기반 검정은 균질하고 균일한 방식으로 표지를 부착하는 공정을 개발하고, 표지가 선형으로 정량적이며, 측정되는 상호작용 또는 공정을 방해하거나 영향을 미치지 않을 것이라고 결정할 때 상당한 시간량을 요구한다. 복합 혼합물에서의 표지의 균일한 도포는 공정이 자연적으로 진행하는데 필요한 모든 분자의 존재로 인해 복잡하다. 표지를 추가하면 해당 분자 기능을 간접적으로 가시화할 수 있을 뿐만 아니라 전체 시스템 기능을 직접적으로 (즉, 일부 확장된 가정이 필요할 수도 있음) 가시화할 수 있다. 세포 활성은 표지로 정확하게 측정하기가 더욱 어렵다. 유용한 테스트는 표지가 세포와 관련하여 적절한 위치에 적합한 분자 상에, 올바른 방법으로 도달하는 방법을 알아내야 하고, 표지가 정상 세포 과정을 방해하지 않는지 확인해야 한다.
무표지 검출은 일반적으로 DNA 분자, 펩타이드, 단백질 또는 세포와 같은 생물학적 화합물 또는 생물학적 성질의 일부 물리적 특성을 직접 측정할 수 있는 변환기의 사용을 포함한다. 모든 생화학 분자와 세포는 센서 유형을 사용하여 그의 존재 유무, 증가 또는 감소 및 변형을 나타내는데 사용될 수 있는 부피, 질량, 점탄성, 유전체 유전율, 열용량 및 전도도에 대한 유한한 물리적 값을 갖는다. 또한 생체 시스템은 분자를 이용하여 에너지를 공급하고, 유한 환경에서 pH와 같은 측정가능한 변화를 일으키는 그의 생명 과정, 예컨대 O2/CO2 소비/생성, 글루코스 생산/소비, ATP 생산/소비를 수행한다. 센서는 이러한 물리적 특성 중 하나를 정량화가능한 신호, 예컨대 측정될 수 있는 전류 또는 전압으로 변환할 수 있는 변환기로서 기능한다.
어떤 경우에는, 변환기를 바이오센서로 사용하기 위해, 변환기의 표면은 단백질 또는 특정 세포 유형과 같은 특정 물질을 선택적으로 포획할 수 있어야 하며, 원하지 않는 물질을 부착시키지 않아야 한다. 선택적인 검출 능력은 변환기의 표면에 화학 분자의 특정 코팅층을 형성함으로써 제공된다. 센서 표면에 부착된 물질을 센서 코팅이라고하며, 검출된 물질을 피분석물이라고한다. 따라서, 일부의 경우, 바이오센서는 변환기에 부착되는 물질로부터 측정가능한 신호를 생성할 수 있는 변환기와 시험 샘플로부터 표적화된 피분석물에 결합할 수 있는 수용체 리간드를 함유하는 특정 인식 표면 코팅의 조합이다.
특정 구현예에서, 코팅은 특정 세포 성분 또는 경로와 관련된 바이오센서에 대해 선택된다. 예를 들어, 세포 생리적 파라미터가 세포 유착의 변화인 경우에, 세포 샘플 내의 세포와 바이오센서 표면의 접착을 제공하는 코팅이 선택된다. 구현예들에서, 바이오센서에 대한 세포의 접착을 향상시키는 코팅은 세포외 기질, 파이브로넥틴, 인테그린 등을 포함한다. 다른 구현예에서, 세포 표면 마커에 기초하여 특정 세포 유형에 결합하는 코팅이 선택된다. 구현예들에서, 이러한 세포 표면 마커는 분화 클러스터(CD), CD20, CD30, EGFR, HER2 수용체, HER3 수용체, HER4 수용체, VEGFR 및 기타 세포 표면 암 바이오마커를 포함한다.
다른 구현예에서, 바이오센서는 생체분자 코팅으로 코팅된다. CReMS 표면 접촉 세포는 세포의 첨가 전에, 세포의 첨가 동안 또는 세포의 첨가 후에 생체분자 코팅을 함유할 수 있다. 코팅 물질은 합성, 천연, 동물 유래, 포유동물 유래, 또는 센서 위에 배치된 세포에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 코팅은 인테그린, 아드헤린(adherins), 카드헤린(cadherins) 및 기타 세포 접착 분자 및 세포 표면 단백질(예를 들어, 파이브로넥틴, 라미닌, 빈트로넥틴, 콜라겐, 세포간CAMs, 혈관CAMs, MAdCAMs), 또는 그의 유도체에 속하는 것으로 알려진 세포외 기질 성분을 포함할 수 있으며, 또는 천연 생화학적 라이신 및 오르니틴을 기반으로 하는 중합체 분자인 폴리라이신 또는 폴리오르니틴과 같은 생화학 물질을 포함할 수 있으며, 아미노산과 같은 자연 발생 생화학 물질에 기초한 중합체 분자는 천연 생화학적 생화학적 화합물의 이성질체 또는 거울상 이성질체, 항체, 항체의 단편 또는 펩타이드 유도체, 특정 세포 표면 단백질을 바이오센서에 부착시키도록 설계된 보체 결정 영역(CDR)을 사용할 수 있다.
생존가능 세포를 마이크로플레이트에 부착시키는 방법은 예를 들어 센서 마이크로플레이트 표면을 바이오센서의 표면과 상호작용하도록 설계된 일 단부 및 펩타이드 상의 작용기와 반응하도록 설계된 다른 단부를 갖는 반응성 분자로 코팅하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 금-코팅된 바이오센서를 사용할 때, 반응성 분자는 황 원자 또는 바이오센서 표면과 화학적으로 상호작용하도록 설계된 다른 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 분자의 다른 말단은 예를 들어 펩타이드 상의 아미드 또는 카복시기와 특이적으로 반응할 수 있다.
바이오센서 표면에 생존가능한(예를 들어, 일차 세포)를 부착시키는 방법은 또한 PCT 출원 제 PCT/US2016/0579023 호에 상세히 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 명시적으로 편입된다.
또 다른 예에서, 바이오센서 표면은 반데르발스력, 수소 결합, 정전 인력, 소수성 상호작용, 또는 당 업계에서 실시되는 것과 같은 이들의 임의의 조합을 통해 부착하는 분자로 코팅되어 단백질을 적용할 수 있다. 세포외 기질(ECM) 분자는 또한 제1 표면 분자 코팅에 첨가될 수 있다. Humphries 2006 일견의 인테그린 리간드. Journal of Cell Science 119 (19) p3901-03은 본 발명에서 유용한 접착 분자를 기술한다. 특정 세포 부착 분자와 접촉하는데 사용될 수 있는 추가의 ECM 분자는 Takada 등, 게놈 Biology 8:215 (2007)의 표 1에 기재된 것들을 포함한다. 본 실시예는 세포-ECM 및 세포-세포 유착에 관여하는 인테그린을 위한 것이다. 많은 다른 접착 분자는 생리적 조절 및 반응과 관련된 특성으로 기재되어 있다(하기 표 14 참조).
Figure pct00021
Figure pct00022
추가의 코팅물은 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해 환자 세포를 바이오센서에 근접하게 가져오기 위해 환자 세포 표면 단백질에 친화성을 갖는 것으로 공지된 항체 또는 다른 단백질을 포함할 수 있다. 또한 환자 세포가 원하는 방식으로 마이크로플레이트에 부착되었는지 확인하는 것이 유익할 수 있다. 특정 바이오센서 코팅물은 센서 코팅을 특정 세포 경로에 연결함으로써 특정 환자 세포 유형의 특정 세포 신호 및 활성화 및 치료제에 대한 세포 신호 반응을 향상, 개선, 명확화, 분리, 또는 검출하는데 추가로 사용될 수 있다(예를 들어, Hynes, 인테그린, 세포, 110:673-687 (2002) 참고). 바이오센서는 세포를 시딩하는 영역을 포함한다. 예를 들어, 바이오센서는 세포를 시딩하기 위한 웰들을 포함하는 미세적정 플레이트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 세포 샘플은 구별된 위치에서 표면에 물리적 흡착에 의해 바이오센서 상에 시딩될 수 있다. 바이오센서는 1, 10, 24, 48, 96, 384개 또는 그 이상의 구별된 위치를 포함할 수 있다. 세포 샘플은 약 100 내지 약 100,000개의 개별 세포 또는 그 사이의 임의의 세포 수를 포함할 수 있다. 최적의 세포 샘플은 바이오센서 상의 별개의 위치의 크기 및 특성에 좌우된다. 세포 샘플은 약 5000개 이하; 약 10,000개 이하의 세포; 약 15,000개 이하의 세포; 약 20,000개 이하의 세포; 약 25,000개 이하의 세포; 또는 약 50,000개 이하의 세포를 포함할 수 있다. 세포 샘플은 약 1000 내지 약 2500개의 세포; 약 1000 내지 약 5000개의 세포; 5000 내지 약 10,000개의 세포; 약 5000 내지 약 15,000개의 세포; 약 5000 내지 약 25,000개의 세포; 약 1000 내지 약 10,000개의 세포; 약 1000 내지 약 50,000개의 세포; 및 약 5000 내지 약 50,000개의 세포를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 반응 또는 생리적 파라미터의 변화는 정해진 기간에 걸쳐 측정된다. 다른 구현예에서, 정해진 기간은 대조군 세포가 생리적 파라미터의 출력 변화가 20% 이하로 변하는 정상 상태에 도달하는데 걸리는 시간량이다. 다른 구현예에서, 상기 변화는 1시간 이내에 세포에서 관측된다. 다른 구현예에서, 변화는 적어도 1분 내지 약 60분 동안 및 매분마다 세포에서 관측된다. 다른 구현예에서, 세포 반응의 변화는 약 10분 내지 약 1주 또는 200시간 측정된다. 다른 구현예에서, 치료제가 세포 경로를 표적으로 하는 경우, 세포 반응은 약 10분 내지 약 5시간, 약 10분 내지 약 4시간, 약 10분 내지 약 3시간, 약 10분 내지 약 2시간, 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 30분 또는 그 사이의 임의의 시점에 측정된다. 다른 구현예에서, 치료제가 세포 증식 또는 세포 살상 또는 세포 내성에 영향을 줄 때, 세포 반응은 약 1시간 내지 약 200시간 측정된다. 또 다른 구현예에서, 1분 내지 200시간의 반응(그렇지 않으면 전체 시간 패턴으로 기재됨)의 조합이 사용되어, 세포에 대한 화합물의 치료 효과 및 저항성을 발현시키는 세포의 능력을 결정할 수 있다. 이 기간에는 환자의 정황적 반응 및 유지를 평가하는데 중요한 단기 경로 신호전달, 동적 재프로그래밍 및 장기간 세포 반응의 중요한 과정이 포함된다.
특정 대상체의 세포가 바이오센서에 시딩되면 기준선 측정이 결정될 수 있다. 기준선 측정은 동일한 세포 샘플 또는 대조군 세포 샘플에서 취할 수 있다. 대조군 샘플은 건강한 세포 또는 동일한 환자 및/또는 동일한 조직의 이환 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플은 활성제 또는 작용제를 받지 않는 이환 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플은 제제에 반응하는 것으로 알려진 이환 세포를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대조군 샘플은 제제에 반응하지 않는 것으로 알려진 이환 세포를 포함한다. 대조군 샘플은 세포 건강, 세포 대사 또는 세포 경로 활성에 관한 표준화된 반응을 유도하도록 설계된, 특정 환자의 건강한 세포 또는 이환 세포에 대한 활성제 제제의 적용을 포함할 수 있다.
통제는 각각의 질환 및/또는 약물 유형에 따라 결정된다. 일 구현예에서, 이는 동일한 환자로부터의 건강한 세포 대조군에 대한 비교 또는 비-이환 환자 집단에 대한 결과(예를 들어, 정상 기준 범위)와의 비교를 포함한다. 예를 들어, 세포 살상 약물의 경우, 이 방법은 건강한 세포보다 이환 세포를 죽이는 효과가 있어 상당한 치료 지수를 달성할 수 있다. 다른 구현예는 경로 기능 및 약물에 의한 제어를 결정하기 위한 경로 도구의 사용을 포함한다. 표적화된 치료제의 경우, 도구는 경로를 교란시키고 활성화를 방해할 표적 약물의 능력을 결정하기 위한 대조군으로 사용되는 활성제 제제(예를 들어, 활성제 제제), 생물반응제 또는 소분자일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포에 대한 약물의 생리적 효과는 언급하는 활성제 제제에 의한 외인성 섭동없이, 예를 들어 산소 소비의 시간 패턴 또는 속도, 산성화의 속도 또는 일시적인 패턴, 이온 플럭스 또는 대사물 턴오버 없이 측정된다.
특정 구현예에서, 바이오센서 신호는 연속적 시간 경과에 걸쳐 측정된다. 약물 치료에 대한 환자 세포 반응을 나타내는 시간 대 바이오센서 신호 플롯에 특유의 패턴이 있다. 이러한 패턴의 평가는 유효한 이벤트의 존재를 확인하는데 유용하다. 시간 경과 또는 지속적으로 변화하는, 생존 및 완전 기능성 세포의 측정은 특정 시점만을 대표하는 전형적인 전체 세포 검정에서 사용된 현재의 실시법보다 유익하다. 본 명세서에 기재된 방법은 동적 시스템을 환자에서 발생하는대로 측정하고 환자 반응을 결정하는 가장 정확한 수단을 나타낸다. 경로 반응의 경우, 완전한 시간 경과 또는 일시적 패턴의 기록은 보다 복잡한 분석을 지원하는 능력이 뛰어나며, 단일 측정에 대한 최적의 시점을 선택하지 않아도 된다.
대조군에 대한 비교는 일시적 최대치, 최소치 또는 최대 신호-최소 신호 간의 차이로, 또는 동일한 환자의 생존가능한 이환 세포에 대한 교란 및 비교란 웰들의 비교 또는 양성 또는 음성 대조군 웰들에 대한 테스트 웰의 시간 경과 플롯 또는 다른 비-선형 비교(예를 들어, 차이 벡터의 합산)를 위한 곡선 아래의 적분 면적(AUC)을 비교함으로써 발생할 수 있다. 바이오센서로 측정하는 것만으로도 뒷받침되는 추가 분석은 최대치/최소치에 도달하는 시간과 일시적 시간 경과의 다른 유도체이다. 장기간의 반응의 경우, 비교 시간은 며칠 또는 1주 치료 또는 약물의 다중 적용 후 특정 시점일 수 있다. 더 긴 시간 코스는 약물 치료의 시작, 중간 또는 말기에 기울기의 변화를 비교하거나, 시간 대 바이오센서 신호 플롯의 제2 유도체를 비교할 수 있다. 대조군에 비해 유의미한 변화는 세포 대사의 감소와 관련된 바이오센서 신호의 절대적인 저하를 포함할 수 있다. 대안적으로, 저하에 이어서, 검정 동안 약물에 대한 저항성의 발생을 나타낼 수 있는 증가가 뒤따를 수 있다. 추가로, 비-선형 유클리드 분석을 사용하여 완전한 시간 경과에 걸쳐 대조군과 환자 샘플 간의 총 차이의 측정을 생성할 수 있다. 이것은 환자의 결과 예측과 관련해서도 중요하다.
