KR20220143813A - Ras 노드 또는 rtk 표적화된 치료제를 사용하여 암 환자를 치료하는 방법 - Google Patents

Ras 노드 또는 rtk 표적화된 치료제를 사용하여 암 환자를 치료하는 방법 Download PDF

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KR20220143813A
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랜스 가빈 랭
살만 아흐메드 칸
브라이언 프란시스 설리반
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셀퀴티 인크.
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Abstract

대상체로부터 수득된 이환된 세포 샘플에서 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달 경로의 기능적 상태를 결정하여, 이에 의해 대상체에서 RAS 노드 또는 수용체 티로신 키나제 (RTK) 표적화된 치료제를 치료적 사용을 위해 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, GPCR 신호전달 경로가 대상체로부터의 이환된 세포 샘플에서 초민감성인지 여부를 결정하는 방법이 제공된다. 선택된 RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 방법이 또한 제공된다.

Description

RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제를 사용하여 암 환자를 치료하는 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 12월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/945,608을 우선권 주장하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
암은 상당한 의학적 문제이며, 미국에서 남성 및 여성의 대략 40%가 일생 중 일부 시점에서 암 진단을 받는 것으로 추정된다. 환자에 걸친 암의 이질성을 감안할 때, 각 환자의 암 특징에 기초한 맞춤형 요법 및 환자가 특정한 치료제에 반응할 가능성이 높은지 여부를 결정할 수 있는 것이 큰 관심이며 맞춤형 의료의 목적이다. 그럼에도 불구하고, 기존의 예후 도구 세트는 상당한 단점을 갖는다. 실제로, 현재 주요 유전자 및 단백질 바이오마커의 검출은 치료적 반응성에 대한 불량한 예측 가치를 갖는 것으로 나타났다.
각 환자가 상이하고 요법이 종종 긍정적인 반응을 유도하지 못할 수도 있다는 인식에 대한 한 가지 반응은 동반 진단의 개발이었다. 이 유형의 진단 시험은 특정한 약물에 반응할 가능성이 더 높은 환자를 식별하기 위해 동시대의 바이오마커 검출 도구를 사용하여 설계된다. 시험은 증가된 유전자 수, 유전자 돌연변이(들), 또는 특정한 유전자의 변경된 발현 수준을 찾는 것을 포함한다. 오늘날 많은 암은 질환과 연관된 특정 유전적 돌연변이 또는 과다발현된 수용체 단백질의 존재를 결정하기 위한 시험의 도움으로 진단된다. 그러나, 대부분의 바이오마커 시험은 질환 및 이의 근본적인 원인에 대한 간접적이고 추론적인 정보만을 제공한다. 그러므로, 상당한 치료적 반응을 예측할 때 이들 시험의 대부분에 대한 성공률은 종종 50%보다 훨씬 더 적다. 예를 들어, PI3KCA 돌연변이를 갖는 말기 유방암 환자의 20% 미만이 승인된 PIK3CA 억제제인 알펠리십에 반응하며 (Andre et al., N Engl J Med 2019;380:1929-40), 이는 유전적 돌연변이의 존재가 돌연변이된 유전자/단백질에 의해 영향을 받는 비정상적인 신호전달을 특이적으로 표적화하는 약물에 환자가 반응할지 또는 반응하지 않을지 여부를 반드시 예측하는 것은 아님을 시사한다.
환자의 세포에 의한 특정한 유전자 또는 단백질 바이오마커의 발현을 단순히 검출하는 것이 치료적 반응성의 고도로 효과적인 예측인자가 아니라는 이러한 관찰은 치료적 치료 요법을 선택하기 위한 더 효과적인 수단이 필요함을 입증한다. 특정 환자의 세포가 어떻게 기능하거나 오작동하는지를 해결하기 위한 한 가지 접근법은 신호전달 경로의 활성 또는 이의 결여를 나타내는 세포 접착과 같은 생리학적 반응 파라미터의 변화의 평가를 통해 환자의 세포에서 신호전달 경로의 활성을 조사하는 것이었다. 이러한 접근법은 조사되는 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 표적화된 치료제의 유효성의 정확한 예측을 허용하였다 (PCT 공개 WO 2013/188500 및 WO2018/175251에 기재된 바와 같음, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 그러나, 시장에서 승인된 약물의 제한된 무기고를 감안할 때, 이들 약물에 반응적이고 치료가능할 수 있는 환자의 새로운 하위집단을 식별할 필요가 항상 있다.
본원에 기재된 방법은 RAS 노드 (예를 들어, 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K), AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, BCL) 또는 수용체 티로신 키나제 (RTK) 신호전달 경로의 억제에 반응적이며 그러므로 각각 RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 선택된 비정상적인 G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달을 갖는 암 환자의 하위집단의 식별, 선택 및 치료를 허용한다. 이러한 방법은 전형적으로 치료 표준 가이드라인에 따른 요구사항인 RAS 노드 또는 RTK의 유전적 돌연변이를 갖지 않을 수 있으며 그러므로 초기에는 이들 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위한 것으로 간주되지 않았지만 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료 후보로서 새롭게 식별된 환자의 하위집단의 식별을 허용한다는 점에서 고도로 유익하다. 본원에 개시된 방법은 RAS 노드 또는 RTK 노드 관련이 있는 비정상적인 리소인지질 GPCR 신호전달을 갖는 환자를 식별, 선택 및 치료하는데 특히 적합하다.
보다 구체적으로, 본원에 개시된 방법은 또 다른 부위, 즉 RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, BCL) 또는 RTK에서의 신호전달 경로 활성의 억제 (길항작용)와 조합된 한 부위, 즉 GPCR에서의 신호전달 경로 활성의 활성화 (효능작용)를 포함하며, 이에 의해 환자의 세포에서 비정상적인 GPCR 신호전달 경로 활성이 RAS 노드 또는 RTK 신호전달 경로의 억제에 의해 조정될 수 있는지 여부를 결정한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 방법은 억제제에 의해 표적화된 RAS 노드의 비-돌연변이된 (즉, 야생형) 버전을 가짐에도 불구하고 세포가 RAS 노드의 억제제에 반응적인 암 환자의 하위집단을 성공적으로 식별하였다. 더욱이, 이 방법은 RTK를 과다발현하지 않음에도 불구하고 세포가 RTK 억제제에 반응적인 암 환자의 하위집단을 성공적으로 식별하였다 (즉, RTK 음성 세포). 또한, 이 방법은 또한 돌연변이된 PI3K 효소를 갖지 않음에도 불구하고 세포가 PI3K 억제제에 반응적인 암 환자의 하위집단을 성공적으로 식별하였다. 또한, 이 방법은 또한 돌연변이된 PI3K 효소를 가짐에도 불구하고 세포가 PI3K 억제제에 반응적이지 않은 암 환자의 하위집단을 성공적으로 식별하였다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 그렇지 않으면 현재의 치료 표준 하에 식별되지 않았을 암 환자의 특정 집단을 위한 표적화된 요법을 이용가능하게 한다. 이 방법은 또한 선택 기준으로서 돌연변이된 PI3K 효소를 사용하는 현재의 치료 표준이 PI3K 억제제를 사용하는 치료를 위해 환자를 식별하더라도 PI3K 억제제를 사용하는 치료를 위해 표시되어서는 안되는 환자를 식별한다.
따라서, 한 측면에서, 하기 단계를 포함하는, RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 측면에서, RAS 노드에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 포스포이노시티드 3 키나제 (PI3K), ERK, MEK, mTOR, RAF, BCL, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 샘플의 제1 부분은 2종 이상의 억제제와 접촉되며, 이들 각각은 상이한 RAS 노드를 억제한다. 예를 들어, 2종 이상의 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 RAS 노드의 조합을 억제할 수 있다: (a) PI3K, mTOR 및 BCL, (b) PI3K, mTOR 및 RAF, (c) PI3K, mTOR 및 ERK, 및 (d) PI3K, mTOR 및 MEK. 일부 실시양태에서, 대상체는 상이한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제의 조합으로 치료되거나 또는 그를 사용하는 치료를 위해 선택된다.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 PI3K이고, 억제제는 PI3K 억제제이다. 한 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110α 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110β 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110γ 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110δ 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110 서브유닛의 하나 초과의 이소형을 억제한다. 일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110 촉매 서브유닛의 모든 이소형을 억제한다. 일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 또한 mTOR을 억제한다.
일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 보르트만닌, LY294002, 히비스콘 C, 이델라리십 (GS-1101, CAL-101), 코판리십, 두벨리십, 알펠리십, (BYL719), 타셀리십 (GDC-0032), GDC-0077, 페리포신, 이데알리십, 필라랄리십 (XL147), 부파르리십 (BKM120), 두벨리십, 움브랄리십, PX-866, 닥톨리십, CUDC-907, 복스탈리십, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, 픽틸리십 (GDC-0941), 팔로미드 529, SAR260301, GSK1059615, GSK2636771, CH5132799, CZC24832, AZD6482, AZD8835, WX-037, AZD8186, KA2237, CAL-120, AMG-319, AMG-511, HS-173, INCB050465, INCB040093, TGR-1202, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, TGX221, CAL263, RP6530, PI-103, GNE-477, IPI-145, BAY 80-6946, BAY1082439, PX866, BEZ235, MKM120, MLN1117, SAR245408, AEZS-136, 세라벨리십 (TAK-117), 게다톨리십, 오미팔리십 및 필라르리십.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 ERK이고, 억제제는 ERK 억제제, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 ERK 억제제이다: 라복세르티닙, SCH772984, SCH900353 (MK8353), 울릭세르티닙, AZD0364 (ATG017), VX-11e (VTX-113), CC-90003, LY3214996, FR180204, ASN007 및 GDC0994.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 MEK이고, 억제제는 MEK 억제제, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 MEK 억제제이다: 트라메티닙, 비니메티닙, 피마세르팁, 코비메티닙, PD901, U0126, 셀루메티닙, PD325901, TAK733, CI-1040 (PD184352), PD198306, PD334581, PD98059 및 SL327.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 mTOR이고, 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 mTOR 억제제이다: 게다톨리십, 오미팔리십, 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 닥톨리십, AZD8055, ABTL-0812, PQR620, GNE-493, KU0063794, 토르키닙, 리다포롤리무스, 사파니세르팁, 복스탈리십, 토린 1, 토린 2, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리십, GSK1059615, WYE-354, 비스투세르팁, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, WYE-687, WAY600, GDC-0349, XL388, 비미랄리십 (PQR309), 오나타세르팁 (CC-223), 사모톨리십 및 GNE-477.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 RAF이고, 억제제는 RAF 억제제, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 RAF 억제제이다: PLX7904, GDC-0879, 벨바라페닙 (GDC-5573), SB590885, 엔코라페닙, RAF265, RAF709, 다브라페닙 (GSK2118436), TAK-632, TAK580, PLX-4720, CEP-32796, 소라페닙, 베무라페닙 (PLX-4032), AZ-628, GW5074, ZM-336372, NVP-BHG712, CEP32496, PLX4032 및 LGX-818.
일부 실시양태에서, RAS 노드는 Bcl-xL이고, 억제제는 Bcl-xL 억제제, 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 Bcl-xL 억제제이다: 나비토클락스 (ABT-263), GDC-0199 (ABT-199), 사부톡스락스 (Bl-97C1), ABT-737, AT101, TW037, A1331852, BXI-61 및 BXI-72.
일부 실시양태에서, RAS 노드 억제제 및 RAS 노드 표적화된 치료제는 동일한 화합물이다. 다른 실시양태에서, RAS 노드 억제제 및 RAS 노드 표적화된 치료제는 상이한 화합물이다.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, RTK 신호전달의 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 측면에서, RTK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, RTK 신호전달의 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, RTK는 EGFR/ERBB, MuSK, HGFR, NGFR, FGFR, IR, CCK, EphR, RYK, RET, ROS, PDGFR, DDR, LTK, VEGFR, TIE, AXL, ROR, LMR 또는 RTK106 패밀리의 구성원으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, RTK는 ErbB 패밀리의 구성원, 예를 들어 HER2이다.
일부 실시양태에서, RTK 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 반데타닙, 아파티닙, 파니투무맙, 세툭시맙, 브리가티닙, 이코티닙, 오시메르티닙, 네라티닙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 페르투주맙, 트라스투주맙, 다코미티닙, 아코미티닙, BIBW2992, 테세바티닙, 아무바티닙, 네시투무맙, REGN955, MM-151, 나자르티닙, ASP8273, 올무티닙, TDM1, MEDI4276, ZW25, ZW33, 투카티닙, 로실레티닙, 이브루티닙, DS-8201, TAS07828, XMT-1522, TAK-788, Sym013, LIM716, 세리반투맙, AMG888, 룸레투주맙, PF-06804103, ARX788, 포지오티닙, 피로티닙, 둘리고투주맙, MCLA-128, MM-111, 카보잔티닙, 티반티닙, 크리조티닙 (PF-2341066), 테포티닙, 캅마티닙, 사볼리티닙, K252a, SU11274, PHA-665752, ARQ197, 포레티닙, SGX523, MP470, AV229, AMG102, CGEN241, DN30, OA5D5, 릴로투무맙, 오나르투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, ABBV-399, sym015, 피클라투주맙, 메레스티닙, JNJ-61186372, 알티라티닙, Indo5, BMS-754807, BMS-777607, 글레사티닙, CEP-751, ANA-12, 시클로트락신 B, 고시페틴, 엔트렉티닙, 라로트렉티닙, LOXO-101, 도보티닙, 렌바티닙, 포나티닙, 레고라페닙, 루시타닙, 세디라닙, 인테다닙, 브리바닙, PD173074, AZD4547, BGJ398, JNJ42756493, GP369, BAY1187982, MFGR1877S, FP1039, 파조파닙, 에르다피티닙, Debio-1347, B-701, 피소가티닙, FIIN-2, FIIN-3, BLU9931, LY2874455, LY3076226, 수니티닙, AG538, AG1024, NVP-AEW541, 피기투무맙, 린시티닙, 달로투주맙, MEDI-573, 테프로투무맙, 가니투맙, 세리티닙, MM-141, 코페투주맙 펠리도틴 (PF-06647020), 다사티닙, 닐로티닙, NVP-BHG712, 시트라바티닙, ALW-II-41-27, JI-101, 123C4, 소라페닙, 아파티닙, AST487, 알렉티닙, 도비티닙, 크리조티닙, 로라티닙, TPX-0005, DS-6051b, 이마티닙, 리니파닙, KTN0182A, 길테리티닙, 퀴자르티닙, 미도스타우린, 레스타우르티닙, 리프레티닙, 마시티닙, 아바프리티닙, 펙시다르티닙, 텔라티닙, 모테사닙, PLX7486, ARRY386, JNJ-40346527, BLZ945, 에막투주맙, AMG820, IMC-CS4, 카비랄리주맙, CHMFL-KIT-033, SU14813, Ki20227, OSI-930, 플루마티닙, 토세라닙, AZD3229, AC710, AZD2932, ICK03, PLX647, c-Kit-IN-3, 바탈라닙, 베바시주맙, 레바스티닙, BAY-826, 벰센티닙, R428 (BGB324), YW327.6S2, GL2I.T, TP-0903, LY2801653, 보수티닙, MGCD265, ASP2215, SGI-7079, BGB324, HuMax-AXL-ADC 및 UC-961. 일부 실시양태에서, RTK 억제제 및 RTK 표적화된 치료제는 동일한 화합물이다. 다른 실시양태에서, RTK 억제제 및 RTK 표적화된 치료제는 상이한 화합물이다.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 암으로 진단된 인간 대상체가 비정상적으로 활성인 GPCR 신호전달을 갖는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키는 단계;
효능제와 접촉되지 않은 샘플의 부분에 비해 효능제와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화가 효능제와 접촉되지 않은 샘플의 부분과 비교하여 효능제와 접촉된 샘플의 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 효능제에 대한 샘플의 민감성 및 효능제에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하며, 여기서 GPCR 신호전달 경로는 효능제에 대한 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우 비정상적으로 활성인 것으로 간주되는 것인 단계.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 암으로 진단된 인간 대상체가 비정상적으로 활성인 GPCR 신호전달을 갖는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키며, 여기서 샘플의 일부분은 효능제의 더 높은 농도와 접촉되고 샘플의 일부분은 효능제의 더 낮은 농도와 접촉되는 것인 단계;
효능제의 더 낮은 농도와 접촉된 샘플의 부분에 비해 효능제의 더 높은 농도와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계; 및
효능제에 대한 신호전달 경로의 민감성을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하며, 여기서 GPCR 신호전달 경로는 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성인 경우 비정상적으로 활성인 것으로 간주되는 것인 단계.
일부 실시양태에서, 효능제의 더 높은 농도는 EC90이고 효능제의 더 낮은 농도는 EC10이다. 한 실시양태에서, 81 미만의 EC90:EC10 비율은 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성임을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 효능제에 대한 신호전달 경로의 민감성은 힐 계수를 결정하기 위해 힐 방정식을 사용하여 결정된다. 한 실시양태에서, 1 초과의 힐 계수 값은 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성임을 나타낸다.
상기 기재된 방법의 일부 실시양태에서, GPCR은 리소인지질 GPCR, 예컨대 LPA 수용체 (예를 들어, LPAR1, LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5 및 LPAR6) 또는 S1P 수용체 (예를 들어, S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5)이다.
일부 실시양태에서, GPCR 신호전달의 효능제는 단백질, 펩티드, 지질, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물질, 또는 이들의 조합이다. LPA 수용체의 적합한 효능제는 예를 들어 리소포스파티드산 (LPA) (예를 들어, LPA 18:0, LPA 18:1, LPA 18:2, LPA 20:4 및 LPA 16:0), FAP-10, FAP-12 및 OMPT를 포함한다. S1P 수용체의 적합한 효능제는 예를 들어 스핑고신-1-포스페이트 (S1P), FTY720, BAF312, A971432, 세랄리피모드, CS2100, CYM50260, CYM50308, CYM5442, CYM5520, CYM5541, GSK2018682, RP001 히드로클로라이드, SEW2871, TC-G1006 및 TC-SP14를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일부 실시양태에서, GPCR 신호전달 경로는 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 대상체로부터 수득된 암 세포에서 RAS 노드 (예를 들어, PI3K 효소 또는 유전자)는 비-돌연변이된 (야생형), 예를 들어 비-돌연변이된 PI3K, RAF, MEK, ERK, mTOR, BCL, 또는 이들의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체로부터 수득된 암 세포에서 RAS 노드 (예를 들어, PI3K 효소 또는 유전자)는 돌연변이된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체로부터 수득된 암 세포는 RTK, 예컨대 HER2를 과다발현하지 않거나 (즉, 암 세포는 RTK (예를 들어, HER2) 음성 암 세포임), RTK와 연관된 유전적 돌연변이를 갖는다 (예를 들어, HER2 유전자 증폭). 또 다른 실시양태에서, 암 세포에서 GPCR 신호전달의 효능제에 의해 활성화된 GPCR (예를 들어, LPA 수용체 또는 S1P 수용체)은 돌연변이되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 암 세포에서 GPCR 신호전달의 효능제에 의해 활성화된 GPCR은 과다발현되지 않는다.
일부 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-아폽토시스제를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다.
상기 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 세포 접착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다.
본 개시내용은 세포가 표적화된 치료제에 반응적인 암 환자를 식별하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 작용제로 이러한 환자를 선택하고 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK 및 BCL) 또는 RTK 신호전달 경로의 억제와 커플링된 세포에서 GPCR 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK 및 BCL) 또는 RTK 표적화된 치료제에 반응적인 환자가 판독치로서 세포 접착 또는 부착의 변화를 사용하는 세포-기반 검정에서 식별될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 그러므로, 환자의 세포는 한 부위, 즉 GPCR에서 효능작용되고, 또 다른 부위, 즉 RAS 노드 또는 노드들 또는 RTK에서 억제되며, 이는 RAS 노드 또는 RTK 억제제에 반응적인 환자 암 세포를 성공적으로 식별하는 것으로 나타났다. 더욱이, 반응적 암 세포는 비-돌연변이된 RAS 노드 (예를 들어, 야생형 PI3K, mTOR, RAF, MEK 및 ERK)를 발현하는 환자 및 돌연변이된 PI3K 효소 또는 유전자를 발현하는 환자, 뿐만 아니라 세포가 RTK를 과다발현하지 않거나 (즉, RTK-음성 암 세포, 예컨대 HER2-음성 암 세포) RTK와 연관된 유전적 돌연변이를 갖는 (예를 들어, HER2 유전자 증폭) 환자 둘 다에서 성공적으로 식별되었다. 그러므로, 본 개시내용의 방법은 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위한 암 환자의 새로운 하위집단의 식별을 허용한다.
본 개시내용이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 상세한 설명 전반에 걸쳐 추가 정의가 제시된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다. 이 섹션에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 일치하지 않는 경우, 이 섹션에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다. 본원에서 사용된 바와 같은 하기 용어들은 하기 정의를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 대략, 부근, 거의 또는 주변을 의미한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 제시된 수치 값의 위 및 아래의 경계를 연장함으로써 해당 범위를 변형시킨다. 일반적으로, 용어 "약"은 10%의 변동만큼 언급된 값의 위 및 아래의 수치 값을 변형시키기 위해 본원에서 사용된다. 한 측면에서, 용어 "약"은 그것이 사용되는 숫자의 수치 값의 플러스 또는 마이너스 20%를 의미한다. 따라서, 약 50%는 45%-55%의 범위를 의미한다. 본원에서 종점에 의해 인용된 수치 범위는 해당 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함함).
용어 "활성화제", "활성화시키다", "활성화", "교란제", "교란하다" 및 "교란"은 세포와 관련하여 함께 사용될 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 세포에 영향을 미치는 시약, 승인된 약물, 실험 화합물 및 약물 유사 분자 및 개발 중인 실험 약물, 유기 분자, 성장 인자, 신호전달 인자, 생화학물질, 핵산, 시토카인, 케모카인, 또는 단백질을 사용한 세포의 생리학적 조작의 특정 대상체 또는 활성을 지칭한다. 조작은 세포 생리학적 활성의 임의의 조정을 지칭하며 상향 또는 하향-조절을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "효능작용"은 세포 생리학적 활성 (예를 들어, 세포 신호전달 활성)의 상향-조절을 지칭하고, 여기서 용어 "길항작용"은 세포 생리학적 활성 (예를 들어, 세포 신호전달 활성)의 하향-조절을 지칭한다.
용어 "접착"은 세포를 ECM에 또는 다른 세포에 직접적으로, 간접적으로, 및/또는 경로 통신에 의해 간접적으로 연결하는 역할을 하는 임의의 수의 분자를 포함하는 프로세스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인테그린은 세포골격 조직화, 세포 운동성, 세포 주기의 조절, 인테그린 친화성의 세포 조절, 바이러스에 대한 세포의 부착, 다른 세포 또는 ECM에 대한 세포의 부착을 담당한다. 인테그린은 또한 세포가 세포내 및 세포간에 한 종류의 신호 또는 자극을 또 다른 종류의 신호 또는 자극으로 변환하는 프로세스인 신호 전달을 담당한다. 인테그린은 정보를 ECM에서 세포로 및 정보를 세포에서 다른 세포로 (예를 들어, 다른 세포의 인테그린을 통해) 또는 ECM으로 전달할 수 있다. α- 및 β-서브유닛의 조합은 인테그린의 리간드 특이성을 결정한다. 많은 인테그린은 동일한 리간드에 대해 결합 특이성을 가지며, 생체내 상호작용을 특정하는 리간드의 이용가능성 및 인테그린 발현/활성화 패턴의 조합이다. 접착은 세포 구역 또는 세포 집단 구역 내에서 밀도가 변화할 수 있다. 접착은 세포 또는 세포 집단 내에서 양적으로 변화할 수 있다. 접착은 접착 프로세스와 관련된 특이성 또는 단백질 유형에 의해 질적으로 변화할 수 있다. 접착은 극성이 변화할 수 있다.
용어 "검정" 또는 "검정하는"은 예를 들어 외인성 자극 (예를 들어, 치료제 또는 리간드)으로 활성화 시 세포의 광학 또는 바이오임피던스 반응과 같은 표적의 존재, 부재, 양, 범위, 동역학, 역학 또는 유형을 결정하기 위한 분석을 지칭한다.
용어 "부착하다" 또는 "부착"은 예컨대 물리적 흡수, 화학적 결합, 화학적 인력, 및 유사 프로세스, 또는 이들의 조합에 의해 예를 들어 표면에 연결된 표면 개질제 성분, 세포, 리간드 후보 화합물, 및 본 개시내용의 유사 실체를 지칭한다. 특히, "세포 부착", "세포 접착" 또는 "세포 샘플 부착"은 세포가 함께 결합하거나 표면에 상호작용하거나, 예컨대 배양에 의해 또는 세포 고정 물질과 상호작용하는 것 등을 지칭한다.
용어 "부착 패턴"은 표면에 대한 세포 또는 세포 샘플의 연결의 관찰가능한 형질 또는 특징을 지칭한다. 부착 패턴, 예를 들어 부착 부위의 수는 정량적일 수 있다. 부착 패턴, 예를 들어 세포외 매트릭스에 대한 바람직한 부착 분자 부위는 또한 정성적일 수 있다.
용어 "세포 부착 신호 (CAS)"는 마이크로플레이트의 웰에 배치되고 임피던스 바이오센서로 분석될 때 세포에 의해 생성되는 세포 부착의 정량적 측정을 지칭한다. 전형적으로, 임의의 작용제의 부재 하의 세포의 CAS는 특정한 신호전달 경로에 영향을 미치는 활성화제 작용제 (예를 들어, 효능제, 예컨대 GPCR 신호전달 경로의 효능제) 단독의 존재 하의 세포의 CAS 및/또는 해당 특정한 신호전달 경로 또는 경로의 노드의 특이적 억제제와 조합하여 특정한 신호전달 경로에 영향을 미치는 활성화제 작용제의 존재 하의 세포의 CAS와 비교될 수 있다. 전형적으로, 세포의 CAS는 옴 단위로 측정된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
항체는 예를 들어 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있으며, 이들의 항원-결합 단편일 수 있다. "항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 예를 들어 항체 단편으로부터 형성된 것을 포함한다. "기능적 단편"은 전장 항체의 항원에 대한 결합을 실질적으로 유지하고 생물학적 활성을 유지한다. 항체는 개별 약물 분자가 별도로 달성할 수 있는 것보다 더 큰 효력, 특이성 및 효능을 달성하기 위해 공유결합적 또는 다른 부착을 통해 하나 이상의 다른 약물과 조합함으로써 "무장" 또는 "접합"될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "확증 작용제"는 본원에 기재된 시험에 사용되는 관심 경로 활성을 파괴하거나 영향을 미치는 것으로 공지된 소분자, 공지된 기능의 특이적 리간드, 또는 항체 또는 친화성/특이성 시약을 지칭한다. 이는 관심 경로 활성과 직접적으로 연관된 활성을 특이적으로 개시하는 활성화제 작용제가 세포 샘플에 도입될 때 생성되는 특정 작용 메커니즘과 연관된 경로 활성의 양을 확증하고 정량화하기 위해 시험에 사용된다. 예를 들어, 활성화제가 세포 표면 수용체에 대한 공지된 리간드인 경우, 확증 작용제의 도입 후 변화된 본원에 기재된 방법에서 측정된 활성은 방법이 분석하고자 하는 경로와 연관된 활성의 양을 나타낼 것이다. 추가 예에서, 리간드 결합 영역, 수용체 이량체화 영역, 및 수용체 티로신 키나제 영역으로 구성된 수용체의 경우와 같이, 활성화제 작용제는 수용체 리간드 결합 부위에 결합하는 리간드일 수 있다. 그 후, 확증 시약은 리간드 결합 전 또는 리간드 결합 후의 사건(들), 즉 수용체 이량체화 또는 수용체 이량체화 이후의 수용체 티로신 키나제 활성을 방지하는 작용제일 수 있다. 또한, 확증 시약은 관심 환자에게 활성화되거나 기능장애가 있는 하류 신호전달 경로의 특정한 부분을 정제하는 작용제일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단의 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 고도로 특이적이다. 또한, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "면역포획 시약"은 임의의 유형의 항체를 지칭하고, RNA, DNA 및 염기의 합성 변이체를 함유하는 중합체로 구성된 압타머, 또는 압타머 또는 시약이 또 다른 분자 및 신호 이의 존재, 양 및/또는 질을 특이적으로 인식하고 결합하도록 구축되고 선택된 임의의 합성 분자를 추가로 포함한다.
용어 "배양"은 본 발명을 수행하기 위한 세포의 제조를 지칭한다. 제조는 본 발명의 실시에 있어서 상이한 시간에, 다양한 배지, 배지 보충물, 온도, 습도, CO2%, 씨드 밀도, 세포 유형 순도 또는 혼합물의 다양한 조건 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 세포 배양의 다른 조건을 포함할 수 있다. 제조는 세포가 증식하고 휴지 상태가 되고 노화되고 진입하고 통과하거나 세포 주기의 다양한 단계에서 확인되도록 허용하는 조건을 포함할 수 있다. 배양은 본 발명의 이상적인 실시를 허용 및/또는 최적화하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수의 배지 또는 보충물, 예컨대 (그러나 이에 제한되지는 않음) 비타민, 시토카인, 성장 인자, 혈청 (예를 들어, 공급원 동물은 소, 소 태아, 인간, 말 또는 다른 포유동물임), 대사물, 아미노산, 미량 미네랄, 이온, pH 완충제, 및/또는 글루코스를 포함할 수 있다. 세포를 배양하는 것은 본 발명에 의한 활성화 전 또는 후에 무혈청 및/또는 활성화제-무함유 배지로 실시될 수 있다. 배양은 환자의 종양 미세환경을 모방하도록 설계된 조건을 이상적으로 포함할 수 있다. 배양 제조는 경로 활성의 효능작용 또는 길항작용의 측정을 허용하기 위해 특정한 경로를 기초 또는 고조된 수준으로 배치하도록 설계된 조건을 이상적으로 포함할 수 있다.
용어 "기본 배지"는 무기 염, 필수 아미노산, 글루코스, 비타민 및 pH 완충제를 잘 정의된 양으로 함유하는 배양 배지의 유형을 지칭하며, 이는 방법이 분석하고자 하는 신호전달 경로를 자극하는 작용제를 함유하지 않는다. 많은 기본 배지가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 DMEM, F12, MEM, MEGM, RPMI-1640 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, ErbB 신호전달 경로를 분석해야 하는 경우, 기본 배지는 ErbB 경로를 교란하는 것으로 공지된 시약을 함유하지 않는다. 기본 배지는 세포 집단이 생존가능한 상태로 유지되고 개별 세포 유형의 이질성 및 세포 주기의 상이한 단계를 나타내는 세포의 정규 분포를 유지하도록 세포 배양을 유지하는데 사용된다. 질환 세포의 샘플을 활성화제 작용제와 접촉시키는 방법의 단계 직전에 본원에 기재된 방법에서 대상체로부터 수득된 이환된 세포의 샘플을 배양하는데 사용된다.
용어 "신선한"은 물질에 적용되는 경우, 아직 사용되지 않은 물질을 지칭한다. 그러므로, 신선한 기본 배지는 아직 사용되지 않은 기본 배지이다. 신선한 기본 배지는 기본 배지에서 이미 배양되고 있는 질환 세포의 샘플을 함유하는 용기에 첨가되어, 세포 배양물을 함유하는 용기에서 기본 배지의 부피를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 용기에서 이환된 세포의 샘플을 배양하는데 사용된 기본 배지의 일부를 세포 배양 용기로부터 제거하고 신선한 기본 배지로 대체할 수 있다. 어느 경우에서든, 세포 배양 용기에서 총 기본 배지 부피의 50% 초과가 신선한 기본 배지인 경우, 세포 배양 용기는 신선한 기본 배지를 함유하는 것으로 간주된다. 동일한 기본 배지에서 연장된 기간 (예를 들어, 72시간 초과) 동안 배양된 세포는 개별 세포 유형의 이질성을 상실할 것이고, 대부분의 세포가 신호전달 경로 활성의 측정을 방해할 수 있는 G0/G1 세포 주기 단계에 진입할 수 있다. 신선한 배지에 배치된 세포 샘플은 세포 샘플이 원래 세포 샘플에서 발견되는 개별 세포 유형의 이질성 및 세포 주기의 상이한 단계를 나타내는 세포의 정규 분포를 반영하도록 새로운 배지에 적응하는데 일정 기간 (예를 들어, 적어도 12시간)을 필요로 한다.