특정 구현예에서, 정의된 시간에 걸친 바이오센서의 출력은 세포 지수로서 표현된다. 세포 지수는 테스트 개시점에서의 임피던스 변화이다. 세포 지수는 임피던스의 측정으로서 정의되며, 예를 들어 10 kHz의 고정된 전기 주파수 및 고정 전압에서 측정함으로써 본 발명의 일례에 적용될 수 있다.
및 방정식에 의해 계산됨
세포 지수i = (Rtn - Rt0)/F
식 중:
i = 1, 2 또는 3 시점
기기가 10 kHz 주파수에서 작동할 때 일례에서 F = 15 ohm
Rt0는 시점 T0에서 측정된 배경 저항이다.
Rtn은 세포 부가, 세포 생리적 변화 또는 세포 섭동 후의 시점 Tn에서 측정된 저항이다.
세포 지수는 세포 상태를 나타내기 위해 측정된 전기 임피던스의 상대적 변화로 도출된 무차원 파라미터이다. 세포가 존재하지 않거나 전극에 잘 부착되지 않으면, CI는 0이다. 동일한 생리적 조건 하에서, 전극에 더 많은 세포가 부착되면 CI 값이 더 크다. 따라서, CI는 웰에 존재하는 세포 수의 정량적 측정 값이다. 또한 세포 형태, 기저 상태, 안정 또는 휴지기 상태의 변화, 세포 유착 또는 세포 생존력을 포함한 세포 생리적 상태의 변화는 CI의 변화로 이어질 것이다.
세포 지수는 개시점 또는 기준선 임피던스 측정에 기초하여 존재, 밀도, 부착 또는 변화를 정량적으로 측정한 것이다. 기준선 개시점 임피던스는 물리적으로 관측가능한 특성이며, 약물이나 다른 활성제로 임의로 치료하기 전에 세포의 건강, 생존력 및 생리 상태의 조짐을 나타낸다. 기준선 개시점은 CELx 테스트를 위한 정 성적 대조군으로 사용될 수 있다. 약물 또는 활성제의 첨가는 임피던스가 세포에 의해 경험되는 세포 생리적 변화의 특이성을 반영하는 일시적인 패턴에서 변화되도록 한다. 예를 들어 세포 형태, 세포 수, 세포 밀도, 세포 유착 또는 세포 생존력과 같은 세포 생리적 상태의 변화는 세포 지수의 변화로 이어질 것이다.
생리적 반응 파라미터는 세포주기 분석을 추가로 포함할 수 있으며, 기능적 및 기능이상 경로와 연관된 환자 세포에서 형광 염료가 접합된 또는 비접합된 다른 비색계 변화와 같은 화학적 바이오센서의 임의의 수를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 비접합된 염료를 사용하는 세포 모집단에 대한 세포주기의 변화는 프로피듐 아이오다이드 또는, DNA로 삽입되고 DNA 양의 변화를 평가함으로써 성장 및 복제의 G0, G1, S, G2, Gm 단계를 통한 세포 순환과 상호연관된 것으로 알려져 있는 유사한 염료로 정량화될 수 있다. 하나의 염료 유형, 프로피듐 아이오다이드를 사용하면 G2/M 상 세포의 형광은 G0/G1 상 세포의 형광보다 2배 높을 것이다. 프로피듐 아이오다이드는 또한 RNA로 개재할 수 있으며, 종종 RNA와 비교하여 DNA로부터 형광 신호를 구별하기 위해 리보뉴클레아제가 사용된다. 예로는 세포주기 체크포인트에 연결된 특정 단백질에 특이적인 염료가 포함되며, 추가의 세포주기 상태 측정을 제공한다. 본 명세서에 비제한적으로 연결된, 이러한 측정을 수행하는데 유용한 일반적인 악기는 형광 현미경검사, 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사, 유세포측정, 형광분석법, 형광분극화, 균질 시간 분해 형광 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)이다.
비접합된 염료는 대사 파라미터 예컨대 동화작용, 이화, 소분자 합성 및 생성, 턴오버, 및 호흡을 측정하면서, 세포 또는 경로의 생리적 상태의 화학적 바이오센서로서 본 발명에 의해 이용될 수 있다. Warburg 효과로 명명된, 잘 알려진 세포 생리적 반응은 종양 및 다른 이환 세포내에서 산화적 인산화로부터 에너지 생성을 위한 락테이트 생산으로의 이동을 설명하며, 주요 신호전달 경로, 종양유전자 및 종양 억제인자(예를 들어 비제한적으로 Akt, mTor, c-myc, p53)는 본 명세서에 기재된 화학 바이오센서 방법에 의해 또는 광-전자 바이오센서에 의해 측정될 수 있다. 세포 반응에서 세포질 산소 소비 또는 호흡 및 당분해가 양성자를 생성하고 용존 산소 및 자유 양성자의 농도 또는 산성도를 신속하고 쉽게 측정할 수 있는 변화를 일으킨다.
화학 바이오센서를 이용하는 생리적 반응 파라미터의 추가의 비제한적 예는 ATP 존재(예를 들어, CellTiterGlo 및 유사한 루시퍼라제 유도 검정)의 정량화에 기초한 배양 중 세포에 의해 이용되는 ATP의 양, 대사적으로 활성 및 불활성인 세포 기능의 지표이다.
생체분자 접힘 및 기능에 중요한 칼슘, 마그네슘 및 기타 하전된 이온은 생리적 반응으로 인해 유동적이다. 또한 화학적 바이오센서, 예컨대 Cal-520, 오레곤 그린 BAPTA-1, fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, 칼슘 녹색-1, 및 특정 이온 착화 및 측정을 위한 다른 EGTA 또는 EDTA-유사 화학 물질로 측정될 수 있다. 이러한 생리적 반응 파라미터는 많은 유형의 비접합된 반응성 또는 결합 염료 또는 기타 전자 또는 분광 수단을 사용하여 측정될 수 있다. 이 방법들 중 많은 것들이 동일한 세포 모집단의 생리적 기능이 경시적으로 반복적으로 계속 측정되도록 하는 세포에 비파괴되도록 배열될 수 있다.
천연 세포 단백질 결합 리간드에 부착되거나 또는 면역 입자(항체 또는 항체 단편 또는 고특이성 고친화도 합성 분자, 압타머) 또는 핵산 중합체 하이브리드화 프로브에 부착된 것들과 같은 접합된 염료가 사용되어, 다양한 세포 구획, 게놈 및 프로테오믹스에서 단백질, 특정 경로 구성원 분자, DNA 및/또는 RNA와 관련된 생리적 반응 파라미터를 측정하고 특정 번역후 변형 및 기전을 측정할 수 있다. 세포 조절의 번역후 변형 및 후성유전적 수단은 비제한적으로 리보자임, 키나제, 포스파타제, 유비퀴티나제, 데유비퀴티나제, 메틸화효소, 탈메틸효소, 및 프로테아제를 포함하는 경로 기능을 수행하는 다수의 효소에 의한 조절을 포함할 수 있다. 죽은 세포의 포르말린 고정 파라핀 실장된 샘플을 염색하는데 사용되는 이러한 분자의 예는 하기에 확인될 수 있다: DAKO 면역조직화학 염색 방법 교육 가이드 - 제6판 또는 세포 신호전달 기술 자습서 및 적용 가이드 http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=tutorials-and-application-guides. 이들 2가지 예는 생세포 반응을 측정하기 위한 본 발명에 더욱 유용할 수 있다. 이 측정을 수행하는데 유용한 일반적인 도구는 비제한적으로, 형광 현미경검사, 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사, 유세포측정, 형광분석법, 균질한 시간 분해 형광, 형광 분극화, 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)이다.
접합된 및 결합되지 않은 염료의 조합도 세포의 생리적 반응을 측정하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 활성화 후, 생리적 반응을 조절하는 수용체의 한 유형은 GPCR이다. 그들은 2개의 신호전달 경로를 통해 정보와 대조군 세포를 전송한다: 이차 메신저 이노시톨(1,4,5) 삼인산(IP3)에 의해 유리된, 이차 메신저 cAMP의 수준 변화, 또는 세포내 Ca2+ 수준의 변화. cAMP 검출은 예를 들어, GPCR 반응 및 후속 항체 결합을 위한 세포 cAMP와 경쟁하는 d2-표지된 cAMP 및 크립테이트-표지된 항-cAMP 항체(또는 다른 면역포획 분자)를 사용하는 경쟁적 면역검정에 기초할 수 있다. 특정 신호(즉, 에너지 전달)는 표준 또는 샘플의 cAMP 농도에 반비례한다.
생리적 기능을 갖는 mRNA, RNAi, 마이크로RNA 및 다른 RNA를 정량화함으로써 생리적 반응을 측정하는 것은 전사 수준에서 세포 변화의 활성화를 결정하기 위해 본 발명의 실시와 함께 이용되는 매우 민감한 방법일 수 있다. RNA는 예를 들어 rtPCR, qPCR, 선택적 서열 탐침검사, 선택적 서열 포착, 및 모든 화학 센서를 사용하는 서열 하이브리드화 방법을 사용하여 본 명세서에 비제한적으로 열거된 것들로 정량화될 수 있다.
면역-포착 및 하이브리드화 방법에는 비드 기반 방법, 예컨대 Luminex 또는 광섬유 기술, 예컨대 Illumina 또는 단백질, DNA, RNA 또는 다른 하이브리드화 마이크로어레이 기술이 포함되며, 상기 특정 포착 시약은 세포로부터 생리적 반응 분자(들)을 꺼내고, 단리하고, 정확하게 측정하기 위해 사용되는 단단한 표면 상에 고정된다. 이 방법은 단일 실험에서 다수의 반응 파라미터를 측정할 수 있는 이점을 제공한다.
세포 반응 또는 생리적 파라미터의 변화는 기준선 측정치와의 비교에 의해 결정된다. 세포 파라미터 또는 생리적 반응의 변화는 CReMS의 유형에 좌우된다. 예를 들어, 세포 반응의 변화가 광학적으로 결정된다면, 화학적 흡광도 또는 투과율, 표면 플라즈몬 측정 장치의 변화 또는 광자 결정 장치에 의해 검출된 변화에 대한 스펙트럼 파장에서의 광학 밀도의 함수로서 물리적으로 관측가능한 변화가 측정될 수 있다. 세포 파라미터 또는 생리적 반응의 변화가 전기적으로 결정되면, 예를 들어 전극에 부착된 세포의 밀리 또는 마이크로 임피던스 변화를 사용하여 물리적으로 관측가능한 변화가 측정될 수 있다. 이온 선택적 전계 효과 트랜지스터(ISFET)를 사용하여 pH, 글루코스, 이산화탄소 또는 이온의 변화가 전자적으로 측정될 수 있다.
다른 구현예에서, 변화율은 치료제에 대한 세포 생리적 반응의 차이를 결정하는데 필요한 기간 동안 CReMS 반응을 측정하는 방법에 의해 결정된다. 변화율은 시간 경과 데이터의 다양한 해석에 의해 기술되며, 속도의 가속도를 포함하여 속도 또는 추가의 미분 함수로 표현될 수 있다.
환자의 생리적 병태를 측정하는 시험은 하나 이상의 컷오프 값을 도출할 수 있으며, 그 이하에서는 환자가 다른 임상 결과를 경험할 것으로 예측된다. 구현예들에서, 세포 반응의 변화를 결정하기 위한 하나 이상의 컷오프 값은 하기를 포함하는 방법에 의해 결정된다: 표준 편차, 신호대 잡음비, 표준 오차, 분산 분석, 또는 공지된 반응 세포 샘플로부터의 샘플 세트 및 공지된 비반응 환자로부터의 샘플 세트의 통계적 유의도에 대한 적절한 신뢰 구간을 결정하기 위해 당 업계에서 실시된 것들에 의해 알려진 다른 통계적인 시험 값을 결정하는 단계; 및 둘 사이의 차이를 결정하고 두 그룹에 대한 신뢰 구간들 사이의 컷오프 값을 설정하는 단계. 추가의 구현예는 질환이 없는 것으로 공지된 환자로부터의 CReMS 반응에 의해 정의된 정상 참조 범위로부터 결정된 컷오프를 이용한다. 이 구현예에서, 단일 환자 질환 물질 시험 결과는 본 발명의 다른 곳에서 추가로 기재된 교란된 및 비섭동 생존가능한 암 세포 결과를 비-이환 기준 범위 간격과 비교함으로써 보고된다.
정상적인(건강한) 기준 범위 테스트 결과는 건강한 대상체의 정상 조직을 사용하여 연구를 수행하여 "정상적인" 경로 활성을 확립한다. 그리고나서, 시험 결과는 이환 경로(예를 들어, 바이오마커 음성 환자)를 가질 것으로 예상되지 않는 임의의 환자가 정상적인 기준 간격 연구로부터 유래된 값과 비교할 때 사실상 비정상 경로 활성을 갖는지 여부를 평가한다. 본 발명의 결과는 또한 현재 질환으로 진단받은 대상체(바이오마커 양성 환자)로부터 측정한 것에 대한 바이오마커-음성 환자에서 관측된 비정상적인 측정치와 비교하여, 바이오마커-음성 환자가 비정상적인 및 바이오마커 양성 환자의 경로 활성과 비교할 만한 경로 활성을 갖는 환자인지 관측한다. 경로 활성을 방해하려는 치료에서 현재 혜택을 받고 있는 환자의 경로 활성에 필적하는 비정상적인 경로 활성을 갖는 환자는 경로 질환을 갖는 것으로 진단될 것이며, 따라서 상기 경로 활성을 방해하기 위해 바이오마커를 표적으로 하는 약물로 치료되어야 한다.
따라서, 본 발명은 의사가 이환 경로의 기능적 활성에 기초하여 질환을 진단하는 보다 정확한 수단을 개발할 수 있게 한다. 이는 단일 바이오마커가 원인 모델이 아닌 상관 관계에 의존하여 측정될 때 취하는 접근법과 대조적이다. 현재의 바이오마커 접근법은 높은 백분율의 위음성 및 위양성 결과를 초래할 수 있다. 본 발명은 거짓 결과의 백분율을 감소시킬 것이다.
바람직한 구현예는 80~90% 신뢰 구간을 포함하고, 더욱 바람직한 구현예는 > 90% 신뢰 구간을 포함하고, 가장 바람직한 구현예는 > 95% 또는 > 99% 신뢰 구간을 포함한다.
구현예들에서, 컷오프 값을 사용하고 샘플을 블라인드 해제하여, 블라인드된 공지된 샘플의 상태를 반응군 또는 비-반응군으로서 결정하고 샘플의 상태를 예측하는 정확도를 결정함으로써 컷오프값이 유효화된다. 단일 컷오프 값의 경우, 컷오프 값 아래로 떨어지거나 공지된 반응군에 대한 출력 값에 더 가까운 출력 값은 환자 샘플이 치료제에 대한 반응성을 나타냄을 나타낸다. 출력 값이 컷오프 출력 값 이상이거나 공지된 비-반응군 출력 값에 대한 출력 값에 더 가깝다면, 세포 샘플은 치료제에 대한 비-반응군으로 확인된다. 일부 구현예에서, 정의된 기간에서의 바이오센서의 출력 값은 무반응, 약한 반응성 또는 반응성으로 분류된다.
바람직한 구현예에서, 컷오프 값 및 블라인드 해제된 샘플을 사용하여, 블라인드된 공지된 샘플의 상태를 질환 경로 반응을 갖는(예를 들어, 비정상적인 EGF 신호전달을 갖는 암 환자) 상태 또는 질환 경로 반응을 갖지 않는(예를 들어, 정상적인 EGF 신호전달을 갖는 암 환자) 상태로 결정함으로써 및 샘플의 상태 예측 정확도를 결정함으로써 컷오프 값이 입증된다. 단일 컷오프 값의 경우, 컷오프 값 미만이거나 또는 질환 경로 반응을 갖지 않는 샘플의 출력 값에 더 가까운 출력 값은 환자 샘플이 경로 질환을 나타내지 않음을 나타낸다. 출력 값이 컷오프 값 이상이거나 공지된 이환 경로 샘플 값에 대한 출력 값에 더 가깝다면, 세포 샘플은 이환 경로 존재로 확인된다. 일부 구현예에서, 정의된 기간에서의 바이오센서의 출력 값은 존재하지 않는 경로 질환, 확정적인 경로 질환, 또는 존재하는 경로 질환으로 분류된다.
출력을 카테고리로 분류하기 위해 정의된 기간에서의 출력 값이 선택된다. 다른 구현예에서, 정의된 기간은 세포가 바이오센서에서 연속적으로 모니터링되는 기간의 종점이다. 다른 구현예에서, 기간은 적어도 60분, 240분, 300분, 10시간, 24시간, 60시간 또는 120시간이다. 바람직한 구현예에서, 정의된 기간에서의 출력은 30분 내지 10시간이다. 보다 바람직한 구현예에서, 정의된 기간에서의 출력은 180분 내지 600분, 또는 240분이다.
다른 구현예에서, 암 환자의 무작위로 선택된 모집단의 암 세포는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 시험된다. 암 환자의 모집단에서 수득된 암 세포는 광범위한 신호전달 활성 수준 또는 출력 값을 나타낼 것으로 기대된다. 신호전달 활성 수준 또는 출력 값의 모집단 분포를 특징분석하기 위해, 통계적인 분석 소프트웨어(예를 들어, 믹스 툴, 유한 혼합물 모델 분석을 위한 R 패키지)를 사용하여 개별 출력 값의 다른 통계적인 분석 또는 유한 혼합물 모델 분석이 수행된다. 분석된 암 환자의 모집단 내에서 두개 이상의 그룹이 확인되면, 한 그룹의 평균 출력 값과 두번째 그룹 또는 다른 그룹의 평균 출력 값 사이의 컷오프 값이 선택된다.
구현예들에서, 무 반응으로 분류된 출력 값은 치료제 또는 치료제로 처리되지 않은 대조군 세포를 투여하기 전의 기준선의 출력 값과 적어도 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하 상이한 출력 값으로 표시된다.
다른 구현예에서, 약 반응성으로 분류된 출력 값은 치료제 또는 치료제로 처리되지 않은 대조군 세포를 투여하기 전의 기준선의 출력 값과 적어도 50% 이하 및 5% 초과 상이한 출력 값으로 표시된다. 다른 구현예에서, 반응성으로 분류된 출력 값 백분율은 치료제 또는 치료제로 처리되지 않은 대조군 세포를 투여하기 전의 기준선과 적어도 50% 초과 상이한 출력 값으로 표시된다. 구현예들에서, 대조군 샘플은 동일한 대상체로부터의 이환 세포 샘플이고 치료제로 처리되지 않은 샘플이다.
본 명세서에 기재된 방법의 또 다른 양태는 개별 대상체에서 치료제의 효능을 예측하는데 사용될 수 있는 알고리즘을 개발하는 방법을 포함한다. 알고리즘은 개별 대상체의 건강 양태를 정의하는 하나 이상의 환자 특성에 할당된 값과 조합하여, 본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 도출된 값을 통합한다. 환자의 특성은 비제한적으로, 전이의 존재, 전이의 위치, 결절 상태, 암의 초기 진단으로부터 전이 진단까지의 무질환 간격, 보조 화학요법의 수혜, 다른 약물 요법의 수혜, 방사선 치료 요법의 수혜, 질환의 우세한 부위, 종양질량 크기, 체질량 지수, 연관절 수, 부종 관절 수, 통증, 장애 지수, 의사 종합 평가, 환자 종합 평가, 배쓰 강직 척추염 기능적 지수(Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index), 배쓰 강직 척추염 질환 활동 지수, 배쓰 강직 척추염 계측 지수, C-반응성 단백질, 총 요통, 염증, 유전 상태, 다른 질환의 병력, 다른 생명 유지 관련 건강 통계 상태, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이들 값을 통합하는 알고리즘은 치료제가 치료하고자 하는 질환을 가진 환자 모집단에서 질환 진행과의 상관 관계에 따라 이들 값을 가중시킨다. 차별적인 반응과 임의의 상관 관계를 입증하지 않은 질환 특성은 알고리즘에 포함되지 않는다.
일 구현예에서, 환자 특성을 나타내는 수치는 시험 결과(즉, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 치료제, 활성제 제제, 치료제(들) 및 활성제 제제(들)의 조합 등에 대한 반응성을 결정하는 방법으로부터 유도된 값)의 회귀 분석 및 활성제(들) 등), 환자 특성 및 연구된 환자군의 임상 결과로부터 유래될 수 있다. 일 예에서, 환자 특성 데이터에 기초한 변수와 조합된 테스트 결과를 사용하는 알고리즘의 최적화는 0.10으로 시작하는 폭 0.10의 9개의 등간격으로 이격된 컷 포인트에 기초하여 테스트 출력 값을 10개의 간격으로 나누어 수행될 수 있다. 각각의 컷 포인트에 대해, 콕스(Cox) 회귀는 대상체가 컷 포인트보다 작거나 같은 알고리즘 값을 갖는 경우 "1", 및 그렇지 않은 경우 "0" 값을 취하는 지표 변수를 사용하여 실행될 수 있다. 컷-오프 이하 대 컷-오프 이상에서 이들의 비교치인 위험 비율은 각각의 컷-오프에 대해 결정될 것이다. 그런 다음 추정된 위험 비율을 최소화하는 컷 포인트의 값이 선택된다.
예를 들어, 환자의 총 종양 질량이 특정 값 이상인 경우, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 결정된 약물에 대한 그들의 반응성은 약물에 반응하지 않는 환자들에 대하여 발견된 중간 결과를 넘어서 환자의 잠재적인 무 진행 기간을 연장시키기에 충분하지 못하다는 것을 발견할 수 있다. 약물이 환자에게 기능적이며, 이로부터 얻어지길 기대되는 것과 다름을 테스트 결과가 나타내는 경우, 환자의 특성 변수를 포함하는 알고리즘은 종양 질량 변수가 테스트 결과 값을 상쇄하므로 결과가 불확실하다고 보고한다.
본 명세서에 기재된 방법의 또 다른 양태는 표적화된 치료제에 반응할 가능성이 있거나 그렇지 않을 가능성이 있는 환자를 확인하는 테스트에 대한 컷오프 값을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제로 처방된 환자 그룹을 선택하는 단계, b) 환자 그룹 내의 각각의 대상체에 대한 테스트 값을 도출하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 사용하는 단계, c) 테스트를 받은 환자 전체의 상당 부분이 사전규정된 임상 종점에 도달하고, 그들이 사전규정된 임상 종점에 도달했다면 각각의 환자가 도달하는데 필요한 시간을 기록하기에 충분한 일정 기간에 걸쳐 시험된 환자 그룹의 각각의 구성원의 건강 상태를 관측하는 단계, d) 다른 값과 동일한 값을 갖는 2개 이상의 후보 컷오프 값을 식별하는 단계로서, 여기서 각각의 후보 컷오프 값은 환자가 반응하거나 반응하지 않을 것으로 예상되는 이하의 값을 나타내고, 환자가 스코어가 컷오프 값 이하로 떨어진 환자와 반대되는 방식으로 반응할 것으로 예상되는 이상의 값을 나타내는 단계, e) 통계적 방법을 사용하여 테스트 값이 컷오프 또는 그 이하인 환자의 임상 종점 기간과 테스트 값이 컷오프 이상인 환자의 임상 종점 기간 사이의 차이를 분석하는 단계, 및 f) 컷오프 값 선택 환자의 컷-오프 값의 위와 아래의 환자의 그룹 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있음을 나타내는 후보 컷오프 값 그룹 사이의 치료에 반응하지 않을 것으로 예측된 환자의 가장 큰 백분율을 차지하는 컷오프 값을 선택하는 단계.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 세포가 동일한 치료제로 시험된 동일한 질환을 가진 다른 개체로부터 유도된 시험 값과 비교될 수 있는 개별 대상체에 대한 수치 시험 결과 값을 유도하는 것이 가능하다. 이것은 a) 동일한 질환을 갖고 동일한 치료법으로 시험된 개별적인 대상체 그룹에 대한 테스트 결과 값을 기록하고, b) 그 값을 목록으로 컴파일링하고, c) 각각의 개별 대상체의 절대 수치 테스트 값에 기초하여 시험된 개별 대상체에 대한 테스트 결과 값에 기초하여 목록을 정렬하고, d) 개별 대상체의 테스트 값의 백분위수 랭킹을 결정하는 단계에 의해 개별 대상체에 대한 치료제의 효능을 예측하는 것을 가능하게 하며; 개별 대상체의 테스트 값의 백분위수 랭킹은 개별 대상체에서 질환에 대한 치료제의 효능을 예측한다.
또 다른 구현예는 동일한 치료법의 효능을 시험하는 임상 시험으로부터 얻은 결과를 분석하여 특정 결과의 백분위수 랭킹을 추정한 다음, 개별 대상체의 테스트 값에 대한 백분위수 랭크를 확인하고, 동일한 백분위수 랭킹에 해당하는 임상 시험 종점 결과를 확인하는 것을 포함하며, 각각의 대상체 테스트 값과 동일한 백분위수 랭킹을 얻은 임상 시험 종점 결과는 개별 대상체가 질환의 치료제로부터 얻을 가능성이 있는 임상 결과를 예측한다. 임상 시험 종료점은 예를 들어 시간-진행 기간, 무 진행 생존 기간, 전체 생존 기간, 객관적 반응 기간, ACR 반응, 총 샤프 스코어의 변화, 침식 점수 및 관절 공간 축소, 임상 반응, 통증, 장애 지수, 임상적 차도, 체-표면적 침범, 의사의 전반적인 평가, 및 건선의 면적 및 심각도 지수를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예는 본 명세서에 기재된 방법으로부터 유도된 시험 결과 값과 시험된 치료제를 투여받은 개체에 대한 임상 결과 사이의 통계적인 상관관계를 결정하는 방법을 포함한다. 이 방법은 하기를 포함한다: a) 환자 각각이 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제로 처방된 환자 그룹을 선택하는 단계; b) 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 개체에 대한 테스트 결과 값을 도출하는 단계; c) 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제로 시험된 환자의 그룹내 각각의 대상체에 대한 테스트 결과 값의 목록을 컴파일링하는 단계, d) 사전규정된 임상 종점에 도달하기 위해 검사된 전체 환자의 상당한 백분율에 대해 충분한 일정 기간에 걸쳐 시험된 환자의 그룹의 각각의 구성원의 건강 상태를 관측하는 단계, e) 각각의 환자가 사정규정된 임상 종점에 도달했다면, 도달하는데 필요한 시간의 길이를 기록하는 단계, f) 종점 결과와 테스트 값 사이의 통계적인 관계가 결정되는 방식으로 종점 데이터(예를 들어, 시간-진행 기간, 무 진행 생존, ACR 반응)를 분석하는 단계.
예를 들어, 일단 임상 시험 결과가 이용가능하면, 컷오프 값 - "C*"의 추정값 결정은 하기와 같이 진행된다. Cox 회귀 테스트에서 테스트 값이 시간-진행(time-to-progression, TTP)과 같은 환자 결과를 예측한다고 가정하면, 테스트 값은 0.10에서 시작하여 폭이 0.10인 9개의 동일 간격으로 이격된 컷 포인트를 기준으로 10개의 간격으로 분할될 것이다. 각각의 컷 포인트에 대해 Cox 회귀 분석은 대상체가 컷 포인트보다 작거나 같은 검정 값을 갖는 경우 값 "1"을 취하고, 그렇지 않으면 "0"을 취하는 지표 변수를 사용하여 실행될 것이다. 컷오프 값 이하 대 컷오프 이상의 비교인, 위험 비율은 각각의 컷 포인트에 대해 결정될 것이다. 추정된 위험 비율을 최대화하는 컷 포인트의 값은 연구의 후속적인 중심 단계에서 사용하기 위해 선택될 것이다. 최종 분석을 위해 Cox 비례 위험 회귀를 지표 변수(컷 포인트 이하 대 컷 포인트 이상)와 비교하여 실행할 수 있다. 최종 분석에는 TTP의 다른 예측적 환자 특징적인 변수도 포함될 수 있다.
치료제가 세포 표면 수용체에 결합하는 표적화된 치료제일 경우, 세포 반응성의 변화는 수용체에 결합하는 활성제 제제 또는 섭동제의 부재 또는 존재하에 측정된다. 구현예들에서, 치료제는 활성제 또는 섭동제 전, 동시 또는 후에 세포 샘플에 투여된다. 구현예들에서, 활성제 제제 또는 섭동제는 표지가 없다. 세포 표면 수용체의 밀도에 관계없이, 기초 측정 및 임의로 다른 치료제와 비교하여 활성제 제제 또는 섭동제에 대한 세포 반응성을 억제하는 치료제가 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 수용체의 밀도와 무관하게 활성제 제제 또는 섭동제의 작용을 억제하는 치료제가 선택된다.
생리적 파라미터의 변화는 기준선 또는 건강한 또는 교란되지 않은 세포 대조군과 비교하여 파라미터의 증가 또는 감소일 수 있다. 변화는 전체 효능작용, 슈퍼효능작용, 비가역적 효능작용, 선택적 효능작용, 공-효능작용, 역 효능작용, 또는 부분적인 제한 효능작용, 가역적 및 비가역적 길항작용, 경쟁적 길항작용, 비-경쟁적 길항작용, 부-경쟁적 길항작용을 나타낼 수 있었다. 상기 변화는 적절한 대조군에 비해 더 빨리, 늦게 또는 전혀 발생하지 않을 수 있다. 상기 변화는 더 길거나 더 짧은 기간 동안 발생하도록 선택될 수 있다. 가역적 또는 비가역적인 변화들이 선택될 수 있다.