용어 "완충제 배지"는 pH 완충제 및 등장성 용액을 함유하는 용액을 지칭한다. 완충제 배지는 전형적으로 세포의 샘플을 굶기거나 세포가 쉬고 있을 때 발견되는 세포-주기 G0/G1과 같이 세포를 휴지 또는 노화로 구동하는데 사용된다.
"키메라" 항체 (이뮤노글로불린)는 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분을 함유하는 반면, 쇄(들)의 나머지는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]).
용어 "인간화 항체"는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자 항체의 가변 도메인 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 또는 억셉터) 항체)이다. 초가변 영역은 서열에 의해 정의된 상보성-결정 영역 (CDR) (예를 들어 Kabat 1991, 1987, 1983 참조), 또는 구조에 의해 정의된 초가변 루프 (HVL) (예를 들어, Chothia 1987 참조), 또는 둘 다일 수 있다.
"생체분자 코팅"은 자연 발생 생체분자 또는 생화학물질인 분자, 또는 하나 이상의 자연 발생 생체분자 또는 생화학물질로부터 유래되거나 이에 기초한 생화학물질을 포함하는 표면 상의 코팅이다. 예를 들어, 생체분자 코팅은 세포외 매트릭스 구성요소 (예를 들어, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 다른 당단백질, 펩티드, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, IntercellularCAM, VascularCAM, MAdCAM), 또는 이의 유도체를 포함할 수 있거나, 또는 자연 발생 생화학물질 리신 및 오르니틴에 기초한 중합체성 분자인 생화학물질, 예컨대 폴리리신 또는 폴리오르니틴을 포함할 수 있다. 자연 발생 생화학물질, 예컨대 아미노산에 기초한 중합체성 분자는 자연-발생 생화학물질의 이성질체 또는 거울상 이성질체를 사용할 수 있다. 코팅은 또한 세포 표면 수용체 또는 세포 표면 동족 결합 단백질 또는 상기 세포 표면 단백질에 대한 친화성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "기준선 측정"은 시험될 세포 세트에 대한 생리학적 시작점을 지칭하며, 약물이 첨가되기 전 일정 기간에 걸친 측정 평가에 기초한다. 이는 외인성 활성화 전에 기저 세포 대사 측정 또는 CReMS 판독을 포함할 수 있다. 이는 대안적으로 외인성 활성화가 있거나 없는 정상적인 건강한 세포 대사 기능의 CReMS 측정을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
용어 "세포 반응 측정 시스템" 또는 "CReMS"는 세포 내, 세포 내 및 세포 간, 및 세포와 계측 디바이스 간의 생리학적 또는 세포 반응 파라미터의 변화를 정량적으로 결정할 수 있는 디바이스를 지칭한다. 실시양태에서 세포는 전체 무표지 세포이다. 생리학적 또는 세포 반응 파라미터의 변화는 분석물질, 예컨대 글루코스, 산소, 이산화탄소, 아민 함유 물질, 예컨대 단백질, 아미노산, 또는 세포외 매트릭스, 또는 세포 신호전달 분자, 또는 세포 증식, 세포 형태학, 또는 세포골격 재배열의 변화를 결정함으로써 측정된다. CReMS의 예는 바이오센서이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "CReMS 신호"는 화학-전기 CReMS에 의해 세포를 분석할 때 세포의 세포 생리학적 변화의 척도로서 정의된다. CReMS 신호 및 CReMS 신호의 변화는 생리학적 변화를 측정하는 특정한 화학-전기 변환기와 관련하여 다양한 단위를 가질 수 있다. 예를 들어, CReMS 신호는 세포 인덱스, 임피던스, 파장 단위, pH 단위, 전압, 전류의 단위 (그러나 이에 제한되지는 않음)를 가질 수 있거나, 단위의 비율을 사용함으로써 무차원이 될 수 있다. 임의의 이들 단위는 시간 구성요소를 가질 수 있다. CReMS 신호는 생물학, 생화학 및 생물물리학 기술분야에서 실시되는 것에 의해 빈번하게 수행되는 바와 같이 해석의 명확성을 위해 수학적으로 변형될 수 있다 (예를 들어 정규화, 기준선 설정, 곡선 감산, 또는 이들의 임의의 조합 포함). CReMS 신호는 단일 시점에서, 또는 보다 바람직하게는 세포 생리학적 반응의 완전한 패턴을 나타내는 연속적인 일련의 시점에 걸쳐 측정될 수 있다.
용어 CReM "광학 신호"는 세포가 쉬고 있는 광자 결정 바이오센싱 CReMS로부터 빛이 반사될 때 측정된 파장 값 또는 파장 값의 변화로서 정의된다. 단위는 전형적으로 피코미터 또는 나노미터이지만, 변화 비율이 보고되는 경우 무차원이 될 수도 있다. "광학 신호"는 시간과 조합된 상기 단위로 표현될 수 있다. 빛의 반사된 파장의 이동은 광자 결정 표면 상의 질량에 비례한다. 그러므로 "광학 신호"는 CReMS 상의 세포 수의 정량적 측정이다. 또한, "광학 신호"는 예를 들어 세포 형태학의 변화, 세포 접착, 세포 생존력, 세포의 구조적 재배열이 파장 이동으로서 검출되는 센서 상의 질량의 양의 차이를 유발하는 것과 같은 세포 생리학적 상태의 척도이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "세포 인덱스"는 임피던스의 측정으로서 정의되며, 예를 들어 10 kHz의 고정된 전기적 주파수 및 고정된 전압에서 측정함으로써 본 발명의 한 예에 적용될 수 있다.
그리고, 방정식 세포 인덱스i = (Rtn - Rt0)/F에 의해 계산된다:
여기서:
i = 1, 2 또는 3 시점
F = 기구가 10kHz 주파수에서 작동될 때 한 예에서 15옴
Rt0은 시점 T0에서 측정된 배경 저항이다.
Rtn은 세포 첨가, 세포 생리학적 변화 또는 세포 활성화 후 시점 Tn에서 측정된 저항이다.
세포 인덱스는 세포 상태를 나타내기 위해 측정된 전기적 임피던스의 상대적 변화로서 유도된 무차원 파라미터이다. 세포가 존재하지 않거나 전극에 잘 접착되지 않은 경우 CI는 0이다. 동일한 생리학적 조건 하에 더 많은 세포가 전극에 부착된 경우 CI 값이 더 크다. 따라서, CI는 웰에 존재하는 세포 수의 정량적 측정치이다. 또한, 세포 생리학적 상태, 예를 들어 세포 형태학, 세포 접착 또는 세포 생존력의 변화는 CI의 변화로 이어질 것이다.
용어 "측정량"은 임상 시험에서 측정하고자 의도된 양으로서 정의된다. 본원에 기재된 발명을 위해, 측정하고자 의도된 양은 활성화에 대한 세포의 생리학적 반응의 변화이다. 활성화에 대한 세포의 생리학적 반응의 측정치의 변화는 다양한 유클리드 수학적 분석을 사용하여 수학적으로 결정될 수 있으며, 정량적 시험의 경우 수치적으로 보고되거나 정성적 시험의 경우 양성 또는 음성 결과로서 보고될 수 있다. 정량적 및 정성적 시험 둘 다에서, 측정량 (예를 들어, 시험 결과)은 그 이상 및 이하에서 상이한 임상적 결정 또는 해석이 내려지는 컷오프 값과 비교된다.
용어 "출력 값"은 측정량의 한 유형이며, 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 하나 이상의 활성화제 작용제 및/또는 활성화제 작용제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 하나 이상의 치료제와 접촉된 대상체로부터의 생존가능한 세포 샘플에서 발생하는 세포 접착 또는 부착의 측정과 같은 CReMS 신호의 차이를 지칭한다. 출력 값은 일정 기간에 걸쳐 수득된 CReMS 신호의 다양한 유클리드 수학적 분석을 사용하여 유도될 수 있으며, 정량적 시험의 경우 수치적으로 보고되거나 정성적 시험의 경우 양성 또는 음성 결과로서 보고될 수 있다. 예를 들어, 활성화제 작용제 (예를 들어, 효능제) 단독과 접촉된 대상체로부터의 세포 샘플은 1,000 단위의 CReMS 신호를 생성할 수 있고, 활성화제 작용제 및 치료제와 접촉된 동일한 대상체로부터의 세포 샘플은 100 단위의 CReMs 신호를 생성할 수 있다. 이 예에서 출력 값은 900 CReMS 신호 단위와 동일할 것이며, 이는 활성화제 작용제 단독과 접촉된 세포 샘플 및 활성화제 작용제 및 치료제 조합과 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위의 차이이다. 정량적 및 정성적 시험 둘 다에서, 출력 값 (예를 들어, 시험 결과)은 그 이상 및 이하에서 상이한 임상적 결정 또는 해석이 내려지는 컷오프 값과 비교될 수 있다.
용어 "출력 값 백분율"은 하나 이상의 활성화제 작용제 또는 하나 이상의 치료제 단독과 접촉된 샘플과 비교하여 신호전달 경로에 선택적으로 영향을 미치는 하나 이상의 활성화제 작용제 및 활성화제 작용제와 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 하나 이상의 치료제와 접촉된 환자 세포 샘플로부터의 생존가능한 세포 샘플에서 발생하는 CReMS 신호의 퍼센트 변화를 지칭한다. 예를 들어, 활성화제 작용제 단독과 접촉된 대상체로부터의 세포 샘플은 1,000 단위의 CReMS 신호를 생성할 수 있고, 활성화제 작용제 및 치료제와 접촉된 동일한 대상체로부터의 세포 샘플은 100의 CReMs를 생성할 수 있다. 이 예에서 출력 값 백분율은 90%와 동일할 것이며, 이는 활성화제 작용제 단독과 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위와 활성화제 작용제 및 치료제 조합과 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위의 차이를 활성화제 작용제 단독과 접촉된 세포 샘플에서 측정된 CReMS 신호 단위로 나눈 값이다. 정량적 및 정성적 시험 둘 다에서, 출력 값 백분율은 그 이상 및 이하에서 상이한 임상적 결정 또는 해석이 내려지는 컷오프 값과 비교될 수 있다.
용어 "기초 형태학"은 작용제, 활성화제 또는 자극의 도입 전의 세포 또는 세포 샘플의 형태 및 구조를 지칭한다.
용어 "세포 접착" ("세포성 접착", "세포 부착" 또는 "세포성 부착"과 상호교환적으로 사용됨)은 또 다른 세포, 세포외 매트릭스 구성요소 또는 표면 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트)에 대한 세포의 결합을 지칭한다.
용어 "바이오마커"는 가장 일반적인 의미에서 세포 또는 환자 건강 또는 질환 상태의 상태의 생물학적 척도를 지칭한다. 일반적인 바이오마커의 비제한적인 목록은 포유동물에서 발견되는 생물학적으로 유래된 분자, 포유동물 세포 또는 조직의 생물학적 활성, 유전자 카피 수, 유전자 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 유전자 발현 수준, mRNA 수준, 스플라이스 변이체, 전사 변형, 전사 후 변형, 후성 유전적 변형, 세포 표면 마커, 단백질 또는 핵산 (모든 형태의 기능적 RNA 포함)의 차등적 발현, 핵산의 증폭, 세포 형태학, 번역 후 변형, 단백질 말단절단, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화, 대사물, 생합성의 임의의 단계에서의 호르몬, 시토카인, 케모카인, 및 이들의 조합을 포함한다. 바이오마커의 서브세트는 병리학자가 질환을 진단하는데 도움이 되고 의사가 요법을 처방하는데 도움이 되는 진단적 및 치료적 선택 목적으로 사용된다. 바이오마커는 전형적으로 고정된 탑재된 조직에서, 유전자 카피 수, 유전적 돌연변이, 또는 단백질의 상태 또는 활성의 사양 없이 단백질의 수준을 측정한다. 본 발명은 살아있는 환자 세포 샘플로부터의 활성 또는 동적 결과인 생리학적 반응 파라미터인 새로운 유형의 바이오마커를 포함한다.
용어 "바이오마커 상태"는 환자 또는 환자의 세포에서 바이오마커(들)의 평가를 지칭하며, 전형적으로 바이오마커가 존재하는 경우 "바이오마커 양성" 또는 바이오마커가 부재하는 경우 "바이오마커 음성"으로서 보고된다. 단백질 수용체가 바이오마커로서 사용되는 경우, 바이오마커 양성 결과는 또한 수용체가 과다발현 또는 증폭된 것으로 지칭되고, 바이오마커 음성 결과는 수용체가 정상적으로 발현 또는 비-증폭된 것으로 지칭된다. 바이오마커 또는 바이오마커 시그니처가 질환 진행의 예후 지표이거나 치료 효능을 예측하는 질환의 경우, 현재 임상 실습은 환자를 바이오마커 음성 또는 양성으로서 분류함으로써 환자의 진단을 정제하기 위해 바이오마커 또는 이의 관련 돌연변이의 양의 측정에 의존한다. 바이오마커 상태의 결정은 종종 환자를 치료하기 위한 약물 치료제의 선택을 가이드하는데 사용된다. 바이오마커 양성 및 바이오마커 음성 환자를 구별하는데 사용되는 바이오마커 측정의 컷오프 값은 바이오마커마다 다르다. 바이오마커가 약물 표적인 경우, 컷오프 값은 그 이상에서 환자가 바이오마커를 표적화하는 치료제를 받고, 그 미만에서 환자가 바이오마커를 표적화하는 치료제를 받지 않을 조건이다. 임상 시험은 전형적으로 바이오마커의 임상적 관련성을 확인하기 위해 필요하다.
용어 "바이오센서"는 분석물질 또는 분석물질 또는 세포의 생리학적 상태의 변화를 측정하는 디바이스를 지칭한다. 실시양태에서, 바이오센서는 전형적으로 하기 세 부분을 함유한다: 분석물질에 결합하거나 그를 인식하는 생물학적 구성요소 또는 요소 (비제한적인 예, 예컨대 세포외 매트릭스, 세포 신호전달 분자, 또는 세포 증식, 조직, 세포, 대사물, 이화대사물, 생체분자, 이온, 산소, 이산화탄소, 탄수화물, 단백질 등 포함), 검출기 요소 (광학, 압전, 전기화학, 온도측정 또는 자성와 같은 물리화학적 방식으로 작동함), 및 두 구성요소 모두와 연관된 변환기.
용어 "광학 바이오센서"는 빛의 형광, 흡수, 투과도, 밀도, 굴절률 및 반사를 측정하는 디바이스를 지칭한다. 실시양태에서, 광학 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서 분자 인식 또는 분자 활성화 사건을 정량화가능한 신호로 변환하기 위한 광학 변환기를 포함할 수 있다. 추가로, 실시양태는 광자 결정 디바이스, 광학 도파관 디바이스, 및 표면 플라즈몬 공명 디바이스를 포함할 수 있다.
용어 "임피던스 바이오센서"는 임피던스 (Z)가 옴의 법칙 (Z = V/I)에 의해 설명된 바와 같이 전압 대 전류의 비율과 관련된 살아있는 환자 세포의 복잡한 임피던스 변화 (델타 Z, 또는 dZ)를 측정하는 디바이스를 지칭한다. 그것은 세포와의 전극 인터페이스에서 국소 이온 환경에 민감하고, 전압 및 전류 변동의 함수로서 이들 변화를 검출한다. 이의 정상적인 기능 또는 활성화의 결과로서 세포의 생리학적 변화는 전극 주변의 전류 흐름에 정량화가능한 변화를 초래하고 측정된 신호의 크기 및 특징에 영향을 미친다. 실시양태에서, 임피던스 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서 분자 인식 또는 분자 활성화 사건을 정량화가능한 신호로 변환하기 위한 전극 또는 전기 회로를 포함할 수 있다. 실시양태에서, ISFET 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서 분석물질 인식 또는 세포 활성화 사건을 정량화가능한 신호로 변환하기 위한 이온 선택적 전계 효과 전기 변환기를 포함할 수 있다. ISFET 바이오센서의 분석물질 농도가 변화하는 경우, 트랜지스터의 전류가 변화하며, 이는 정량화 신호를 생성한다.
용어 "세포 신호전달"은 정보의 세포내 또는 세포간 전달을 지칭한다. 세포 신호전달은 세포 사이의 직접적인 접촉에 의해 또는 또 다른 세포에 의해 흡수되는 한 세포로부터의 성분의 방출에 의해 달성될 수 있다. 세포간 신호전달은 두 분자 (예를 들어, 리간드 및 수용체) 간의 상호작용을 통해 발생할 수 있다. 수용체 결합은 세포내 신호전달 캐스케이드 (예를 들어, 세포 내의 생화학적 변화의 개시 또는 막 전위의 변형)를 촉발할 수 있다.
용어 "신호전달 경로"는 세포 표면 수용체, 핵 수용체, 신호 조절 단백질 및 세포내 신호전달 구성요소를 포함하는 세포내 또는 세포간 통신 또는 정보 전달에 관여하는 일련의 세포 구성요소를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 특정한 "신호전달 경로"는 세포내 신호전달의 캐스케이드를 촉발하는 세포 표면 수용체에 따라 또는 세포내 신호전달에 관여하는 임의의 구성요소에 따라 명명될 수 있다. 예를 들어, LPA 수용체에 대한 LPA의 결합 또는 S1P 수용체에 대한 S1P의 결합은 PI3K 또는 RTK를 포함할 수 있는 신호전달 경로 활성화를 개시한다.
용어 "신호전달 활성", "경로 활성", "세포 신호전달 활성" 및 "신호전달 경로 활성"은 상호교환적으로 사용되며, 신호전달 경로의 비정상적 또는 정상적인 기능 동안 발생하는 사건을 지칭한다. 신호전달 활성은 주로 하나의 세포 표면 수용체 (예를 들어, GPCR)와 종종 연관된다. 그러나, 하나의 경로에서 신호전달 활성은 신호전달 경로의 세포 표면 수용체의 상류, 하류 또는 측면에 있는 다른 신호전달 경로로부터의 경로 구성원과 연관된 신호전달 활성에 의해 구동될 수 있다. 이는 다중 경로 수렴 지점, 경로 간의 누화, 및 경로 간의 피드백 루프가 하나의 경로로부터의 신호전달 활성이 상이한 경로의 신호전달 활성에 영향을 주는 것을 가능하게 할 수 있는 신호전달 활성의 상호연결된 성질을 반영한다 (문헌 [Giulliano et al., Bidirectional Crosstalk between the Estrogen Receptor and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Signaling Pathways in Breast Cancer: Molecular Basis and Clinical Implications, Breast Care (Basel). 2013 Aug; 8(4): 256-262] 참조). 그러므로, 종양이 2개 이상의 상호연결된 경로로부터의 신호전달 활성에 의해 구동되는 암 환자는 비정상적으로 기능하는 경로의 활성화 지점과 상이한 표적에 결합하는 표적화된 요법에 반응할 수 있다. 암의 성질 및 복잡성으로 인해, 암 환자 신호전달 경로 기능장애는 건강한 정상 집단에서 일반적으로 설명되지 않는 다른 경로에 대한 고유한 상호연결을 함유할 수 있다.
용어 "세포골격 조직화"는 세포의 내부 스캐폴드의 배열을 지칭한다. 세포의 세포골격은 세포질 또는 막 요소 및/또는 세포내 소기관을 지지하는 역할을 하는 필라멘트를 포함한다. 세포골격은 또한 세포의 형상을 유지하는데 도움이 된다.
용어 "세포 증식"은 세포 성장 및 세포 분열의 결과로서 세포 수의 증가를 지칭한다.
용어 "세포 생존"은 특정 기능, 예컨대 대사, 성장, 이동, 재생산, 일부 형태의 반응성 및 적응성을 수행하는 능력에 의해 특징화된 세포의 생존력을 지칭한다.
용어 "효능"은 특정 개입이 유익한 결과를 생성하는 정도를 지칭한다. 실시양태에서, 개입은 공지된 단백질에서 개입에 대한 높은 친화성 및 특이성을 갖는 소분자 또는 항체 또는 유기 시약의 표적화된 펩티드와 같은 치료제일 수 있다. 유익한 결과는 제한 없이 증상의 억제, 세포 성장의 감소, 세포 사멸의 증가, 객관적인 종양 반응, 환자의 생존 기간의 증가, 환자의 무진행 기간의 증가, 환자의 무질환 생존 기간의 증가, 염증의 감소, 및 면역 반응성의 증가를 포함한다.
용어 "세포외 매트릭스 구성요소"는 동물의 세포외 매트릭스에서 발생하는 분자를 지칭한다. 그것은 임의의 종 및 임의의 조직 유형으로부터의 세포외 매트릭스의 구성요소일 수 있다. 세포외 매트릭스 구성요소의 비제한적인 예는 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 다른 당단백질, 펩티드, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸 등을 포함한다. 세포외 매트릭스 구성요소는 또한 성장 인자를 포함할 수 있다.
용어 "포괄적 표현형"은 전체로서 세포 또는 세포 샘플의 관찰가능한 특성의 복수 또는 복합물을 지칭하고, 발달, 생화학적 또는 생리학적 특성, 계절학, 거동, 및 거동 산물을 반영한다. 포괄적 표현형은 세포 크기, 세포 형상, 독특한 돌기, 파생물, 퍼짐, 부착 초점 밀도, 세포골격 배열, 세포 증식 패턴, 수용체 식세포작용, 또는 부착 초점 번호, pH 변화, 대사물의 흡수 또는 유출, 신호전달 단백질 및 성장 인자, 산소, CO2, 글루코스, ATP, 및 이온, 예컨대 마그네슘, 칼슘, 칼륨을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
용어 "사건 특이성"은 세포의 특정 특성의 물리적 관찰을 지칭한다. 이러한 특정 특성은 특정한 활성화제 또는 치료제에 대한 세포의 의도된 및/또는 예상된 생리학적 반응의 일부로서 특정 세포 기능, 외인성 활성화, 또는 경로 효능작용/길항작용과 관련이 있다. 활성화제 및 치료제는 세포골격 구조 또는 세포 경로와 같은 세포 기능의 특정 측면에 영향을 미치도록 표적화되는 것으로 공지되어 있을 수 있다. 물리적으로 관찰가능한 사건은 활성화제 또는 치료제의 존재 하에 세포에서 물리적으로 관찰가능한 사건이 세포에 대한 활성화제 또는 치료제의 의도된 및/또는 예상된 효과의 반영이기 때문에 사건 특이성이라고 한다. 예를 들어, CReMS의 부착 바이오센서 유형에서 대부분의 세포 샘플에 빈블라스틴을 첨가하는 것은 신호의 엄청난 감소를 생성한다. 빈블라스틴은 세포성 세포골격 스캐폴딩 파괴제이다. 신호의 감소는 미세소관 분자에서 약물 작용으로 인한 세포 형상 및 부착의 손실과 특이적으로 연결된 세포의 물리적으로 관찰가능한 사건이다.
용어 "상승작용" 또는 "상승작용적"은 세포 샘플을 하나 이상의 활성화 작용제 및/또는 2개 이상의 치료제로 시험할 때 측정된 CReMS 신호, 출력 값, 또는 출력 값 백분율이 세포 샘플을 활성화제 작용제[들] 및/또는 치료제로 개별적으로 시험할 때 수득된 상응하는 측정치의 합계보다 큰 시험 결과를 지칭한다. 하나 이상의 활성화 작용제와 접촉된 세포 샘플에 두 가지 치료제를 동시에 첨가하는 것이 각 치료제를 하나 이상의 동시 활성화제 작용제로 개별적으로 시험할 때 수득된 CReMs 신호, 출력 값, 또는 출력 값 백분율의 합계보다 더 큰 CReMS 신호, 출력 값, 또는 출력 값 백분율을 생성할 때 상승작용적 결과가 발생할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "임피던스"는 하기 방정식에 의해 전압 및 전류와 관련된 물리적 법칙에 의해 정의된다: 임피던스 (옴) = 전압 (볼트) /전류 (암페어) 또는 Z= V/I.
치료 또는 요법 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
용어 "마이크로캔틸레버 디바이스", "마이크로캔틸레버 어레이", 또는 "마이크로캔틸레버 장치"는 적어도 하나의 캔틸레버, 막대-형상, V-형상일 수 있거나 이의 적용에 의존하여 다른 형상을 가질 수 있는 가요성 빔을 포함하는 CREMS 기구의 한 유형을 지칭한다. 마이크로캔틸레버의 한쪽 말단은 지지 베이스에 고정되고, 또 다른 말단은 자유롭게 서 있다. 마이크로캔틸레버는 자연 공명 주파수와 매치될 수 있는 위상차 신호를 검출하기 위해 전기적 방법을 사용하여 농도를 측정할 수 있다 (2000년 3월 28일에 허여된 미국 특허 번호 6,041,642 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 예). 공지된 분자, 예를 들어 거대분자 생체분자, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질이 배치된 마이크로캔틸레버의 공명 특성의 변화를 사용한 표적 종의 농도의 결정. 편향은 광학 및 압전 방법을 사용하여 측정된다.
용어 "정상적인 기능"은 세포가 비천연 수준의 신호전달, 복제, 접촉 억제 손실, 및 비정상적인 유전자 카피 및 증폭으로부터 기능장애를 일으키지 않도록 방지하는 체크 및 균형의 정의된 시스템을 갖는 세포의 경로를 지칭한다. 많은 경우에, 경로가 일부 휴지 또는 정상 기저 상태에서 시작하는 경우, 경로 구성원의 EC50 농도에서 소량의 활성화제의 첨가는 세포 시스템이 활성화제를 인식하고, 경로 활성을 개시하고 그 후 활성화제 효과를 하향 조절하여 다른 세포 기능과의 균형을 유지하기 때문에 작은 일시적 효과만을 가질 것이다. 이환된 기능은 종종 활성화제에 대한 과잉반응, 경로에 따른 과다/과소 활성, 활성화제 효과를 수용하기 위한 부적절한 경로간 활성, 및 최소 활성화제 효과를 하향조절하지 못하는 것으로서 인식가능하다. 또한, 일부 이환된 상태에서, 일부 경로 구성원에 대한 기저 상태가 경로에 대해 도달될 수 없다. 이들 시스템은 구성적으로 활성화된 것으로 설명된다.
용어 "정상적인 참조 구간"은 건강한 대상체 (예를 들어, 관심 질환이 결여된 대상체)의 집단으로부터 수득된 값의 특정된 백분율을 포함하는 것으로 추정되는 참조 상한 및 하한인 두 숫자 사이에 있고 그를 포함하는 구간으로서 여기에서 정의된다. 대부분의 분석물질의 경우, 참조 하한 및 상한은 각각 참조 집단에 대한 시험 결과의 분포의 2.5번째 및 97.5번째 백분위수로서 추정된다. 일부 경우에, 단 하나의 참조 한계, 일반적으로 상한 (97.5번째 백분위수)이 의학적 중요성을 갖는다. 참조 구간의 한계의 추정치에 대한 신뢰 구간은 참조 집단 (일반적으로 약 120명의 참조 대상체)의 무작위 샘플링을 가정하는 구축될 수 있다. 각 신뢰 구간의 너비는 참조 대상체의 수, 뿐만 아니라 관찰된 참조 값의 분포에 의존한다.
정상적인 참조 범위 컷오프는 참조 개체의 선택 프로세스, 해당 참조 개체에 적용된 분석적 방법에 의해 결정 및 설정되며, 간행물 [Clinical Laboratory Standards Institute Approved Guideline EP28-A3C "Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory"] (그 내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 정의된 바와 같은 데이터 수집 및 분석으로 결론내린다.
한 실시양태에서, 참조 개체는 질환, 특히 모든 형태의 암이 없는 개체일 것이다. 정상적인 참조 구간은 본원에 기재된 방법을 사용하여 정상적인 참조 개체를 시험함으로써 결정될 것이다. 정상적인 참조 구간의 상한은 정상적인 경로 활성의 상한을 나타낼 것이다. 한 실시양태에서, 양성 및 음성 시험 결과를 구별하는 컷오프 값은 정상적인 참조 구간의 상한과 동일할 것이다. 다른 실시양태에서, 컷오프 값은 정상적인 참조 구간의 상한에 하기 값 중 하나, 조합 또는 모두의 임의의, 조합, 모두 또는 다중을 더한 값과 동일할 것이다: 검출 한계, 공백 한계, 정량화 한계, 측정량의 표준 편차.
질환이 없는 참조 개체의 그룹은 관심 질환 이외의 다양한 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다. 예를 들어, 유방암에 대한 본 발명의 적용에서, 질환이 없는 참조 여성 그룹은 하기 특징 중 임의의 것, 조합 또는 모두를 포함하도록 추가로 정의될 수 있다: 폐경 전 또는 후, 수유 중 또는 비-수유부, 출산한 자녀가 있음, BRCA 유전자 돌연변이를 가짐, 당뇨병의 존재, BMI (체질량 지수)에 의해 결정된 바와 같은 비만. 약리학적 작용제, 예컨대 호르몬 또는 다른 약물 중독의 금단, 식이 물질, 예컨대 알콜 및/또는 암의 가족력의 금단.
용어 "비정상적인 신호전달 경로", "비정상적인 신호전달 경로" 및 "기능장애 신호전달 경로"는 상호교환적으로 사용되며, 이의 정상적인 기능을 수행하는 세포의 능력을 손상시키는 방식으로 파괴된 세포 신호전달 경로를 지칭한다. 세포 신호전달 파괴 및 그로 인한 기능장애의 원인은 전형적으로 신호전달 경로의 정상적인 기능을 방해하는 게놈 또는 프로테옴에 대한 손상의 결과이다. 이 손상은 예를 들어 내인성 프로세스의 결과, 예컨대 DNA 복제 오류, 특정 DNA 염기의 내인성 화학적 불안정성, 종양 미세환경, 동적 시스템 조정 또는 선택, 또는 대사 동안 생성된 자유 라디칼에 의한 공격으로 인한 결과일 수 있다. 일부 불활성화 돌연변이는 추가 돌연변이의 획득을 용이하게 하는 게놈 무결성을 유지하는 역할을 하는 유전자에서 발생한다. 세포 제어의 게놈 수준에 영향을 미치는 추가 메커니즘은 히스톤 단백질의 기능에 대한 변화에 의해 특이적 유전자의 발현이 변경되는 후성 유전적 메커니즘을 포함한다. 에피게놈 기능은 질환 병인 및 전파에 참여하는 조건을 포함하여 많은 상이한 환경 조건에 고도로 적응성이거나 반응적인 것으로 입증되었다. 경로 기능장애의 다양한 RNA-기반 메커니즘은 전사, 전사 후, 번역, 및 번역 후 수준에서 설명되었다.
또한, 단백질 수준에서 경로 기능장애의 많은 작용은 세포 분자 생물학 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 경로 기능장애는 경로 구성원 또는 구성원들 또는 보조인자(들)의 과다발현 또는 과소발현, 비천연 세포 유형 또는 세포 위치에 존재하는 단백질 활성, 경로 교차-반응성으로도 공지된 비천연 경로 구성원과의 단백질 상호작용, 기능장애 피드백 또는 피드포워드 루프, 또는 번역 후 변형의 결과일 수 있다. 경로 기능장애는 추가적으로 프로테옴, 프로테아솜, 키놈, 대사체, 핵 단백질 및 인자, 세포질 단백질 및 인자, 및/또는 미토콘드리아 단백질 및 인자의 활성의 결과일 수 있다.
기능장애 경로를 갖는 세포가 복제할 때, 이들은 이들의 자손에게 이상을 전달할 수 있으며, 이는 세포가 이환될 가능성을 증가시킨다. 살아있는 세포에서 세포 신호전달 경로의 활성을 분석함으로써, 세포의 신호전달 경로가 정상적으로 또는 비정상적으로 기능하는지 여부를 결정할 수 있다.
용어 "초민감성 신호전달 경로" 및 "과다활성 신호전달 경로"는 상호교환적으로 사용되며, 매우 낮은 수준의 세포 입력 차이, 예컨대 신호전달 경로 활성화제 (예를 들어, 1 nM 내지 10 nM의 수용체 리간드 농도 차이)만이 낮은 수준의 활성 (예를 들어, 10% 세포 출력)이 매우 높은 수준의 경로 활성화 반응성 (예를 들어, 90% 세포 출력)으로 변화하도록 유발할 수 있는 세포 신호전달 경로를 지칭한다. 전형적으로, 초민감성 또는 과다활성 신호전달 경로 내의 구성요소 (예를 들어, 효소)는 10% 내지 90% 최대 반응으로부터 활성을 구동하기 위해 자극의 81배 미만 증가가 필요한 경우 초민감성 또는 과다활성인 것으로 간주된다. 신호전달 경로 초민감성은 문헌 [Ferrell, J.E. and Ha, S.H. (2014) Trends in Biochem. Sci. 39:496-503]; [Ferrell, J.E. and Ha, S.H. (2014) Trends in Biochem. Sci. 39:556-569]; [Ferrell, J.E. and Ha, S.H. (2014) Trends in Biochem. Sci. 39:612-618]; [Huang, C.Y. and Ferrell, J.E. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10078-10083]; [Kim, S.Y. and Ferrell, J.E. (2007) Cell 128:1133-1145]; [Trunnell, N.B. et al. (2011) Cell 41:263-274]에 추가로 설명되어 있으며 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 "캡", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대, 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 펜던트 모이어티, 예컨대, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것들, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)를 갖는 것들, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 연결을 갖는 것들 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기는 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 추가 뉴클레오티드에 대한 추가 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보시클릭 당 유사체, 알파-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 포함하는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적인 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R', P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에테르 (--O--) 연결, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬 (1-20 C)임)에 의해 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 앞의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 펩티드 또는 단백질을 지칭하며, 펩티드, 올리고머, 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드는 천연, 변형 또는 합성 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 자연적으로, 예컨대 번역 후 프로세싱에 의해, 또는 화학적으로, 예컨대 아미드화, 아실화, 가교결합 등에 의해 변형될 수 있다.