예를 들어, 세포 신호전달의 감소를 초래하는 치료제는 자가면역 상태의 치료를 위해 선택될 것이다. 사이토카인의 작용을 억제하는 제제에 반응하는 말초 혈액 세포는 세포 신호전달의 감소를 나타낸다. 또 다른 예로서, Her2와 같은 수용체를 표적으로 하는 인간화된 항체와 같은 항암제에 반응하는 이환 세포의 경우, 이환 세포는 EGF 계열 경로 신호전달에서 상당한 감소를 보일 것이다. 다른 경우, 항-혈관신생제에 반응하는 이환 세포에 대해, 이환 세포는 VEGF 경로 신호전달의 감소 또는 증식능력의 감소를 나타낼 것이다. 각각의 유형의 제제에 대해 측정된 CReMS 반응 또는 물리적으로 관측가능한 특성은 약물이 불법으로 설계된 의도된 생리적 반응에 의존하며, 필요에 따라 특이적 또는 일반적일 수 있다. 핵심은 CReMS를 생리적 측정에 사용하여, 일정 기간 약물이 의도한 반응을 테스트하는 것이다.
특정 치료제 또는 제제는 이환 세포 및 선택적으로, 건강한 세포에 투여되어 특정 치료제 또는 치료제의 유효성을 결정할 수 있다. 이환 세포 및/또는 건강한 세포는 또한 치료되거나 치료되지 않은 이환 및/또는 건강한 세포에서 치료제 또는 치료제의 효과를 비교하기 위해 치료되지 않을 수 있다. 단일 치료제를 투여하여 대상체가 치료적 처치에 어떻게 반응할지를 결정할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상이한 치료제의 패널이 특정 대상체의 세포에 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 경로의 활성화를 억제하기 위한 치료제의 효능에 대한 컷오프 값은 일 구현예에서 약물을 첨가하고 생리적 반응을 측정함으로써 결정된다. 또 다른 구현예에서, 경로는 약물 전처리 유무에 관계없이 섭동된다. 85% 신뢰 구간에서 또는 이상적으로 90% 신뢰 구간보다 길거나 이상적으로 95% 또는 99% 신뢰 구간보다 큰 경우 생리적 기준선 신호 변화 또는 약물에 의한 활성화 신호의 감소는 효과적이라고 간주된다. 구현예들에서, 세포 증식을 억제하거나 세포 살상을 강화하는 치료제의 효능에 대한 컷오프 값은 시간에 따른 생리적 반응을 기록함으로써 결정된다. 85% 신뢰 구간에서 또는 이상적으로 90% 초과 신뢰 구간에서, 또는 이상적으로는 95% 또는 99% 초과 신뢰 구간에서 약물에 의한 비-치료 또는 건강한 세포 또는 이들의 조합과 비교하여 생리적 기준선 신호 또는 일시적인 패턴으로부터 편차로의 환원이 유효한 것으로 간주된다.
개별 대상체의 질환을 치료하기 위한 치료제의 민감성 및 특이성은 특정 표적에 대해 설계된 바와 같이 약물이 작용하고 있는지를 결정하기 위해 CReMS에 의해 측정된 세포 생리적 경로 반응을 비교하고, 효능에 대한 컷오프 값이 획득되었음을 결정함으로써 결정된다.
일부 구현예에서, 활성제 제제 및/또는 치료제는 어느 한 제제에 대한 힐 슬로프, EC50 또는 IC50 값을 얻기 위해 적정된다. 활성제 제제 적정 및/또는 치료제 적정으로부터 수득된 데이터는 어느 한 제제의 효력(어느 농도가 최대 효과의 절반을 달성하는지) 및/또는 효능(최대 달성가능한 효과)을 평가하는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태는 활성화 제제 또는 치료제를 적정하여 IC50 값을 발현시킴으로써 대상체로부터 수득된 이환 세포를 사용하여 개별 대상체에서 치료제의 효능을 예측하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 활성제는 세포 경로 활성을 감소시키며, 치료제는 세포 경로 활성을 고갈시킨다.
일 구현예에서, 개별 대상체에서 질환에 대한 제제의 치료 효능을 결정하는 방법은 하기를 포함한다: 세포 반응 측정 시스템(CReMS)에서 개별 대상체로부터의 적어도 하나의 단리된 이환 세포 샘플에 상기 제제를 투여하는 단계; 및 제제에 대한 세포 샘플의 세포 반응 파라미터의 변화가 기준선 측정 값과 비교하여 일어나는지 여부를 결정하여, 제제가 개별 대상체에서 질환에 대한 치료적 효능을 나타냄을 상기 세포 반응 변화가 나타낸다. 구현예에서, 방법은 세포 반응 측정 시스템에서 개별 대상체로부터의 적어도 하나의 단리된 이환 세포 샘플에 치료제 투여 전후에 세포 반응 경로를 교란시키는 활성제 제제 또는 섭동제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
이 테스트는 1 nM 이하에서 100 uM 이상까지의 농도 범위에서 약물의 유효성을 측정할 수 있으며, 일반적으로 표준 편차가 20% 미만이고 최적으로 표준 편차가 5% 미만이다. 화합물 테스트 범위는 최대 허용 용량으로 알려진 약물 패키징 표지에 정의된 투약 수준에 해당할 것이다. 테스트에서 실제 세포 세트에서 생존 세포의 수를 확인할 수 없는 대부분의 테스트와는 달리, 이 테스트는 테스트 초기에 품질관리 및 기준선 생리적 결정 단계에서 결정된대로 생존 세포에서만 작동한다. 이 기능의 결과로 테스트 결과의 편차가 감소된다. 테스트는 당 업계에서 통상적으로 알려진 세포 생존력에 대해 일반적으로 허용가능한 온도, 산소, 습도 및 이산화탄소 범위를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 바람직한 온도 범위는 25℃~40℃이다. 다른 경우, 온도는 특정 섭동에 대해 이 범위 내에서 ±0.5℃까지 추가로 최적화되고 표준 온도 제어 인큐베이터 캐비닛을 사용하여 유지될 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체의 세포에 후보 치료제를 투여하여 안전성을 판정하고 치료 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 또한, 대상체의 이환 세포에 대한 후보 치료제의 투여는 2상 또는 3상 임상 시험을 위한 적절한 환자 모집단을 선택하는 방법으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 공지된 치료적 조합에 대해 이환 세포를 시험하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 공지된 치료제 및 후보 치료제를 시험하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 제제의 특정 조합이 보다 효과적인 결과(즉, 질환 증상의 개선 또는 치료)를 생성하는지를 결정하기 위해 치료제의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 치료제의 조합은 동일한 세포 샘플에 투여되는 2개 이상의 치료제이다. 본 발명의 일 구현예에서, 치료제의 조합이 세포 샘플에 동반 투여된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 치료제는 조합의 다른 적어도 하나의 치료제의 투여와 상이한 시간에 세포 샘플에 투여된다.
세포 샘플에 치료제를 투여한 후 세포 샘플의 여러 측면에서 실시간 데이터가 수집될 수 있다. 예를 들어, pH와 온도가 측정될 수 있다. 또한 "세포사 인자"와 같은 다른 인자가 결정될 수 있다. CReMS에 의해 결정된 세포사 인자는 CReMS로 측정된 물리화학적 특성의 변화일 수 있다. 예를 들어, 암 세포는 표면에 부착되어 굴절률에 대한 기준선 판독을 제공한다. 암 세포사를 촉진시키는 치료제의 투여는 샘플의 암 세포가 표면에서 모아져서 분리되기 때문에 굴절률의 변화를 일으킨다. 이것은 연속적 실시간 방식으로 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 광학 바이오센서로 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 특정 치료제에 대한 최적의 용량 범위를 결정하는 단계를 포함한다. 용량 범위의 결정은 임상 시험의 적절한 디자인을 허용하고 의사가 효능과 유해한 부작용의 균형을 맞출 수 있게 한다. 구현예들에서, 방법은 치료제의 용량 범위를 투여하여 동일한 환자로부터의 이환 세포 샘플을 분리하는 단계, 기준선 및/또는 건강한 대조군 세포와 비교하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포의 생리적 파라미터의 변화를 초래하는 용량 범위를 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 방법이 개별 대상체의 이환 세포가 하나 이상의 치료제에 반응하는지 여부를 결정하기 위해 사용되면, 그 결과는 대상체의 치료를 위한 치료제의 선택을 허용하기 위해 의료 종사자에게 전달된다. 구현예들에서, 상기 방법은 선택된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
신호전달 경로 활성을 측정하면 질환과 일치하는 이상 유무를 감지할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 세포 신호전달 경로 작동과 세포 유착 과정 사이의 밀접한 관계를 활용하는 플랫폼이 개발되었다. 막관통 세포 유착 수용체, 예컨대 인테그린, 카드헤린, Ig CAMs, 및 셀렉틴과 세포외 기질 또는 다른 세포내 그의 동족 결합 부위와의 상호작용은 다중 세포 신호전달 과정에 대한 연결성을 입증했다. 접착 연결은 세포내 신호전달 캐스케이드와 직접 연결된 조직화된 막-근위 세포골격 구조를 통해 전달된다. 이것은 경로 활성제의 투여시 특정 세포 경로를 통해 특정 부착 분자에 영향을 줄 수 있게 한다.
세포 경로의 활성화가 세포 접유에 미치는 영향을 측정하기 위해, 마이크로전극을 코팅하는 특정 세포외 기질(ECM) 물질에 부착된 생존가능한 환자 세포의 복잡한 임피던스 변화를 측정하는 장치가 사용된다. 세포의 임피던스 바이오센서로 알려진 이 장치는 각각의 웰 바닥을 덮는 얇은 금 전극을 가진 표준 마이크로플레이트로 구성된다. 선택적 세포외 기질와 함께 사용되는 웰들은 마이크로플레이트 웰 전극에 특정 방식으로 생존가능한 세포를 부착시킨다. 웰 전극 상부에 생존가능한 세포가 존재하면 전극/세포 인터페이스에서 국소 이온성 환경에 영향을 미치므로 전극 임피던스가 증가한다. 세포가 교란되거나 자극되어 그의 기능을 변화시키면 그에 수반되는 세포 유착의 변화가 임피던스를 변화시킨다. 유착 반응의 특이성은 경로의 다양한 지점에서 작용하는 것으로 알려진 특정 ECM 또는 도구 화합물 또는 약물의 적용에 의해 결정될 수 있다. 임피던스 결과는 임피던스 시간 패턴에 의해 지시된 시점에서 특정 단백체 변화의 면역검출에 의해 추가로 지지된다. 시스템은 하위-나노미터에서 마이크로미터 범위의 접착 변화를 감지할 수 있으며, 생존 세포에서 다양한 경로 약리를 분류하기 위한 데이터를 생성할 수 있다. 세포 부착 신호(CAS)로 불리는 측정되고 옴 단위로 표시된 임피던스 양을 사용하여 세포 생존력, 부착 및 신호전달 경로 활성화를 모니터링할 수 있다. 생성된 데이터는 임피던스 대 시간이다.
따라서, 본 발명의 진단 시험에서, 피분석물은 마이크로플레이트의 웰에 배치될 때, 단독으로, 또는 세포 활성제의 존재하에 생존가능한 환자 세포가 생성하는 세포 부착 신호(CAS)이며, 바이오센서, 예컨대 임피던스 바이오센서로 분석된다. 모든 테스트에서, CAS는 두 그룹의 환자 세포 샘플에 대해 측정되고 분석된다.
1) 환자 세포 단독(C)
2) 환자 세포 + 활성제 경로 인자(들)(CF)
3) 환자 세포 + 활성제 경로 인자(들) + 확인 제제(CCF)
신호전달 경로가 정상적으로 또는 비정상적으로 기능하는지를 검출하기 위해, 환자의 이환 세포에서 신호전달 경로는 하나 이상의 경로 인자 및 확인제로 교란되고, 생성된 활성은 활성제 및/또는 확인 제제가 컷오프 값에 대하여 갖는 효과와 비교된다. 컷-오프 값은 암이 없는 대상체로부터 수득된 건강한 세포 샘플 세트의 신호전달 경로 활성 분석을 포함하는 연구로부터 도출될 수 있다. 분석 측정량은 환자의 이환 세포에서 CF와 C 세포 사이의 CAS 변화 및 CF와 CCF 이환 세포 사이의 CAS 변화를 반영한다. 신호전달 경로가 비정상인 경우, CF와 C 이환 세포 사이의 CAS 변화 및/또는 CF와 CCF 이환 세포 사이의 CAS 변화는 컷오프 값 이상이 될 것이다. 컷오프 값은 전형적으로 관심있는 경로 활성에 대한 정상 참조 간격의 상한보다 높다. 간소화된 구현예에서, 경로 인자 또는 확인 제제로 활성화되기 직전의 시점에서의 CAS와 비교하여 활성화 시점 이후의 CF 및 CCF 샘플의 CAS 측정은 유용한 측정량일 수 있다.
본 발명의 진단 검사는 본질적으로 임의의 임상 상황에서, 특히 현재 유전 또는 단백질 바이오마커가 질환의 지표로서, 따라서 치료적 의사 결정을 위한 지표로서 사용되는 임상 상황에서 사용될 수 있다. 하기 표 15는 FDA에서 승인한 치료제와 다양한 질환 상태의 치료에 있어서 이의 용도와 관련된 바이오마커의 목록을 보여준다. 본 발명의 방법에 따라, 본 명세서에 기재된 접근법은 치료제에 의해 영향을 받는 관련된 신호전달 경로의 활성을 조사하여, 표준 바이오마커 검정을 사용하여 긍정적인 결과를 나타낼지 여부와 무관하에 그 치료제로의 치료가 환자에게 처방되어야하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
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생리적 반응 파라미터의 변화가 세포 샘플에서 발생하는지를 결정하기 위해 연속 측정을 분석하는 방법(예를 들어, 반응(양성 또는 음성)의 규모, 최대 또는 최소 시간, 반응 시간선의 임의의 지점에서 시간 대 규모의 기울기 등)이 본 명세서에 기재되어 있다. 이들 및 비-선형 분석의 다른 방법은 생리적 반응 파라미터의 변화가 활성제 제제의 존재 하에서 발생하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
기준선과 대조군을 사용하여 세포 경로의 상태를 판단할 수 있다. 적합한 기준선은 활성제 제제가 없는 샘플, 활성제 제제의 무한한 희석의 샘플, 활성제 제제의 첨가 후 충분히 긴 시간 이전 또는 이후의 동일한 샘플, 및 세포 기반 검정 분야의 당업자에게 공지된 활성의 다른 상기 기준선을 비제한적으로 포함할 수 있다.