용어 "석영 결정 공명기/마이크로 저울"은 측정되도록 의도된 작은 질량, 예컨대 바이러스 또는 임의의 다른 작은 물체의 첨가에 의해 방해될 때 압전 석영 결정의 주파수의 변화를 측정함으로써 질량을 측정하는 CREMS 디바이스의 한 유형을 지칭한다. 주파수 측정은 고정밀도로 쉽게 이루어지며, 따라서 작은 질량을 측정하는 것이 용이하다.
용어 "샘플"은 본 개시내용에서 장치, 마이크로플레이트 또는 방법을 사용하여 단리, 조작, 측정, 정량화, 검출 또는 분석될 모이어티를 함유할 수 있는 임의의 것을 지칭한다. 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 생물학적 유체 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예는 배지 중의 세포 현탁액, 예컨대 세포 배양 배지, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 객담, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 포함한다. 생물학적 조직은 일반적으로 결합, 상피, 근육 및 신경 조직을 포함하여 인간, 동물, 식물, 박테리아, 진균 또는 바이러스 구조의 구조적 물질 중 하나를 형성하는 이들의 세포간 성분과 함께 특정한 종류의 세포의 응집체이다. 생물학적 조직의 예는 또한 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별 세포(들)를 포함한다. 생물학적 샘플은 세포 현탁액, 생물학적 분자 (예를 들어, 단백질, 효소, 핵산, 탄수화물, 생물학적 분자에 결합하는 화학 분자)를 함유하는 용액을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "세포 샘플"은 세포가 대상체의 생물학적 유체, 배설물 또는 조직으로부터 단리되는 특정한 대상체로부터 단리된 세포를 지칭한다. 조직으로부터 단리된 세포는 종양 세포를 포함할 수 있다. 조직으로부터 단리된 세포는 균질화된 조직, 및 세포 추출물, 및 이들의 조합을 포함한다. 세포 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 정액 유체, 정장, 전립선액, 사정전액 (쿠퍼액), 배설물, 눈물, 타액, 땀, 생검, 복수, 뇌척수액, 림프, 골수 또는 모발로부터의 단리물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "CELx" 시험은 일반적으로 본원에 기재된 방법의 다양한 실시양태를 지칭한다.
용어 "질환 세포 샘플"은 질환 부위로부터의 복수의 세포 또는 질환의 특징을 갖는 세포를 지칭한다.
용어 "건강한 세포 샘플"은 세포가 시험되는 질환을 갖지 않거나 질환을 갖지 않는 조직으로부터 추출된 세포 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 특정한 대상체가 대상체의 유방암에 대한 치료제의 효과에 대해 시험될 때, 비-암성 세포 또는 비-유방 조직으로부터의 세포는 "건강한" 것으로 간주된다. 용어 "건강한 세포 샘플"은 대상체의 전체 건강 상태에 대한 결정 또는 반영이 아니다. 정상적인 참조 구간을 유도하기 위해, 이는 종종 사용된 건강한 세포 샘플은 시험 중인 질환을 갖지 않는 대상체로부터 수득된 경우이다.
용어 분석적 "민감성"은 시험 또는 검출 한계를 지칭하며, 제로와 구별되는 가장 낮은 양으로 정의된다. (예를 들어, 95% 신뢰 구간 또는 영점 제어 평균 이상의 2 표준 편차 (SD)가 일반적으로 사용됨).
용어 임상적 "민감성"은 시험이 양성인 표적 상태를 갖는 대상체의 비율 또는 관심 상태가 존재하는 경우 시험이 양성인 빈도를 지칭한다. 시험의 임상적 "민감성"은 하기 계산에 의해 제공되는 정확도의 추정치로서 정의된다: 100% x TP/(TP+FN), 여기서 TP는 시험 중인 결과에 대한 참 양성 사건의 수이고, FN은 음성으로서 잘못 결정된 사건인 허위 음성 사건의 수이다.
임상적 "특이성"은 시험이 음성인 표적 상태가 없는 대상체의 비율 또는 관심 상태가 부재하는 경우 시험이 음성인 빈도를 지칭한다. 임상적 특이성은 하기 계산에 의해 추정된다: 100% x TN/(FP +TN), 여기서 TN은 시험 중인 결과에 대한 참 음성 사건의 수이고, FP는 양성으로서 잘못 결정된 사건인 허위 양성의 수이다.
용어 "표면 플라즈몬 공명 디바이스"는 국소 굴절률의 변화를 검출함으로써 금속 표면에서 생체분자의 결합 사건을 측정하는 CReMS의 광학 바이오센서 유형을 지칭한다.
용어 "치료제"는 유기체 (인간 또는 비인간 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약리학적, 면역원성 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 임의의 합성 또는 자연 발생 생물학적 활성 화합물 또는 물질의 조성물을 지칭한다. 이 용어는 분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 호르몬, 핵산, 유전자 구축물 등을 포함하여 전통적으로 약물, 백신 및 생물의약품으로 간주되는 화합물 또는 화학물질을 포함한다. 작용제는 수의학, 적용 및 농업, 예컨대 식물, 뿐만 아니라 기타 분야를 비롯한 의료에서 사용되는 생물학적 활성 작용제일 수 있다. 용어 치료제는 또한 제한 없이, 의약; 비타민; 미네랄 보충물; 질환 또는 질병의 치료, 예방, 진단, 치유 또는 경감에 사용되는 성분; 또는 신체의 구조 또는 기능에 영향을 미치는 성분; 또는 미리 결정된 생리학적 환경에 배치된 후에 생물학적으로 활성이 되거나 더 활성이 되는 전구약물을 포함한다. 치료제는 항암 치료제, 항정신병제, 항염증제 및 항생제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "세포독성 요법" 및 "화학요법"은 하나 이상의 치료제를 사용하는 치료를 지칭하며, 여기서 작용제(들)는 이환된 세포 (뿐만 아니라, 가능하게는, 비-이환된 세포)에 대해 비-특이적 또는 비-표적화된 세포독성을 나타낸다.
용어 "표적화된 치료제", "표적화된 치료 작용제", "표적화된 경로 약물", "경로 약물", 또는 "표적화된 약물"은 질환 프로세스에 관여하는 특이적 생체분자 (예를 들어, 단백질)에 선택적으로 결합하여 이에 의해 이의 활성을 조절하도록 설계된 치료 능력을 갖는 임의의 분자 또는 항체를 지칭한다. 표적화된 치료제가 결합할 수 있는 생체분자의 비제한적인 예는 세포-표면 수용체 및 세포간 및 세포내 신호전달 경로 구성요소를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 치료를 위해 대상체에게 투여되는 "표적화된 치료제"는 대상체 세포에서 신호전달 경로의 상태를 결정하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 시험관내에서 시험되는 동일한 표적화된 치료제일 수 있거나, 또는 대안적으로, 치료를 위해 투여되도록 선택된 표적화된 치료제는 시험관내에서 시험된 것과 상이하지만 시험관내에서 시험된 표적화된 치료제와 동일한 신호전달 경로 (예를 들어, 시험된 표적화된 치료제와 동일한 지점 또는 노드의 신호전달 경로에 영향을 미침)를 표적화 (예를 들어, 선택적으로 영향을 미침)하는 표적화된 치료제일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RAS" 또는 "RAS 단백질"은 작은 GTPase의 Ras 슈퍼패밀리의 RAS 서브패밀리 구성원 (H-RAS, N-RAS 및 K-RAS)을 지칭한다. RAS 단백질은 세포 증식, 아폽토시스 및 분화를 포함하는 다양한 세포 반응으로 세포외 신호를 형질도입하는데 중요한 역할을 한다. RAS의 돌연변이는 하류 이펙터 경로를 구성적으로 활성화시키며, 이는 조절되지 않은 세포 성장, 세포 사멸 억제, 침습성, 및 혈관신생 유도를 유발할 수 있다. RAS는 인간 암에서 가장 흔한 종양유전자 중 하나이며, 활성화 돌연변이는 모든 인간 종양의 약 30%에서 발견된다. 또한, 많은 종양은 RAS 유전자의 부재 하에 RAS 신호전달의 활성화를 나타낸다 (Ji et al. Trends Mol. Med. 18, 27-35). 예를 들어, 상승된 RAS 경로 활성은 인간 유방 종양의 50% 초과에서 존재하지만 (특히 고도로 공격적인 하위유형), RAS 돌연변이를 거의 나타내지 않고 일반적으로 '비-RAS' 종양 유형인 것으로 간주된다 (Sears and Gray, Cancer Discov. 7, 131-133; Siewertsz Van Reesema, Clin. Lab. Int. 40, 18-23).
본원에서 사용된 바와 같은 "RAS 경로" (관련 기술분야에서 "RAS 이펙터 경로"로도 지칭됨)는 활성화된 RAS, 수용체 티로신 키나제, 및 G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR)로부터의 신호를 전달하여 세포 증식 및 형질전환을 촉진하는 신호전달 경로를 지칭한다. 이러한 RAS 경로는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 RAF/MEK/ERK, PLCε/PKC, PI3K/AKT/mTOR, RAL-GEF/RAL/TBK1, AKT/BAD/ BCL, 및 TIAM1/RAC/PAK를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RAS 노드"는 RAS 경로의 신호전달 구성요소 (이는 관련된 단백질, 예컨대 유전자 이소형을 포함할 수 있음), 예컨대 RAS/RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR, RAL/CDC42, RAL-GEF/RAL/TBK1, AKT/BAD/ BCL, 및 TIAM1/RAC/PAK (RAS, 수용체 티로신 키나제, 및 G-단백질-커플링된 수용체에 의해 활성화될 수 있음)를 지칭한다. 예를 들어, ERBB 패밀리의 이종이량체는 HER3 또는 어댑터, 예컨대 GRB2 상의 부위를 통해 직접적으로 PI3K/AKT/mTOR 캐스케이드를 활성화시킬 수 있으며, 또한 EGFR/HER2/HER4 또는 어댑터, 예컨대 SHC 상의 부위를 통해 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드를 직접적으로 활성화시킬 수 있다. 대안적으로, GPCR, 예컨대 SIP 및 LPA는 RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR, 및 RAL/CDC42 경로를 통해 과다활성화된 신호전달을 개시할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "RAS 노드의 억제제"는 활성화된 RAS, 수용체 티로신 키나제 또는 GPCR로부터의 신호를 전달하는 주어진 RAS 경로 내의 구성요소 (이는 관련된 단백질, 예컨대 유전자 이소형을 포함할 수 있음)의 억제제를 지칭한다. RAS 노드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 PI3K, AKT (Akt1, Akt2, Akt3), mTOR, S6K, RAL (RalA, RalB), RalBP1, RalGDS, TBK1, PLCε, RGL (Rgl1, Rgl2, Rgl3), RAF (A-RAF, B-RAF, C-RAF), MEK (MEK1/2), ERK (ERK1/2), TIAM1/2, RAC, PAK, Bcl-xL, 및 BCL-2를 포함한다 (예를 들어 문헌 [Clark, et al. Journal of Cell Science (2020) 133, jcs238865]; [Baines et al., Future Med Chem 2011;3:1787-808]; [Vigil et al., Nat Rev Cancer 2010;10:842-57]; [Moghadam et al., Cancer Med. 2017;6:2998-3013]; [Kang et al., Front Oncol. 2012:2:206]; [Carne Trecesson et al., Nature Communications 2017;8:1123]; [Gaspar et al., Small GTPases 2020, DOI:10.1080/21541248.2020.1724596] 참조). 일부 실시양태에서, RAS 노드의 억제제는 PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK 및 BCL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 RAS 노드를 억제한다. 게다톨리십은 하나 초과의 RAS 노드, 즉, PI3K 및 mTOR을 억제하는 억제제의 한 예이다. 일부 실시양태에서, RAS 경로 및 RAS 노드는 세포 증식 및/또는 세포 생존을 촉진한다.
용어 "PI3K"는 지질 키나제의 포스파티딜이노시톨-3-키나제 패밀리를 지칭한다. PI3K는 이들의 키나제 도메인에서 서열 상동성을 갖지만, 별개의 기질 특이성, 발현 패턴 및 조절 모드를 갖는다. PI3K는 4개의 클래스 (클래스 I-IV)로 세분화된다. 클래스 I, II 및 III은 포스포이노시티드 지질을 인산화하는 지질 키나제이다. 클래스 I PI3K는 4개의 이소형: p110α (PI3Kα), p110β (PI3Kβ), p110δ (PI3Kδ), 및 p110γ (PI3Kγ)을 포함하며, 이들의 조절 서브유닛에 따라 IA 또는 IB로 추가로 세분화된다. PI3Kα, PI3Kβ 및 PI3Kδ를 포함하는 클래스 IA는 RTK와의 상호작용에 의해 활성화되는 2개의 SH2 도메인을 함유하는 p85 조절 서브유닛을 갖는다. PI3Kγ를 포함하는 클래스 IB는 GPCR에 의해 활성화되는 p101 조절 서브유닛을 갖는다. 클래스 II는 4개의 구성원 (CIIα, CIIβ 및 CIIδ)으로 이루어지고, 클래스 III은 1개의 구성원, Vps34로 이루어진다. PIKK (PI3K-관련된 단백질 키나제)로도 지칭되는 클래스 IV 키나제는 PI3K와 상동성을 공유하지만 포스포이노시티드 지질보다는 단백질을 인산화하는 세린/트레오닌 단백질 키나제의 서브패밀리이다. PIKK는 mTOR (라파마이신의 포유동물 표적)을 포함한다.
용어 "AKT" 또는 "단백질 키나제 B (PKB)"는 성장 인자, 시토카인 및 종양발생 RAS에 반응하여 세포 생존 신호를 조절하는 세린/트레오닌 키나제를 지칭한다. AKT는 PI3K에 의한 원형질막 상의 지질의 인산화에 의해 형성되는 2차 메신저 PIP3와의 상호작용을 통해 세포의 원형질막으로 모집되고, 후속적으로 증식, 이동, 혈관신생 및 생존을 포함하는 하류 반응을 매개한다.
용어 "mTOR"은 PI3K 패밀리와 관련된 세린/트레오닌 키나제이고 PI3K/ AKT 신호전달 경로의 하류 이펙터인 라파마이신의 단백질 포유동물 표적을 지칭한다. mTOR은 세포 성장 및 대사의 조절인자로서 기능하며, 2개의 복합체, mTORC1 및 mTORC2로 존재한다.
용어 "RAF"는 카르복시 말단에서 고도로 보존된 아미노-말단 조절성 영역 및 촉매 도메인을 공유하는 3개의 이소형을 생성하는 3개의 유전자로 이루어진 유전자 패밀리에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다: A-RAF, B-RAF, 및 C-RAF (RAF1). B-RAF는 Ras:GTP에 의해 B-RAF가 활성화되는 세포내 세포막으로 모집된다. 차례로, B-RAF는 MEK1/2를 활성화시키고, MEK1/2는 ERK1/2를 활성화시킨다. 악성종양의 상당한 분획에서 발견되는 B-RAF (예를 들어, V600E)의 돌연변이는 B-RAF가 상류 신호와 독립적으로 신호를 보내고, 하류 MEK 및 ERK 신호전달의 과도한 활성화를 촉진하도록 허용하며, 이는 과도한 세포 증식 및 생존 및 종양발생을 유발한다. 돌연변이된 B-RAF에 의한 하류 신호전달의 과활성화는 많은 악성종양에 연루된다. 돌연변이된 B-RAF는 악성종양의 상당한 분획에서 발견된다.
용어 "MEK" 또는 "미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제"는 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK)를 인산화하는 키나제이다. MEK의 하위유형은 MAP2K1 (MEK1), MAP2K2 (MEK2), MAP2K3 (MKK3), MAP2K4 (MKK4), MAP2K5 (MKK5), MAP2K6 (MKK6), MAP2K7 (MKK7)을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "MEK"는 바람직하게는 MEK1 또는 MEK2, 또는 MEK1 및 MEK2 둘 다를 지칭한다.
용어 "ERK" 또는 "세포외 신호-조절 키나제"는 MAPK 패밀리의 구성원인 세린/트레오닌 키나제를 지칭한다. ERK는 RAS/RAF/MEK 신호전달 경로의 구성요소이며, 여기서 RAF는 MEK1/2를 활성화시키고, MEK1/2는 ERK1/2를 활성화시킨다. 본원에서 사용된 바와 같은 "ERK"는 ERK1 또는 ERK2, 또는 ERK1 및 ERK2 둘 다를 지칭할 수 있다.
BCL2 유전자에 의해 코딩되는 용어 "Bcl-2"는 염색체 18에 위치된 B-세포 CLL/림프종 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. Bcl-2는 미토콘드리아 투과화를 조절하는 원종양유전자이며 내인성 세포 아폽토시스 경로의 핵심 포인트이다. 이는 또한 세포 사멸 조절인자의 Bcl-2 패밀리의 창립 구성원이며, 이의 항-아폽토시스 구성원은 예를 들어 Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 및 A1을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "BCL"은 Bcl-2 패밀리의 항-아폽토시스 구성원을 지칭한다. "Bcl-xL" 또는 "B-세포 림프종-초대형"은 Bcl-2 패밀리의 구성원이며, Bcl-x의 엑손 2에서 대안적인 스플라이싱에 의해 생성된 긴 형태의 Bcl-x를 지칭한다. Bcl-xL은 Bax를 억제함으로써 부분적으로 아폽토시스을 방지하는 항-아폽토시스 단백질이다.
용어 "수용체 티로신 키나제" 또는 "RTK"는 단백질의 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원을 지칭한다. 성장 인자 수용체는 전형적으로 세포 성장, 세포 분열, 분화, 대사 및 세포 이동을 포함하는 세포 프로세스에 관여한다. RTK는 세포외 도메인, 막관통 (막횡단) 도메인, 및 세포내 티로신 키나제 도메인을 포함하는 보존된 도메인 구조를 갖는다. 구조적 모티프에 의한 분류는 각각 보존된 티로신 키나제 도메인을 갖는 20개의 RTK 패밀리를 식별하였다. RTK의 예는 에리트로포이에틴-생산 간세포 (EPH) 수용체, 표피 성장 인자 (EGF) 수용체, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 수용체, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체, 세포 접착 RTK (CAK), Tie/Tek 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF) 수용체, 및 인슐린 수용체 관련 (IRR) 수용체를 포함한다. RTK를 코딩하는 예시적인 유전자는 ERBB2 (HER2로도 공지됨), ERBB3, DDRl, DDR2, TKT, EGFR, EPHA1, EPHAB, FGFR2, FGFR4, FLT1 (VEGFR-1로도 공지됨), FLKl (VEGFR-2로도 공지됨) MET, PDGFRA, PDGFRB, 및 TEK를 포함한다.
용어 "G-단백질 커플링된 수용체" 또는 "GPCR"은 G-단백질과 회합하고 7개의 알파 나선 막횡단 도메인을 갖는 막-회합 수용체를 지칭한다. GPCR은 리간드 또는 효능제와 회합하고 또한 G-단백질과 회합하고 그를 활성화시킨다. "GPCR 활성"은 신호를 전달하는 GPCR의 능력을 지칭한다.
용어 "리소인지질 GPCR"은 리소인지질, 예컨대 리소포스파티드산 (LPA), 스핑고신 1-포스페이트 (S1P), 리소포스파티딜 이노시톨 (LPI), 및 리소포스파티딜세린 (LyPS)에 의해 활성화되는 GPCR 클래스를 지칭한다.
용어 "효능제"는 수용체에 결합하고 세포에서 반응을 일으키는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, "GPCR 신호전달의 효능제" 또는 "GPCR 효능제"는 GPCR에 대한 결합 시 GPCR을 활성화시키고 GPCR에 의해 매개되는 세포내 반응을 유도하는 작용제 (예를 들어, 리간드)를 지칭한다. 예시적인 GPCR 효능제는 리소인지질 GPCR, 예컨대 LPA 수용체 또는 S1P 수용체에 결합하는 리소인지질, 예컨대 LPA 또는 S1P이다. GPCR 효능제의 추가 예는 본원에 기재되어 있다.
용어 "RAS 노드 요법" 또는 "RAS 노드-표적화된 요법"은 RAS 노드를 표적화하는 항체 및 소분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RAS 경로 내의 RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK 및 BCL)를 특이적으로 표적화하도록 설계된 하나 이상의 치료제를 사용하는 치료를 지칭한다.
용어 "PI3K 요법" 또는 "PI3K-표적화된 요법"은 예를 들어 PI3K 분자 및/또는 신호전달 경로(들)를 표적화하는 항체 및 소분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 PI3K 분자 및/또는 신호전달 경로(들)를 특이적으로 표적화하도록 설계된 하나 이상의 치료제를 사용하는 치료를 지칭한다.
용어 "RTK 요법" 또는 "RTK-표적화된 요법"은 예를 들어 RTK 분자 및/또는 신호전달 경로(들)를 표적화하는 항체 및 소분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RTK 분자 및/또는 신호전달 경로(들)를 특이적으로 표적화하도록 설계된 하나 이상의 치료제를 사용하는 치료를 지칭한다.
용어 "항증식성 약물", "항증식제", 또는 "아폽토시스 유도 약물"은 세포 분열을 감소시키거나 세포 성장을 감소시키거나 세포를 사멸시키는 기능을 하는 치료 능력을 갖는 임의의 분자 또는 항체를 지칭한다. 많은 경우에, 이들 약물의 활성은 정상적인 세포 프로세스에 관여하는 광범위한 클래스의 생체분자 (예를 들어, DNA 인터칼레이션)를 향해 지정되며, 그러므로 약물이 세포 질환 상태를 덜 판별할 수 있다.
용어 "치료적으로 활성인"은 대상체의 암 세포가 표적화된 치료제, 예컨대 소분자 또는 항체 또는 표적화된 펩티드 또는 공지된 단백질에서 개입을 위해 높은 친화성 및 특이성을 갖는 임의의 유기 시약과 접촉될 때 발생하는 신호전달 경로에 대한 효과를 지칭한다. 치료적으로 활성인 표적화된 치료제는 표적화된 치료제가 영향을 미치도록 의도된 신호전달 경로(들)에 영향을 미치는 것이다. 또 다른 표적화된 치료제보다 대상체의 암 세포에서 치료적으로 더 활성인 표적화된 치료제는 다른 치료제가 영향을 미치도록 의도된 신호전달 경로에 대해 다른 치료제가 갖는 것보다 영향을 미치도록 의도된 신호전달 경로에 더 큰 영향을 미치는 것이다. 적어도 특정 암에서, 2개 이상의 신호전달 경로가 다중 수렴 지점, 누화 및 피드백 루프와 상호연결될 수 있어 경로 중 하나만 억제하는 것이 다른 것을 통한 신호전달의 유지를 여전히 초래할 수 있다는 증거가 있다 (상호 경로) (예를 들어, 문헌 [Saini, K.S. et al. (2013) Cancer Treat. Rev. 39:935-946] 참조). 하나의 신호전달 경로의 활성이 다른 신호전달 경로의 활성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 표적화된 치료제는 해당 표적화된 치료제의 결합 부위와 간접적으로 연관된 신호전달 활성을 파괴할 수 있다. 이들 경우에, 표적화된 요법은 해당 표적화된 치료제 결합 부위와 직접적으로 연관되지 않은 경로에 대한 신호전달 활성을 억제하는 것으로 밝혀지면 치료적으로 활성인 것으로 간주될 수 있다.
폴리펩티드의 "변이체"는 참조 서열과 상이한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 참조 서열은 전장 천연 폴리펩티드 서열 또는 전장 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 서열은 가변 도메인 중쇄 또는 가변 도메인 경쇄 컨센서스 서열이다. 폴리펩티드 변이체는 일반적으로 참조 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
암 환자의 선택 및 치료 방법
RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK 및 BCL) 또는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 인간 암 환자를 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 치료를 위해 인간 대상체를 선택하는데 사용되는 방법은 대상체의 암 세포에서 GPCR-매개 신호전달에 대한 RAS 노드 또는 RTK의 억제제의 효과를 평가하는 것을 포함한다. RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 인간 암 환자를 선택하는데 사용되는 방법은 GPCR 효능제 (예를 들어, 리소인지질, 예컨대 LPA 또는 S1P)에 의해 환자의 세포에서 개시되고 RAS 노드 또는 RTK의 억제제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)에 의해 억제된 활성의 양을 평가하는 것을 포함한다. 그러므로, 본원에 기재된 방법은 예를 들어 RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 RAS 노드 또는 RTK를 수반하는 비정상적인 GPCR 신호전달을 갖는 환자를 식별 및 선택하는 것을 허용한다.
따라서, 한 측면에서, 하기 단계를 포함하는, RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 측면에서, RAS 노드에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
특정 실시양태에서, 미리 결정된 컷오프 값을 사용하기보다는, RAS 노드 표적화된 치료제로 환자를 치료하거나 환자를 선택하기 위한 결정은 세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 백분율로서 표현된 출력 값 (이하, "출력 값 백분율")에 기초한다. 예를 들어, 제2 부분 (즉, 효능제 단독)에 대한 판독치가 1000이고 제1 부분 (효능제 + 억제제)에 대한 판독치가 700인 경우, 30%의 출력 값 백분율이 할당될 것이다. 2개의 출력 값 간의 차이인 300은 억제제에 의해 감소되는 효능제 활성의 양을 나타낸다. 유사하게, 제2 부분 (즉, 효능제 단독)에 대한 판독치가 1000이고 제1 부분 (효능제 + 억제제)에 대한 판독치가 250인 경우, 75%의 출력 값 백분율이 할당될 것이다.
따라서, 또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 측면에서, RAS 노드에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드에 영향을 미치는 RAS 노드 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
억제제에 의해 억제될 수 있는 예시적인 RAS 노드는 PI3K, AKT (Akt1, Akt2, Akt3), mTOR, S6K, RAL (RalA, RalB), RalBP1, RalGDS, TBK1, PLCε, RGL (Rgl1, Rgl2, Rgl3), RAF (A-RAF, B-RAF, C-RAF), MEK (MEK1/2), ERK (ERK1/2), TIAM1/2, RAC, PAK, Bcl-xL, 및 Bcl-2, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 억제제에 의해 억제되는 RAS 노드는 PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, Bcl-xL, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, RAS 노드의 억제제는 PI3K, AKT (Akt1, Akt2, Akt3), mTOR, S6K, RAL (RalA, RalB), RalBP1, RalGDS, TBK1, PLCε, RGL (Rgl1, Rgl2, Rgl3), RAF (A-RAF, B-RAF, C-RAF), MEK (MEK1/2), ERK (ERK1/2), TIAM1/2, RAC, PAK, Bcl-xL, 및 Bcl-2, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RAS 노드를 억제한다. 일부 실시양태에서, RAS 노드의 억제제는 PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, Bcl-xL, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RAS 노드를 억제한다.
일부 실시양태에서, 샘플의 제1 부분은 각각 상이한 RAS 노드를 억제하는 2개 이상의 RAS 노드의 억제제와 접촉된다. 예를 들어, 2종 이상의 억제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 RAS 노드의 조합을 억제할 수 있다: (a) PI3K, mTOR 및 BCL (예를 들어, Bcl-xL, Bcl-2, Mcl-1), (b) PI3K, mTOR 및 RAF, (c) PI3K, mTOR 및 ERK, 및 (d) PI3K, mTOR 및 MEK. 2개 이상의 RAS 노드의 다른 조합이 또한 고려되며, 본원에 기재된 방법의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 상이한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제의 조합으로 치료되거나 또는 그를 사용하는 치료를 위해 선택된다.
일부 실시양태에서, RAS 노드의 억제제는 하나 초과의 RAS 노드를 억제한다. 예를 들어, 억제제는 2개 이상의 RAS 노드의 다중-특이적 억제제일 수 있다. 예로서, 억제제 게다톨리십은 RAS 노드 mTOR 및 PI3K를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 PI3K이고, RAS 노드의 억제제는 PI3K 억제제이다.
일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 동일한 PI3K 이소형을 선택적으로 억제한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110α 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110β 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110γ 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110δ 서브유닛을 선택적으로 억제한다. 이소형-선택적 PI3K 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 클래스 IA PI3K (즉, p110α, p110β 및 p110γ)를 선택적으로 억제한다.
일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110 서브유닛의 하나 초과의 이소형을 억제한다. 일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 p110 촉매 서브유닛의 모든 이소형을 억제한다.
PI3K 억제제의 비제한적인 예는 예를 들어 보르트만닌, LY294002, 히비스콘 C, 이델라리십 (GS-1101, CAL-101), 코판리십, 두벨리십, 알펠리십, (BYL719), 타셀리십 (GDC-0032), GDC-0077, 페리포신, 이데알리십, 필라랄리십 (XL147), 부파르리십 (BKM120), 두벨리십, 움브랄리십, PX-866, 닥톨리십, CUDC-907, 복스탈리십, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, 픽틸리십 (GDC-0941), 팔로미드 529, SAR260301, GSK1059615, GSK2636771, CH5132799, CZC24832, AZD6482, AZD8835, WX-037, AZD8186, KA2237, CAL-120, AMG-319, AMG-511, HS-173, INCB050465, INCB040093, TGR-1202, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, TGX221, CAL263, RP6530, PI-103, GNE-477, IPI-145, BAY 80-6946, BAY1082439, PX866, BEZ235, MKM120, MLN1117, SAR245408, 및 AEZS-136, 세라벨리십 (TAK-117), 게다톨리십, 오미팔리십 및 필라르리십을 포함한다.
일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 또한 mTOR 신호전달을 억제한다. 이러한 억제제는 BGT-226, DS-7423, PF-04691502, PKI-179, GSK458V, GSK2126458, P7170, SB2343, VS-5584, NVP-BEZ235, SAR245409, GDC-0084, GDC-0980, LY3023414, PQR309, XL765, SF-1126, PF-05212384, PKI-587, 닥톨리십, 픽틸리십 (GDC-0941), LY3023414, 게다톨리십, 오미팔리십 및 PQR309를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 또한 RAF 신호전달을 억제한다. 이러한 억제제는 ASN003을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, PI3K 억제제는 또한 HDAC 신호전달을 억제한다. 이러한 억제제는 피메피노스타트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, PI3K 억제제 및/또는 PI3K 표적화된 치료제는 알펠리십이다. 또 다른 실시양태에서, PI3K 억제제 및/또는 PI3K 표적화된 치료제는 IPI-549이다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, PI3K 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 PI3K 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 PI3K 신호전달 경로를 억제하는 PI3K 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, PI3K 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 PI3K 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 PI3K 신호전달 경로에 영향을 미치는 PI3K 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 ERK이고, RAS 노드의 억제제는 ERK 억제제이다. 일부 실시양태에서, ERK 억제제는 ERK1을 선택적으로 억제한다. 다른 실시양태에서, ERK 억제제는 ERK2를 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, ERK 억제제는 ERK1 및 ERK2 둘 다를 억제한다. 이소형-특이적 ERK 억제제를 포함하는 ERK 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 라복세르티닙, SCH772984, SCH900353 (MK8353), 울릭세르티닙, AZD0364 (ATG017), VX-11e (VTX-113), CC-90003, LY3214996, FR180204, ASN007, E6201 및 GDC0994를 포함한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, ERK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 ERK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 ERK 신호전달 경로를 억제하는 ERK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, ERK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 ERK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 ERK 신호전달 경로에 영향을 미치는 ERK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 MEK이고, RAS 노드의 억제제는 MEK 억제제이다. 일부 실시양태에서, MEK 억제제는 MEK1을 선택적으로 억제한다. 다른 실시양태에서, MEK 억제제는 MEK2를 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, MEK 억제제는 MEK1 및 MEK2 둘 다를 억제한다. 이소형-특이적 MEK 억제제를 포함하는 MEK 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 트라메티닙, 비니메티닙, 피마세르팁, 코비메티닙, PD901, U0126, 셀루메티닙, PD325901, TAK733, CI-1040 (PD184352), PD198306, PD334581, PD98059 및 SL327을 포함한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, MEK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 MEK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 MEK 신호전달 경로를 억제하는 MEK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, MEK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 MEK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 MEK 신호전달 경로에 영향을 미치는 MEK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 AKT이고, RAS 노드의 억제제는 AKT 억제제이다. 일부 실시양태에서, AKT 억제제는 AKT 1을 선택적으로 억제한다. 다른 실시양태에서, AKT 억제제는 AKT 2를 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, AKT 억제제는 AKT 1 및 AKT 2 둘 다를 억제한다. 이소형-특이적 AKT 억제제를 포함하는 AKT 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 ARQ 751, 보루세르팁, TAS-117, 아퓨레세르팁, M2698, MK-2206, 카피바세르팁 및 이파타세르팁을 포함한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, AKT 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 AKT 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 AKT 신호전달 경로를 억제하는 AKT 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, AKT 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 AKT 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 MEK 신호전달 경로에 영향을 미치는 AKT 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 mTOR이고, RAS 노드의 억제제는 mTOR 억제제이다. 일부 실시양태에서, mTOR 억제제는 또한 다른 RAS 노드, 예컨대 PI3K를 억제한다 (예를 들어, 이중 PI3K/mTOR 억제제). 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 mTORC1을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, mTOR 억제제는 mTORC2를 억제한다. 또 다른 실시양태에서, mTOR 억제제는 mTORC1 및 mTORC2 둘 다를 억제한다. mTOR 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 게다톨리십, 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 닥톨리십, AZD8055, ABTL-0812, PQR620, GNE-493, KU0063794, 토르키닙, 리다포롤리무스, 사파니세르팁, 복스탈리십, 토린 1, 토린 2, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리십, GSK1059615, WYE-354, 비스투세르팁, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, WYE-687, WAY600, GDC-0349, XL388, 비미랄리십 (PQR309), 오미팔리십 (GSK2126458, GSK458), 오나타세르팁 (CC-223), 사모톨리십, 오미팔리십, RMC-5552 및 GNE-477을 포함한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, mTOR 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 mTOR 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 mTOR 신호전달 경로를 억제하는 mTOR 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, mTOR 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 mTOR 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 mTOR 신호전달 경로에 영향을 미치는 mTOR 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 RAF이고, RAS 노드의 억제제는 RAF 억제제이다. 한 실시양태에서, RAF 억제제는 A-RAF를 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, RAF 억제제는 B-RAF를 선택적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, RAF 억제제는 C-RAF를 선택적으로 억제한다. 추가 실시양태에서, RAF 억제제는 RAF의 하나 초과의 이소형을 억제한다. 또 다른 추가 실시양태에서, RAF 억제제는 RAF의 모든 이소형을 억제한다. RAF 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 PLX7904, GDC-0879, 벨바라페닙 (GDC-5573), SB590885, 엔코라페닙, RAF265, RAF709, 다브라페닙 (GSK2118436), TAK-632, TAK580, PLX-4720, CEP-32796, 소라페닙, 베무라페닙 (PLX-4032), AZ-628, GW5074, ZM-336372, NVP-BHG712, CEP32496, PLX4032, PF-0728489 및 LGX-818을 포함한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, RAF 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAF 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAF 신호전달 경로를 억제하는 RAF 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, RAF 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAF 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 RAF 신호전달 경로에 영향을 미치는 RAF 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 Bcl-xL이고, RAS 노드의 억제제는 Bcl-xL 억제제이다. Bcl-xL 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 나비토클락스 (ABT-263), G139, GDC-0199 (ABT-199, 베네토클락스), 사부톡스락스 (Bl-97C1), ABT-737, AT101, TW037, A1331852, BXI-61, WEHI-539, A1331852 및 BXI-72를 포함한다. 일부 실시양태에서, Bcl-xL 억제제는 Bcl-2 패밀리의 하나 이상의 구성원, 예컨대 Bcl-2를 추가로 억제한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, Bcl-xL 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 Bcl-xL 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 Bcl-xL 신호전달 경로를 억제하는 Bcl-xL 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, Bcl-xL 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 Bcl-xL 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 Bcl-xL 신호전달 경로에 영향을 미치는 Bcl-xL 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적화된 RAS 노드는 Bcl-2이고, RAS 노드의 억제제는 Bcl-2 억제제이다. Bcl-2 억제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 나비토클락스 (ABT-263), 오바토클락스 메실레이트 (GX15-070), AZD5991, 자세오시딘, A-1210477, ML311, 감보그산, S63845, 마리노피롤 A (마리토클락스), VU661013, UMI-77 및 S64315 (MIK665)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Bcl-2 억제제 (예를 들어, 나비토클락스)는 Bcl-2 패밀리의 하나 이상의 구성원, 예컨대 Bcl-xL을 추가로 억제한다.
한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, Bcl-2 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 Bcl-2 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 Bcl-2 신호전달 경로를 억제하는 Bcl-2 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, Bcl-2 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 Bcl-2 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 예를 들어 95% 이상인 경우, 동일한 Bcl-2 신호전달 경로에 영향을 미치는 Bcl-2 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
RAS 노드의 억제제 (예를 들어, PI3K 억제제, AKT 억제제, ERK 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, RAF 억제제, Bcl-xL 억제제), 또는 RAS 노드의 억제제가 예를 들어 미리 결정된 컷오프 이상인 출력 값 또는 30% 이상, 예를 들어 50% 이상인 출력 값 백분율에 반영된 바와 같이 환자의 암 세포에서 GPCR 신호전달에 영향을 미치는 것으로 결정되면, 암 환자는 RAS 노드 표적화된 치료제 (예를 들어, PI3K 표적화된 치료제, AKT 표적화된 치료제, ERK 표적화된 치료제, MEK 표적화된 치료제, mTOR 표적화된 치료제, RAF 표적화된 치료제, Bcl-xL 표적화된 치료제), 또는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, RAS 노드의 억제제 및 RAS 노드 표적화된 치료제는 동일한 화합물이다. 대안적으로, 환자의 암 세포에서 GPCR 신호전달이 RAS 노드의 억제에 반응적인 것으로 결정되면, RAS 노드 표적화된 치료제가 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 한, 환자를 치료하는데 사용되는 RAS 노드 표적화된 치료제는 억제제와 동일한 화합물일 필요는 없다. 따라서, 다른 실시양태에서, RAS 노드의 억제제 및 RAS 노드 표적화된 치료제는 상이한 화합물이다. 예로서, RAS 노드 PI3K를 표적화하는 경우, 환자의 암 세포에서 GPCR 신호전달이 PI3K의 억제에 반응적인지 여부를 결정하는데 사용되는 PI3K 억제제는 LY294002일 수 있는 반면, 환자의 암 세포가 LY294002에 반응적인 경우 환자에게 투여되는 PI3K 표적화된 치료제는 PI3K 억제제 알펠리십일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 또한 RAS, 예컨대 RTK와 공동-연관된 신호전달 노드를 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 측면에서, RTK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, RTK 신호전달을 억제하는 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
특정 실시양태에서, 미리 결정된 컷오프 값을 사용하기보다는, RTK 표적화된 치료제로 환자를 치료하거나 환자를 선택하기 위한 결정은 세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율에 기초한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상인 경우, RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 측면에서, RTK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상인 경우, RTK 신호전달을 억제하는 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, RTK 신호전달의 억제제는 단백질, 펩티드, 지질, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물질, 또는 이들의 조합이다.
다양한 RTK 억제제는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 (비제한적인) RTK 및 이들의 상응하는 억제제는 표 1에 기재되어 있다.
표 1.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
RTK 억제제가 예를 들어 미리 결정된 컷오프 이상인 출력 값 또는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상인 출력 값 백분율에 반영된 바와 같이 환자의 암 세포에서 GPCR 신호전달에 영향을 미치는 것으로 결정되면, 암 환자는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, RTK 억제제 및 RTK 표적화된 치료제는 동일한 화합물이다. 대안적으로, 환자의 암 세포에서 GPCR 신호전달이 RTK 억제에 반응적인 것으로 결정되면, 환자를 치료하는데 사용되는 RTK 표적화된 치료제가 RTK 억제제와 동일한 화합물일 필요는 없다. 따라서, 다른 실시양태에서, RTK 억제제 및 RTK 표적화된 치료제는 상이한 화합물이다.
일부 실시양태에서, RTK 억제제 및/또는 RTK 표적화된 치료제는 EGFR/ERBB, MuSK, HGFR, NGFR, FGFR, IR, CCK, EphR, RYK, RET, ROS, PDGFR, DDR, LTK, VEGFR, TIE, AXL, ROR, LMR 또는 RTK106 패밀리의 구성원의 억제제이다. 한 실시양태에서, RTK 억제제 및/또는 RTK 표적화된 치료제는 ErbB 패밀리의 구성원의 억제제이다. 특정 실시양태에서, RTK 억제제 및/또는 RTK 표적화된 치료제는 HER2의 억제제이다. 추가의 특정 실시양태에서, RTK 억제제 및/또는 RTK 표적화된 치료제는 네라티닙이다.
척추동물에서 발현되는 GPCR은 서열 유사성 및 기능에 기초하여 클래스 A (로돕신-유사), 클래스 B (세크레틴 수용체 패밀리), 클래스 C (대사향성 글루타메이트 수용체) 및 클래스 F (프리즐드/스무든드 수용체)를 포함하는 4개의 클래스로 나눌 수 있다. 본 방법에서 표적화될 수 있는 GPCR의 서브클래스는 예를 들어 문헌 [Alexander et al., Br J Pharmacol. 2019;176 S1: S21-S141] 및 www.guidetopharmacology.org에 기재되어 있으며, 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 5-히드록시트립타민 수용체, 아세틸콜린 수용체 (무스카린성), 아데노신 수용체, 접착 클래스 GPCR, 아드레날린성 수용체, 안지오텐신 수용체, 아펠린 수용체, 담즙산 수용체, 봄베신 수용체, 브래디키닌 수용체, 칼시토닌 수용체, 칼슘-감지 수용체, 칸나비노이드 수용체, 케메린 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 클래스 프리즐드 GPCR, 보체 펩티드 수용체, 코르티코트로핀-방출 인자 수용체, 도파민 수용체, 엔도텔린 수용체, G 단백질-커플링된 에스트로겐 수용체, 포르밀펩티드 수용체, 유리 지방산 수용체, GABAB 수용체, 갈라닌 수용체, 그렐린 수용체, 글루카곤 수용체 패밀리, 당단백질 호르몬 수용체, 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체, GPR18, GPR55, GPR119, 히스타민 수용체, 히드록시카르복실산 수용체, 키스펩틴 수용체, 류코트리엔 수용체, 리소인지질 수용체, 멜라닌-농축 호르몬 수용체, 멜라토닌 수용체, 대사향성 글루타메이트 수용체, 모틸린 수용체, 뉴로메딘 U 수용체, 뉴로펩티드 FF/뉴로펩티드 AF 수용체, 뉴로펩티드 S 수용체, 뉴로펩티드 W/뉴로펩티드 B 수용체, 뉴로펩티드 Y 수용체, 뉴로텐신 수용체, 오피오이드 수용체, 오렉신 수용체, 옥소글루타레이트 수용체, P2Y 수용체, 부갑상선 호르몬 수용체, 혈소판-활성화 인자 수용체, 프로키네티신 수용체, 프로락틴-방출 펩티드 수용체, 프로스타노이드 수용체, 프로테이나제-활성화 수용체, 소마토스타틴 수용체, 숙시네이트 수용체, 타키키닌 수용체, 티로트로핀-방출 호르몬 수용체, 미량 아민 수용체, 유로텐신 수용체, 바소프레신 및 옥시토신 수용체, 및 VIP 및 PACAP 수용체. 추가적인 GPCR은 후각 수용체, 고아 수용체 (클래스 A-C 고아), 옵신 수용체, 미각 1 및 2 수용체, 및 다른 7-막횡단 단백질, 예컨대 GPR107, GPR137, TPRA1, GPR143 및 GPR157을 포함한다.
상기 기재된 GPCR 및 GPCR 서브클래스의 적합한 효능제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 기재된 방법에서 각각의 GPCR을 자극하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, GPCR은 리소인지질 GPCR이다. 리소인지질 GPCR은 글리세롤 또는 스핑고이드 백본을 가질 수 있고 단일 탄소 쇄 및 극성 헤드그룹을 가질 수 있는 리소인지질에 의해 활성화된다. 이 클래스의 수용체는 증식, 생존, 이동, 접착 및 Ca 항상성을 포함하는 광범위한 세포 기능에 연루된다.
따라서, 한 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, BCL) 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, BCL)에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, BCL) 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, RAS 노드 (예를 들어, PI3K, AKT, mTOR, RAF, MEK, ERK, BCL)에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, RTK 표적화된 치료제 (예를 들어, ErbB 패밀리 구성원 표적화된 치료제, 예컨대 HER2 표적화된 치료제)를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, RTK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, RTK 표적화된 치료제 (예를 들어, ErbB 패밀리 구성원 표적화된 치료제, 예컨대 HER2 표적화된 치료제)를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
또 다른 실시양태에서, RTK 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
(1) 샘플의 제1 부분을 리소인지질 GPCR 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값 백분율을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
출력 값 백분율이 30% 이상, 예를 들어 35% 이상, 또는 예를 들어 40% 이상, 또는 예를 들어 45% 이상, 또는 예를 들어 50% 이상, 또는 예를 들어 55% 이상, 또는 예를 들어 60% 이상, 또는 예를 들어 65% 이상, 또는 예를 들어 70% 이상, 또는 예를 들어 75% 이상, 또는 예를 들어 80% 이상, 또는 예를 들어 85% 이상, 또는 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, RAS 노드의 억제제 및 RAS 노드 표적화된 치료제는 동일한 화합물이다. 다른 실시양태에서, RAS 노드의 억제제 및 RAS 노드 표적화된 치료제는 상이한 화합물이다. 일부 실시양태에서, RTK 신호전달의 억제제 및 RTK 표적화된 치료제는 동일한 화합물이다. 다른 실시양태에서, RTK 신호전달의 억제제 및 RTK 표적화된 치료제는 상이한 화합물이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 리소인지질 GPCR은 리소포스파티드산 (LPA) 수용체, 스핑고신 1-포스페이트 (S1P) 수용체, 리소포스파티딜 이노시톨 (LPI) 수용체, 및 리소포스파티딜세린 (LyPS) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 리소인지질 GPCR은 내피 분화 유전자 (EDG) GPCR, 예를 들어 LPA 수용체 (LPAR1-3) 또는 S1P 수용체 (S1PR1-5)이다. 일부 실시양태에서, 리소인지질 GPCR은 P2Y 패밀리 GPCR (LPAR4-6)이다.
일부 실시양태에서, LPA 수용체 (LPAR)는 LPAR1, LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5 및 LPAR6 (관련 기술분야에서 LPA1, LPA2, LPA3, LPA4, LPA5, LPA6으로도 지칭됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, S1P 수용체 (S1PR)는 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5 (관련 기술분야에서 S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 및 S1P5로도 지칭됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, LPI 수용체는 GPR55이다. 일부 실시양태에서, LyPS 수용체는 LyPS1 (GPR34), LyPS2 (P2Y10), LyPS2L 및 LyPS3 (GPR174)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, GPCR 신호전달의 효능제는 단백질, 펩티드, 지질, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물질, 또는 이들의 조합이다.
GPCR이 LPA 수용체인 실시양태에서, 예시적인 효능제는 LPA, FAP-10, FAP-12 및 OMPT를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 효능제로서 사용하기에 적합한 LPA의 비제한적인 예는 예를 들어 LPA 18:0, LPA 18:1, LPA 18:2, LPA 20:4 및 LPA 16:0을 포함한다.
GPCR이 S1P 수용체인 실시양태에서, 예시적인 효능제는 S1P, FTY720, BAF312, A971432, 세랄리피모드, CS2100, CYM50260, CYM50308, CYM5442, CYM5520, CYM5541, GSK2018682, RP001 히드로클로라이드, SEW2871, TC-G1006 및 TC-SP14를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
GPCR이 LPI 수용체 (GPR55)인 실시양태에서, 예시적인 효능제는 LPI 및 2-아라키도노일 LPI을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
GPCR이 LyPS 수용체인 실시양태에서, 예시적인 효능제는 예를 들어 문헌 [Ikubo et al. J Med Chem 2015;58:4204-19]에 기재된 바와 같이 LyPS 및 이의 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 생존가능한 암 세포는 치료제 단독을 함유하는 샘플의 제3 부분과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 접착 또는 부착의 변화가 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계는 샘플의 제1 부분을 제2 부분 및 제3 부분과 비교하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, GPCR 신호전달 경로는 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성이다. 비정상적으로 활성인 신호전달을 결정하는 방법은 아래 서브섹션에 기재되어 있다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 미리 결정된 컷오프 값은 아래 서브섹션에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 세포 접착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 아래 서브섹션에 더 자세히 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 적합한 암은 아래 서브섹션에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) RAS 노드 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) PI3K 효소를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 돌연변이된 PI3K 효소를 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) PI3K, ERK, MEK, RAF, BCL 및/또는 mTOR을 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 상승되지 않은 수준의 RTK (즉, RTK 음성 암 세포)를 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 상승되지 않은 수준의 HER2 (즉, HER2 음성 암 세포)를 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 HER2 음성이고, 비-돌연변이된 (즉, 야생형) PI3K, ERK, MEK, RAF, BCL 및/또는 mTOR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) GPCR을 발현한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 GPCR 신호전달의 효능제에 의해 활성화된 GPCR은 돌연변이되지 않는다 (즉, 야생형). 또 다른 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 상승되지 않은 수준의 GPCR을 발현한다. 즉, 본원에 기재된 방법에서 GPCR 신호전달의 효능제에 의해 활성화된 GPCR은 과다발현되거나 정상 이상의 통계적으로 유의한 수준 이상으로 발현될 필요가 없다.
한 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 한 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-아폽토시스제를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 배양 조건 및 세포 배양은 아래 서브섹션에 더 자세히 기재되어 있다.
GCPR 신호전달 경로 초민감성을 측정하는 방법
본원에 기재된 방법과 관련하여 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 환자의 암 세포에서 GPCR 신호전달 경로는 비정상적으로 활성이다 (즉, 초민감성). 따라서, 환자의 세포에서 GPCR 신호전달 경로가 비정상적으로 초민감성인지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 초민감성 경로는 오직 매우 낮은 수준의 세포 입력, 예컨대 신호전달 경로 효능제의 변화 (예를 들어, 1 nM에서 10 nM로 수용체 리간드 농도 변화)가 낮은 수준 (예를 들어, 세포 출력의 10%)의 경로 활성화에서 매우 높은 수준의 경로 활성화 반응성 (예를 들어, 90% 세포 출력)으로 변화를 유발할 수 있는 것이다. 비정상적으로 초민감성인 환자의 암 세포에서 신호전달 경로는 암 세포에 추가적인 비정상적인 신호전달 경로가 존재하더라도 질환 프로세스 (예를 들어, 종양 성장)를 구동하는데 관여할 가능성이 높다. 그러므로, 비정상적으로 초민감성인 환자의 암 세포에서 신호전달 경로를 식별하는 것은 치료적으로 효과적인 치료 요법을 선택하기 위한 효과적인 수단이다. 신호전달 경로에 대한 암 세포의 초민감성의 실시양태가 실시예 2에 기재되어 있다.
따라서, 한 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 암으로 진단된 인간 대상체가 비정상적으로 활성인 GPCR 신호전달을 갖는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키는 단계;
효능제와 접촉되지 않은 샘플의 부분에 비해 효능제와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계; 및
세포 접착 또는 부착의 변화가 효능제와 접촉되지 않은 샘플의 부분과 비교하여 효능제와 접촉된 샘플의 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 효능제에 대한 샘플의 민감성 및 효능제에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하며, 여기서 GPCR 신호전달 경로는 효능제에 대한 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우 비정상적으로 활성인 것으로 간주되는 것인 단계.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 암으로 진단된 인간 대상체가 비정상적으로 활성인 GPCR 신호전달을 갖는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다:
대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키며, 여기서 샘플의 일부분은 효능제의 더 높은 농도와 접촉되고 샘플의 일부분은 효능제의 더 낮은 농도와 접촉되는 것인 단계;
효능제의 더 낮은 농도와 접촉된 샘플의 부분에 비해 효능제의 더 높은 농도와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계; 및
효능제에 대한 신호전달 경로의 민감성을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하며, 여기서 GPCR 신호전달 경로는 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성인 경우 비정상적으로 활성인 것으로 간주되는 것인 단계.
한 실시양태에서, 활성화제의 더 높은 농도는 EC90 (즉, 유효 농도 90)이고, 활성화제의 더 낮은 농도는 EC10 (즉, 유효 농도 10)이다. 본원에서 사용된 바와 같은 EC90은 대상체의 세포에서 활성화제에 대한 최대 반응의 90%를 제공하는 활성화제의 농도이다. 본원에서 사용된 바와 같은 EC10은 대상체의 세포에서 활성화제에 대한 최대 반응의 10%를 제공하는 활성화제의 농도이다. 한 실시양태에서, 81 미만의 EC90:EC10 비율은 신호전달 경로가 활성화제에 대해 초민감성인 것을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 활성화제의 더 높은 농도는 활성화제의 더 낮은 농도보다 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배 이상 최대 80배 더 많다.
또 다른 실시양태에서, 활성화제의 더 높은 농도는 사용되는 유일한 농도이며, 초민감성인 환자의 작은 집단의 결과를 초민감성이 아닌 환자의 작은 집단의 결과와 본원에 기재된 임의의 실시양태에 의해 비교함으로써 결정된다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 신호전달 경로 초민감성을 측정하는 것을 포함하는 본 개시내용의 방법은 세포 접착 또는 부착에 대한 효과에 의해 측정된 바와 같이 신호전달 경로를 활성화시키도록 샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키는 접촉 단계 (배양 단계와 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계 사이)를 포함하며, 여기서 사용된 활성화제의 농도는 신호전달 경로의 초민감성을 식별하기 위해 결정된 농도이다.
한 실시양태에서, 활성화제에 대한 신호전달 경로의 민감성은 힐 계수를 결정하기 위해 힐 방정식을 사용하여 결정된다.
힐 방정식은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 하기와 같이 가장 간단하게 표현될 수 있다:
Figure pct00006
여기서:
· 입력은 입력 농도이다. 이는 많은 상이한 형태, 예컨대 pM, nM, μM, mM, M, ng/mL, % 등으로 표현될 수 있다.
· K 0.5 는 최대 절반 농도 상수이다. 이는 또한 K절반으로 지칭될 수 있다. 이는 50% 완료된 반응을 일으키는 기질 농도이다.
n은 힐 계수이다.
한 실시양태에서, 1 초과의 힐 계수 값은 신호전달 경로가 활성화제에 대해 초민감성임을 나타낸다.
대안적인 방식으로 표현된 힐 방정식:
Figure pct00007
여기서
θ - 경로로부터 유도된 활성의 분율
[L] - 유리 (비결합된) 리간드 (활성화제) 농도
Kd - 질량 작용의 법칙으로부터 유도된 겉보기 해리 상수 (해리에 대한 평형 상수), 이는 리간드-수용체 복합체의 해리 속도 대 이의 회합 속도의 비율 (Kd = kd/ka)과 동일하다.
n - 힐 계수
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 방정식이 기울기가 n, 힐 계수인 선형 플롯을 생성하는 log(θ/(1-θ)) 대 log L의 선형 플롯을 생성하는데 유용하다는 것을 인식할 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 EC90/EC10 < 81이 초민감성 신호전달 인스턴스를 나타내며, 여기서 EC90/EC10 비율이 작을수록 초민감성이 더 크다는 것을 인식할 것이다.
한 실시양태에서, GPCR 신호전달 경로는 리소인지질 GPCR 신호전달 경로, 예를 들어 LPAR, S1PR, LPIR (GPR55) 및 LyPSR로 이루어진 군으로부터 선택된 리소인지질 GCPR이다. 일부 실시양태에서, LPA 수용체 (LPAR)는 LPAR1, LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5 및 LPAR6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, S1P 수용체 (S1PR)는 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, LyPS 수용체는 LyPS1 (GPR34), LyPS2 (P2Y10), LyPS2L 및 LyPS3 (GPR174)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, GPCR 신호전달 (예를 들어, 리소인지질 GPCR 신호전달)의 효능제는 단백질, 펩티드, 지질, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물질, 또는 이들의 조합이다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 GPCR 효능제는 상응하는 GPCR 신호전달 경로가 대상체의 세포에서 초민감성인지 여부를 결정하는데 적합하다. 사용하기에 적합한 예시적인 리소인지질 GPCR 효능제는 선행 서브섹션에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제에 대한 비정상적으로 활성인 GPCR 신호전달 경로의 반응성은 GPCR 신호전달 경로 (예를 들어, 리소인지질 GPCR 신호전달 경로)가 비정상적으로 활성인지 여부를 먼저 결정한 후에 시험된다. 다른 실시양태에서, GPCR 신호전달의 효능제에 대한 환자의 세포의 민감성은 RAS 노드 또는 RTK 신호전달의 억제제가 GPCR 신호전달 경로에 영향을 미치는지 여부의 결정과 동시에 시험된다.
한 실시양태에서, 세포 접착 또는 부착은 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정된다. 바이오센서의 사용은 아래 서브섹션에 더 자세히 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 적합한 암은 아래 서브섹션에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) RAS 노드 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) PI3K 효소를 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 돌연변이된 PI3K 효소를 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 비-돌연변이된 (즉, 야생형) PI3K, ERK, MEK, RAF, BCL 및/또는 mTOR을 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 상승되지 않은 수준의 RTK (즉, RTK 음성 암 세포)를 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 상승되지 않은 수준의 HER2 (즉, HER2 음성 암 세포)를 발현한다. 한 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 HER2 음성이고, 비-돌연변이된 (즉, 야생형) PI3K, ERK, MEK, RAF, BCL 및/또는 mTOR을 발현한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 GPCR 신호전달의 효능제에 의해 활성화된 GPCR은 돌연변이되지 않는다 (즉, 야생형). 또 다른 실시양태에서, 대상체의 암 세포는 GPCR 신호전달의 효능제에 의해 활성화된 상승되지 않은 수준의 GPCR을 발현한다.
한 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-아폽토시스제를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 배양 조건 및 세포 배양은 아래 서브섹션에 더 자세히 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 이들 작용제 중 하나 이상에 대한 샘플의 반응은 또한 세포 증식을 교란하는 성장 인자 또는 항-아폽토시스제의 존재 또는 부재 하에 측정될 수 있다. 세포 증식을 교란하는 성장 인자는 성장 호르몬, 표피 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 간세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타를 포함한다. 항-아폽토시스제는 항-아폽토시스 단백질 또는 경로를 조절하는 화합물 (예를 들어, Bcl-2 단백질 활성에 대한 탁솔 및 항-아폽토시스 Ras 신호전달 캐스케이드의 제어를 위한 게피티닙)을 포함한다.
샘플 제조 및 배양
본 발명의 실시양태는 표적화된 치료제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)의 유효성을 결정하거나, 표적화된 치료제의 유효성을 모니터링하거나, 대상체의 이환된 세포에 투여될 때 표적화된 치료제의 용량을 식별하기 위한 시스템, 키트 및 방법을 포함한다.
전통적으로, 질환은 질환이 영향을 미치는 조직 또는 장기에 의해 분류되었다. 근본적인 메커니즘 (예를 들어, 과다활성 RTK 또는 GPCR 신호전달, 유전적, 자가면역 반응 등)에 대한 더 나은 지식으로 인해, 동일한 조직/장기에 영향을 미치거나 동일한 증상을 생성하는 질환이 상이한 병인을 가질 수 있고 이질적 유전자 발현 프로파일을 가질 수 있음이 이제 이해된다. 또한, 많은 질환에서 치료제에 반응자 및 비반응자가 있는 것으로 나타났다. 실시양태에서, 반응자 및 비반응자가 식별된 임의의 질환 유형은 약물의 특정한 치료적 약물 조합이 특정한 개체에 효과적일 것인지 여부를 예측 또는 예상하기 위해, 예를 들어 개체가 반응자인지 비반응자인지 여부를 결정하기 위해 본원의 방법에 사용될 수 있다.
본질적으로 이질적이며 반응자 및 많은 비반응자를 갖는 것으로 공지된 질환 유형의 한 예는 암이다. 암은 전형적으로 조직 유형에 따라 분류된다. 그러나, 암의 이질성에 대한 보다 정확한 설명은 상이한 암의 상이한 돌연변이에 반영된다. 암의 이질성에 대한 훨씬 더 정확한 설명은 특정한 환자의 세포에서 돌연변이의 실제 기능적, 생리학적 결과이다. 예를 들어, 유방암은 이 장기의 암을 유발하는 상이한 유형 및 상이한 돌연변이를 갖는다. 암을 유발하는 돌연변이가 기능 획득 (예를 들어, 단백질 생산 증가를 유발하는 원종양유전자) 또는 기능 상실 돌연변이 (예를 들어, 종양 서프레서) 및 유전자인지 여부에 기초하여 결과 및 치료가 상이할 수 있다. 특정한 암의 이질성으로 인해, 특정한 치료제에 대해 이질적인 반응이 있을 것으로 예상될 것이다. 본 발명의 실시양태는 특정한 대상체의 암 세포를 치료제 또는 치료제 패널에 시험하여 특정한 대상체의 암에 대한 특정 치료제 또는 가장 효과적인 치료제의 효능을 결정하여 대상체를 위한 치료를 선택하도록 허용한다.
본 발명의 실시양태는 개별 대상체로부터의 암 세포의 질환 세포 샘플을 포함한다. 이러한 암 세포는 하기로부터 유래될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다: 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 간외 담관암, 방광암, 골암, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 중추 신경계 비정형 기형양/횡문근양 종양, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막모세포종, 뇌실막세포종, 수질모세포종, 수질상피종, 유방암, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 천막상 원시 신경외배엽성 종양, 송과체모세포종, 기관지 종양, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수형성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 피부 T-세포 림프종, 원위치 도관 암종 (DCIS), 자궁내막암, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 성선외 생식 세포 종양, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 섬유성 조직구종, 담낭암, 위암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 임신성 영양막 종양, 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 심장암, 간세포암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 섬 세포 종양, 카포시 육종, 신세포암, 후두암, 입술암, 간암, 원위치 소엽성 암종 (LCIS), 폐암, 메르켈 세포 암종, 흑색종, 중피종, 구강암, 다발성 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구강암, 구강인두암, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 실질, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 횡문근육종, 침샘암, 편평 세포 암종, 소장암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 요관암, 요도암, 자궁암, 질암, 외음부암 및 윌름스 종양.
자가면역 질환은 자기 항원에 대한 면역 시스템 활성화로 인해 증가된 염증에 의해 특징화된다. 현재 요법은 면역 시스템 세포, 예컨대 B 세포 및 염증 분자, 예컨대 항 TNFα를 표적화한다. 요법은 면역 조정제 또는 면역저해제로서 광범위하게 특징화될 수 있다. 약물은 특정한 분자, 예컨대 TNF 알파, 인테그린, 스핑고신 수용체 및 인터류킨으로 표적화될 수 있다. 다른 약물은 항염증제, 예컨대 코르티코스테로이드로서 작용한다. 또 다른 경우에, 약물은 면역저해제, 예컨대 머캅토퓨린 및 시클로포스파미드이다. 자가면역 상태와 관련하여, 말초 혈액 세포는 특정 치료제에 대한 반응에 대해 조사될 수 있다. 다른 실시양태에서, 염증 부위의 조직 샘플, 예를 들어 류마티스 관절염에서 활막 조직 또는 궤양성 대장염에 대한 결장 조직.
예를 들어, 류마티스 관절염을 갖는 일부 환자는 항-TNFα 항체에 대한 비반응자인 것으로 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 말초 혈액 세포는 RA를 갖는 것으로 의심되는 환자로부터 수득될 수 있고, 환자의 TNF 수용체 및 연관된 MAPK 경로의 세포 신호전달 능력의 감소는 환자가 면역조정제 또는 면역저해제 화합물에 대한 반응자 또는 비반응자일 가능성이 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 다른 치료제, 예컨대 IL-6, 인터페론 알파, 인터페론 감마 등으로 표적화하는 치료제가 동일한 방식으로 시험될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다발성 경화증을 갖는 환자는 인터페론 베타에 대한 비반응자인 것으로 공지되어 있다. 대상체로부터의 세포 샘플을 약물 패널에 대해 시험하여 세포 생리학적 파라미터의 변화를 유도함으로써 특정한 대상체에게 약물 중 임의의 것이 효과적인지 확인할 수 있다. 유리한 결과의 예는 미국 류마티스 학회 (ACR) 기준에 의해 결정된 바와 같이 세포 염증 파라미터의 감소 또는 혈액-뇌 장벽 기능을 강화하기 위한 세포 접착의 증가일 것이다.