적합한 대조군은 동일한 환자로부터의 건강한 물질의 샘플, 정상적인 기준 간격을 도출하기 위해 관심 질환이 없는 충분한 수의 환자로부터의 건강한 물질의 샘플 세트, 유사하지만 상이한 활성제 제제를 갖는 샘플, 공지된 양성 또는 음성 반응의 세포주, 활성제의 역 활성으로 처리된 샘플, 하나 이상의 환자로부터의 이환 물질 샘플, 및 세포 기반 검정 분야의 당업자에게 공지된 다른 양성 및 음성 대조군을 비제한적으로 포함할 수 있다.
K. 테스트 결과의 분석 및 해석
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 수득된 테스트 결과는 다양한 방식으로 분석 및 해석되어, 임상의 및/또는 환자에게 정보를 제공할 수 있다. 특정 구현예는 아래와 같이 제시된다.
(i) 이환 경로 분석. 이 분석은 이환 경로 활성이 환자의 생체외에서 발견되는지 여부를 확인한다. 이번 분석을 통해 의사들은 환자의 이환 세포에 질환 과정이 존재하는지에 대한 동적인 평가를 처음으로 제공할 것이다. 이 구현예에서, 시험된 경로는 4가지 그룹 카테고리 중 하나로 분류될 수 있다: 구성적 활성, 과반응, 전혀 활성없음(저-활성), 또는 정상 활성. 경로가 이환이고, 그에 따라 관심의 경로 활성을 억제하는 것으로 알려진 표적 치료로 치료하기에 적합한 지 여부를 결정하기 위해, 질환을 가진 것으로 의심되는 환자에 대해 본 명세서에 기재된 방법으로 결정된 경로 활성은 질환을 가진 것으로 의심되는 환자의 무작위로 선택된 모집단에서 그 경로 활성의 통계적 분석으로부터 도출된 컷-오프 값과 비교한다. 비정상적인 경로 활성을 갖는 것으로 밝혀진 약물 표적 경로(예를 들어, 비정상적 및 정상적 경로 활성을 묘사하는 컷오프 이상)는 그 활성을 방해하여, 그것에 의해 환자에게 의도된 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
(ii) 약물 기능 분석. 이 분석은 생체외에서 약물의 기능에 대한 두 가지 측정을 제공한다.
1) 반응 점수(Response Score, RS): 반응 점수는 시험된 약물이 표적화된 경로에서 갖는 기능적 효과를 특징으로 한다. 점수가 높을수록 약물 기능이 뛰어나다는 것을 0 - 1 척도로 보고될 수 있다.
2) 반응 점수 백분위수 랭킹(RSPR): RSPR은 동일한 제제로 시험된 다른 환자가 받은 점수와 비교하여 환자의 반응 점수가 어떻게 평가되는지를 특징으로 한다. 각각의 환자에 대해 전체 그룹 내에서 그의 반응 점수의 백분위 수가 결정된다. 백분위수 랭킹이 지정되면 환자는 a) 중간 이하, b) 중간 근처 또는 c) 중간 이상, 세 그룹 중 하나로 분류될 수 있다. 특정 약물의 경우, 진행 시간(TTP)과 같은 임상 종점에 의해 측정된 환자 약물 반응의 다양한 변화가 반응 점수의 변동에 반영될 것이다. 임상 시험에서 75번째 백분위수 환자의 TTP 기간이 25번째 백분위수 환자의 TTP 기간보다 5~10배 큰 경우가 종종 있기 때문에, 의사에게 환자 반응 점수의 상대적 순위를 제공하면 중요한 해석 문맥을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이들은 개별 환자의 반응 점수 백분위수에 해당하는 백분위수 범위의 임상 시험에서 환자의 TTP 기간을 기준으로 개별 환자의 TTP 기간을 산정할 수 있다.
(iii) 가능성이 있는 임상 결과의 예측. 이 분석은 문제의 제제를 받은 후 시험된 및 관측된 환자의 반응 점수와 임상 종점 사이의 임상 시험에서 발견된 상관 관계를 반영한다. 이러한 상관 관계를 통해, 임상 시험에서 특정 반응 점수를 받은 환자와 일치하는 임상 결과를 확인할 수 있다. 예를 들어 TTP가 측정된 임상 결과인 경우, 환자의 결과는 세 가지 카테고리 중 하나로 분류될 수 있다.
1) 가능성이 있는 TTP 기간 - 최저: 이 하위 집단에 속하는 환자는 전체 환자 모집단이 경험할 수 있는 중간 TTP 기간보다 훨씬 짧은 TTP 기간을 경험할 가능성이 있다.
2) 가능성이 있는 TTP 기간 - 불확정: 이 범주에 속하는 반응 점수를 받은 환자에 대해서는 평가가 제공되지 않는다.
3) 가능성이 높은 TTP 기간 - 최고: 이 하위-모집단에 속하는 환자는 전체 환자 모집단이 경험할 TTP 중간 값보다 훨씬 높은 TTP 기간을 경험할 가능성이 있다.
임상의들은 선택할 약물 요법을 결정할 때 지침으로 CELx 프로파일 테스트 결과를 사용한다. 환자의 세포가 다수의 활성제 제제 및 표적화된 치료제로 시험될 때, 각각의 약물 또는 약물 조합의 가능한 임상 결과는 비교될 수 있어서, 의사는 약물 또는 약물의 조합을 가장 가능성 있는 임상 결과와 관련이 있는 시험 결과로 선택할 수 있다.
L. 키트
본 발명의 또 다른 양태에서, 키트가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 키트는 수송 매질을 함유하는 개별 대상체로부터의 이환 세포 샘플용 컨테이너; 수송 매질을 함유하는 개별 대상체로부터의 대조군 세포 샘플을 위한 컨테이너; 바이오센서; 바이오센서로부터의 데이터를 출력으로 변환하기 위한 컴퓨터 실행가능 명령을 갖는 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하며, 상기 출력은 정의된 기간에 걸쳐 세포 생리적 반응 파라미터의 변화를 나타내고, 상기 세포 생리적 반응 파라미터는 pH, 세포 유착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 세포 주기, 동화 작용, 이화, 소분자 합성 및 생성, 턴오버, 및 호흡, ATP, 칼슘, 마그네슘 및 기타 하전된 이온, 단백질, 특정 경로 구성원 분자, 다양한 세포 구획, 유전체 및 프로테오믹스에서의 DNA 및 RNA, 번역 후 변형 및 기전, 2차 메신저의 수준, cAMP, mRNA, RNAi, 마이크로RNA 및 생리적 기능을 갖는 다른 RNA 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 출력을 반응군 또는 비-반응군으로서의 상태를 나타내는 컷오프 값보다 높거나 아래로 분류하고 및/또는 상기 샘플을 반응이 없고 반응이 약하고 반응성이 있다고 분류하고; 및 분류된 보고서를 생성하기 위한 컴퓨터 실행가능 명령을 갖는 매체를 포함한다.
이환 세포 샘플의 유형 및 양은 본 명세서에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 이환 세포 샘플은 적어도 5,000개의 세포를 갖는 전체 세포 표지없는 생존가능한 세포 샘플이다. 구현예들에서, 대조군 세포 샘플은 동일한 대상체의 이환 세포 샘플, 동일한 대상체의 건강한 세포 샘플, 질환이 없는 것으로 알려진 대상체의 건강한 세포 샘플, 정상 참조 간격을 도출하기 위한 관심 질환이 없는 충분한 수의 환자로부터의 건강한 물질의 샘플 세트, 치료제에 반응하는 것으로 알려진 세포 샘플, 치료제에 반응하지 않는 것으로 알려진 세포 샘플 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
컨테이너 및 수송 매질은 세포 생존력을 유지하고 세포 활성화를 최소화하도록 설계된다. 구현예들에서, 배지 및 컨테이너는 내독소가 없고 비발효성이며, DNase- 및 RNase-미함유이다. 수득된 세포 샘플은 세포 생존력을 유지하는 수송 배지에서 유지된다. 분석 부위로 수송하기 위한 시간의 길이에 따라, 상이한 매질이 사용될 수 있다. 구현예들에서, 조직 샘플의 수송이 최대 10시간 필요로 할 때, 매질은 400 mosm/L 미만의 오스몰농도를 가지며, Na+, K+, Mg+, Cl-, Ca+2, 글루코스, 글루타민, 히스티딘, 만니톨, 및 트립토판, 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하며, 필수 아미노산을 함유하고, 비-필수 아미노산, 비타민, 기타 유기 화합물, 미량 미네랄 및 무기 염류, 혈청, 세포 추출물 또는 성장 인자, 인슐린, 트랜스페린, 나트륨 셀레나이트, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 포스포포릴에탄올아민, 트리아이오도티로닌, 나트륨 피루베이트, L-글루타민을 추가로 함유할 수 있으며, 인간 일차 세포의 증식 및 플레이팅 효율을 지원한다. 이러한 매질의 예는 셀시오(Celsior) 매질, 로스웰 파크 기념 연구소 매질(RPMI), 행크 완충 식염수 및 맥코이(McCoy) 5A, 이글의 필수 최소 베지(EMEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 라이보비츠(Leibovitz) L-15, 또는 일차 세포 치료의 실시를 위한 그의 변형을 포함한다.
본 명세서에 바이오센서가 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 바이오센서는 세포 유착, 세포 부착, 세포 형태, 세포 표현형, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 밀도, 세포 극성, pH, O2, CO2, 글루코스, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 세포 파라미터를 검출하는 바이오센서로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예들에서, 상기 장치는 임피던스 또는 광학 장치이다. 바이오센서는 본 명세서에 기재된 바와 같이 선택적으로 코팅될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 치료제 및/또는 활성제 제제의 유형과 관련된 생리적 파라미터의 변화를 측정하는 바이오센서가 선택된다.
다른 구현예들에서, 본 키트는 바이오센서로부터의 데이터를 출력으로 변환하기 위한 컴퓨터 실행가능 명령을 갖는 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하며, 상기 출력은 정의된 기간에 걸쳐 세포 생리적 반응 파라미터의 변화를 나타내고, 상기 세포 생리적 반응 파라미터는 pH, 세포 유착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 출력을 반응이 없고 반응이 약하고 반응성이 있다고 분류하고; 및 분류된 보고서를 생성하기 위한 컴퓨터 실행가능 명령을 갖는 매체를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 구현하기 위한 명령을 컴퓨팅 장치 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 제공한다. 컴퓨터 판독가능 매체는 비-일시적 CD, DVD, 플래시 드라이브, 외부 하드 드라이브 및 모바일 장치를 포함한다.
본 명세서에 기재된 키트 및 방법은 프로세서/컴퓨터 시스템의 사용을 채택할 수 있다. 예를 들어, 방법을 구현하기 위한 컴퓨터 프로그램 코드를 저장하는 프로그램 메모리, 작업 메모리, 및 종래의 컴퓨터 스크린, 키보드, 마우스 및 프린터와 같은 인터페이스뿐만 아니라 네트워크 인터페이스와 같은 기타 인터페이스, 및 데이터베이스 인터페이스를 포함하는 소프트웨어 인터페이스에 커플링된 프로세서를 포함하는 범용 컴퓨터 시스템은 본 명세서에 기술된 일 구현예를 사용한다.
컴퓨터 시스템은 데이터 입력 디바이스, 예컨대 키보드, 입력 데이터 파일 또는 네트워크 인터페이스, 또는 또 다른 시스템, 예컨대 예를 들어 정의된 시간 동안 바이오센서에 의해 생성된 데이터를 해석하는 시스템으로부터의 사용자 입력을 수신하며, 출력 디바이스, 예컨대 프린터, 디스플레이, 네트워크 인터페이스 또는 데이터 저장 장치에 출력을 제공한다. 입력 디바이스, 예를 들어 네트워크 인터페이스는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 세포 생리적 파라미터의 변화 및/또는 이들 변화의 정량화를 포함하는 입력을 수신한다. 출력 디바이스는 세포 파라미터의 변화의 검출 및/또는 정량화를 도시하는 하나 이상의 숫자 및/또는 그래프를 포함하는 디스플레이와 같은 출력을 제공한다.
컴퓨터 시스템은 본 명세서에서 기재된 방법에 의해 생성된 데이터를 저장하는 데이터 저장소에 커플링될 수 있다. 이 데이터는 각각의 측정 및/또는 각각의 대상체에 대해 저장되며; 선택적으로, 이들 데이터 유형들 각각의 복수의 세트가 각각의 대상체에 대응하여 저장된다. 예를 들어, 하나 이상의 컴퓨터/프로세서는 예를 들어 네트워크를 통해 컴퓨터 시스템에 커플링된 별도의 기계로 사용될 수 있거나, 컴퓨터 시스템에서 실행되는 별도의 또는 통합된 프로그램을 포함할 수 있다. 어떤 방법을 사용하든, 이 시스템은 데이터를 수신하고, 대가로 검출/진단에 관한 데이터를 제공한다.
일부 구현예에서, 컴퓨팅 장치는 서버 컴퓨터와 같은 단일 컴퓨팅 장치를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 컴퓨팅 장치는 네트워크(도시되지 않음)를 통해 서로 통신하도록 구성된 다수의 컴퓨팅 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨팅 장치는 메모리 내에 여러 데이터베이스를 저장할 수 있다. 컴퓨팅 장치에 저장된 데이터베이스는 클리닉, 실무 임상의, 프로그래머 식별 코드 또는 임의의 다른 원하는 카테고리 별로 조직화될 수 있다.
바이오센서로부터의 데이터는 원격 컴퓨팅 시스템 또는 다른 데이터 저장 장치로 전송될 수 있다. 통신 프로세스는 시작 모듈에서 초기화되고 시작되어, 연결 작업으로 진행된다. 연결 작업은 예를 들어 케이블 연결, 무선 근거리 통신망(WLAN 또는 Wi-Fi) 연결, 셀 네트워크, 무선 개인 영역 네트워크(WPAN) 연결, 예를 들어 블루투스®, 또는 임의의 원하는 통신 회선을 통해 원격 컴퓨팅 시스템에 보건 의료 제공자의 저장된 정보를 통신가능하게 커플링한다.
전송 작업은 바이오센서로부터의 데이터를 컴퓨팅 장치로 전송한다. 일 구현예에서, 전송 작업은 디바이스들간에 데이터를 전송하기 전에 데이터를 암호화한다. 통신 프로세스는 정지 모듈에서 완료되고 종료될 수 있다. 일단 바이오센서 데이터가 원격 컴퓨팅 장치로 전송되면, 데이터는 시간 경과에 따른 세포 지수 측정과 같은 출력으로 변환된다. 특정 구현예에서, 정의된 종점이 선택되고, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 반응이 없거나 약한 반응성이거나 반응성인 것으로 세포 샘플을 분류하는데 사용된다. 구현예들에서, 반응군 또는 비-반응군으로서의 샘플 분석 상태는 케이블 연결, 무선 근거리 통신망(WLAN 또는 Wi-Fi) 연결, 휴대폰 통신망, 무선 개인 단거리 통신망(WPAN) 연결, 예를 들어, 블루투스®, 또는 임의의 원하는 통신 회선을 통해 의료 제공자에게 다시 전달된다.