다른 실시양태에서, 환자는 미생물, 외래 이물질 또는 외래 작용제에 의한 세포 감염으로 인한 질환을 가질 수 있다. 미생물로 감염된 혈액 세포 또는 조직 샘플은 다양한 항생제, 항바이러스제 또는 다른 치료제 후보에 대한 반응성에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 기능을 감소시키는 C형 간염 감염에 대한 다수의 상이한 치료제가 있으며, 감염된 조직 샘플은 하나 이상의 치료제와 접촉될 수 있으며, 세포 생리학적 파라미터의 변화가 검출된다. 감염된 조직의 세포 생리학적 파라미터의 변화를 제공하는 치료제, 및/또는 최저 용량에서 세포 생리학적 파라미터의 변화를 제공하는 치료제가 선택된다. 세포 생존의 증가 또는 세포 성장의 증가와 같은 결과는 유리한 것으로 간주될 것이다. 예컨대 특이적 수용체 유형을 통한 바이러스 진입의 차단 또는 세포 경로의 활성화에 의해 치료제가 인간 세포에 직접적으로 영향을 미치도록 설계된 다른 실시양태에서, 환자 세포는 본원의 다른 실시양태에 기재된 바와 같이 상기 치료제에 의한 수용체 결합 또는 경로 활성화에 대해 시험될 수 있다.
실시양태에서, 세포 샘플은 요법 개시 전, 요법 동안, 요법 후, 관해 동안 및 재발 시에 수득될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 방법은 치료 전, 치료 동안, 환자가 내성을 나타낼 때, 및 재발 시에 치료 효능을 예측하는데 유용하다. 본 개시내용의 방법은 또한 치료제 또는 작용제의 조합에 대한 반응자 또는 비반응자를 예측하는데 유용하다.
특정 실시양태에서, 세포는 임의의 종류의 고정제와 접촉되거나 처리되지 않거나, 파라핀 또는 다른 물질, 또는 임의의 검출가능한 표지에 매립되지 않는다. 다른 실시양태에서, 세포는 온전한, 생존가능한 및/또는 무표지 상태로 유지되는 것이 바람직하다. 그러므로, 생존가능한 1차 세포는 세포 샘플로서 사용될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 세포 샘플은 이환된 조직 및 건강한 조직 둘 다에 대해 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플은 생존가능한 및 고정된 형태 둘 다로 제공된다. 고정된 형태로 제공된 세포 샘플은 특히 추가 바이오마커의 개선된 식별 및 상관관계를 위해 본원에 기재된 바와 같은 방법에 따라 분석되는 생존가능한 세포와 비교하기 위한 대조군으로서 역할을 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 개별 대상체로부터의 세포는 치료 유효성을 결정하는데 사용된다. 세포는 널리 공지된 방법 (즉, 면봉, 생검 등)에 의해 수집 및 단리될 수 있다. 이환된 및 비-이환된 세포 둘 다가 사용될 수 있다. 비-이환된 세포는 음성 대조군, 기준선 척도, 시간 경과에 따른 척도 비교 등으로서 사용될 수 있다. 실시양태에서, 동일한 대상체로부터의 조직 세포의 대조군 샘플이 또한 수득될 수 있다. 대조군 샘플은 대상체에서 또 다른 건강한 조직으로부터 또는 이환된 조직 샘플과 동일한 장기로부터의 건강한 조직으로부터 채취될 수 있거나, 보다 바람직하게는 건강한 조직은 질환이 없는 개체로부터 채취된다. 이환된 세포는 활성 질환을 갖는 조직으로부터 추출된 세포이다. 한 실시양태에서, 이환된 세포는 종양 세포, 예컨대 유방암 세포일 수 있다. 암성 세포가 반드시 종양으로부터 추출되어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 백혈병을 갖는 환자의 혈액으로부터 백혈병 세포가 수집될 수 있다. 세포는 상이한 조직 부위, 예컨대 전이 부위, 순환 종양 세포, 원발성 종양 부위, 및 재발성 종양 부위로부터 수집될 수 있으며, 세포 반응성은 서로 비교될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이환된 세포는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염의 부위로부터 추출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각 조직 샘플의 세포 수는 바람직하게는 적어도 약 5000개의 세포이다. 다른 실시양태에서, 조직 샘플의 세포 수는 약 5000 내지 100만개의 세포 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 세포 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 정액, 정액 유체, 정장, 전립선액, 사정전액 (쿠퍼액), 배설물, 눈물, 타액, 땀, 생검, 복수, 뇌척수액, 림프, 골수 또는 모발로부터의 단리물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 다른 실시양태에서, 세포 샘플은 환자 혈청, 이의 분획, 오르가노이드, 섬유모세포, 기질 세포, 중간엽 세포, 상피 세포, 백혈구, 적혈구, B 세포, T 세포, 면역 세포, 줄기 세포, 또는 이들의 조합을 함유하거나 이로부터 유래될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체로부터의 세포의 추출은 신호전달 경로 활성을 평가하는 방법 (예를 들어, 본원에 기재된 CReMS 시스템)과 동일한 위치에서 수행된다 (예를 들어, 실험실, 병원에서). 이와 같이, 세포는 대상체에서 바이오센서까지의 시간을 연결하기 위해 널리 공지된 전달 배지에 현탁 또는 보존될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체로부터의 세포의 추출은 신호전달 경로 활성을 평가하는 방법 (예를 들어, 본원에 기재된 CReMS 시스템)과 상이한 위치에 있다. 일단 수득되면 세포 샘플은 세포 생존력을 유지하는 배지에서 유지된다. 분석 장소까지 수송하는데 걸리는 시간에 따라, 상이한 배지가 사용될 수 있다. 실시양태에서, 조직 샘플의 수송이 최대 10시간을 필요로 할 수 있는 경우, 배지는 400 mosm/L 미만의 오스몰농도를 가지며, Na+, K+, Mg+, Cl-, Ca+2, 글루코스, 글루타민, 히스티딘, 만니톨, 및 트립토판, 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하고, 필수 아미노산을 함유하고, 비필수 아미노산, 비타민, 다른 유기 화합물, 미량 미네랄 및 무기 염, 혈청, 세포 추출물, 또는 성장 인자, 인슐린, 트랜스페린, 나트륨 셀레나이트, 히드로코르티손, 에탄올아민, 포스포릴에탄올아민, 트리아이오도티로닌, 피루브산나트륨, L-글루타민을 추가로 함유하여 인간 1차 세포의 증식 및 플레이팅 효율을 지원할 수 있다. 이러한 배지의 예는 셀시오(Celsior) 배지, 로스웰 파크 메모리얼 연구소(Roswell Park Memorial Institute) 배지 (RPMI), 행크스(Hanks) 완충 염수, 및 맥코이 5A, 이글 필수 최소 배지 (EMEM), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 레이보비츠(Leibovitz) L-15, 또는 이의 변형 (1차 세포 치료의 실시를 위해)을 포함한다. 실시양태에서, 배지 및 컨테이너는 내독소 무함유, 비발열성 및 DNase- 및 RNase-무함유이다.
다른 실시양태에서, 개별 대상체의 조직 표본으로부터 수득된 이환된 세포는 조직 표본의 세절 및 효소 소화, 세포 유형에 의한 추출된 세포의 분리, 및/또는 추출된 세포의 배양을 포함하는 단계를 사용하여 추출된다. 배양 시약은 다양한 보충물, 예를 들어 환자 혈청 또는 환자 유래 인자를 포함할 수 있다.
추가 측면은 조직 표본으로부터 오르가노이드를 추출하는 방법을 포함하며, 이는 개별 대상체에서 치료제의 효능을 결정하기 위해 후속적으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 세절 및 효소 소화 단계를 포함한다. 추가 측면은 조직 표본으로부터 오르가노이드를 배양하는 방법을 포함하며, 이는 개별 대상체에서 치료제의 효능을 결정하기 위해 후속적으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 세절, 효소 소화, 세포 유형에 의한 분리, 및 배양 단계를 포함한다. 추가 측면은 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 그렇게 분리된 세포의 특이적 재조합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체로부터의 생존가능한 세포의 샘플에서 신호전달 경로 활성을 평가하기 전에, 세포는 먼저 생리학적 상태 및 경로 활성화와 관련하여 세포가 동기화되도록 평가될 GPCR 신호전달 경로를 교란할 수 있는 임의의 작용제 및 혈청이 없는 배지에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포 샘플은 혈청 및 성장 인자가 없는 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 세포는 인간 1차 세포의 증식 및 플레이팅 효능을 지원하기 위해 기능적 세포 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 기능적 갑상선 수용체 및/또는 기능적 G-단백질-커플링된 수용체 (또는 앞서 언급된 특성 중 2개 또는 3개의 임의의 조합)를 유지하는 배지에서 배양된다.
한 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 성장 인자를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 생존가능한 암 세포의 샘플은 또한 항-아폽토시스제를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양된다. 항-아폽토시스제의 비제한적인 예는 키나제 억제제, 프로테아제 억제제, 스트레스 억제제, 사멸 수용체 억제제, 시토크롬 C 억제제, Rho-연관 키나제 억제제를 포함하는 아노이키스 억제제, ALK5 억제제, 카스파제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 산화환원 완충 작용제, 활성 산소종 억제제, TNFα 억제제, TGFβ 억제제, 시토크롬 C 방출 억제제, 칼슘 채널 활성화가 없는 탄산 탈수효소 길항제, 인테그린 안정화제, 인테그린 리간드, Fas 억제제, FasL 억제제, Bax 억제제 및 Apaf-1 억제제를 포함한다.
1차 세포 샘플, 예를 들어 대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포 샘플의 제조를 위한 추가 적합한 배양 조건은 WO 2017/070353으로 공개된 PCT 출원 번호 PCT/US2016/057923에 자세히 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
샘플 분석
본 발명의 시스템 및 방법은 본원에서 세포 반응 측정 시스템 (CReMS)으로 지칭되는 시스템을 활용한다. CReMS는 세포 내, 세포 내 및 세포 간, 및 세포와 계측 디바이스 간의 생리학적 파라미터의 변화를 정량적으로 결정할 수 있는 디바이스 (예를 들어, 바이오센서)를 지칭한다. 생리학적 파라미터의 변화는 분석물질 (비제한적인 예, 예컨대 세포외 매트릭스, 세포 신호전달 분자, 또는 세포 증식, 조직, 세포, 대사물, 이화대사물, 생체분자, 이온, 산소, 이산화탄소, 탄수화물, 단백질 등 포함)의 변화를 결정함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 바이오센서는 단리된 전체 무표지 생존가능한 세포에서 생리학적 파라미터의 변화를 측정하고 있다. 일부 실시양태에서, 치료제 및/또는 활성화제 작용제의 유형으로 인한 예상되는 변화를 측정할 수 있는 바이오센서가 선택된다.
CReMS의 예는 바이오센서이다. 바이오센서의 예는 전기화학적 바이오센서, 전기적 바이오센서, 광학 바이오센서, 질량 민감성 바이오센서, 열 바이오센서 및 ISFET 바이오센서이다. 전기화학적 바이오센서는 전위차계, 전류계 및/또는 전압전류계 특성을 측정한다. 전기적 바이오센서는 표면 전도도, 임피던스, 저항 또는 전해질 전도도를 측정한다. 광학 바이오센서는 형광, 흡수, 투과도, 밀도, 굴절률 및 반사를 측정한다. 질량 민감성 바이오센서는 압결정의 공명 주파수를 측정한다. 열 바이오센서는 반응열 및 흡착열을 측정한다. ISFET 바이오센서는 이온, 원소, 및 단순 분자, 예컨대 산소, 이산화탄소, 글루코스, 및 기타 생명과학 분야의 관심 대사물을 측정한다. 일부 실시양태에서, 바이오센서는 임피던스 디바이스, 광자 결정 디바이스, 광학 도파관 디바이스, 표면 플라즈몬 공명 디바이스, 석영 결정 공명기/마이크로 저울, 및 마이크로캔틸레버 디바이스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 광학 바이오센서는 살아있는 세포, 병원체 또는 이들의 조합에서 분자 인식 또는 분자 활성화 사건을 변환하기 위한 광학 변환기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 디바이스는 임피던스 디바이스이다.
단백질 또는 다른 시험관내 생체분자 상호작용을 측정하는데 사용되는 바이오센서의 예에서, 특정 단백질 질량의 포획은 의미있는 생화학적 및 생물물리학적 가치로 번역된다. 포획된 특정 단백질의 분자량을 포함하는 포획된 질량으로 간단한 계산을 적용하면, 몰수가 평가되어, 평형 결합 상수 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 상호작용 기술 값이 유도된다. 세포 검정에 사용되는 바이오센서의 예에서, 세포 표면 상의 특정 접착 분자는 특정 세포 경로를 통해 외부 화학물질 또는 다른 자극의 적용 시 센서 및 다른 인근 세포의 표면에 가까운 이들의 부착 및 형태학을 조정한다.
바이오센서는 자극 및 자극에 반응하기 위해 사용된 세포 내의 경로에 고유한 방식으로 선택될 수 있는 이들 조정을 검출할 수 있다. 적절하게 설계된 경우, 상기 세포 검정에 대한 바이오센서 결과는 분자 및 기능적 측면에서 정교하게 정량적일 수 있다. 상기 바이오센서 결과는 추가 고유성을 위한 시간적 반응 패턴일 수 있다. 세포 내에서 특정 경로를 켜고 끄는 것으로 공지된 생체분자 활성화제 또는 교란제는 CReMS 바이오센서 신호의 특이성을 결정하기 위한 대조군으로서 사용될 수 있다. 바이오센서 결과의 시간적 반응의 곡선 디콘볼루션을 위한 방법 (예를 들어, 대조군 반응과의 비선형 유클리드 비교)은 추가로 더욱 미세하게 세부적인 특정 세포 반응으로 적용될 수 있다. 세포 바이오센서 검정에서 적정 외부 자극의 사용은 또한 추가 생화학적 및 생물물리학적 파라미터 설명을 제공할 수 있다.
무표지 센서의 한 예는 고주파 석영 공명기 또는 석영 결정 마이크로 저울 (QCM) 또는 공명 캔틸레버이다. 공명기는 이의 표면에 패턴화된 금속 전극을 갖는 석영 결정을 포함한다. 석영 물질은 전압이 인가될 때 잘 특징화된 공명 특성을 갖는다. 특정한 주파수에서 전극에 교류 전압을 인가함으로써, 결정이 특징 주파수에서 진동할 것이다. 진동 주파수는 질량이 센서 표면에 포획될 때 정량적 방식으로 조정되며; 추가 질량은 더 낮은 공명기 주파수를 초래한다. 따라서, 석영 진동자의 공명 주파수의 작은 변화를 측정함으로써, 연구 중인 생체분자 또는 세포에 표지를 부착하지 않고도 증착된 질량의 매우 작은 변화를 측정할 수 있다.
이온 선택적 전계 효과 트랜지스터 (ISFET) 디바이스는 선택된 이온, 원소, 및 단순 분자, 예컨대 산소, 이산화탄소, 글루코스, 및 기타 생명과학 분야의 관심 대사물을 측정할 수 있는 소형화된 나노스케일 디바이스이다. 이들은 전기기계 작동 수준에서 뿐만 아니라 생물학적 응용 수준에서 광범위하게 설명되었다. 현재까지, 이들은 질환 프로세스에서 제안된 치료적 개입에 대한 이의 반응 또는 내성 또는 시간적 패턴을 포착하기 위해 특정 환자의 세포와 함께 사용하는 것에 대해 설명되지 않았다.
광학 바이오센서는 센서 표면에 커플링된 빛의 일부 특징의 측정가능한 변화를 생성하도록 설계된다. 이러한 접근법의 장점은 여기 공급원 (센서의 조명 공급원), 검출 변환기 (반사된 또는 투과된 빛을 모으는 디바이스), 및 변환기 표면 자체 간의 직접적인 물리적 연결이 필요하지 않다는 것이다. 다시 말해서, 광학 바이오센서에 대한 전기적 연결이 필요하지 않아, 대부분의 생물학적 시스템을 안정화하고 연구하는데 필요한 유체와 센서를 인터페이스하는 방법을 단순화한다. 질량을 직접적으로 검출하는 것보다는, 모든 광학 바이오센서는 측정가능한 신호를 생성하기 위해 검출된 성분의 유전율에 의존한다. 유전율의 변화는 자유 공간에서의 빛의 속도 대 매질에서의 빛의 속도의 비율의 차이와 관련된다. 이러한 변화는 본질적으로 매질의 굴절률을 나타낸다. 굴절률은 공식적으로 매질의 유전 상수의 제곱근으로서 정의된다 (이 관계에 대한 보다 명확한 처리는 맥스웰의 방정식 참조). 광학 바이오센서는 모든 생물학적 물질, 예컨대 단백질, 세포 및 DNA가 자유 공간보다 더 높은 유전 상수를 갖는다는 사실에 의존한다. 따라서, 이들 물질은 모두 통과하는 빛의 속도를 늦추는 고유한 능력을 보유한다. 광학 바이오센서는 생물학적 물질을 함유하는 매질을 통한 빛의 전파 속도의 변화를 센서 표면에 포획된 생물학적 물질의 양에 비례하는 정량화가능한 신호로 번역하도록 설계된다.
상이한 유형의 광학 바이오센서는 엘립소미터, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 디바이스, 이미징 SPR 디바이스, 격자 커플링된 이미징 SPR 디바이스, 홀로그램 바이오센서, 간섭 바이오센서, 반사계 간섭 분광법 (RIFS), 비색 간섭 바이오센서, 차동 간섭계, 하트먼 간섭계, 이중 편광 간섭계 (DPI), 도파관 센서 칩, 통합 입력 격자 커플러 디바이스, 처프 도파관 격자 디바이스, 광자 결정 디바이스, 우드의 이상에 기초한 유도 모드 공명 필터 디바이스, 삼각형 은 입자 어레이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그리고 또한, 가시광선, 자외선, 근적외선 및 적외선을 포함하나 이에 제한되지는 않는 전자기 스펙트럼의 다양한 파장을 측정하는 디바이스를 포함한다. 작동 모드는 산란, 비탄성 산란, 반사, 흡광도, 라만, 투과도, 횡방향 전기파 및 횡방향 자기파를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표면 플라즈몬 공명 디바이스는 국소 굴절률의 변화를 검출함으로써 금속 표면에서 생체분자의 결합 사건을 측정하는 광학 바이오센서이다. 일반적으로, 고처리량 SPR 기구는 자동-샘플링 로봇, 고해상도 CCD (전하-커플링된 디바이스) 카메라, 및 금 또는 은-코팅 유리 슬라이드 칩 (각각은 플라스틱 지지체 플랫폼에 매립된 4개 초과의 어레이 셀을 가짐)으로 이루어진다. SPR 기술은 특정 금속 인터페이스, 가장 현저히 은 및 금에서 여기될 수 있는 표면 플라즈몬 (특수한 전자기파)을 활용한다. 입사광이 임계각보다 큰 각도에서 금속 인터페이스와 커플링될 때, 반사광은 입사광으로부터 표면 플라즈몬으로의 에너지의 공명 전달로 인해 반사율의 급격한 감쇠 (SPR 최소값)를 나타낸다. 표면에서 생체분자의 결합은 국소 굴절률을 변화시키고, SPR 최소값의 이동을 초래한다. SPR 신호의 변화를 모니터링함으로써, 실시간으로 표면에서 결합 활성을 측정할 수 있다.
SPR 측정은 굴절률 변화에 기초하기 때문에, 분석물질의 검출은 무표지이고 직접적이다. 분석물질은 어떠한 특수한 특징 또는 표지 (방사성 또는 형광성)도 필요로 하지 않으며, 다단계 검출 프로토콜 필요 없이 직접적으로 검출될 수 있다. 측정은 실시간으로 수행될 수 있으며, 이는 동역학 데이터 및 열역학 데이터의 수집을 허용한다. 마지막으로, SPR은 광범위한 분자량 및 결합 친화성에 걸쳐 다수의 분석물질을 검출할 수 있다. 그러므로, SPR 기술은 세포 반응 측정 시스템으로서 매우 유용하다.
살아있는 환자 세포의 복잡한 임피던스 변화 (델타 Z, 또는 dZ)의 측정을 위한 CReMS는 임피던스 (Z)가 옴의 법칙 (Z = V/I)에 의해 설명된 바와 같이 전압 대 전류의 비율과 관련된 이 실시양태에서 설명된다. 예를 들어, 환자 세포가 부착된 전극에 일정한 전압이 인가되면, 차동 주파수로 세포 주위, 세포 사이 및 세포를 통해 흐르는 전류가 생성된다. 이러한 CReMS는 세포와의 전극 인터페이스에서 국소 이온 환경에 민감하고, 전압 및 전류 변동의 함수로서 이들 변화를 검출한다. 이의 정상적인 기능 또는 활성화의 결과로서 세포의 생리학적 변화는 전극 주변의 전류 흐름에 정량화가능한 변화를 초래하고 이러한 CReMS에서 측정된 신호의 크기 및 특징에 영향을 미친다.
특정 실시양태에서, 바이오센서는 사건 특이성을 갖는 포괄적 표현형의 변화를 검출한다. 포괄적 표현형은 pH, 세포 접착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 세포 주기, 동화작용, 이화작용, 소분자 합성 및 생성, 전환, 및 호흡, ATP, 칼슘, 마그네슘, 및 다른 하전된 이온, 단백질, 특정 경로 구성원 분자, 다양한 세포 구획 내의 DNA 및/또는 RNA, 유전체학, 및 단백질체학, 번역 후 변형 및 메커니즘, 2차 메신저, cAMP, mRNA, RNAi, 마이크로RNA 및 생리학적 기능을 갖는 다른 RNA의 수준, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 반응 파라미터를 포함한다. 사건 특이성과 관련하여, 해당 유형의 치료제 및/또는 활성화제 작용제에 대한 예상되는 변화인 세포 샘플의 변화를 반영하는 세포 파라미터가 선택된다. 예를 들어, 치료제가 세포골격 요소를 표적화하는 것으로 공지된 경우, 이러한 작용제와 접촉된 세포는 작용제의 존재 하에 세포 접착의 변화를 나타낼 것으로 예상될 것이다.
다른 실시양태에서, 부착 패턴의 변화는 세포 접착의 변화이다. 일부 경우에, 세포 접착의 변화는 굴절률의 변화 또는 임피던스의 변화에 의해 표시된다. 또 다른 실시양태에서, 부착 패턴의 변화는 기초 형태학의 변화, 세포 밀도의 변화, 또는 세포 크기 또는 세포 형상의 변화이다. 특정 실시양태에서, 기초 형태학의 변화는 세포 극성의 변화이다. 실시양태에서, 세포 신호전달의 감소는 세포골격 조직화의 변화를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 무표지이고 실시간으로 측정될 수 있는 세포 샘플의 분석을 제공한다. 한 실시양태에서, 분석된 세포 샘플은 무표지이고, 생존가능하고, 세포를 고정하기 위한 임의의 처리 대상체가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 키트에서 사용되는 치료제 및/또는 활성화제 작용제는 또한 무표지이다. 현재까지, 무표지 방법은 효과적인 방식으로 치료 효능을 결정하는데 적용되지 않았다.
무표지 검정은 표지 검정의 시간 및 오해의 소지가 있는 합병증을 감소시킴으로써 스크리닝 캠페인의 시간 및 비용을 감소시킬 수 있다. 유전자 발현, 유전자 돌연변이 및 단백질 기능을 식별하고 정량화할 수 있는 검정은 대규모 병렬성을 가능하게 하는 형식으로 수행된다. 수만 내지 수백만 개의 단백질-단백질 또는 DNA-DNA 상호작용은 무표지 검정으로 더 경제적으로 동시에 수행될 수 있다.
다양한 표지된 방법과 대조적으로, 분자 상호작용의 검출을 허용하는 방법은 상대적으로 적고 표지가 없는 세포 기능에 대해서는 훨씬 더 적다. 무표지 검출은 치료제 및 활성화제 작용제의 분자 폴딩, 세포 상의 활성 부위의 차단, 또는 세포 내에 효과적으로 배치될 수 있는 실험에서 모든 분자에 대해 동등하게 기능하는 적절한 표지를 찾을 수 없는 능력에 대한 표지의 효과에 의해 생성된 실험적 불확실성을 제거한다. 무표지 검출 방법은 검정 개발에 필요한 시간 및 노력을 크게 단순화하면서, 담금질, 저장 수명 및 배경 간섭으로부터 실험적 인공물을 제거한다.
표지는 생화학적 및 세포-기반 검정의 주축이다. 표지는 모든 검정 방법의 대부분을 구성하며, 특히 살아있는 인간 세포의 복잡한 동적 활성의 연구의 맥락에서 여러 문제를 극복해야 한다. 방사성 표지의 사용은 다량의 오염된 물질을 생성하고, 그를 사용하는 사람들에게 (세포 수준에서) 피해를 방지하기 위한 규제 방법이 있는 전문화된 시설에서 사용해야 한다. 형광단의 여기/방출 효율은 시간 및 빛에 대한 노출에 의해 저하되어, 정확하고 정밀한 표지의 능력을 감소시키며, 시간적 정보를 수득할 수 없도록 종점 방식으로 한 번만 검정을 판독해야 한다. 모든 표지-기반 검정은 균질하고 균일한 방식으로 표지를 부착하는 프로세스를 개발하고 표지가 선형적으로 정량적일 것이며 측정될 상호작용 또는 프로세스를 방해하거나 영향을 미치지 않을 것이라고 결정하는데 상당한 시간을 필요로 한다. 복합체 혼합물에 표지의 균일한 적용은 프로세스가 자연적으로 진행되는데 필요한 모든 분자의 존재로 인해 복잡하다. 표지의 첨가는 오직 해당 분자 기능의 시각화를 간접적으로 허용하며, 전체 시스템 기능의 시각화를 직접적으로 허용하지 않는다 (즉, 일부 연장된 가정이 필요할 수 있음). 세포 활성은 표지로 정확하게 측정하기가 훨씬 더 어렵다. 유용한 시험은 표지가 세포와 관련하여 올바른 위치에서 올바른 방법으로 올바른 분자에 어떻게 전달되는지 파악하고, 표지가 정상적인 세포 프로세스를 방해하지 않는지 확인해야 한다.
무표지 검출은 일반적으로 생물학적 화합물 또는 바이오엔티티, 예컨대 DNA 분자, 펩티드, 단백질 또는 세포의 일부 물리적 특성을 직접적으로 측정할 수 있는 변환기의 사용을 포함한다. 모든 생화학 분자 및 세포는 센서의 한 유형을 사용하여 이들의 존재 또는 부재, 증가 또는 감소, 및 변형을 나타내는데 사용될 수 있는 부피, 질량, 점탄성, 유전율, 열용량 및 전도도에 대한 유한한 물리적 값을 갖는다. 또한, 살아있는 시스템은 유한한 기간에 걸쳐 이들의 주변환경에서 pH와 같은 측정가능한 변화를 유발하는 O2/CO2 소비/생성, 글루코스 생산/소비, ATP 생산/소비와 같은, 에너지를 제공하고 이들의 생명 과정을 수행하기 위해 분자를 활용한다. 센서는 이들 물리적 특성 중 하나를 측정될 수 있는 정량화가능한 신호, 예컨대 전류 또는 전압으로 변환할 수 있는 변환기로서 기능한다.
일부 경우에, 변환기를 바이오센서로서 사용하기 위해, 변환기의 표면은 원치않는 물질이 부착하는 것을 허용하지 않으면서 특정 물질, 예컨대 단백질 또는 특정 세포 유형을 선택적으로 포획하는 능력을 가져야 한다. 변환기의 표면에 화학 분자의 특정 코팅층의 구축에 의해 선택적 검출 능력이 제공된다. 센서 표면에 부착된 물질은 센서 코팅으로 지칭되는 반면, 검출된 물질은 분석물질이라고 한다. 그러므로, 일부 경우에, 바이오센서는 변환기에 부착된 물질로부터 측정가능한 신호를 생성할 수 있는 변환기, 및 시험 샘플로부터의 표적화된 분석물질에 결합할 수 있는 수용체 리간드를 함유하는 특이적 인식 표면 코팅의 조합이다.
특정 실시양태에서, 코팅은 특정한 세포 구성요소 또는 경로와 연관된 바이오센서에 대해 선택된다. 예를 들어, 세포 생리학적 파라미터가 세포 접착의 변화인 경우에, 바이오센서 표면에 대한 세포 샘플의 세포 접착을 제공하는 코팅이 선택된다. 실시양태에서, 바이오센서에 대한 세포의 접착을 향상시키는 코팅은 세포외 매트릭스, 피브로넥틴, 인테그린 등을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 표면 마커에 기초하여 특정한 세포 유형에 결합하는 코팅이 선택된다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포 표면 마커는 GPCR, 예컨대 리소인지질 GPCR (예를 들어, LPAR 및 S1PR)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 바이오센서는 생체분자 코팅으로 코팅된다. 세포와 접촉하는 CReMS 표면은 세포의 첨가 전, 세포의 첨가 동안, 또는 세포의 첨가 후에 생체분자 코팅을 함유할 수 있다. 코팅 물질은 합성, 천연, 동물 유래, 포유동물일 수 있거나, 또는 센서에 배치된 세포에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체분자 코팅은 인테그린, 애드헤린, 카드헤린 및 다른 세포 접착 분자 및 세포 표면 단백질 (예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, IntercellularCAM, VascularCAM, MAdCAM), 또는 이의 유도체와 결합하는 것으로 공지된 세포외 매트릭스 구성요소를 포함할 수 있거나, 또는 생화학물질, 예컨대 폴리리신 또는 폴리오르니틴을 포함할 수 있으며, 이는 자연 발생 생화학물질 리신 및 오르니틴에 기초한 중합체성 분자이며, 자연 발생 생화학물질, 예컨대 아미노산에 기초한 중합체성 분자는 자연-발생 생화학물질의 이성질체 또는 거울상 이성질체, 특정 세포 표면 단백질을 바이오센서에 부착하도록 설계된 항체, 항체의 단편 또는 펩티드 유도체, 보체 결정 영역 (CDR)을 사용할 수 있다.
생존가능한 세포를 마이크로플레이트에 부착하는 방법은 예를 들어 바이오센서의 표면과 상호작용하도록 설계된 하나의 말단 및 펩티드 상의 관능기와 반응하도록 설계된 또 다른 말단을 갖는 반응성 분자로 센서 마이크로플레이트 표면을 코팅하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 금-코팅 바이오센서를 사용하는 경우, 반응성 분자는 황 원자 또는 바이오센서 표면과 화학적으로 상호작용하도록 설계된 다른 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 분자의 다른 말단은 예를 들어 펩티드의 아미드 또는 카르복시 기와 특이적으로 반응할 수 있다.
생존가능한 세포 (예를 들어, 1차 세포)를 바이오센서 표면에 부착하는 방법은 또한 PCT 출원 번호 PCT/US2016/0579023에 자세히 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 예에서, 바이오센서 표면은 반데르발스 힘, 수소 결합, 정전기 인력, 소수성 상호작용, 또는 이들의 임의의 조합, 예컨대 단백질에 적용하기 위해 사용할 수 있는 관련 기술분야에서 실시되는 것을 통해 접착하는 분자로 코팅될 수 있다. 세포외 매트릭스 (ECM) 분자는 또한 제1 표면 분자 코팅에 첨가될 수 있다. 문헌 [Humphries 2006 Integrin Ligands at a Glance. Journal of Cell Science 119 (19) p3901-03]에는 본 발명에 유용한 접착 분자가 기재되어 있다. 특정 세포 접착 분자와 접촉하는데 사용될 수 있는 추가 ECM 분자는 문헌 [Takada et al., Genome Biology 8:215 (2007)]의 표 1에 기재된 것들을 포함한다. 이 예는 세포-ECM 및 세포-세포 접착에 관여하는 인테그린에 대한 것이다. 많은 다른 접착 분자가 생리학적 제어 및 반응과 관련된 특성을 갖는 것으로 설명되었다 (하기 표 2 참조).
표 2:
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추가 코팅은 본원에 기재된 방법을 수행할 목적으로 환자 세포를 바이오센서에 매우 근접하게 하기 위해 환자 세포 표면 단백질에 대해 친화성을 갖는 것으로 공지된 항체 또는 다른 단백질을 포함할 수 있다. 환자 세포가 원하는 방식으로 마이크로플레이트에 부착되었는지 확증하는 것이 또한 유익할 수 있다. 특정 바이오센서 코팅은 센서 코팅을 특정 세포 경로에 연결함으로써 특정 환자 세포 유형 및 활성화 및 치료제에 대한 세포 신호전달 반응으로부터의 특정 세포 신호를 향상, 개선, 명확화, 분리 또는 검출하는데 추가로 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Hynes, Integrins, Cell, 110:673-687 (2002)] 참조). 바이오센서는 세포를 씨딩할 구역을 포함한다. 예를 들어, 바이오센서는 세포를 씨딩할 웰을 함유하는 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 세포 샘플은 별개의 위치에서 표면에 대한 물리적 흡착에 의해 바이오센서에 씨딩될 수 있다. 바이오센서는 1, 10, 24, 48, 96, 384개 또는 그 이상의 별개의 위치를 포함할 수 있다. 세포 샘플은 약 100 내지 약 100,000개 개별 세포 또는 그 사이의 임의의 세포 수를 포함할 수 있다. 최적의 세포 샘플은 바이오센서 상의 별개의 위치의 크기 및 성질에 의존한다. 세포 샘플은 약 5000개 이하의 세포; 약 10,000개 이하의 세포; 약 15,000개 이하의 세포; 약 20,000개 이하의 세포; 약 25,000개 이하의 세포; 또는 약 50,000개 이하의 세포를 포함할 수 있다. 세포 샘플은 약 1000 내지 약 2500개 세포; 약 1000 내지 약 5000개 세포; 5000 내지 약 10,000개 세포; 약 5000 내지 약 15,000개 세포; 약 5000 내지 약 25,000개 세포; 약 1000 내지 약 10,000개 세포; 약 1000 내지 약 50,000개 세포; 및 약 5000 내지 약 50,000개 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 반응 또는 생리학적 파라미터의 변화는 정의된 기간에 걸쳐 측정된다. 다른 실시양태에서, 정의된 기간은 생리학적 파라미터의 출력의 변화가 20% 이하만큼 변하는 정상 상태에 대조군 세포가 도달하는데 걸리는 시간의 양이다. 다른 실시양태에서, 변화는 1시간 이하에서 세포에서 관찰된다. 다른 실시양태에서, 변화는 적어도 1분 내지 약 60분 동안 및 그 사이의 모든 분에 세포에서 관찰된다. 다른 실시양태에서, 세포 반응의 변화는 약 10분 내지 약 1주 또는 200시간 동안 측정된다. 다른 실시양태에서, 치료제가 세포 경로로 표적화되는 경우, 세포 반응은 약 10분 내지 약 5시간, 약 10분 내지 약 4시간, 약 10분 내지 약 3시간, 약 10분 내지 약 2시간, 약 10분 내지 약 1시간, 또는 약 10분 내지 약 30분 또는 그 사이의 임의의 시점에 측정된다. 다른 실시양태에서, 치료제가 세포 증식 또는 세포 사멸 또는 세포 저항에 영향을 미치는 경우, 세포 반응은 약 1시간 내지 약 200시간 동안 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 1분 내지 200시간 사이의 반응의 조합 (그렇지 않으면 완전한 시간적 패턴으로 기술됨)은 세포에 대한 화합물의 치료 효과 및 내성을 발달시키는 세포 능력을 결정하는데 사용된다. 이 기간은 환자에서 가능한 반응 및 그의 유지를 평가하는데 중요한 단기간 경로 신호전달, 동적 재프로그램화 및 장기간 세포 반응의 중요한 프로세스를 포함한다.
특정한 대상체의 세포가 바이오센서에 씨딩되면, 기준선 측정이 결정될 수 있다. 기준선 측정은 동일한 세포 샘플 또는 대조군 세포 샘플에서 수행될 수 있다. 대조군 샘플은 동일한 환자 및/또는 동일한 조직으로부터의 건강한 세포 또는 이환된 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플은 GPCR 효능제, RAS 노드 또는 RTK 억제제, 또는 RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제를 받지 않은 이환된 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플은 GPCR 효능제에 반응하는 것으로 공지된 질환 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 대조군 샘플은 GPCR 효능제에 반응하지 않는 것으로 공지된 질환 세포를 포함한다. 대조군 샘플은 세포 건강, 세포 대사, 또는 세포 경로 활성과 관련된 표준화된 반응을 유도하도록 설계된 특정한 환자의 건강한 또는 이환된 세포에 효능제의 적용을 포함할 수 있다.
대조군은 각 질환 및/또는 약물 유형에 대해 결정될 것이다. 한 실시양태에서, 이는 동일한 환자로부터의 건강한 세포 대조군에 대한 비교 또는 비-이환된 환자의 풀에 대한 결과에 대한 비교 (예를 들어, 정상적인 참조 범위)를 포함한다. 예를 들어, 세포 사멸 약물의 경우, 방법은 유의한 치료 지수를 달성하기 위해 건강한 세포보다 질환 세포를 사멸시키는 이점을 보여줄 것이다. 다른 실시양태는 경로 기능 및 약물에 의한 제어를 결정하기 위한 경로 도구의 사용을 포함한다. 표적화된 치료제의 경우, 도구는 경로를 교란하고 활성화를 파괴하는 표적화된 약물의 능력을 결정하기 위한 대조군으로 사용되는 활성화제 작용제 (예를 들어, 활성화제 작용제), 생물시약 또는 소분자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포에 대한 약물의 생리학적 효과는 예를 들어 산소 소비의 시간적 패턴 또는 속도, 산성화의 속도 또는 시간적 패턴, 이온 플럭스, 또는 대사물 전환을 나타내는 활성화제 작용제에 의한 외인성 교란 없이 측정된다.
특정한 실시양태에서, 바이오센서 신호는 연속적인 시간 경과에 걸쳐 측정된다. 시간 대 바이오센서 신호 플롯에는 약물 치료에 대한 환자 세포 반응을 나타내는 독특한 패턴이 있다. 이들 패턴의 평가는 효능있는 사건의 존재를 식별하는데 유용하다. 살아있는 세포 및 완전히 기능적인 세포의 시간 경과 또는 지속적으로 변화하는 측정은 특정 시점만을 나타내는 전형적인 전체 세포 검정에 사용되는 현재 관행보다 더 유익하다. 본원에 기재된 방법은 환자에서 발생할 때 동적 시스템을 측정하고 환자 반응을 결정하는 가장 정확한 수단을 나타낸다. 경로 반응의 경우, 전체 시간 경과 또는 시간적 패턴을 기록하는 것이 보다 복잡한 분석을 지원하는 능력이 우수하고, 단일 측정을 위한 최적 시점을 선택하지 않아도 된다.
대조군과의 비교는 시간적 최대, 최소 또는 최대 신호-최소 신호 간의 차이로 발생하거나, 또는 양성 또는 음성 대조군 웰에 대한 시험 웰의 시간 경과 플롯 또는 다른 비선형 비교 (예를 들어, 차이 벡터의 합산)를 위해 곡선 아래 통합 면적 (AUC)을 비교함으로써 또는 동일한 환자 생존가능한 이환된 세포에 대한 교란된 및 교란되지 않은 웰의 비교에 의해 발생할 수 있다. 오직 바이오센서로 측정함으로써 지원되는 추가 분석은 최대/최소에 도달하는 시간 및 시간적 시간 경과의 다른 도함수이다. 장기간 반응의 경우, 비교 시간은 치료 또는 약물의 다중 적용 후 며칠 또는 일주일 후의 특정 시점일 수 있다. 더 긴 시간 경과는 또한 약물 치료의 일주일의 시작, 중간 또는 끝에서 기울기의 변화를 비교하거나 시간 대 바이오센서 신호 플롯의 2차 도함수를 비교할 수 있다. 대조군과 비교하여 유의한 변화는 세포 대사의 축소와 관련된 바이오센서 신호의 절대적 강하를 포함할 수 있다. 대안적으로, 강하에 이어서, 검정 동안 약물에 대한 내성의 발달을 나타낼 수 있는 증가가 뒤따를 수 있다. 또한, 비선형 유클리드 분석은 전체 시간 경과에 걸쳐 대조군 및 환자 샘플 간의 총 차이의 측정치를 생성하는데 사용될 수 있다. 이는 또한 환자의 결과를 예측하는 것과 관련하여 중요할 것이다.
특정 실시양태에서, 정의된 기간에 걸친 바이오센서의 출력은 세포 인덱스로 표시된다. 세포 인덱스는 시험 시작점으로부터의 임피던스의 변화이다. 세포 인덱스는 임피던스의 측정으로서 정의되며, 예를 들어 10 kHz의 고정된 전기적 주파수 및 고정된 전압에서 측정함으로써 본 발명의 한 예에 적용될 수 있다.
그리고, 방정식 세포 인덱스i = (Rtn - Rt0)/F에 의해 계산된다:
여기서:
i = 1, 2 또는 3 시점
F = 기구가 10kHz 주파수에서 작동될 때 한 예에서 15옴
Rt0은 시점 T0에서 측정된 배경 저항이다.
Rtn은 세포 첨가, 세포 생리학적 변화 또는 세포 교란 후 시점 Tn에서 측정된 저항이다.
세포 인덱스는 세포 상태를 나타내기 위해 측정된 전기적 임피던스의 상대적 변화로서 유도된 무차원 파라미터이다. 세포가 존재하지 않거나 전극에 잘 접착되지 않은 경우 CI는 0이다. 동일한 생리학적 상태 하에 더 많은 세포가 전극에 부착된 경우 CI 값이 더 크다. 따라서, CI는 웰에 존재하는 세포 수의 정량적 측정치이다. 또한, 세포 형태학, 기저, 안정적 또는 휴지 상태, 세포 접착, 또는 세포 생존력의 변화를 포함하는 세포 생리학적 상태의 변화는 CI의 변화로 이어질 것이다.
세포 인덱스는 시작점 또는 기준선 임피던스 측정에 기초한 존재, 밀도, 부착 또는 이의 변화의 정량적 측정이다. 기준선 시작점 임피던스는 물리적 관찰가능한 특징이며, 약물 또는 다른 활성화제를 사용하는 임의의 치료 전에 세포의 건강, 생존력 및 생리학적 상태를 나타낸다. 기준선 시작점은 CELx 시험에 대한 정성적 대조군으로서 사용될 수 있다. 약물 또는 활성화제의 첨가는 세포가 경험하는 세포 생리학적 변화의 특이성을 반영하는 시간적 패턴에서 임피던스를 변화시킨다. 세포 생리학적 상태, 예를 들어 세포 형태학, 세포 수, 세포 밀도, 세포 접착, 또는 세포 생존력의 변화는 세포 인덱스의 변화로 이어질 것이다.
생리학적 반응 파라미터는 세포 주기 분석을 추가로 포함할 수 있으며, 기능 및 기능장애 경로와 연관된 환자 세포의 형광 염료 접합된 또는 비접합된 또는 다른 비색 변화와 같은 임의의 수의 화학적 바이오센서를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 비접합된 염료를 사용하는 세포 집단에 대한 세포 주기의 변화는 DNA에 인터칼레이션하고 DNA 양의 변화를 평가함으로써 G0, G1, S, G2, Gm 성장 및 복제 단계를 통한 세포 주기와 상관관계가 있는 것으로 공지된 아이오딘화프로피듐 또는 유사한 염료로 정량화될 수 있다. 한 가지 염료 유형인 아이오딘화프로피듐의 경우, G2/M 단계의 세포의 형광은 G0/G1 단계의 세포의 형광보다 2배 높을 것이다. 아이오딘화프로피듐은 또한 RNA에 인터칼레이션할 수 있으며, 종종 리보뉴클레아제가 RNA와 비교하여 DNA로부터 형광 신호를 구별하는데 사용된다. 예는 또한 세포 주기 체크 포인트에 연결된 특정한 단백질에 특이적인 염료를 포함하고, 추가 세포 주기 상태 측정을 제공한다. 이들 측정을 수행하는데 유용하지만 여기에 나열된 것에 제한되지는 않는 일반적인 기구는 형광 현미경법, 공초점 레이저 스캐닝 현미경법, 유동 세포계측법, 형광측정법, 형광 편광, 균질 시간 분해 형광, 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)이다.
비접합된 염료는 대사적 파라미터, 예컨대 동화작용, 이화작용, 소분자 합성 및 생성, 전환 및 호흡을 측정하면서 세포 또는 경로의 생리학적 상태의 화학적 바이오센서로서 본 발명에서 활용될 수 있다. 바르부르크(Warburg) 효과라고 명명된 널리 공지된 세포 생리학적 반응은 종양 및 다른 이환된 세포에서 에너지 생성을 위한 산화적 인산화에서 락테이트 생산으로의 이동을 설명하며, 핵심 신호전달 경로, 종양유전자 및 종양 서프레서는 여기에 기재된 임의의 화학적 바이오센서 방법에 의해 또는 광전자 바이오센서에 의해 측정될 수 있다. 세포 반응에서 세포의 산소 소비 또는 호흡 및 해당작용은 양성자를 생성하고, 용존 산소 및 유리 양성자의 농도 또는 산도에 빠르고 쉽게 측정가능한 변화를 유발한다.
화학적 바이오센서를 활용하는 생리학적 반응 파라미터의 추가적이지만 제한적이지 않은 예는 대사적 활성 및 비활성 세포 기능의 지표인 존재하는 ATP의 정량 (예를 들어, 셀타이터글로(CellTiterGlo) 및 유사한 루시페라제 구동된 검정)에 기초하여 배양 중인 세포에 의해 활용되는 ATP의 양이다.
생체분자 폴딩 및 기능에 중요한 칼슘, 마그네슘 및 다른 하전된 이온은 생리학적 반응으로 인해 유동적이다. 이들은 또한 화학적 바이오센서, 예컨대 Cal-520, 오리건 그린 BAPTA-1, fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, 칼슘 그린-1, 및 특정 이온 착화 및 측정을 위한 다른 EGTA 또는 EDTA-유사 화학에 의해 측정될 수 있다. 이들 생리학적 반응 파라미터는 많은 유형의 비접합된 반응성 또는 결합 염료 또는 다른 전자 또는 분광 수단을 사용하여 측정될 수 있다. 이들 방법 중 다수는 세포를 비파괴적으로 배열하여 동일한 세포 집단의 생리학적 기능을 시간 경과에 따라 반복적으로 연속적으로 측정할 수 있도록 할 수 있다.
천연 세포 단백질 결합 리간드에 부착되거나 면역입자 (항체 또는 항체의 단편 또는 고특이성 고친화성 합성 분자, 예컨대 압타머)에 부착된 것과 같은 접합된 염료, 또는 핵산 중합체 혼성화 프로브는 단백질, 특정 경로 구성원 분자, 다양한 세포 구획 내의 DNA 및/또는 RNA, 유전체학, 및 단백질체학과 관련된 생리학적 반응 파라미터를 측정하는데 사용될 수 있으며, 특이적 번역 후 변형 및 메커니즘을 측정할 수 있다. 세포 제어의 번역 후 변형 및 후성 유전적 수단은 리보자임, 키나제, 포스파타제, 유비퀴티나제, 데유비퀴티나제, 메틸라제, 데메틸라제, 및 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 경로 기능을 수행하는 다수의 효소에 의한 조절을 포함할 수 있다. 죽은 세포의 포르말린 고정된 파라핀 탑재된 샘플을 염색하기 위해 사용되는 이들 분자의 예는 문헌 [DAKO Immunohistochemical Staining Methods Education Guide - Sixth Edition or at Cell Signaling Technology tutorials and application guides http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=tutorials-and-application-guides]에서 찾을 수 있다. 이들 두 가지 예는 살아있는 세포 반응을 측정하기 위해 본 발명에서 훨씬 더 유용할 수 있다. 이 측정을 수행하는데 유용하지만 이들 방법에 제한되지는 않는 일반적인 도구는 형광 현미경법, 공초점 레이저 스캐닝 현미경법, 유동 세포계측법, 형광측정법, 균질 시간 분해 형광, 형광 편광, 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)이다.
접합된 및 비접합된 염료의 조합은 또한 세포의 생리학적 반응을 측정하기 위해 본 발명에 의해 사용될 수 있다. 활성화 후, 생리학적 반응을 제어하는 역할을 하는 수용체의 한 유형은 GPCR이다. 이들은 두 가지 신호전달 경로를 통해 정보를 전달하고 세포를 제어한다: 2차 메신저 cAMP 수준의 변화, 또는 2차 메신저 이노시톨 (1, 4, 5) 트리포스페이트 (IP3)에 의해 유리되는 세포내 Ca2+ 수준의 변화. cAMP 검출은 예를 들어 크립테이트-표지된 항-cAMP 항체 (또는 다른 면역포획 분자) 및 GPCR 반응 및 후속 항체 결합에 대해 세포 cAMP와 경쟁하는 d2-표지된 cAMP를 사용하는 경쟁적 면역검정에 기초할 수 있다. 특정 신호 (즉, 에너지 전달)는 표준 또는 샘플의 cAMP 농도에 반비례한다.
mRNA, RNAi, 마이크로RNA 및 생리학적 기능을 갖는 다른 RNA를 정량화함으로써 생리학적 반응을 측정하는 것은 전사 수준에서 세포 변화의 활성화를 결정하기 위해 본 발명의 실시와 함께 사용되는 매우 민감한 방법일 수 있다. RNA는 예를 들어 rtPCR, qPCR, 선택적 서열 프로빙, 선택적 서열 포획, 및 서열 혼성화 방법 (모두 화학적 센서를 사용함)을 사용하여 정량화될 수 있지만 여기에 나열된 것들에 제한되지는 않는다.
면역-포획 및 혼성화 방법은 비드 기반 방법, 예컨대 루미넥스(Luminex) 또는 광섬유 팁 기술, 예컨대 일루미나(Illumina) 또는 단백질, DNA, RNA, 또는 특정 포획 시약이 고체 표면에 고정된 다른 혼성화 마이크로어레이 기술 (세포로부터 생리학적 반응 분자(들)를 찾아내고 단리하고 정확하게 측정하는데 사용됨)을 사용하는 것을 포함한다. 이들 방법은 단일 실험에서 다수의 반응 파라미터를 측정하는 이점을 제공한다.
세포 반응 또는 생리학적 파라미터의 변화는 기준선 측정과 비교하여 결정된다. 세포 파라미터 또는 생리학적 반응의 변화는 CReMS의 유형에 의존한다. 예를 들어, 세포 반응의 변화가 광학적으로 결정되는 경우, 물리적으로 관찰가능한 변화는 예를 들어 화학적 흡광도 또는 투과도, 표면 플라즈몬 측정 디바이스의 변화, 또는 광자 결정 디바이스에 의해 검출된 변화에 대한 스펙트럼 파장에서의 광학 밀도의 함수로서 측정될 수 있다. 세포 파라미터 또는 생리학적 반응의 변화가 전기적으로 결정되는 경우, 물리적으로 관찰가능한 변화는 예를 들어 전극에 접착된 세포의 밀리 또는 마이크로 임피던스 변화를 사용하여 측정될 수 있다. pH, 글루코스, 이산화탄소 또는 이온의 변화는 이온 선택적 전계 효과 트랜지스터 (ISFET)를 사용하여 전자적으로 측정될 수 있다.
다른 실시양태에서, 변화율은 치료제에 대한 세포 생리학적 반응의 차이를 결정하는데 필요한 기간 동안 CReMS 반응을 측정하는 방법에 의해 결정된다. 변화율은 시간 경과 데이터의 다양한 해석에 의해 설명되며, 비율 또는 비율의 가속화를 포함하는 비율의 추가 미분 함수로 표현될 수 있다.
환자의 생리학적 상태를 측정하는 시험은 그 이상 및 이하에서 환자가 상이한 임상 결과를 경험할 것으로 예측되는 하나 이상의 컷오프 값을 유도할 수 있다. 실시양태에서, 세포 반응의 변화를 결정하기 위한 하나 이상의 컷오프 값은 하기를 포함하는 방법에 의해 결정된다: 표준 편차, 신호 대 노이즈 비율, 표준 오차, 분산 분석, 또는 공지된 반응하는 세포 샘플로부터의 샘플 세트 및 공지된 비반응하는 환자로부터의 샘플 세트의 통계적 유의성에 대한 적절한 신뢰 구간을 결정하기 위한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 통계적 시험 값을 결정하는 단계; 및 둘 사이의 차이를 결정하고 두 그룹에 대한 신뢰 구간 사이의 컷오프 값을 설정하는 단계. 추가 실시양태는 이환되지 않은 것으로 공지된 환자로부터의 CReMS 반응에 의해 정의된 정상적인 참조 범위로부터 결정된 컷오프를 활용한다. 이 실시양태에서, 단일 환자 질환 물질 시험 결과는 본 발명의 다른 곳에서 추가로 기재된 바와 같은 교란된 및 교란되지 않은 생존가능한 암 세포 결과를 비-이환된 참조 범위 구간과 비교함으로써 보고된다.
정상적인 (건강한) 참조 범위 시험 결과는 건강한 대상체로부터의 정상적인 조직을 사용하여 연구를 수행함으로써 "정상적인" 경로 활성이 무엇인지를 확립한다. 그 후, 시험 결과는 이환된 경로를 가질 것으로 예상되지 않는 임의의 환자 (예를 들어, 바이오마커 음성 환자)가 정상적인 참조 구간 연구로부터 유도된 값과 비교할 때 실제로 비정상적인 경로 활성을 갖는지 여부를 평가한다. 본 발명의 결과는 또한 바이오마커 음성인 환자가 비정상적이면서 또한 바이오마커 양성 환자의 경로 활성에 필적하는 경로 활성을 갖는지를 확인하기 위해 현재 질환으로 진단된 대상체 (바이오마커 양성 환자)로부터 이루어진 측정에 대해 바이오마커-음성 환자로부터 관찰된 비정상적인 측정에 대해 비교된다. 그러므로, 현재 경로 활성을 파괴하도록 의도된 요법을 받고 이로부터 이익을 받고 있는 환자의 경로 활성에 필적하는 비정상적인 경로 활성을 갖는 환자는 경로 질환을 갖는 것으로 진단될 것이며, 그러므로 경로 활성 (예를 들어, GPCR 신호전달 경로 활성)을 파괴하기 위해 바이오마커 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 억제제)를 표적화하는 약물로 치료되어야 한다.
그러므로, 본 발명은 의사가 이환된 경로의 기능적 활성에 기초하여 질환을 진단하는 보다 정밀한 수단을 생성하는 것을 가능하게 한다. 이는 원인 모델이 아닌 상관관계에 의존하는 단일 바이오마커를 측정할 때 취한 접근법과 대조적이다. 현재 바이오마커 접근법은 높은 백분율의 허위 음성 및 허위 양성 결과를 초래할 수 있다. 본 발명은 허위 결과의 백분율을 감소시킬 것이다.
바람직한 실시양태는 80-90% 신뢰 구간을 포함하고, 보다 바람직한 실시양태는 >90% 신뢰 구간을 포함하고, 가장 바람직한 실시양태는 >95% 또는 >99% 신뢰 구간을 포함한다.
일부 실시양태에서, 컷오프 값은 컷오프 값을 사용하여 맹검 공지된 샘플의 상태를 반응자 또는 비반응자로서 결정하고, 샘플을 맹검 해제하고, 샘플의 예측 상태의 정확도를 결정함으로써 검증된다. 단일 컷오프 값의 경우, 컷오프 값 아래로 떨어지거나 공지된 반응자에 대한 출력 값에 더 가까운 출력 값은 환자 샘플이 치료제에 대한 반응성을 나타내고 있음을 나타낸다. 출력 값이 컷오프 출력 값 이상이거나 공지된 비반응자 출력 값에 대한 출력 값에 더 가까운 경우, 세포 샘플은 치료제에 대한 비반응자로서 식별된다. 일부 실시양태에서, 정의된 기간에서 바이오센서의 출력 값은 무반응, 약한 반응성 또는 반응성으로 분류된다.
바람직한 실시양태에서, 컷오프 값은 컷오프 값을 사용하여 맹검 공지된 샘플의 상태를 질환 경로 반응을 갖는 것으로 (예를 들어, 비정상적인 GPCR 신호전달을 갖는 암 환자) 또는 질환 경로 반응을 갖지 않는 것으로 (예를 들어, 정상적인 GPCR 신호전달을 갖는 암 환자) 결정하고, 샘플을 맹검 해제하고, 샘플의 예측 상태의 정확도를 결정함으로써 검증된다. 단일 컷오프 값의 경우, 컷오프 값 아래로 떨어지거나 질환 경로 반응을 갖지 않는 샘플의 출력 값에 더 가까운 출력 값은 환자 샘플이 경로 질환을 나타내지 않고 있음을 나타낸다. 출력 값이 컷오프 값 이상이거나 공지된 이환된 경로 샘플 값에 대한 출력 값에 더 가까운 경우, 세포 샘플은 이환된 경로 존재로서 식별된다. 일부 실시양태에서, 정의된 기간에서 바이오센서의 출력 값은 경로 질환이 존재하지 않음, 경로 질환이 결정되지 않음, 또는 경로 질환이 존재함으로서 분류된다.
출력을 범주로 분류하기 위해 정의된 기간에서의 출력 값이 선택된다. 다른 실시양태에서, 정의된 기간은 세포가 바이오센서에서 연속적으로 모니터링된 기간의 종점이다. 다른 실시양태에서, 시간 기간은 적어도 60분, 120분, 180분, 240분, 300분, 10시간, 24시간, 60시간, 또는 120시간이다. 바람직한 실시양태에서 정의된 기간에서의 출력은 30분 내지 10시간이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 정의된 기간에서의 출력은 180분 내지 600분 또는 240분이다.
다른 실시양태에서, 무작위로 선택된 암 환자 집단의 암 세포는 본원에 기재된 방법을 사용하여 시험된다. 암 환자 집단으로부터 수득된 암 세포는 광범위한 신호전달 활성 수준 또는 출력 값을 나타낼 것으로 예상된다. 신호전달 활성 수준 또는 출력 값의 집단 분포를 특징화하기 위해, 통계적 분석 소프트웨어 (예를 들어, 믹스툴스(mixtools), 유한 혼합 모델 분석용 R 패키지)를 사용한 개별 출력 값의 유한 혼합 모델 분석 또는 다른 통계적 분석이 수행된다. 분석된 암 환자 집단 내에서 2개 이상의 그룹이 식별되는 경우, 한 그룹의 평균 출력 값과 제2 또는 다른 그룹의 평균 출력 값 사이의 컷오프 값이 선택된다.
실시양태에서, 무반응으로 분류된 출력 값은 치료제의 투여 전의 기준선 또는 치료제로 처리되지 않은 대조군 세포의 출력 값과 적어도 20% 이하 또는 그 미만, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하만큼 차이가 나는 출력 값에 의해 표시된다.
다른 실시양태에서, 약한 반응성으로 분류된 출력 값은 치료제의 투여 전의 기준선 또는 치료제로 처리되지 않은 대조군 세포의 출력 값과 적어도 50% 이하 및 5% 초과만큼 차이가 나는 출력 값에 의해 표시된다. 다른 실시양태에서, 반응성으로 분류된 출력 값 백분율은 치료제의 투여 전의 기준선 또는 치료제로 처리되지 않은 대조군 세포와 적어도 50% 초과만큼 차이가 나는 출력 값에 의해 표시된다. 실시양태에서, 대조군 샘플은 동일한 대상체 및 치료제로 치료되지 않은 대상체로부터의 질환 세포의 샘플이다.
본원에 기재된 방법의 추가 측면은 개별 대상체에서 치료제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 신호전달의 억제제)의 효능을 예측하는데 사용될 수 있는 알고리즘을 개발하는 것을 포함한다. 알고리즘은 개별 대상체의 건강 측면을 정의하는 하나 이상의 환자 특징에 할당된 값과 조합하여 본원에 기재된 방법을 사용하여 유도된 값을 혼입한다. 환자 특징은 전이의 존재, 전이의 위치, 노드 상태, 암의 초기 진단부터 전이의 진단까지의 무질환 기간, 아주반트 화학요법의 수용, 다른 약물 요법의 수용, 방사선 요법의 수용, 질환의 우세 부위, 종양 덩어리 크기, 체질량 지수, 압통 관절 수, 종창 관절 수, 통증, 장애 지수, 의사 종합 평가, 환자 종합 평가, 목욕 강직성 척추염 기능 지수, 목욕 강직성 척추염 질환 활성 지수, 목욕 강직성 척추염 계량학 지수, C-반응성 단백질, 전체 요통, 염증, 유전적 상태, 다른 질병의 이력, 다른 중요한 건강 통계 상태, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 값을 혼입하는 알고리즘은 치료제가 치료하도록 의도된 질환을 갖는 환자 집단에서 질환 진행과의 이들의 상관관계에 따라 이들 값에 가중치를 부여할 것이다. 차등적 반응과의 어떠한 상관관계도 나타내지 않은 질환 특징은 알고리즘에 포함되지 않을 것이다.
한 실시양태에서, 환자 특징을 나타내는 수치 값은 시험 결과 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 표적화된 치료제, GPCR 신호전달의 효능제, 표적화된 치료제 및 효능제의 조합 등에 대한 반응성을 결정하는 방법으로부터 유도된 값)의 회귀 분석, 환자 특징, 및 연구된 환자 그룹의 임상 결과로부터 유도될 수 있다. 한 예에서, 환자 특징 데이터에 기초하여 변수와 조합하여 시험 결과를 사용하는 알고리즘의 최적화는 시험 출력 값을 0.10에서 시작하여 너비 0.10의 균일한 간격의 컷-포인트 9개에 기초하여 10개의 간격으로 나누어 수행될 수 있다. 각 컷-포인트에 대해, 대상체가 컷-포인트 이하의 알고리즘 값을 갖는 경우 값 "1"을 취하고 그렇지 않으면 "0"을 취하는 지표 변수를 사용하여 콕스 회귀를 실행할 수 있다. 컷오프 초과의 것에 대한 컷오프 이하의 것의 비교인 위험 비율이 각 컷-포인트에 대해 결정될 것이다. 그 후, 추정된 위험 비율을 최소화하는 컷-포인트의 값이 선택된다.
예를 들어, 환자의 총 종양 질량이 특정 값을 초과하는 경우, 본원에 기재된 방법에 의해 결정된 바와 같이 약물에 대한 이들의 반응성은 약물에 반응적이 아닌 환자에서 발견되는 환자의 잠재적인 무진행 기간을 중앙값 결과 이상으로 연장하기에 충분하지 않을 것임을 발견할 수 있다. 시험 결과가 약물이 환자에서 기능적이며 그렇지 않으면 그로부터 이익을 받을 것으로 예상되는 것을 나타내는 경우, 환자 특징 변수를 포함하는 알고리즘은 종양 질량 변수가 시험 결과 값을 상쇄하기 때문에 결과가 불확정적이라고 보고할 것이다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 측면은 표적화된 치료제에 반응할 가능성이 있거나 반응하지 않을 가능성이 있는 환자를 식별하는 시험에 대한 컷오프 값을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 하기를 포함한다: a) 각각이 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제를 처방받은 환자 그룹을 선택하는 단계, b) 환자 그룹 내에서 각 대상체에 대한 시험 값을 유도하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하는 단계, c) 시험된 총 환자의 유의한 백분율이 미리 정의된 임상적 종점에 도달하기에 충분한 기간에 걸쳐 시험된 환자 그룹의 각 구성원의 건강 상태를 관찰하고 각 환자가 미리 정의된 임상적 종점에 도달하는데 필요한 시간 길이 (도달한 경우)를 기록하는 단계, d) 값이 서로 등거리인 2개 이상의 후보 컷오프 값을 식별하며, 여기서 각 후보 컷오프 값은 그 미만에서 환자가 반응하거나 반응하지 않을 것으로 예측되고 그 초과에서 환자는 스코어가 컷오프 값 아래로 떨어진 환자와 반대 방식으로 반응할 것으로 예측되는 값을 나타내는 것인 단계, e) 통계적 방법을 사용하여 시험 값이 컷오프 이하인 환자에 대한 임상적 종점 기간 및 시험 값이 컷오프 초과인 환자에 대한 임상적 종점 기간 간의 차이를 분석하는 단계, 및 f) 컷오프 값 초과 및 미만인 환자 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 있음을 나타내는 후보 컷오프 값의 그룹 중에서 요법에 반응하지 않을 것으로 예측되는 환자의 가장 큰 백분율을 초래하는 컷오프 값을 선택하는 단계.