특정 구현예에서, 컴퓨터 판독가능한 저장 매체는 컴퓨팅 장치에 의해 실행될 때 컴퓨팅 장치로 하여금 바이오센서로부터의 데이터를 출력으로 변환하는 단계로서, 상기 출력이 정의된 기간에 걸쳐 세포 생리적 반응 파라미터의 변화를 나타내며, 치료제의 존재 및/또는 부재하에 상기 세포 생리적 반응 파라미터가 pH, 세포 유착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 단계; 치료제의 존재하에 상기 세포 샘플로부터의 바이오센서로부터의 출력을 상기 치료제의 부재하에 상기 세포 샘플로부터의 바이오센서로부터의 출력과 비교함으로써 정의된 종점에서 상기 출력을 무반응 및 반응성으로 분류하는 단계; 및 그 분류에 의해 보고서를 생성하는 단계를 포함하는 단계를 수행하도록 한다. 구현예들에서, 컴퓨터 실행가능 명령은 분류를 건강 관리 제공자에게 전달하기 위한 명령을 포함한다.
다른 구현예들에서, 컴퓨터 판독가능한 저장 매체는 대상체의 이환 세포 샘플에서 어떤 경로가 작동하는지를 식별하기 위한 명령을 포함할 수 있다. 컴퓨팅 장치에 의해 실행될 때, 상기 명령은 상기 제1 활성제 또는 섭동제에 반응하는 경로가 상기 이환 세포 샘플에서 활성인지를 결정하기 위해, 제1 활성화 또는 섭동제로 처리된 대상체로부터의 이환 세포 샘플로부터의 바이오센서 데이터의 출력과 제1 활성화 또는 섭동제로 처리되지않은 대상체로부터의 제2 이환 세포 샘플로부터의 바이오센서 데이터의 출력 간의 차이가 있는지 여부를 결정하는 단계; 경로의 활성의 지표로서 출력의 차이의 존재를 확인하는 단계, 및 경로의 활성을 건강 관리 제공자에게 전달하는 단계를 포함한다. 활성제 또는 섭동제와 그의 경로는 본 명세서에 기재되어 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당해 분야의 숙련가에게 제안될 것이며, 본원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함될 것이다.
실험 설계에 대한 논의
본 명세서에 개시된 바와 같이 신호전달 경로의 활성화 또는 억제에 의해 개시되는 세포 유착 변화를 측정하는 방법은 환자의 종양 세포에서 가장 활성인 신호전달 경로를 확인하거나, 초-민감한 신호전달 경로를 확인하는 단계를 기반으로 치료 결정을 내리는데 사용된다. 단백질 결합의 생화학적 원리가 세포 유형에 걸쳐 보편적이라는 사실에 비추어, 본 명세서에 기재된 방법은 따라서 단백질 및 다른 생체분자 결합이 발생할 수 있는 모든 세포 및 세포 경로에 광범위하게 적용가능하다.
현재의 최첨단 진단 테스트는 환자의 종양 세포에서 다양한 신호전달 경로의 활성 수준을 직접 비교하거나, 특정 신호전달 경로가 극도로 민감한지 여부를 결정할 수 없다. 따라서 그들은 환자에게 가장 유익한 표적 치료법으로 환자를 치료하는 방법을 제공하지 않는다. 가장 활성인 신호전달 경로를 확인하거나, 비정상적으로 초-민감한 신호전달 경로를 확인함으로써 가장 활성적이거나 초-민감한 경로에 영향을 주는 표적 요법을 선택하여, 환자에게 투여할 수 있다.
하기에 제공된 4개의 실시예는 환자를 치료할 목적으로 최적의 표적화된 요법의 선택을 안내하기 위해 신호전달 경로 활성을 특성화하는 방법의 다양한 구현예를 입증한다. 특히, 실시예는 1) 환자의 종양 세포에서 가장 활성이 있는 신호전달 경로(예를 들어, HER1, HGFR, FGFR 등)를 식별하고, 동일한 유형의 암(예를 들어, 유방, 폐, 결장 등)을 가진 여러 환자의 신호전달 경로가 상이한 활성 수준을 가짐을 확인하고; 2) 환자의 종양 세포에서 비정상적으로 초-민감한 신호전달 경로를 확인하고; 및 3) 공동-활성화된 경로를 확인하고 가장 큰 CELx 테스트 출력 값을 얻기 위한 약물의 조합을 필요로 하는 것이 가능함을 입증한다. 이들 실시예는 본 발명에 의해 결정된 환자의 종양 세포에서 신호전달 경로 활성의 상태(예를 들어, 가장 활성적이거나 또는 초-민감한 상태)를 사용하여 치료 결정이 이루어질 수 있음을 확인한다.
실시예 1: 다중 경로 테스트
방법:
바이오센서 및 변환기: xCELLigence RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서(ACEA, San Diego, CA)에 96-웰 임피던스 E-플레이트(ACEA, San Diego, CA)를 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정했다. 특정 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포가 임피던스 마이크로플레이트와 함께 가지고 있는 세포의 수 및 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이러한 작은 세포 모집단의 섭동에 대한 반응을 나타낸다.
코팅물: 96-E-플레이트는 파이브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅된 웰들이었다. 콜라겐은 Advanced BioMatrix(Carlsbad, CA)로부터 구매하였으며, 파이브로넥틴은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구매한다.
조직 및 세포 샘플: 유방, 폐, 결장암, 난소암, 신장암, 방광암에서 유래한 18종의 인간 종양 세포 샘플을 연구했다. 이 6가지 다른 암 유형 각각에 대해 3명의 다른 환자의 종양 세포 샘플을 시험했다. 표적 요법의 선택을 안내하는데 사용되는 임의의 바이오마커는 존재한다면, 각각의 환자에 대해 표 18에 열거되어 있다.
신호전달 경로 활성제 제제 및 표적화된 치료제 쌍:
10개의 상이한 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제 쌍을 사용하여 각각의 인간 종양 세포 샘플에서 11개의 상이한 신호전달 경로를 연구하였다. 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제 쌍 각각은 동일한 신호전달 경로에 영향을 미친다. 신호전달 경로 활성제 각각은 그것의 연관된 신호전달 경로의 잘 특성규명된 및 특이적 효능제이고 각각의 표적화된 치료제 각각은 동일한 연관된 신호전달 경로의 잘 특성규명된 및 특이적 길항제이다. 연관된 신호전달 경로의 활성 수준을 특성화하기 위해 사용된 신호전달 경로 활성제 제제 및 표적화된 치료제는하기 표 16에 요약되어 있다:
Figure pct00030
다른 시약 : 표준 배지 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 기타 완충액을 구입하여 ATCC(Manassas, VA, USA) 또는 Life Technologies(Grand Island, NY)에서 제공한대로 사용한다.
절차 : 한 쌍의 신호전달 경로 활성제 및 표적화된 치료제를 갖는 환자 세포 샘플의 각각의 테스트에 대해, 6개의 웰에 120 uL 배양 배지내 약 15,000개의 세포를 시딩하였다. 20 마이크로리터의 표적화된 치료제를 각각의 환자의 세포의 2개의 웰들에 첨가하고, 20 마이크로리터의 표준 매질을 신호전달 경로 활성제 제제를 첨가하기 18시간 전에 각각의 환자에 대한 다른 4개의 웰에 첨가하였다. 표적화된 치료제를 투여한 2개의 웰에서 20 ul의 신호전달 경로 활성제 제제를 첨가하고 표적화된 치료제없이 각각의 환자의 세포 세트에 2개의 웰을 첨가하여 신호전달 경로 자극을 개시하였다. 부착 및 접착 변화의 임피던스 기록은 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 테스트를 통해 데이터를 연속적으로 기록하였으며, 상기 제시된 데이터는 표적화된 치료제 및 18가지 다른 환자 샘플에 대한 신호전달 활성제 제제 첨가후 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준에서 제공된다.
결과 :
표 17은 위에 기재된 방법을 사용하여 수행된 167번의 테스트 각각에 대한 출력 값으로 표현된 결과를 나타낸다. 18명의 환자 샘플 각각에 대해 최대 11개의 다른 신호전달 경로를 시험하였다. 출력 값은 신호전달 경로 활성제 제제의 첨가로 인한 세포 유착 변화량과 표적화된 치료제의 첨가로 인한 세포 유착 변화량 사이의 차이를 나타낸다. 시험된 각각의 환자에 대해, 적어도 하나의 신호전달 경로의 활성은 시험된 다른 9개의 신호전달 경로보다 상당히 더 높았다. 가장 활성의 신호전달 경로와 연관된 표적화된 치료제는 환자에게 투여되는 것이다.
Figure pct00031
논의:
하기 표 18은 표적 요법의 선택을 안내하는데 사용될 세포내 (있는 경우) 존재하는 바이오마커를 각각의 환자별로 나열한 것이다. 표에는 또한 바이오마커가 존재하는 경우 환자를 치료하는데 사용되는 해당 표적 요법 목록이 열거되어 있다. 많은 환자는 임의의 치료-관련 바이오마커가 없으므로, 따라서 본 발명이 없으면 표적 치료를 받을 자격이 없다. 또한, 표는 본 발명에 의해 기재된 방법에 기초하여 환자에게 투여하기에 권장되는 잠재적 표적화된 치료제를 열거한다.
시험된 18명의 환자 중 17명에 대해, 본 명세서에 기재된 방법의 결과를 사용하여 투여되는 표적화된 치료제는 현재의 표준 치료법 지침이 추천하는 표적 치료법과는 상이하다. 대부분의 경우, 현재 치료 지침에 기반하여 처방된 표적화된 치료법은 없다. 본 실시예는 많은 경우에, 처방된 현재의 표준 치료 요법이 기저 질환 기전, 즉 그 환자에서 입증된 특정 신호전달 경로 기능이상을 치료하지 않기 때문에 암 환자 신호전달 경로의 활성 측정의 중요성을 확인한다.
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 2: 경로 초민감성 테스트
방법:
바이오센서 및 변환기: xCELLigence RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서(ACEA, San Diego, CA)에 96-웰 임피던스 E-플레이트(ACEA, San Diego, CA)를 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정했다. 특정 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포가 임피던스 마이크로플레이트와 함께 가지고 있는 세포의 수 및 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이러한 작은 세포 모집단의 섭동에 대한 반응을 나타낸다.
코팅물: 96-E-플레이트는 파이브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅된 웰들이었다. 콜라겐은 Advanced BioMatrix(Carlsbad, CA)로부터 구매하였으며, 파이브로넥틴은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구매한다.
조직 및 세포 샘플: 유방 종양(R131, R39, R36, R20, R82)으로부터의 인간 세포의 5개의 상이한 샘플 및 비-소세포 폐암(NSCLC) 종양으로부터의 인간 세포의 2개의 상이한 샘플을 연구하였다(C15 및 C23). 표적 요법의 선택을 안내하는데 사용되는 임의의 바이오마커는 존재한다면, 각각의 환자에 대해 표 20에 열거되어 있다.
신호전달 경로 활성제:
HER3 효능제인 NRG1을 사용하여 5개의 유방암 세포 샘플 각각에서 HER3 경로를 자극하였다. 신호전달 경로 활성제 제제의 EC90 및 EC10 농도는 또한 각각의 유방암 샘플에 대해 유래되었다. 표 19는 요약을 제공한다.
Figure pct00034
2개의 NSCLC 세포 샘플 각각에서, 4개의 상이한 활성제 제제를 사용하여 EGF 또는 HER3 경로를 자극했다. 신호전달 경로 활성제 제제의 EC90 및 EC10 농도는 또한, 각각의 NSCLC 세포 샘플에 대해서도 유래되었다. 표 20은 요약을 제공한다,
Figure pct00035
다른 시약 : 표준 배지 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 기타 완충액을 구입하여 ATCC(Manassas, VA, USA) 또는 Life Technologies(Grand Island, NY)에서 제공한대로 사용한다.
절차 : 2개의 상이한 농도의 신호전달 경로 활성제를 갖는 환자 세포 샘플의 각각의 테스트에 대해, 6개의 웰에 120 uL 배양 배지내 약 15,000개의 세포를 시딩하였다. 대략 EC90 농도를 나타내는 20 마이크로리터의 신호전달 경로 활성제 제제를 각각의 환자의 세포의 2개의 웰들에 첨가하고, 대략 EC10 농도를 나타내는 20 마이크로리터의 신호전달 경로 제제 및 20 마이크로리터의 표준 매질을 각각의 환자에 대한 다른 2개의 웰에 첨가하였다. 부착 및 접착 변화의 임피던스 기록은 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 테스트를 통해 데이터를 연속적으로 기록하였으며, 상기 제시된 데이터는 12개의 다른 환자 샘플에서 2가지 농도의 신호전달 활성제 제제를 첨가한 후의 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준에서 제공된다.
결과:
표 21, 22 및 23은 결과를 요약한 것이다. 시험된 각각의 환자 세포 샘플에 대해, 신호전달 경로 활성제 제제의 2개의 상이한 농도의 첨가 후에 측정된 신호전달 경로 활성에 대한 출력 값을 계산하였다. 신호전달 경로 활성제 제제에 대한 신호전달 경로의 민감도를 결정하기 위해, 민감도는 2개의 출력 값을 사용하여 계산되었다. EC90 대 EC10의 비율이 81 미만이면, 경로가 초-민감한 것으로 간주되며; 그렇지 않으면 경로가 정상적으로 민감한 것으로 간주된다.
표 21은 테스트된 유방암 세포 샘플의 결과를 나타낸다. 이 연구에서 연구된 5개의 유방암 환자 샘플 중 4개는 EC10에 대한 EC90 비율이 81 미만이었으며, 이는 시험된 신호전달 경로가 초-민감하다는 것을 의미한다. 초-민감한 것으로 밝혀진 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제가 확인되어, 그의 바이오마커 상태에 기초하여 환자에게 처방된 치료제와 비교할 수 있다.
Figure pct00036
표 22 및 표 23은 시험된 NSCLC 세포 샘플에 대한 결과를 나타낸다. 두 NSCLC 세포 샘플에서, 여기에서 연구된 4개의 활성제 각각은 EC10에 대한 EC90의 비율이 81 미만이었고, 이는 테스트된 신호전달 경로가 초-민감하다는 것을 의미한다. 초-민감한 것으로 밝혀진 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 표적화된 치료제가 확인되어, 그의 바이오마커 상태에 기초하여 환자에게 처방된 치료제와 비교할 수 있었다.
Figure pct00037
Figure pct00038
논의:
시험된 6명의 환자 중 5명에 대해, 본 명세서에 기재된 방법의 결과를 사용하여 투여되는 표적화된 치료제는 현재의 표준 치료법 지침이 추천하는 표적 치료법과는 상이하다. 본 실시예는 많은 경우에, 게놈 바이오마커 상태에 기초하여 처방된 현재의 표준 치료 요법이 기저 질환 기전, 즉 초-민감성 신호전달 경로 기능을 치료하지 않기 때문에, 신호전달 경로가 초-민감성인지 여부를 측정하는 것의 중요성을 확인한다.
실시예 3: 여러 경로의 동시 검사
방법:
바이오센서 및 변환기: xCELLigence RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서(ACEA, San Diego, CA)에 96-웰 임피던스 E-플레이트(ACEA, San Diego, CA)를 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정했다. 특정 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포가 임피던스 마이크로플레이트와 함께 가지고 있는 세포의 수 및 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이러한 작은 세포 모집단의 섭동에 대한 반응을 나타낸다.
코팅물: 96-E-플레이트는 파이브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅된 웰들이었다. 콜라겐은 Advanced BioMatrix(Carlsbad, CA)로부터 구매하였으며, 파이브로넥틴은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구매한다.
조직 및 세포 샘플: 유방암에서 유래한 인간 종양 세포 샘플을 연구했다(C1815, C1596, C1838, C135, C42, C264). 표적 요법의 선택을 안내하는데 사용되는 임의의 바이오마커는 존재한다면, 각각의 환자에 대해 표 22에 열거되어 있다.
신호전달 경로 활성제 제제 및 표적화된 치료제 쌍:
각각의 인간 종양 세포 샘플에서, 3개의 활성제 제제(EGF, NRG1, HGF) 조합에 의해 개시된 HER1, HER3 및 c-Met 경로의 총 신호전달 활성을 정량화하였다. 또한, 총 11가지의 상이한 단일 약물 또는 다중 약물 조합에서 5개의 상이한 약물(네라티닙, 2C4, HER1+HER3 mAb, 테포티닙, 타셀리십)에 의해 억제된 활성제 제제에 의해 개시된 신호전달 경로 활성의 양을 정량화했다. 각각의 신호전달 경로 활성제 제제는 그것의 연관된 신호전달 경로의 잘 특성규명된 및 특이적 효능제이다. 4개의 시험된 표적화된 치료제 - 네라티닙, 2C4, HER1+HER3 mAb 및 테포티닙은 성장 인자에 의해 활성화된 신호전달 경로 중 적어도 하나의 잘 특성규명된 및 특이적 길항제이다. 테스트된 제5 표적화된 치료제인, 타셀리프는 HER 계열 및 c-Met 수용체의 다운스트림인 PI3k에 결합하는 억제제이다.
다른 시약: 표준 배지 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 기타 완충액을 구입하여 ATCC(Manassas, VA, USA) 또는 Life Technologies(Grand Island, NY)에서 제공한대로 사용한다.
절차 : 신호전달 경로 활성제(들) 및 표적화된 치료제(들)을 갖는 환자 세포 샘플의 각각의 테스트에 대해, 6 또는 8개의 웰에 120 uL 배양 배지내 약 15,000개의 세포를 시딩하고; 6개의 웰은 단일 약물을 단독 평가할때 시딩하고, 8개의 웰은 2개의 약물을 평가할때만 시딩하였다. 단일 약물을 단독으로 평가할때 20 uL의 표적화된 치료제를 각각의 환자의 세포의 2개의 웰에 첨가하였고, 단일 치료제를 갖는 2개의 웰에서 치료제의 최종 농도는 500 nM이었다. 2개의 치료제를 평가할 때, 환자 세포의 2개의 웰에 각각 500 nM의 농도로 20 uL의 결합된 치료제를 투여하였고, 추가로 2개의 환자 세포 웰에 각각 50 nM의 농도로 결합된 치료제 20 uL을 투여하였다. 20 uL의 표준 매질을 신호전달 경로 활성제 제제를 첨가하기 18시간 전에 각각의 환자에 대한 다른 4개의 웰에 첨가하였다. 20 uL의 표적화된 치료제를 각각의 환자의 세포의 2개의 웰들에 첨가하고, 표적화된 치료제를 투여한 2 또는 4개의 웰에 및 각각의 환자의 세포 세트에 대하여 2개의 웰에 20 ul의 신호전달 경로 활성제 제제를 첨가하여 신호전달 경로 자극을 개시하였다. 부착 및 접착 변화의 임피던스 기록은 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 테스트를 통해 데이터를 연속적으로 기록하였으며, 상기 제시된 데이터는 표적화된 치료제 및 9가지 다른 환자 샘플에 대한 신호전달 활성제 제제 첨가후 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준에서 제공된다.
결과:
표 24는 위에 기재된 방법을 사용하여 수행된 102가지 테스트 각각에 대한 출력 값으로 표현된 결과를 나타낸다. 6명의 환자 샘플 각각에 대해 3가지 상이한 신호전달 경로(HER1, HER3, c-Met)가 동시에 활성화되었다. 출력 값은 신호전달 경로 활성제(들)의 첨가로 인한 세포 유착 변화량과 표적화된 치료제(들)의 첨가로 인한 세포 유착 변화량 사이의 차이를 나타낸다. 단독으로 또는 다중 신호전달 경로 활성제 제제로 자극된 세포의 가장 많은 신호전달 경로 활성을 억제하는 표적화된 치료제(들)는 환자를 치료하기 위해 선택된 것일 것이다.
Figure pct00039
하기 표 25는 각각의 환자의 세포에 존재하는 바이오마커와 환자를 치료하는데 사용되는 해당 표적 요법 목록이다. 또한, 표 25는 본 명세서에 기재된 방법에 기초하여 환자에게 투여하기에 권장되는 잠재적 표적화된 치료제를 열거한다.
Figure pct00040
논의:
시험된 6명의 환자 각각에 대해, 본 명세서에 기재된 방법의 결과를 사용하여 투여되는 표적화된 치료제는 현재의 표준 치료법 지침이 추천하는 표적 치료법과는 상이하다. 각각의 환자에 대해, 50 나노몰 농도에서 시험된 두 약물로 기록된 출력 값은 동일한 두 약물이 500 나노몰 농도에서 시험되었을 때 출력 값과 거의 동일했다. 4명의 환자들에 대해, 두 약물의 시험은 개별적으로 평가할 때 동일한 두 약물의 조합된 출력 값보다 높은 출력 값을 동시에 생성했다. 이 결과는 약물이 공-활성화된 경로를 치료할 때 약물을 조합하여 사용하는 것의 동반상승효과가 있음을 입증한다. 본 실시예는 처방된 현재의 표준 치료 요법이 기저 질환 기전, 즉 그 환자에서 입증된 특정 신호전달 경로 기능이상을 치료하지 않기 때문에 암 환자 신호전달 경로의 활성 측정의 중요성을 확인한다. 본 실시예는 또한 여러 활성제와 치료제를 동시에 테스트하는 이점을 확인한다. 마지막으로, PI3k 억제제, 타셀리십을 포함하는 시험은 활성제 제제의 결합 부위 다운스트림에 있는 노드 억제제의 신호전달 활성에 대한 효과를 입증한다.
실시예 4: 두 경로를 처리하는 두 약물의 마우스 이종이식 연구
c-Met과 ErbB 계열 수용체 사이의 누화를 포함한 비정상적인 c-Met 신호전달은 다양한 암 유형에서 역할을 한다고 의심된다. 그러나, 임상적으로 항암 치료법을 평가하는 임상 시험은 유방암과 폐암의 다른 표적화된 치료법과 조합하여 대부분 부정적인 결과를 초래했다. 이러한 시도는 c-MET 단백질 과발현 또는 유전자 증폭으로 대상자를 등록하여, 수용체 상태와 표적화된 치료적 반응간에 낮은 상관관계를 나타냈다. 본 발명에 따라 살아있는 종양 세포를 사용하는 다중 신호전달 경로의 활성을 측정하는 이점을 입증하기 위해, 그 결과를 본 발명에 기재된 CELx 테스트로 얻은 결과와 비교한 마우스 이종 이식 연구를 수행하였다.
방법:
HER2+ 종양 세포 샘플, C21을 상기 실시예 1 및 3에 기재된 것과 본질적으로 동일한 방법을 사용하여 시험하여, c-Met, EGFR, HER2 및 HER3 경로의 상태를 평가하였다. 이 세포를 동시에 첨가된 NRG1, EGF 및 HGF 활성제 제제로 시험하고, 이들 조합된 활성제를 네라티닙(pan-HER 억제제), 테포티닙(c-Met 억제제), 및 네라티닙으로 시험한 동일한 샘플의 다른 부분과 테포티닙을 병용하여, 동시에 활성화될때 이들 경로에 대한 이들 표적화된 치료법의 효과를 동시에 측정할 수 있다. 이 세포 샘플은 정상 HER2 신호전달, 비정상적인 EGFR 신호전달 및 비정상적인 c-Met 신호전달을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이 세포 샘플은 동일한 세포 샘플의 다른 부분이 이종이식 마우스 모델에 이식되었을 때 CELx 테스트에서 생체외에서 c-Met 및 EGFR 억제제에 반응하는 것으로 밝혀진 세포가 이들 동일한 억제제에 반응하는지 여부를 평가하는데 적합했다.
이종 이식 연구를 위해, 40마리의 암컷 NSG 마우스에 각각 200만개의 C21 세포를 주사하였다. 마우스는 하기와 같이 처리된 4개의 10-마우스 아암 중 하나에 무작위로 배정되었다: 1) 비히클을 투여한 대조군; 2) 팬-HER 억제제인 네라티닙; 2) c-Met 억제제인 테포티닙; 또는 3) 네라티닙 및 테포티닙. 마우스를 16일 동안 치료하였다.
결과:
CELx 생체외 테스트는 C21 샘플이 HGF(c-Met 리간드)에 의해서만 작용될 때, 매우 특이적인 c-Met 억제제인 테포티닙에 의해 억제된 c-Met 신호전달 활성의 백분율이 거의 100%임을 입증했다. 이것은 측정된 c-Met 활성의 특이성을 입증하였다. C21 세포 샘플이 NRG1, EGF 및 HGF(즉, HER 계열 신호전달 경로 및 c-Met 신호전달 경로의 동시 활성화)에 의해 동시에 작용되고, 테포티닙 단독(c-Met 억제제)으로 길항되었을 때, 총 신호전달의 10% 미만이 억제되었다. 그러나, C21 세포 샘플을 NRG1, EGF 및 HGF로 동시에 작용시키고 테포티닙(c-Met 억제제) 및 네라티닙(EGFR 신호전달 경로를 억제하는 pan-HER 억제제)을 길항한 경우, c-Met 및 EGFR 신호전달 활성 억제의 백분율은 거의 100%였다. EGFR 억제제와 조합된 테포티닙에 의한 c-Met 및 EGFR 신호전달 억제의 증가는 c-Met 신호전달 활성이 EGFR 신호전달 활성과 함께 활성화된다는 것을 시사한다. 이 발견은 어느 한 수용체의 수용체 또는 유전자 증폭 상태와 관련이 없으며, 신호전달 활성이 단리되어 측정될 때 관측할 수도 없다. 이것은 생존 세포에서 여러 신호전달 경로를 동시에 평가할 때의 이점을 강조한다.
이러한 생체외 결과에 비추어, C21 세포를 갖는 마우스 이종이식은 네라티닙과 같은 EGFR 억제제 및 테포티닙과 같은 c-Met 억제제의 조합으로 치료할 때 가장 높은 수준의 약물 반응을 나타낼 것으로 기대되었다. 이를 테스트하기 위해, 상기 기재된 4-아암 마우스 이종이식 연구가 수행되었으며, 그 결과는 도 1에 도시되어 있다. 치료 16일 후 대조군과 테포티닙 단독-치료군 사이의 종양 부피의 차이는 10%였다. 그러나, 대조군에 비하여 종양 부피는 네라티닙 단독-치료군에서 52%, 테포티닙 + 네라티닙 치료군에서 73% 감소했다. 따라서, 이러한 결과는 단일 제제로서의 테포티닙이 네라티닙과 같은 EGFR 억제제와 조합될 때만큼 효과적이지 않은 것으로 밝혀진 CELx 신호전달 분석 결과와 일치한다.
논의:
이종 이식 연구에서 테포티닙 단독에 대한 테포티닙 및 네라티닙 약물 조합의 탁월한 종양 감소는 본 발명에 기재된 다중-경로 CELx 분석을 사용하여 약물 치료를 선택하기 위한 게놈 바이오마커 분석에 대한 이점을 확인한다. C21 세포에서 c-Met 및 EGFR 신호전달 활성을 단독 및 동시에 CELx 분석으로 분석하지 않으면, c-Met 억제제가 환자에게 어떤 이점을 줄 수 있을지에 대한 근거가 없어, EGFR 억제제와 조합했을 때의 개선된 효능을 훨씬 덜 제공할 것이다.

Claims (91)

  1. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    각각의 세트가 표적화된 치료제인 제1 제제 및 상기 제1 제제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 활성제인 제2 제제를 포함하는, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 상기 샘플을 접촉시키는 단계로서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트가 상이한 신호전달 경로에 영향을 주어, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
    각각의 제1 제제 또는 각각의 제2 제제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 대해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플에서 세포 유착 또는 부착의 변화가 발생했는지 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    시험된 모든 세트의 최고 절대 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 투여된 표적화된 치료제가 보다 낮은 절대 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트(들)로부터의 표적화된 치료제(들)보다 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 보다 치료적으로 활성인 것을 나타내는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 쌍으로 된 제제의 10개 이상의 세트와 접촉되며, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 신호전달 경로에 영향을 미치는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, PDGFR, SMO, FLT3, Axl, Patched 1, 프리즐레드(Frizzled) 및 노치(Notch)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 쌍으로 된 제제의 세트 및 신호전달 경로는 하기 표로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00041
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, PDGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGF베타/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 상이한 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 쌍으로 된 제제의 각각의 세트는 표 12에 제시된 쌍으로 된 제제의 세트로부터 선택되는, 방법.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, 하기 적어도 2개의 표적화된 치료제가 상기 대상체에게 투여되는, 방법: (ⅰ) 시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 한 세트로부터의 표적화된 치료제 및 (ⅱ) 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 표적화된 치료제가 치료적으로 활성임을 나타내는 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제로부터의 적어도 하나의 추가의 표적화된 치료제.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 표적화된 치료제는 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 표적화된 치료제가 치료적으로 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에서 제2 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 상기 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 상기 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제인, 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 상이하지만, 상기 제1 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는, 방법.
  17. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 신호전달 경로가 하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 것으로 결정되는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하도록 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 활성제와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 샘플의 일부가 고농도의 활성제와 접촉되고, 상기 샘플의 일부가 저농도의 활성제와 접촉되는, 단계;
    저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    상기 연속 측정의 수학적 분석에 의해 상기 활성제에 대한 상기 신호전달 경로의 민감성을 결정하는 단계; 및
    신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감성일 때 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하여, 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성임을 나타내는 단계.