본원에 기재된 방법을 사용하여, 세포가 동일한 치료제로 시험된 동일한 질환을 갖는 다른 개체로부터 유도된 시험 값과 비교될 수 있는 개별 대상체에 대한 수치적 시험 결과 값을 유도하는 것이 가능하다. 이는 하기에 의해 개별 대상체에 대한 치료제의 효능을 예측하는 것을 가능하게 한다: a) 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제로 시험된 개별 대상체 그룹에 대한 시험 결과 값을 기록하는 단계, b) 해당 값을 목록으로 컴파일링하는 단계, c) 각 개별 대상체의 절대 수치적 시험 값을 기준으로 시험된 개별 대상체에 대한 시험 결과 값을 기준으로 목록의 순서를 정하는 단계, 및 d) 개별 대상체의 시험 값의 백분위수 순위를 결정하며, 여기서 개별 대상체의 시험 값의 백분위수 순위는 개별 대상체에서 질환에 대한 치료제의 효능을 예측하는 것인 단계.
또 다른 실시양태는 특정한 결과의 백분위수 순위결정을 추정하기 위해 동일한 요법의 효능을 시험하는 임상 시험으로부터 수득된 결과를 분석한 후, 개별 대상체의 시험 값에 대한 백분위수 순위를 식별하고, 동일한 백분위수 순위결정에 상응하는 임상 시험 종점 결과를 식별하는 것을 포함하며, 여기서 개별 대상체의 시험 값과 동일한 백분위수 순위결정에서 임상 시험 종점 결과는 개별 대상체가 질환에 대한 치료제로부터 수득할 가능성이 있는 임상 결과를 예측한다. 임상 시험 종점은 예를 들어 진행까지의 기간, 무진행 생존 기간, 전체 생존 기간, 객관적 반응 기간, ACR 반응, 총 샤프 스코어의 변화, 미란 스코어, 및 관절 공간 협착, 임상적 반응, 통증, 장애 지수, 임상적 관해, 체표면적 침범, 의사 종합 평가, 및 건선 구역 및 중증도 지수를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태는 본원에 기재된 방법으로부터 유도된 시험 결과 값 및 시험된 치료제를 받은 개체에 대한 임상 결과 간의 통계적 상관관계를 결정하는 방법을 포함한다. 이 방법은 하기를 포함한다: a) 각각이 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제를 처방받은 환자 그룹을 선택하는 단계, b) 개체에 대한 시험 결과 값을 유도하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하는 단계, c) 동일한 질환을 갖고 동일한 치료제로 시험된 환자 그룹 내의 각 대상체에 대한 시험 결과 값의 목록을 컴파일링하는 단계, d) 시험된 총 환자의 유의한 백분율이 미리 정의된 임상적 종점에 도달하기에 충분한 기간에 걸쳐 시험된 환자 그룹의 각 구성원의 건강 상태를 관찰하는 단계, e) 각 환자가 미리 정의된 임상적 종점에 도달하는데 필요한 시간 길이 (도달한 경우)를 기록하는 단계, 및 f) 종점 결과 및 시험 값 간의 통계적 관계를 결정하는 방식으로 종점 데이터 (예를 들어, 진행까지의 기간, 무진행 생존, ACR 반응)를 분석하는 단계.
예로서, 임상 시험으로부터의 결과가 이용가능하면, 컷오프 값 ("C*")의 추정치의 결정은 하기와 같이 진행된다. 콕스 회귀 시험이 시험 값이 환자 결과, 예컨대 진행까지의 시간 (TTP)을 예측한다는 것을 나타낸다고 가정하면, 시험 값은 0.10에서 시작하여 너비 0.10의 균일한 간격의 컷-포인트 9개에 기초하여 10개의 간격으로 나눌 것이다. 각 컷-포인트에 대해, 대상체가 컷-포인트 이하의 검정 값을 갖는 경우 값 "1"을 취하고 그렇지 않으면 "0"을 취하는 지표 변수를 사용하여 콕스 회귀를 실행할 것이다. 컷오프 초과의 것에 대한 컷오프 이하의 것의 비교인 위험 비율이 각 컷-포인트에 대해 결정될 것이다. 추정된 위험 비율을 최대화하는 컷-포인트의 값이 연구의 후속 중추 단계에서 사용하기 위해 선택될 것이다. 최종 분석을 위해, 콕스 비례 위험 회귀는 지표 변수로 실행될 수 있다 (컷-포인트 미만 대 컷-포인트 초과). 최종 분석은 또한 TTP의 다른 추정 예측 환자 특징 변수를 포함할 수 있다.
치료제가 세포 표면 수용체에 결합하는 표적화된 치료제인 경우, 세포 반응성의 변화는 수용체에 결합하는 활성화제 작용제 또는 교란제의 부재 또는 존재 하에 측정된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 활성화제 또는 교란제 이전, 동시에 또는 이후에 세포 샘플에 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성화제 작용제 또는 교란제는 무표지이다. 세포 표면 수용체의 밀도에 관계없이 기준선 측정과 비교하여 및 임의로 다른 치료제와 비교하여 활성화제 작용제 또는 교란제에 대한 세포 반응성을 억제하는 치료제가 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포 수용체의 밀도와 무관하게 활성화제 작용제 또는 교란제의 작용을 억제하는 치료제가 선택된다.
생리학적 파라미터의 변화는 기준선 또는 건강한 또는 교란되지 않은 세포 대조군과 비교하여 파라미터의 증가 또는 감소일 수 있다. 변화는 완전한 효능작용, 초효능작용, 비가역적 효능작용, 선택적 효능작용, 공동-효능작용, 역 효능작용, 또는 부분적 제한 효능작용, 가역적 및 비가역적 길항작용, 경쟁적 길항작용, 비-경쟁적 길항작용, 또는 비경쟁적 길항작용을 나타낼 수 있다. 변화는 적절한 대조군과 비교하여 더 빨리, 늦게 또는 전혀 발생하지 않을 수 있다. 변화는 더 길거나 더 짧은 기간 동안 발생하도록 선택될 수 있다. 가역적 또는 비가역적인 변화가 선택될 수 있다.
예를 들어, 세포 신호전달의 감소를 초래하는 치료제는 자가면역 상태의 치료를 위해 선택될 것이다. 시토카인의 작용을 억제하는 작용제에 반응하는 말초 혈액 세포는 세포 신호전달의 감소를 나타낸다. 또 다른 예에서, Her2와 같은 수용체로 표적화된 인간화 항체와 같은 항암제에 반응적인 질환 세포의 경우, 질환 세포는 EGF 패밀리 경로 신호전달의 유의한 감소를 나타낼 것이다. 다른 경우에, 항혈관신생제에 반응적인 질환 세포의 경우, 질환 세포는 VEGF 경로 신호전달의 감소 또는 증식 능력의 감소를 나타낼 것이다. 각 유형의 작용제에 대해 측정된 CReMS 반응 또는 물리적으로 관찰가능한 특징은 약물이 불법으로 설계된 의도된 생리학적 반응에 따라 달라지며, 필요에 따라 특이적이거나 일반적일 수 있다. 핵심은 약물이 변경하도록 의도된 반응을 시험하기 위해 일정 기간 동안 살아있는 세포의 생리학적 측정을 위해 CReMS를 사용하는 것이다.
특정한 치료제 또는 치료제들은 특정한 치료제 또는 치료제들의 유효성을 결정하기 위해 이환된 세포, 및 임의로 건강한 세포에 투여될 수 있다. 이환된 세포 및/또는 건강한 세포는 또한 처리된 및 비처리된 이환된 및/또는 건강한 세포에 대한 치료제 또는 치료제들의 효과를 비교하기 위해 처리되지 않을 수 있다. 단일 치료제는 대상체가 치료제 치료에 어떻게 반응할지를 결정하기 위해 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 치료제의 패널이 특정한 대상체의 세포에 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포 경로 (예를 들어, GPCR 신호전달 경로, 예컨대 리소인지질 GPCR 신호전달 경로)의 활성화를 억제하는 치료제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)의 효능에 대한 컷오프 값은 한 실시양태에서 약물을 첨가하고 생리학적 반응을 측정함으로써 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 경로는 약물 전처리와 함께 및 없이 교란된다. 85% 신뢰 구간에서 또는 이상적으로는 90% 신뢰 구간보다 크거나 또는 보다 이상적으로는 95% 또는 99% 신뢰 구간보다 더 큰 신뢰 구간에서 생리학적 기준선 신호에 대한 변화 또는 약물에 의한 활성화 신호의 감소는 효능있는 것으로 간주된다. 실시양태에서, 세포 증식을 억제하거나 세포 사멸을 향상시키는 치료제의 효능에 대한 컷오프 값은 시간 경과에 따른 생리학적 반응을 기록함으로써 결정된다. 85% 신뢰 구간에서 또는 이상적으로는 90% 신뢰 구간보다 크거나 또는 보다 이상적으로는 95% 또는 99% 신뢰 구간보다 더 큰 신뢰 구간에서 약물에 의한 비처리된 또는 건강한 세포 또는 이들의 조합과 비교하여 생리학적 기준선 신호에 대한 감소 또는 시간적 패턴으로부터의 편차는 효능있는 것으로 간주된다.
개별 대상체의 질환을 치료하기 위한 치료제의 민감성 및 특이성은 CReMS에 의해 측정된 바와 같은 세포 생리학적 경로 반응을 비교하여 약물이 특정 표적에 대해 설계된 대로 작동하는지 결정하고 효능에 대한 컷오프 값이 획득되었는지 결정함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 활성화제 작용제 (예를 들어, GPCR 효능제) 및/또는 치료제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)는 어느 하나의 작용제에 대한 힐 기울기, EC50 또는 IC50 값을 수득하기 위해 적정된다. 활성화 작용제 적정 및/또는 치료제 적정으로부터 수득된 데이터는 어느 하나의 작용제의 효력 (최대 효과의 절반을 달성하는 농도) 및/또는 효능 (최대 달성가능한 효과)을 평가하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 개별 대상체에서 질환에 대한 작용제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)의 치료 효능을 결정하는 방법은 하기를 포함한다: 세포 반응 측정 시스템 (CReMS)에서 개별 대상체로부터의 적어도 하나의 단리된 질환 세포 샘플에 작용제를 투여하는 단계; 및 작용제에 대한 세포 샘플의 세포 반응 파라미터의 변화가 기준선 측정과 비교하여 발생하는지 여부를 결정하며, 여기서 세포 반응의 변화는 작용제가 개별 대상체에서 질환에 대한 치료 효능을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계. 실시양태에서, 방법은 치료제를 투여하기 전 또는 후에 GPCR 신호전달 경로를 활성화시키는 효능제 (예를 들어, 리소인지질 GPCR의 효능제)를 세포 반응 측정 시스템에서 개별 대상체로부터의 적어도 하나의 단리된 질환 세포 샘플에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
시험은 일반적으로 20% 미만의 표준 편차 및 최적으로 5% 미만의 표준 편차로 1nM 미만에서 100uM 초과까지의 농도 범위에서 약물의 유효성을 측정할 수 있다. 화합물 시험 범위는 최대 관용 용량으로 공지된 약물 포장 라벨에 정의된 바와 같은 투여 수준에 상응할 것이다. 시험에서 실제 세포 세트의 살아있는 세포 수를 확인할 수 없는 대부분의 시험과 달리, 이 시험은 시험 시작시 품질 관리 및 기준선 생리학적 결정 단계에서 결정된 바와 같이 살아있는 세포에서만 작동한다. 이 특징의 결과는 시험 결과의 변동을 감소시킨다. 시험은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 공지된 세포 생존력에 대해 일반적으로 허용가능한 온도, 산소, 습도 및 이산화탄소 범위를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 바람직한 온도 범위는 25℃ 내지 40℃이다. 다른 경우에, 온도는 특정 교란에 대한 이 범위 내에서 ±0.5℃까지 추가로 최적화될 수 있으며, 표준 온도 제어된 인큐베이터 캐비닛을 사용하여 유지될 수 있다.
본 발명의 방법은 후보 치료제를 대상체의 세포에 투여하여 안전성을 결정하고 치료 유효성을 결정하는 것을 포함한다. 또한, 대상체의 이환된 세포에 대한 후보 치료제의 투여는 II상 또는 III상 임상 시험을 위한 적절한 환자 집단을 선택하는 방법으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 공지된 치료제 조합에 대해 이환된 세포를 시험하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 공지된 및 후보 치료제를 시험하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 치료제의 조합을 투여하여 작용제의 특정한 조합이 보다 효과적인 결과 (즉, 질환 증상의 호전 또는 치유)를 생성하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 치료제의 조합은 동일한 세포 샘플에 투여되는 2개 이상의 치료제이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 치료제의 조합은 세포 샘플에 공동으로 투여된다. 한 실시양태에서 적어도 하나의 치료제는 조합의 적어도 하나의 다른 치료제의 투여와 상이한 시간에 세포 샘플에 투여된다.
세포 샘플에 치료제를 투여한 후, 세포 샘플의 다중 측면에 대한 실시간 데이터를 수집할 수 있다. 예를 들어, pH 및 온도가 측정될 수 있다. 또한, 다른 인자, 예컨대 "세포 사멸 인자"가 결정될 수 있다. CReMS에 의해 결정된 바와 같은 세포 사멸 인자는 CReMS에 의해 측정된 바와 같은 물리화학적 특성의 변화일 수 있다. 예를 들어, 암 세포는 표면에 부착하여 굴절률에 대한 기준선 판독을 제공할 것이다. 암 세포 사멸을 촉진하는 치료제의 투여는 샘플의 암 세포가 뭉쳐서 표면으로부터 탈착되기 때문에 굴절률의 변화를 유발할 것이다. 이는 연속적 실시간 방식으로 표면 플라즈몬 공명을 활용하는 광학 바이오센서에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 특정한 치료제에 대한 최적의 용량 범위를 결정하는 것을 포함한다. 용량 범위의 결정은 임상 시험의 적절한 설계를 허용하고/거나 의사가 해로운 부작용과 효능의 균형을 맞추도록 허용한다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료제의 용량 범위를 투여하여 동일한 환자로부터의 이환된 세포의 샘플을 분리하는 단계, 및 기준선 및/또는 건강한 대조군 세포와 비교하여 본원에 기재된 바와 같은 세포의 생리학적 파라미터의 변화를 초래하는 용량 범위를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어 GPCR 신호전달 경로 (예를 들어, 리소인지질 GPCR 신호전달 경로)의 효능제로 자극 시 개별 대상체의 질환 세포가 하나 이상의 치료제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)에 반응하는지 여부를 결정하기 위해 본원에 기재된 임의의 방법이 사용되면, 그 결과는 의료 종사자에게 통신되어 대상체의 치료를 위한 치료제의 선택을 허용한다. 일부 실시양태에서, 방법은 선택된 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
신호전달 경로 활성을 측정하는 것은 질환과 일치하는 이상의 존재를 검출할 수 있다. 그를 성취하기 위해, 세포 신호전달 경로 작동 및 세포 접착 프로세스 사이의 긴밀한 연결을 활용하는 플랫폼이 개발되었다. 막횡단 세포 접착 수용체, 예컨대 인테그린, 카드헤린, Ig CAM 및 셀렉틴과 세포외 매트릭스 또는 다른 세포의 이들의 동족 결합 부위의 상호작용은 다중 세포 신호전달 프로세스에 대한 연결을 입증하였다. 접착 연결은 세포내 신호전달 캐스케이드에 직접적으로 연결된 조직화된 막-근위 세포골격 구조를 통해 통신한다. 이는 경로 활성화제의 적용 시 특정 세포 경로를 통해 특정 접착 분자에 영향을 미치는 것을 가능하게 한다.
세포 경로의 활성화가 세포 접착에 미치는 영향을 측정하기 위해, 미세전극을 코팅하는 특정 세포외 매트릭스 (ECM) 물질에 부착된 생존가능한 환자 세포의 복잡한 임피던스 변화를 측정하는 디바이스가 사용된다. 세포 임피던스 바이오센서로 공지된 이들 디바이스는 각 웰의 바닥을 덮는 얇은 금 전극을 갖는 표준 마이크로플레이트로 구성된다. 선택적 세포외 매트릭스와 함께 사용된 웰은 마이크로플레이트 웰 전극에 특정 방식으로 생존가능한 세포를 부착한다. 웰 전극의 상단 상의 생존가능한 세포의 존재는 전극/세포 인터페이스의 국소 이온 환경에 영향을 미치므로, 전극 임피던스의 증가를 유발한다. 그러므로, 세포가 교란되거나 이들의 기능을 변화시키도록 자극되는 경우, 세포 접착의 수반되는 변화가 임피던스를 변경한다. 접착 반응의 특이성은 경로의 다양한 지점에서 작용하는 것으로 공지된 특정 ECM 또는 도구 화합물 또는 약물의 적용에 의해 결정될 수 있다. 임피던스 결과는 임피던스 시간적 패턴에 의해 표시된 시점에서 특정 프로테옴 변화의 면역검출에 의해 추가로 지원된다. 시스템은 서브-나노미터 내지 마이크로미터 범위의 접착 변화를 검출하고, 살아있는 세포에 대한 다양한 경로 약리학을 범주화하기 위한 데이터를 생성할 수 있다. 세포 부착 신호 (CAS)로 지칭되는 측정된 임피던스의 양 (옴으로 표현됨)은 세포 생존력, 접착, 및 신호전달 경로 활성화를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 생성된 데이터는 임피던스 대 시간이다.
따라서, 본 발명의 진단 시험에서, 분석물질은 생존가능한 환자 세포가 마이크로플레이트의 웰에 배치되고 바이오센서, 예컨대 임피던스 바이오센서로 분석될 때 단독으로 또는 세포 활성화제의 존재 하에 생성하는 세포 부착 신호 (CAS)이다. 모든 시험에서, CAS는 두 환자 그룹 세포 샘플에 대해 측정되고 분석된다.
1) 환자 세포 단독 (C)
2) 환자 세포 + 활성화제 경로 인자(들) (CF)
3) 환자 세포 + 활성화제 경로 인자(들) + 확증 작용제 (CCF)
일부 실시양태에서, C는 환자 세포 단독에 상응하고, CF는 환자 세포 + GPCR 신호전달의 효능제, 예컨대 리소인지질 GPCR의 효능제 (예를 들어, LPA, S1P)에 상응하고, CCF는 환자 세포 + GPCR 신호전달의 효능제 + RAS 노드 또는 RTK 신호전달의 억제제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)에 상응한다.
신호전달 경로가 정상적으로 또는 비정상적으로 기능하는지 여부를 검출하기 위해, 환자의 이환된 세포의 신호전달 경로는 효능제, 예를 들어 GPCR 신호전달 경로의 효능제, 및 확증 작용제 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 신호전달의 억제제)로 교란되고, 생성된 활성은 컷오프 값에 대한 효능제 및/또는 확증 작용제가 갖는 효과와 비교된다. 컷오프 값은 암을 갖지 않는 대상체로부터 수득된 건강한 세포 샘플 세트의 신호전달 경로 활성의 분석을 포함하는 연구로부터 유도될 수 있다. 검정 측정량은 환자의 이환된 세포에서 CF 및 C 세포 간의 CAS 변화 및 CF 및 CCF 이환된 세포 간의 CAS 변화를 반영한다. 신호전달 경로가 비정상적인 경우, CF 및 C 이환된 세포 간의 CAS 변화 및/또는 CF 및 CCF 이환된 세포 간의 CAS 변화는 컷오프 값 초과일 것이다. 컷오프 값은 전형적으로 관심 경로 활성에 대한 정상적인 참조 구간의 상한보다 높다. 단순화된 실시양태에서, 경로 인자 또는 확증 작용제를 사용한 활성화 직전 시점의 CAS와 비교하여 활성화 시점 이후의 CF 및/또는 CCF 샘플의 CAS의 측정은 또한 유용한 척도일 수 있다.
본 발명의 진단 검정은 본질적으로 임의의 임상적 상황, 특히 현재 유전자 또는 단백질 바이오마커가 질환의 지표로서 및 그러므로 치료제 결정을 위한 지표로서 사용되는 임상적 상황에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 본원에 기재된 접근법은 GPCR 신호전달 경로의 효능제에 의해 영향을 받는 RAS 노드 또는 RTK의 활성을 조사하여 RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제가 표준 바이오마커 검정을 사용하여 양성 결과를 나타내는지 여부에 관계없이 환자에게 처방되어야 하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
생리학적 반응 파라미터의 변화가 세포 샘플에서 발생하는지 여부를 결정하기 위해 연속적 측정치를 분석하는 방법이 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 반응의 크기 (양성 또는 음성), 최대 또는 최소까지의 시간, 반응 타임라인의 임의의 시점에 시간 대 크기의 기울기 등). 이들 및 다른 비선형 분석 방법은 생리학적 반응 파라미터의 변화가 효능제 (예를 들어, GPCR 신호전달 경로의 효능제)의 존재 하에 발생하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
기준선 및 대조군은 세포 경로의 상태를 판단하는데 사용될 수 있다. 적합한 기준선은 효능제가 없는 샘플, 효능제의 무한 희석의 샘플, 효능제의 첨가 전 또는 후에 충분히 긴 시간 후에 동일한 샘플, 및 세포 기반 검정의 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 이러한 기준선 설정 활성을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
적합한 대조군은 동일한 환자로부터의 건강한 물질의 샘플, 정상적인 참조 구간을 유도하기에 충분한 수의 관심 질환이 결여된 환자로부터의 건강한 물질의 샘플 세트, 유사하지만 상이한 효능제가 있는 샘플, 공지된 양성 또는 음성 반응의 세포주, 효능제의 역 활성으로 처리된 샘플, 하나 이상의 환자로부터의 이환된 물질의 샘플, 및 세포 기반 검정의 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 이러한 양성 및 음성 대조군을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
시험 결과의 분석 및 해석
본원에 기재된 방법을 사용하여 수득된 시험 결과는 다양한 방식으로 분석 및 해석되어 임상의 및/또는 환자에게 정보를 제공할 수 있다. 특정 실시양태는 하기와 같이 제시된다.
(i) 이환된 경로 분석. 이 분석은 이환된 경로 활성이 생체외에서 환자에서 발견되는지 여부를 식별한다. 분석은 의사에게 질환 프로세스가 환자의 이환된 세포에 존재하는지 여부에 대한 동적 평가를 제공할 것이다. 이 실시양태에서, 시험된 경로는 4개의 그룹 범주 중 하나로 분류될 수 있다: 구성적으로 활성, 과다활성, 전혀 활성이 아님 (과소-활성), 또는 정상적으로 활성. 경로 (예를 들어, GPCR 신호전달 경로)가 이환되고 그러므로 표적화된 요법 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 표적화된 치료제)를 사용하는 치료에 적합한지 여부를 결정하기 위해, 질환을 갖는 것으로 의심되는 환자에 대해 본원에 기재된 방법에 의해 결정된 바와 같은 경로 활성은 질환을 갖는 것으로 의심되는 환자의 무작위로 선택된 집단에서 해당 경로 활성의 통계적 분석으로부터 유도된 컷오프 값과 비교된다. 비정상적인 경로 활성을 갖는 것으로 발견된 약물 표적화 경로 (예를 들어, 비정상적인 및 정상적인 경로 활성을 기술하는 컷오프 초과)는 해당 활성을 파괴하여 이에 의해 환자에서 의도된 효과를 생성할 것으로 예상될 것이다.
(ii) 약물 기능성 분석. 이 분석은 생체외 약물의 기능성의 두 가지 척도를 제공한다.
1) 반응 스코어 (RS): 반응 스코어는 시험된 약물 (예를 들어, RAS 노드 또는 RTK 신호전달의 억제제)이 표적화된 경로에 미치는 기능적 효과를 특징화한다. 이는 0 - 1 스케일로 보고될 수 있으며, 여기서 더 높은 스코어는 더 큰 약물 기능성을 나타낸다.
2) 반응 스코어 백분위수 순위결정 (RSPR): RSPR은 동일한 작용제로 시험된 다른 환자가 받은 스코어에 비해 환자의 반응 스코어 순위를 특징화한다. 각 환자에 대해, 총 그룹 내에서 이들의 반응 스코어의 백분위수가 결정된다. 백분위수 순위결정이 할당되면, 환자는 3개 그룹 중 하나로 분류될 수 있다: a) 중앙값 미만, b) 중앙값 근처, 또는 c) 중앙값 초과. 특정 약물의 경우, 임상적 종점, 예컨대 진행까지의 시간 (TTP)에 의해 측정된 바와 같은 환자 약물 반응의 광범위한 변화가 반응 스코어의 변화에 반영될 것이다. 임상 시험에서 75번째 백분위수 환자의 TTP 기간이 25번째 백분위수 환자의 TTP 기간보다 5-10배 더 긴 경우가 종종 있기 때문에, 의사에게 이들의 환자의 반응 스코어의 상대적 순위를 제공하는 것은 중요한 해석적 맥락을 제공한다. 예를 들어, 개별 환자의 반응 스코어 백분위수에 상응하는 백분위수 범위에서 임상 시험에서 환자의 TTP 기간에 기초하여 개별 환자에 대한 TTP 기간을 추정할 수 있다.
(iii) 가능한 임상 결과의 예측. 이 분석은 문제의 작용제를 받은 후 시험되고 관찰된 환자에 대한 반응 스코어 및 임상적 종점 간의 임상 시험에서 발견되는 상관관계를 반영한다. 이 상관관계를 통해, 임상 시험에서 특정 반응 스코어를 받은 환자와 일치하는 임상 결과를 식별할 수 있다. 예를 들어, TTP가 측정된 임상 결과인 경우, 환자의 결과는 3개 범주 중 하나로 분류될 수 있다.
1) 가능한 TTP 기간 - 가장 낮음: 이 하위집단에 속하는 환자는 전체 환자 집단이 경험할 중앙값 TTP 기간보다 훨씬 낮은 TTP 기간을 경험할 가능성이 있다.
2) 가능한 TTP 기간 - 불확정적: 이 범주에 속하는 반응 스코어를 받은 환자에 대한 평가가 제공되지 않는다.
3) 가능한 TTP 기간 - 가장 높음: 이 하위집단에 속하는 환자는 전체 환자 집단이 경험할 중앙값 TTP 기간보다 훨씬 높은 TTP 기간을 경험할 가능성이 있다.
임상의는 CELx 프로파일 시험의 결과를 지침으로 사용하여 선택할 약물 요법을 결정할 것이다. 환자의 세포가 다중 효능제 작용제 및 표적화된 치료제로 시험되는 경우, 각 약물 또는 약물의 조합의 가능한 임상 결과를 비교하여 의사가 가장 큰 가능한 임상 결과와 상관관계가 있는 시험 결과를 갖는 약물 또는 약물의 조합을 선택할 수 있다.
키트
본 발명의 또 다른 측면에서, 키트가 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 수송 배지를 함유하는 개별 대상체로부터의 질환 세포 샘플을 위한 컨테이너; 수송 배지를 함유하는 개별 대상체로부터의 대조군 세포 샘플을 위한 컨테이너; 바이오센서; 바이오센서로부터의 데이터를 출력으로 변환하고 (여기서 출력은 정의된 기간에 걸쳐 세포 생리학적 반응 파라미터의 변화를 나타내고, 여기서 세포 생리학적 반응 파라미터는 세포 접착 또는 세포 부착임), 반응자 또는 비반응자로서 상태를 나타내는 컷오프 값 초과 또는 미만으로 출력을 분류하고/거나 샘플을 무반응, 약한 반응성, 및 반응성을 갖는 것으로 분류하고; 분류를 사용하여 보고서를 생성하기 위한 컴퓨터 실행가능 명령을 갖는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 생리학적 반응 파라미터는 pH, 세포 접착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 세포 주기, 동화작용, 이화작용, 소분자 합성 및 생성, 전환, 및 호흡, ATP, 칼슘, 마그네슘, 및 다른 하전된 이온, 단백질, 특정 경로 구성원 분자, 다양한 세포 구획 내의 DNA 및/또는 RNA, 유전체학, 및 단백질체학, 번역 후 변형 및 메커니즘, 2차 메신저, cAMP, mRNA, RNAi, 마이크로RNA 및 생리학적 기능을 갖는 다른 RNA의 수준, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
질환 세포 샘플의 유형 및 양은 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 질환 세포 샘플은 적어도 5,000개 세포를 갖는 전체 세포 무표지 생존가능한 세포 샘플이다. 일부 실시양태에서, 대조군 세포 샘플은 동일한 대상체로부터의 질환 세포 샘플, 동일한 대상체로부터의 건강한 세포 샘플, 질환이 없는 것으로 공지된 대상체로부터의 건강한 세포 샘플, 정상적인 참조 구간을 유도하기 위해 관심 질환이 결여된 충분한 수의 환자로부터의 건강한 물질의 샘플 세트, 치료제에 반응하는 것으로 공지된 세포 샘플, 치료제에 반응하지 않는 것으로 공지된 세포 샘플, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
컨테이너 및 수송 배지는 세포 생존력을 유지하고 세포 활성화를 최소화하도록 설계된다. 특정 실시양태에서, 배지 및 컨테이너는 내독소 무함유, 비발열성 및 DNase- 및 RNase-무함유이다. 일단 수득되면 세포 샘플은 세포 생존력을 유지하는 수송 배지에서 유지된다. 분석 장소까지 수송하는데 걸리는 시간에 따라, 상이한 배지가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 수송이 최대 10시간을 필요로 할 수 있는 경우, 배지는 400 mosm/L 미만의 오스몰농도를 가지며, Na+, K+, Mg+, Cl-, Ca+2, 글루코스, 글루타민, 히스티딘, 만니톨, 및 트립토판, 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하고, 필수 아미노산을 함유하고, 비필수 아미노산, 비타민, 다른 유기 화합물, 미량 미네랄 및 무기 염, 혈청, 세포 추출물, 또는 성장 인자, 인슐린, 트랜스페린, 나트륨 셀레나이트, 히드로코르티손, 에탄올아민, 포스포릴에탄올아민, 트리아이오도티로닌, 피루브산나트륨, L-글루타민을 추가로 함유하여 인간 1차 세포의 증식 및 플레이팅 효율을 지원할 수 있다. 이러한 배지의 예는 셀시오 배지, 로스웰 파크 메모리얼 연구소 배지 (RPMI), 행크스 완충 염수, 및 맥코이 5A, 이글 필수 최소 배지 (EMEM), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 레이보비츠 L-15, 또는 이의 변형 (1차 세포 치료의 실시를 위해)을 포함한다.
바이오센서는 본원에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 바이오센서는 세포 접착, 세포 부착, 세포 형태학, 세포 표현형, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 밀도, 세포 극성, pH, O2, CO2, 글루코스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 파라미터를 검출하는 바이오센서로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 디바이스는 임피던스 또는 광학 디바이스이다. 바이오센서는 본원에 기재된 바와 같이 임의로 코팅될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료제 및/또는 활성화제 작용제의 유형과 연관된 생리학적 파라미터의 변화를 측정하는 바이오센서가 선택된다.
다른 실시양태에서, 키트는 바이오센서로부터의 데이터를 출력으로 변환하고 (여기서 출력은 정의된 기간에 걸쳐 세포 생리학적 반응 파라미터의 변화를 나타내고, 여기서 세포 생리학적 반응 파라미터는 pH, 세포 접착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨); 반응자 또는 비반응자 및/또는 무반응, 약한 반응성, 및 반응성으로서 출력을 분류하고; 분류를 사용하여 보고서를 생성하기 위한 컴퓨터 실행가능 명령을 갖는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 방법을 구현하기 위한 명령을 포함하는 컴퓨팅 디바이스 또는 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다. 컴퓨터 판독가능 매체는 비일시적 CD, DVD, 플래시 드라이브, 외장 하드 드라이브, 및 모바일 디바이스를 포함한다.
본원에 기재된 키트 및 방법은 프로세서/컴퓨터 시스템의 사용을 사용할 수 있다. 예를 들어, 방법을 구현하기 위해 컴퓨터 프로그램 코드를 저장하는 프로그램 메모리, 작업 메모리, 및 인터페이스, 예컨대 통상적인 컴퓨터 스크린, 키보드, 마우스, 및 프린터, 뿐만 아니라 다른 인터페이스, 예컨대 네트워크 인터페이스, 및 소프트웨어 인터페이스 (데이터베이스 인터페이스 포함)에 커플링된 프로세서를 포함하는 범용 컴퓨터 시스템은 본원에 기재된 한 실시양태를 사용한다.