  18. 청구항 17에 있어서, 저농도의 활성제와 접촉된 샘플의 부분에 비해, 및 활성제와 접촉하지 않은 샘플의 부분에 비해, 고농도의 활성제와 접촉된 샘플 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    활성제와 접촉하지 않은 샘플의 부분과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 활성제와 접촉된 샘플의 부분에서 일어났는지 여부를 특징짓는 활성제에 대한 샘플의 연속적 측정 민감도 및 활성제에 대한 출력값을 수학적 분석에 의해 결정하는 단계;
    신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성 상태임을 나타내는, 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감성일 때, 또는 활성제에 대한 출력 값이 사전-결정된 컷-오프 값보다 클때, 활성제가 영향을 미치는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 활성제의 고농도는 EC90이고 활성제의 저농도는 EC10인, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 81 미만의 EC90:EC10 비율은 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감성인 것을 나타내는, 방법.
  21. 청구항 17 또는 18에 있어서, 활성제에 대한 신호전달 경로의 민감도는 힐(Hill) 계수를 결정하기 위해 힐 방정식을 사용하여 결정되는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 1보다 큰 힐 계수 값은 신호전달 경로가 활성제에 대해 초-민감하다는 것을 나타내는, 방법.
  23. 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  24. 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, PDGFR, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체 (IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, lamins, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  25. 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 경로는 HER 계열 신호전달 경로인, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, HER 계열 신호전달 경로는 HER2 신호전달 경로인, 방법.
  27. 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합인, 방법.
  28. 청구항 17 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287(AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428(BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 청구항 17 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  30. 청구항 17 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 청구항 17 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  33. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    상기 샘플을 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉시키는 단계로서, 각각의 삼중항 세트는 제1 제제 표적화된 치료제 및 표적화된 치료제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 적어도 2개의 제2 제제 활성제를 포함하며, 세포 유착 또는 부착 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
    제1 제제 표적화된 치료제 또는 각각의 제2 제제 활성제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포 샘플에 비해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플내 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    제1 제제 표적화된 치료제 또는 제2 제제 활성제 단독과 접촉되는 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제제의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 일어나는지의 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    표적화된 치료제가 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로에서 치료적으로 활성임을 나타내는, 출력 값이 사전-결정된 컷오프 값보다 클 때 제제의 삼중항 세트로부터 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 신호전달 경로가 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, FGFR, IGFR, PDGFR, EGFR, FLT3, Axl, SMO, Patched 1, 프리즐레드 및 노치로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 청구항 33에 있어서, 상기 신호전달 경로가 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, IGFR, PDGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체(IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 청구항 33에 있어서, 상기 신호전달 경로가 HER 계열 신호전달 경로인, 방법.
  37. 청구항 33에 있어서, 상기 제1 제제 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제에 의해 영향을 받은 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 활성임을 나타내는 50% 초과의 출력 값 백분율을 갖는 것으로 결정되는, 방법.
  38. 청구항 33 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 삼중항 세트에서 상기 제2 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합인, 방법.
  39. 청구항 33 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  40. 청구항 33 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  41. 청구항 33 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  43. 청구항 33 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제인, 방법.
  44. 청구항 33 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 상기 제1 제제 표적화된 치료제와 상이하지만 상기 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는, 방법.
  45. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 대상체의 암 세포에서 신호전달이 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    (i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 제1 제제 활성제로서, 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 상기 활성화 결합 부위에 대한 다운스트림, 업스트림 또는 측면의 결합 부위에서 상기 활성제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 제2 제제 표적화된 치료제와 샘플을 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 상기 제1 제제 및 상기 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
    제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 및 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지 여부를 특징짓는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    제2 제제 표적화된 치료제가 영향을 주는 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷-오프 값 이상인 단계.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 신호전달 경로가 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, PDGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체(IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  47. 청구항 45 또는 46에 있어서, 상기 제1 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합인, 방법.
  48. 청구항 45 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  49. 청구항 45 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  50. 청구항 45 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  52. 청구항 45 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 상기 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287(AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428(BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 청구항 45 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제2 제제 표적화된 치료제인, 방법.
  54. 청구항 45 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 상기 제2 제제 표적화된 치료제와 상이하지만 상기 제2 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는, 방법.
  55. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    (i) 신호전달 경로에 영향을 미치는 2개 이상의 제1 제제 활성제로서, 각각의 활성제가 활성화 결합 부위를 갖는 활성제, 및 (ii) 상기 활성제의 활성화 결합 부위에 대한 다운스트림, 업스트림 또는 측면의 결합 부위에서 2개 이상의 제1 제제 활성제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 제2 제제 표적화된 치료제를 샘플과 접촉시켜서, 세포 유착 또는 부착 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
    제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제1 제제 및 제2 제제와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제1 제제 또는 제2 제제 모두와 접촉된 샘플에서 발생했는지를 특징짓는 출력 값을 연속 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    제2 제제 표적화된 치료제가 영향을 주는 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 세포 유착 또는 부착의 변화를 특징짓는 출력 값이 대상체의 암 세포에서 신호전달 경로가 활성임을 나타내는 컷오프 값 이상인, 단계.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 신호전달 경로가 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, PDGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체(IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  57. 청구항 55 또는 56에 있어서, 상기 제1 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합인, 방법.
  58. 청구항 55 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  59. 청구항 55 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  60. 청구항 55 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  62. 청구항 55 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 상기 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287(AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428(BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  63. 청구항 55 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제2 제제 표적화된 치료제인, 방법.
  64. 청구항 55 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 상기 제2 제제 표적화된 치료제와 상이하지만 상기 제2 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는, 방법.
  65. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    각각의 세트가 적어도 하나의 표적화된 치료제인 제1 제제 및 상기 제1 제제가 다루고자 하는 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 주는 것으로 알려진 적어도 하나의 활성제인 제2 제제를 포함하는, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 상기 샘플을 접촉시키는 단계로서, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트가 상이한 신호전달 경로에 영향을 주어, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 쌍으로 된 제제의 적어도 2개의 세트와 접촉된 샘플을 생성하는 단계;
    각각의 제1 제제 또는 각각의 제2 제제 단독과 접촉되는 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 대해, 쌍으로 된 제제의 각각의 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    제1 제제 또는 제2 제제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 쌍으로 된 제제의 세트와 접촉된 샘플에서 세포 유착 또는 부착의 변화가 발생했는지 여부를 특징짓는 쌍으로 된 제제의 각각의 세트에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    시험된 모든 세트의 최고 출력 값을 갖는 것으로 결정된 쌍으로 된 제제의 세트로부터의 제1 제제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 투여된 표적화된 치료제가 보다 낮은 출력 값을 갖는 쌍으로 된 제제의 세트(들)로부터의 표적화된 치료제(들)보다 대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 보다 치료적으로 활성인 것을 나타내는 단계.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 신호전달 경로가 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, PDGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체(IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  67. 청구항 65 또는 66에 있어서, 상기 제2 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합인, 방법.
  68. 청구항 65 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로와 상이한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 c-Met/HGF 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  70. 청구항 68에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 에스트로겐 수용체(ER) 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  71. 청구항 68에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 FGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  72. 청구항 68에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 HER 계열 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 PDGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  73. 청구항 65 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 에스트로겐 수용체(ER) 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 ER 신호전달 경로와 상이한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  74. 청구항 73에 있어서, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 ER 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치고, 쌍으로 된 제제의 적어도 한 세트는 IGFR 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는, 방법.
  75. 청구항 65 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  76. 청구항 65 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  77. 청구항 65 내지 76 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  79. 청구항 65 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 투여되는 상기 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287(AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428(BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  80. 청구항 65 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제인, 방법.
  81. 청구항 65 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 표적화된 치료제는 상기 제1 제제 표적화된 치료제와 상이하지만 상기 제1 제제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는, 방법.
  82. 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 신호전달이 대상체의 암 세포에서 측정된 신호전달 경로에서 치료적으로 활성인 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    상기 샘플을 적어도 하나의 삼중항 세트의 제제와 동시에 접촉시키는 단계로서, 각각의 삼중항 세트가 제1 제제 표적화된 치료제, 제1 제제가 다뤄지는 것으로 의도된 동일한 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 것으로 알려진 제2 제제 활성제 및, 제1 제제와 상이한 신호전달 경로 또는 제1 제제가 영향을 주는 신호전달 경로내 상이한 위치에 영향을 주는 제3 제제 표적화된 치료제를 포함하며, 세포 유착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 제1 제제가 영향을 미치는 신호전달 경로를 상향조절하거나 하향조절하여, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉한 샘플을 생성하는 단계;
    제1 제제 표적화된 치료제 단독, 제2 제제 활성제 단독, 또는 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 상기 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플에 비해, 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트와 접촉된 샘플에서 생존가능한 암 세포의 세포 유착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    제1 제제 표적화된 치료제 단독, 제2 제제 활성제 단독 또는 제3 제제 표적화된 치료제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여, 세포 유착 또는 부착의 변화가 제제의 삼중항 세트와 접촉된 샘플내에서 일어나는지의 여부를 특징짓는 제제의 적어도 하나의 삼중항 세트에 대한 출력값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    대상체의 암 세포의 세포 신호전달 경로내에서 상기 제1 제제 표적화된 치료제가 치료적으로 활성임을 나타내는, 사전-결정된 컷-오프 값보다 출력 값이 큰 경우, 제제의 삼중항 세트로부터의 제1 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 주는 적어도 하나의 표적화된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
  83. 청구항 82에 있어서, 제1 제제 또는 제3 제제에 의해 영향을 받는 신호전달 경로가 HER2/HER1, HER1, HER2/HER3, HER3, c-Met/HGF, ALK, ROS, FGFR, PDGFR, IGFR, EGFR, FLT3, Axl, Tyro3, Mer, SMO, Patched 1, 프리즐레드, 노치, MAPK, RON, RHO, AKT, FAK1, RAS, RAF, PI3K/PTEN, MAK, MKK, MEK, MEKK, Mos, Erk, MLK, MLK3, TAK, DLK, p38, ASK, SAPK, JNK, BMK, PKC, PI3K, PIK3/PTEN, Bad, Bcl, Bak, Bax, BID, Bim, Noxa, Puma, BH3, 카스파제, p53, NIK, NFkB, ROCK, XIAP, MOMP, ILK, PDK, 인슐린 수용체(IR), IGFR, mTOR, Jak, PIKK, 4E-BP1, Raptor, KMT, MLL, KDM, UTX, DOT1L, BRD, TET, SirT1, Hat, SNF, DNMT, EZH, AMPK, PLC, CaMKK, 글루코스 수송체, PFK, FAS, Krebs 사이클, 당분해, TNFR, TRAD, TRAF, TAB, NEMO, NIK, IKK, RelA, RelB, kB, IL1R, IRAK, Myd88, TRADD, FADD, FLIPs, ICAD, CAD, PARP, 라민, ZNRF, WntR, PAR, GSK, Dsh, LGR, 카테닌, WTX, APC, Src, CBP, Fringe, Furin, 델타 Jagged, NIC, 프레세닐린, CDO, BOC, Gli, KIF, 사이클린 D, 사이클린 E, SARA, Smad, Smurf, NLK, p28, Myc, Max, Fos, Jun, LIMK, 코필린, CD44, FAT, KIBRA, FRMD, Mst, YAP, LATS, MOB, SAV, TEAD, Mer, SAB, TAZ, Rho, Rac, PAK, CREB, HER2, HER3, HER4, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GPER30, VEGF 수용체, TGFbeta/SMAD, WNT, 헤지혹/GLI, HIF1 알파, JAK/STAT, G1/S 전이의 조절, DNA 손상 조절, 및 세포자멸사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  84. 청구항 82 또는 83에 있어서, 상기 제2 제제 활성제는 단백질, 펩타이드, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  85. 청구항 82 내지 84 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는, 방법.
  86. 청구항 82 내지 85 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  87. 청구항 82 내지 86 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  88. 청구항 87에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-세포자멸제를 포함하고 혈청이 없는 배지에서 배양되는, 방법.
  89. 청구항 82 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 상기 적어도 하나의 표적화된 치료제는 세툭시맙, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 파조파닙, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 에버롤리무스, 아비라테론, 바이칼루타마이드, 보르테조밉, 베무라페닙, 이필리무맙, 페르투주맙, MEDI4276, ONT-380, 네라티닙, 아파티닙, 둘리고투주맙, 다코미티닙, 사피티닙, 포지오티닙, ASLAN001, MM-111 MM-121, MM-141, LJM716, U3-1287(AMG 888), TK-A3/TK-A4, 룸레투주맙, REGN1400, AV-203, AZD5363, 아푸레세르팁, MK-2206, 이파타세르팁, 리다포롤리무스, 템시롤리무스, 셀레메티닙, 코비메티닙, GDC-0994, 타셀리십, 알펠리십, 부파를리십, AZD8186, AZD8835, 파니투무맙, REGN955, MM-151, 오시머티닙, 로실레티닙, AZD5363, SGX-523, 오나투주맙, 카보잔티닙, 볼리티닙, 티반티닙, 카프마티닙, 에미베투주맙, 릴로투무맙, 피클라투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, Sym015, AMG337, JNJ-61186372, 글레사티닙, 1202, LY3023414, 게다톨리십, JI-101, 포나티닙, 수니티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 브리가티닙, 알렉티닙, BGJ398, 린시티닙, 퀴자르티닙, R428(BGB324), 길테리티닙, 비스모데깁, 이트라코나졸, 5E1, LGK974, 세마가세스타트, 코비메티닙, AZD4547, JNJ-42756493, 달로투주맙, MEDI-573, 가니투맙, 소니데깁, 반티크투맙, 이파프리셉트, 타렉스투맙, 브론티크투주맙, SB431542, EW-7197, RepSox, AZD9291, 로실레티닙, 아브락산, 브렌툭시맙 베도톤, 오파투무맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 바이칼루타마이드, 젬시타빈, 이마티닙, 익사베필론, 로미뎁신, 카브라지탁셀, 소라페닙, 인플릭시맙, 레날리도마이드, 리툭시맙, 다사티닙, 닐로티닙, 테모졸로마이드, 보르테조밉, 아자시티딘, 테포티닙, 로르라티닙, 메레스티닙, RG6114, 투칸티닙, 파조파닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 고세렐린 아세테이트, 아비라테론, BH3 모방체, 나비토클락스, 아나스트로졸, 레트로졸, 방향화효소 억제제, 익사베필론, 아플리베르셉트, 템시롤리무스, 이르브리투모맙, 아비라테론, 쿠스티르센, 엔잘루타마이드, 니볼루맙, 팔보시클립, 레고라페닙, 엔티노스타트, ARN-509, ARN-810, BIND-014, 다브라페닙, 다라투무맙, 람브롤리주맙, LDK378, sym004, 트라스투주맙 엠탄신, 티보자닙, 트라메티닙, 악시티닙, LY2835219, MPDL320A, 오비누투주맙, Sym004, 토시투모맙, 트라메티닙, 네시투무맙, 라무시루맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  90. 청구항 82 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 제1 제제 표적화된 치료제, 제3 제제 표적화된 치료제, 또는 제1 및 제3 제제 표적화된 치료제 모두인, 방법.
  91. 청구항 82 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 적어도 하나의 표적화된 치료제는 제1 제제 및/또는 제3 제제 표적화된 치료제와 상이하지만, 상기 제1 제제 또는 제3 제제 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로를 표적으로 하는, 방법.
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