컴퓨터 시스템은 데이터 입력 디바이스, 예컨대 키보드, 입력 데이터 파일, 또는 네트워크 인터페이스, 또는 예를 들어 정의된 기간에 걸쳐 바이오센서에 의해 생성된 데이터를 해석하는 시스템과 같은 또 다른 시스템으로부터 사용자 입력을 수용하고, 출력 디바이스, 예컨대 프린터, 디스플레이, 네트워크 인터페이스, 또는 데이터 저장 디바이스에 출력을 제공한다. 입력 디바이스, 예를 들어 네트워크 인터페이스는 본원에 기재된 바와 같은 세포 생리학적 파라미터의 변화 및/또는 이들 변화의 정량화를 포함하는 입력을 수신한다. 출력 디바이스는 하나 이상의 숫자 및/또는 세포 파라미터의 변화의 검출 및/또는 정량화를 도시하는 그래프를 포함하는 출력, 예컨대 디스플레이를 제공한다.
컴퓨터 시스템은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 데이터를 저장하는 데이터 저장소에 커플링될 수 있다. 이 데이터는 각 측정 및/또는 각 대상체에 대해 저장되며; 임의로 이들 데이터 유형 각각의 복수의 세트는 각 대상체에 상응하게 저장된다. 하나 이상의 컴퓨터/프로세서는 예를 들어 별도의 기계로서 (예를 들어 네트워크를 통해 컴퓨터 시스템에 커플링된) 사용될 수 있거나, 컴퓨터 시스템에서 실행되는 별도의 또는 통합된 프로그램을 포함할 수 있다. 어떤 방법을 사용하든, 이들 시스템은 데이터를 수신하고 그 대가로 검출/진단에 관한 데이터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 컴퓨팅 디바이스는 단일 컴퓨팅 디바이스, 예컨대 서버 컴퓨터를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 컴퓨팅 디바이스는 네트워크 (표시되지 않음)를 통해 서로 통신하도록 구성된 다중 컴퓨팅 디바이스를 포함할 수 있다. 컴퓨팅 디바이스는 메모리 내에 다중 데이터베이스를 저장할 수 있다. 컴퓨팅 디바이스에 저장된 데이터베이스는 클리닉, 실습 임상의, 프로그래머 식별 코드 또는 임의의 기타 원하는 범주별로 조직화될 수 있다.
바이오센서로부터의 데이터는 원격 컴퓨팅 시스템 또는 또 다른 데이터 저장 디바이스로 보내질 수 있다. 통신 프로세스는 초기화하고 시작 모듈에서 시작하여 연결 작업을 진행한다. 연결 작업은 예를 들어 케이블 연결, 무선 근거리 통신망 (WLAN 또는 Wi-Fi) 연결, 셀룰러 네트워크, 무선 개인 영역 네트워크 (WPAN) 연결, 예를 들어 블루투스®, 또는 임의의 원하는 통신 링크를 통해 의료 제공자의 저장된 정보를 원격 컴퓨팅 시스템에 통신적으로 커플링한다.
전송 작업은 바이오센서로부터의 데이터를 컴퓨팅 디바이스로 전송한다. 한 실시양태에서, 전송 작업은 디바이스 간에 데이터를 전송하기 전에 데이터를 암호화한다. 통신 프로세스가 완료되고 정지 모듈에서 종료될 수 있다. 바이오센서 데이터가 원격 컴퓨팅 디바이스로 전송되면, 데이터는 시간 경과에 따른 세포 인덱스 측정과 같은 출력으로 변환된다. 특정 실시양태에서, 정의된 종점이 선택되고, 본원에 기재된 바와 같이 세포 샘플을 무반응, 약한 반응성 또는 반응성으로 분류하는데 사용된다. 실시양태에서, 반응자 또는 비반응자로서의 샘플의 분석 상태는 케이블 연결, 무선 근거리 통신망 (WLAN 또는 Wi-Fi) 연결, 셀룰러 네트워크, 무선 개인 영역 네트워크 (WPAN) 연결, 예를 들어 블루투스®, 또는 임의의 원하는 통신 링크를 통해 유사한 프로세스를 사용하여 의료 제공자에게 다시 통신된다.
특정 실시양태에서, 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 컴퓨팅 디바이스에 의해 실행될 때 컴퓨팅 디바이스가 하기를 포함하는 단계를 수행하게 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 갖는다: 바이오센서로부터의 데이터를 출력으로 변환하는 단계 (여기서 출력은 정의된 기간에 걸친 세포 생리학적 반응 파라미터의 변화를 나타내고, 여기서 세포 생리학적 반응 파라미터는 치료제의 존재 및/또는 부재 하에 pH, 세포 접착, 세포 부착 패턴, 세포 증식, 세포 신호전달, 세포 생존, 세포 밀도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 극성, O2, CO2, 글루코스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨); 치료제의 존재 하에 세포 샘플로부터의 바이오센서로부터의 출력을 치료제의 부재 하에 세포 샘플로부터의 바이오센서로부터의 출력과 비교함으로써 정의된 종점에서 무반응 및 반응성으로서 출력을 분류하는 단계; 및 분류를 사용하여 보고서를 생성하는 단계. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 실행가능 명령은 분류를 의료 제공자에게 통신하기 위한 명령을 포함한다.
다른 실시양태에서, 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 대상체의 질환 세포 샘플에서 어떤 경로가 작동하는지 식별하기 위한 명령을 포함할 수 있다. 컴퓨팅 디바이스에 의해 실행될 때 명령은 효능제 (예를 들어, GPCR 신호전달 경로의 효능제)로 처리된 대상체로부터의 질환 세포 샘플로부터의 바이오센서의 출력 데이터 및 효능제로 처리되지 않은 동일한 대상체로부터의 제2 질환 세포 샘플로부터의 바이오센서의 출력 데이터 사이에 차이가 존재하는지 여부를 결정하여 효능제에 반응적인 경로가 질환 세포 샘플에서 활성인지 여부를 결정하는 것; 경로의 활성의 표시로서 출력의 차이의 존재를 식별하는 것, 및 경로의 활성을 의료 제공자에게 통신하는 것을 포함한다. 효능제 및 이들의 경로는 본원에 기재되어 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제안될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함됨을 이해해야 한다.
실시예 1: HER2-음성/PI3K 야생형인 암 세포에서 PI3K 억제제 및 GPCR 신호전달 효능제의 시험
바이오센서 및 변환기 : 96-웰 임피던스 E-플레이트 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 엑셀리전스(xCELLigence) RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정하였다. 특정한 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포 수 및 세포가 임피던스 마이크로플레이트에 갖는 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이들 작은 세포 집단의 교란에 대한 반응을 나타낸다.
코팅 : 96-E-플레이트 웰을 피브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅하였다. 콜라겐을 어드밴스드 바이오매트릭스(Advanced BioMatrix) (미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터 구입하고, 피브로넥틴을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
조직 및 세포 샘플 : 18개의 HER2-음성/PI3K 야생형 유방 종양 세포 샘플을 연구하였다.
신호전달 경로 활성화제 작용제 (효능제) 및 표적화된 치료제 쌍 :
18개의 종양 세포 샘플 각각에 대해, S1P 효능제 (신호전달 경로 활성화제) 및 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제)에 대한 살아있는 세포 반응을 개별적으로 및 2개의 PI3K 표적화된 치료제인 알펠리십 및 IPI-549와 조합하여 측정하였다. 이들 반응으로부터, S1P-개시된 및 LPA1-개시된 신호전달에서 PI3K 참여의 순량을 정량화하였다.
기타 시약 : 표준 배지 항생제 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 다른 완충제를 ATCC (미국 버지니아주 머내서스) 또는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터 구입하고 제공한 대로 사용하였다.
절차 : 각 유방 종양 세포 샘플에 대해, 7개의 웰에 120 uL 배양 배지에서 대략 12,750개 세포를 씨딩하였다. 20 마이크로리터의 각 표적화된 치료제 (알펠리십, IPI-549)를 각 환자의 세포의 2개 웰 (총 4개의 웰)에 별도로 첨가하고, 20 마이크로리터의 표준 배지를 신호전달 경로 활성화제 작용제의 첨가 18시간 전에 각 환자의 세포 샘플의 다른 3개 웰에 첨가하였다. 20 마이크로리터의 각 신호전달 경로 효능제 (S1P, LPA1)를 표적화된 치료제를 받은 각 환자의 세포의 웰에 별도로 첨가하고, 표적화된 치료제가 없는 각 환자의 세포 세트에 대해 1개의 추가 웰에 별도로 첨가하였다. 활성화 작용제 또는 표적화된 치료제를 받지 않은 세포의 단일 웰을 대조군으로서 사용하였다.
Figure pct00009
부착 및 접착 변화의 임피던스 기록을 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 데이터를 시험 전반에 걸쳐 연속적 기준으로 기록하였으며, 여기서 제시된 데이터는 18개의 상이한 환자 샘플에 대한 표적화된 치료제 및 신호전달 경로 효능제 첨가 후의 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준으로부터 나온 것이다. 미리 결정된 컷오프 값, 즉, 이 실시예에서 250 이상을 초과하는 출력 값을 생성하는 PI3K 표적화된 치료제는 환자를 치료하기 위해 선택되는 것이다.
컷오프 값
컷오프는 이전에 통계적 분석 소프트웨어 (예를 들어, 믹스툴스, 유한 혼합 모델 분석용 R 패키지)의 도움으로 유한 혼합 모델 분석을 사용하여 신호전달 활성 수준 또는 출력 값의 집단 분포를 특징화함으로써 결정되었다. 분석된 암 환자 집단 내에서 2개 이상의 그룹이 식별되었으며; 컷오프 값은 한 그룹의 평균 출력 값 및 제2 또는 다른 그룹의 평균 출력 값 사이의 선택된 중간 지점을 나타낸다.
결과 :
표 3은 상기 기재된 방법을 사용하여 수행된 72개의 시험 각각에 대한 결과 (출력 값으로 표현됨)를 나타낸다. 18개의 세포 샘플 각각에 대해, 2개의 상이한 GPCR 신호전달 경로를 S1P 및 LPA1 단독 및 2개의 상이한 표적화된 치료제인 알펠리십 및 IPI-549와 함께 시험하였다. 출력 값은 S1P 및 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제 작용제)의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 및 표적화된 치료제인 알펠리십 및 IPI-549의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 간의 차이를 나타낸다. 이 실시예에서, 시험된 18개의 환자 세포 샘플 중 5개는 표적화된 치료제 IPI-549를 사용하여 250을 초과하는 출력 값을 기록하였다. 그러므로, 이들 5명의 환자는 PI3K 돌연변이가 결여되었더라도 IPI-549를 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이다.
표 3: GPCR 신호전달 경로 활성 및 PI3K 표적화된 치료제의 시험에 대한 결과
Figure pct00010
논의 :
치료 표준 가이드라인은 PI3K 표적화된 치료제로 유방암 환자를 치료하기 전에 PI3K 돌연변이 상태의 확증을 필요로 한다. 이 실시예에서 시험된 환자 세포 샘플은 PI3K 돌연변이가 결여되어 있기 때문에, 이들은 PI3K 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 받을 적격이 없을 것이며; 이들은 표적화된 요법의 결합 부위에 상응하는 돌연변이가 결여되어 있다. 그러나, 이 실시예에서, 18개의 환자 종양 세포 샘플 중 5개는 PI3K 표적화된 치료제를 사용하여 컷오프를 초과하는 출력 값을 기록하였으며, 그러므로 본원에 기재된 방법에 기초하여 상응하는 PI3K 표적화된 치료제로 치료되도록 선택될 것이다. 그러므로, 이들 5명의 환자에 대해, 이 방법의 결과를 사용하여 투여되는 표적화된 치료제는 현재의 치료 표준 치료 가이드라인에서 권장하는 표적화된 요법과 상이하다. 이 실시예는 암 환자의 GPCR 신호전달 경로의 활성을 측정하는 것의 중요성을 시사하며, 이는 많은 경우에, 근본적인 질환 메커니즘, 즉, 해당 환자에서 입증된 특정 신호전달 경로 기능장애가 상응하는 유전적 돌연변이와 연관되지 않기 때문이다.
이 실시예는 또한 치료를 위해 환자를 선택하기 위해 본원에 기재된 방법이 활성화 작용제의 결합 부위와 상이한 결합 부위를 갖는 표적화된 치료제의 효과를 어떻게 평가할 수 있는지 입증한다. 이 실시예에서, 2개의 상이한 GPCR 경로를 이들의 각각의 수용체 (S1P 및 LPA1)에 결합하는 리간드로 활성화시키고, PI3K에 결합하는 표적화된 치료제 (알펠리십 및 IPI-549)의 효과를 측정하여 PI3K 억제제를 사용하는 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있는 결과를 제공하였다.
실시예 2: HER2-음성/PI3K 야생형인 암 세포에서 HER2 억제제 및 GPCR 신호전달 효능제의 시험
바이오센서 및 변환기 : 96-웰 임피던스 E-플레이트 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 엑셀리전스 RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정하였다. 특정한 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포 수 및 세포가 임피던스 마이크로플레이트에 갖는 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이들 작은 세포 집단의 교란에 대한 반응을 나타낸다.
코팅 : 96-E-플레이트 웰을 피브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅하였다. 콜라겐을 어드밴스드 바이오매트릭스 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터 구입하고, 피브로넥틴을 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
조직 및 세포 샘플 : 18개의 HER2-음성/PI3K 야생형 유방 종양 세포 샘플을 연구하였다.
신호전달 경로 활성화제 작용제 (효능제) 및 표적화된 치료제 쌍 :
18개의 종양 세포 샘플 각각에 대해, S1P 효능제 (신호전달 경로 활성화제) 및 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제)에 대한 살아있는 세포 반응을 개별적으로 및 HER2 억제제 (네라티닙)와 조합하여 측정하였다. 이들 반응으로부터, S1P-개시된 및 LPA1-개시된 신호전달에서 HER-패밀리 경로 참여의 순량을 정량화하였다.
기타 시약 : 표준 배지 항생제 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 다른 완충제를 ATCC (미국 버지니아주 머내서스) 또는 라이프 테크놀로지스 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터 구입하고 제공한 대로 사용하였다.
절차 : 각 유방 종양 세포 샘플에 대해, 5개의 웰에 120 uL 배양 배지에서 대략 12,750개 세포를 씨딩하였다. 20 마이크로리터의 표적화된 치료제 (네라티닙)를 각 환자의 세포의 2개 웰에 별도로 첨가하고, 20 마이크로리터의 표준 배지를 신호전달 경로 활성화제 작용제의 첨가 18시간 전에 각 환자의 세포 샘플의 다른 3개 웰에 첨가하였다. 20 마이크로리터의 각 신호전달 경로 효능제 (S1P, LPA1)를 표적화된 치료제를 받은 각 환자의 세포의 1개의 웰에 별도로 첨가하고, 표적화된 치료제가 없는 각 환자의 세포 세트에 대해 1개의 추가 웰에 별도로 첨가하였다. 활성화 작용제 또는 표적화된 치료제를 받지 않은 세포의 단일 웰을 대조군으로서 사용하였다.
Figure pct00011
부착 및 접착 변화의 임피던스 기록을 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 데이터를 시험 전반에 걸쳐 연속적 기준으로 기록하였으며, 여기서 제시된 데이터는 18개의 상이한 환자 샘플에 대한 표적화된 치료제 및 신호전달 경로 활성화제 작용제 첨가 후의 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준으로부터 나온 것이다. 미리 결정된 컷오프 값, 이 실시예에서 500 이상을 초과하는 출력 값을 기록하는 표적화된 치료제는 환자를 치료하기 위해 선택되는 것이다.
컷오프 값
컷오프는 이전에 통계적 분석 소프트웨어 (예를 들어, 믹스툴스, 유한 혼합 모델 분석용 R 패키지)의 도움으로 유한 혼합 모델 분석을 사용하여 신호전달 활성 수준 또는 출력 값의 집단 분포를 특징화함으로써 결정되었다. 분석된 암 환자 집단 내에서 2개 이상의 그룹이 식별되었으며; 컷오프 값은 한 그룹의 평균 출력 값 및 제2 또는 다른 그룹의 평균 출력 값 사이의 중간 지점을 나타낸다.
결과 :
표 4는 상기 기재된 방법을 사용하여 수행된 36개의 시험 각각에 대한 결과 (출력 값으로 표현됨)를 나타낸다. 18개의 세포 샘플 각각에 대해, 2개의 상이한 GPCR 신호전달 경로를 S1P 및 LPA1 단독 및 HER2 억제제 네라티닙과 함께 시험하였다. 출력 값은 S1P 또는 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제 작용제)의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 및 표적화된 치료제 네라티닙의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 간의 차이를 나타낸다. 이 실시예에서, 시험된 18개의 환자 세포 샘플 중 4개는 표적화된 치료제 네라티닙을 사용하여 500을 초과하는 출력 값을 기록하였다. 그러므로, 이들 4명의 환자는 HER2-음성이더라도 네라티닙을 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이다.
표 4: GPCR 신호전달 경로 활성 및 HER2 표적화된 치료제의 시험에 대한 결과
Figure pct00012
논의 :
치료 표준 가이드라인은 HER2 표적화된 치료제로 환자를 치료하기 전에 환자가 HER2-양성임을 확증하는 것을 필요로 한다. 이 실시예에서 시험된 환자 세포 샘플은 HER2-음성이기 때문에, 이들은 HER2 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 받을 적격이 없을 것이며; 이들은 표적화된 요법의 결합 부위에 상응하는 돌연변이가 결여되어 있다. 그러나, 이 실시예에서, 18개의 환자 종양 세포 샘플 중 4개는 HER2 표적화된 치료제 및 GPCR 활성화된 신호전달을 사용하여 컷오프를 초과하는 출력 값을 기록하였으며, 그러므로 본원에 기재된 방법에 기초하여 상응하는 HER2 표적화된 치료제로 치료되도록 선택될 것이다. 그러므로, 이들 4명의 환자에 대해, 본원에 기재된 이 방법의 결과를 사용하여 투여되는 표적화된 치료제는 현재의 치료 표준 치료 가이드라인에서 권장하는 표적화된 요법과 상이하다. 이 실시예는 암 환자의 GPCR 신호전달 경로의 활성을 측정하는 것의 중요성을 시사하며, 이는 일부 경우에, 근본적인 질환 메커니즘, 즉, 해당 환자에서 입증된 특정 신호전달 경로 기능장애가 상응하는 유전적 돌연변이와 연관되지 않기 때문이다.
이전 실시예에서와 같이, 이 실시예는 치료를 위해 환자를 선택하기 위해 본원에 기재된 방법이 활성화 작용제의 결합 부위와 상이한 결합 부위를 갖는 표적화된 치료제의 효과를 어떻게 평가할 수 있는지 입증한다. 이 실시예에서, 2개의 상이한 GPCR 경로를 이들의 각각의 수용체 (S1P 및 LPA1)에 결합하는 리간드로 활성화시키고, HER1, HER2 및 HER3에 결합하는 표적화된 치료제 (네라티닙)의 효과를 측정하여 네라티닙을 사용하는 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있는 결과를 제공하였다.
실시예 3: PI3K 돌연변이를 갖는 암 세포에서 PI3K 억제제 및 GPCR 신호전달 효능제의 시험
바이오센서 및 변환기 : 96-웰 임피던스 E-플레이트 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 엑셀리전스 RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정하였다. 특정한 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포 수 및 세포가 임피던스 마이크로플레이트에 갖는 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이들 작은 세포 집단의 교란에 대한 반응을 나타낸다.
코팅 : 96-E-플레이트 웰을 피브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅하였다. 콜라겐을 어드밴스드 바이오매트릭스 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터 구입하고, 피브로넥틴을 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
조직 및 세포 샘플 : PI3K-알파 돌연변이를 갖는 3개의 유방 종양 세포 샘플을 연구하였다.
신호전달 경로 활성화제 작용제 (효능제) 및 표적화된 치료제 쌍 :
3개의 유방 종양 세포 샘플 각각에 대해, S1P 효능제 (신호전달 경로 활성화제) 및 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제)에 대한 살아있는 세포 반응을 개별적으로 및 2개의 PI3K 표적화된 치료제인 알펠리십 및 IPI-549와 조합하여 측정하였다. 이들 반응으로부터, S1P-개시된 및 LPA1 개시된 신호전달에서 PI3K 참여의 순량을 정량화하였다.
기타 시약 : 표준 배지 항생제 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 다른 완충제를 ATCC (미국 버지니아주 머내서스) 또는 라이프 테크놀로지스 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터 구입하고 제공한 대로 사용하였다.
절차 : 각 유방 종양 세포 샘플에 대해, 7개의 웰에 120 uL 배양 배지에서 대략 12,750개 세포를 씨딩하였다. 20 마이크로리터의 각 표적화된 치료제 (알펠리십, IPI-549)를 각 환자의 세포의 2개 웰에 별도로 첨가하고, 20 마이크로리터의 표준 배지를 신호전달 경로 활성화제 작용제의 첨가 18시간 전에 각 환자의 세포 샘플의 다른 3개 웰에 첨가하였다. 20 마이크로리터의 신호전달 경로 효능제 (S1P, LPA1)를 표적화된 치료제를 받은 각 환자의 세포의 웰에 별도로 첨가하고, 표적화된 치료제가 없는 각 환자의 세포 세트에 대해 1개의 추가 웰에 별도로 첨가하였다. 활성화 작용제 또는 표적화된 치료제를 받지 않은 세포의 단일 웰을 대조군으로서 사용하였다.
Figure pct00013
부착 및 접착 변화의 임피던스 기록을 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 데이터를 시험 전반에 걸쳐 연속적 기준으로 기록하였으며, 여기서 제시된 데이터는 18개의 상이한 환자 샘플에 대한 표적화된 치료제 및 신호전달 경로 활성화제 작용제 첨가 후의 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준으로부터 나온 것이다. 미리 결정된 컷오프 값, 이 실시예에서 250 이상을 초과하는 출력 값을 기록하는 PI3K 표적화된 치료제는 환자를 치료하기 위해 선택되는 것이다.
컷오프 값
컷오프는 이전에 통계적 분석 소프트웨어 (예를 들어, 믹스툴스, 유한 혼합 모델 분석용 R 패키지)의 도움으로 유한 혼합 모델 분석을 사용하여 신호전달 활성 수준 또는 출력 값의 집단 분포를 특징화함으로써 결정되었다. 분석된 암 환자 집단 내에서 2개 이상의 그룹이 식별되었으며; 컷오프 값은 한 그룹의 평균 출력 값 및 제2 또는 다른 그룹의 평균 출력 값 사이의 선택된 중간 지점을 나타낸다.
결과 :
표 5는 상기 기재된 방법을 사용하여 수행된 10개의 시험 각각에 대한 결과 (출력 값으로 표현됨)를 나타낸다. 2개의 상이한 GPCR 신호전달 경로를 S1P 및 LPA1 별도로 및 2개의 PI3K 억제제인 알펠리십 및 IPI-549와 함께 시험하였다. 출력 값은 S1P 또는 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제 작용제)의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 및 표적화된 치료제인 알펠리십 또는 IPI-549의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 간의 차이를 나타낸다. 이 실시예에서, PI3K-돌연변이된 환자 세포 샘플 중 오직 1개만이 PI3K 표적화된 치료제를 사용하여 250을 초과하는 출력 값을 기록하였다. 다른 2명의 환자는 PI3K 돌연변이를 가짐에도 불구하고 컷오프 미만의 출력 값을 가졌으며, 그러므로 PI3K 억제제를 사용하는 치료를 받도록 선택되지 않을 것이다.
표 5: GPCR 신호전달 경로 활성 및 PI3K 표적화된 치료제의 시험에 대한 결과
Figure pct00014
논의 :
치료 표준 가이드라인은 PI3K 표적화된 치료제로 유방암 환자를 치료하기 전에 PI3K 돌연변이 상태의 확증을 필요로 한다. 이 실시예에서 시험된 환자 세포 샘플은 PI3K 돌연변이를 갖기 때문에, 이들은 PI3K 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 받을 적격이 있을 것이며; 이들의 돌연변이는 표적화된 요법의 결합 부위에 상응한다. 그러나, 이 실시예에서, 3개의 환자 종양 세포 샘플 중 2개는 PI3K 표적화된 치료제를 사용하여 컷오프 미만의 출력 값을 기록하였으며, 그러므로 본원에 기재된 방법에 기초하여 상응하는 PI3K 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 선택되지 않을 것이다. 이전 실시예에서와 같이, 이 실시예는 암 환자의 GPCR 신호전달 경로의 활성을 측정하는 것의 중요성을 시사하며, 이는 많은 경우에, 근본적인 질환 메커니즘, 즉, 해당 환자에서 입증된 특정 신호전달 경로 기능장애가 상응하는 유전적 돌연변이와 연관되지 않기 때문이다.
실시예 4: HER2-음성이고 PI3K, ERK, MEK, RAF 및 mTOR에 대해 야생형인 암 세포에서 RAS 노드 억제제 및 GPCR 신호전달 효능제의 시험
GPCR을 통한 조절장애 신호전달은 유방암 (BC)에서 종양발생 RAS 신호전달에 연루된다. RAS 노드를 연결하는 복잡한 조절 메커니즘은 노드의 돌연변이 상태에 관계없이 단일 RAS 노드가 억제될 때 적응 반응 (예를 들어, 저항)을 촉발할 수 있다. 그러므로, 다중 RAS 노드의 억제는 지속적인 항종양 반응을 달성하는데 필요할 수 있다. RAS 노드 억제제에 반응할 수 있는 조절장애 RAS 신호전달 종양을 갖는 환자를 식별하기 위해, 임피던스 바이오센서를 사용하는 검정을 개발하였다. 이 실시예는 GPCR-개시된 신호전달 활성 및 살아있는 종양 세포에서 이러한 활성을 형질도입하는데 있어서 PI3K, ERK, MEK, mTOR, RAF 및 BCL의 역할(들)을 시험하였다.
바이오센서 및 변환기 : 96-웰 임피던스 E-플레이트 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 엑셀리전스 RTCA MP 스테이션 임피던스 바이오센서 (ACEA, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 배치하였다. 바이오센서는 모든 웰의 임피던스를 동시에 측정하였다. 특정한 웰에 대한 임피던스의 변화는 세포 수 및 세포가 임피던스 마이크로플레이트에 갖는 부착 유형에 비례한다. 임피던스의 변화는 이들 작은 세포 집단의 교란에 대한 반응을 나타낸다.
코팅 : 96-E-플레이트 웰을 피브로넥틴 및/또는 콜라겐으로 코팅하였다. 콜라겐을 어드밴스드 바이오매트릭스 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터 구입하고, 피브로넥틴을 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다.
조직 및 세포 샘플 : 28개의 HER2-음성/PI3K//ERK/MEK/RAF/mTOR 야생형 유방 종양 세포 샘플을 연구하였다.
신호전달 경로 활성화제 작용제 (효능제) 및 표적화된 치료제 쌍 :
28개의 종양 세포 샘플 각각에 대해, LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제)에 대한 살아있는 세포 반응을 개별적으로 및 PI3K-α 억제제 (GDC-0077), 범-PI3K 억제제 (코판리십), 범-PI3K/mTOR 억제제 (게다톨리십), Bcl-xL/Bcl-2 억제제 (나비토클락스), MEK 억제제 (트라메티닙), ERK 억제제 (라복세르티닙) 및 RAF 억제제 (PLX7904)와 조합하여 측정하였다. 이들 반응으로부터, PI3K-α, 클래스 1 PI3K-이소형 (범-PI3K), 클래스 1 PI3K-이소형 및 mTOR, Bcl-xL 및 Bcl-2, MEK, ERK 및 RAF를 포함하는 LPA1-개시된 신호전달의 순량을 개별적으로 및 조합하여 정량화하였다.
기타 시약 : 표준 배지 항생제 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 다른 완충제를 ATCC (미국 버지니아주 머내서스) 또는 라이프 테크놀로지스 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터 구입하고 제공한 대로 사용하였다.
절차 : 각 유방 종양 세포 샘플에 대해, 12개의 웰에 120 마이크로리터의 배양 배지에서 대략 12,750개 세포를 씨딩하였다. 20 마이크로리터의 GDC-0077, 코판리십, 게다톨리십, 나비토클락스, 트라메티닙, 라복세르티닙 및 PLX7904 단독 및 20 마이크로리터의 게다톨리십 및 트라메티닙, 게다톨리십 및 나비토클락스, 게다톨리십 및 라복세르티닙, 및 게다톨리십 및 PLX7904의 조합을 각 환자의 세포의 10개 웰에 별도로 첨가하고, 20 마이크로리터의 표준 배지를 신호전달 경로 활성화제 작용제의 첨가 18시간 전에 각 환자의 세포 샘플의 다른 2개 웰에 첨가하였다. 20 마이크로리터의 신호전달 경로 효능제 (LPA1)를 표적화된 치료제를 받은 각 환자의 세포의 웰에 별도로 첨가하고, 표적화된 치료제가 없는 각 환자의 세포 세트에 대해 1개의 추가 웰에 별도로 첨가하였다. 활성화 작용제 또는 표적화된 치료제를 받지 않은 세포의 단일 웰을 대조군으로서 사용하였다.
부착 및 접착 변화의 임피던스 기록을 37℃, 5% CO2에서 수행하였다. 데이터를 시험 전반에 걸쳐 연속적 기준으로 기록하였으며, 여기서 제시된 데이터는 28개의 상이한 환자 샘플에 대한 표적화된 치료제 및 신호전달 경로 효능제 첨가 후의 후속 효과와 비교하여 세포 부착의 초기 기준선 수준으로부터 나온 것이다. 미리 결정된 컷오프 값, 즉, 이 실시예에서 250 이상을 초과하는 출력 값을 생성하는 단일 표적화된 치료제 및 표적화된 치료제의 조합은 환자를 치료하기 위해 선택되는 것이다.
컷오프 값
컷오프는 이전에 통계적 분석 소프트웨어 (예를 들어, 믹스툴스, 유한 혼합 모델 분석용 R 패키지)의 도움으로 유한 혼합 모델 분석을 사용하여 신호전달 활성 수준 또는 출력 값의 집단 분포를 특징화함으로써 결정되었다. 분석된 암 환자 집단 내에서 2개 이상의 그룹이 식별되었으며; 컷오프 값은 한 그룹의 평균 출력 값 및 제2 또는 다른 그룹의 평균 출력 값 사이의 선택된 중간 지점을 나타낸다.
결과 :
표 4는 상기 기재된 방법을 사용하여 수행된 시험 각각에 대한 결과 (출력 값으로 표현됨)를 나타낸다. 28개의 세포 샘플 각각에 대해, LPA1을 단독으로 및 단일 작용제로서 상이한 표적화된 치료제 (GDC-0077, 코판리십, 게다톨리십, 나비토클락스, 트라메티닙, 라복세르티닙, PLX7904)와 함께 및 조합 작용제 (게다톨리십 및 트라메티닙, 게다톨리십 및 나비토클락스, 게다톨리십 및 라복세르티닙, 게다톨리십 및 PLX7904)와 함께 시험하였다. 출력 값은 LPA1 효능제 (신호전달 경로 활성화제 작용제)의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 및 표적화된 치료제(들)의 첨가에 따른 세포 접착 변화의 양 간의 차이를 나타낸다. 이 실시예에서, 시험된 28개의 환자 세포 샘플 중 14개는 적어도 하나의 표적화된 치료제(들)를 사용하여 250을 초과하는 출력 값을 기록하였다. 어떤 환자도 단일 작용제로서 트라메티닙, GDC-0077, 라복세르티닙을 사용하는 치료를 받도록 선택되지 않을 것이다. 5명의 환자는 게다톨리십을 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이고, 4명은 코판리십을 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이고, 1명의 환자는 PLX7904를 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이고, 6명의 환자는 게다톨리십 및 PLX7904를 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이고, 7명의 환자는 게다톨리십 및 라복세르티닙을 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이고, 9명의 환자는 게다톨리십 및 트라메티닙을 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이고, 14명의 환자는 게다톨리십 및 나비토클락스를 사용하는 치료를 받도록 선택될 것이다.
표 4: GPCR 신호전달 경로 활성 및 RAS 표적화된 치료제의 시험에 대한 결과
Figure pct00015
논의 :
치료 표준 가이드라인은 상응하는 표적화된 치료제로 유방암 환자를 치료하기 전에 PI3K/ERK/MEK/RAF/mTOR 야생형 돌연변이 상태의 확증을 필요로 한다. 이 실시예에서 시험된 환자 세포 샘플은 PI3K/ERK/MEK/RAF/mTOR 돌연변이가 결여되어 있기 때문에, 이들은 PI3K/ERK/MEK/RAF/mTOR 표적화된 치료제 단독 또는 조합을 사용하는 치료를 받을 적격이 없을 것이며; 이들은 표적화된 요법의 결합 부위에 상응하는 돌연변이가 결여되어 있다. 그러나, 이 실시예에서, 28개의 환자 종양 세포 샘플 중 14개는 표적화된 치료제(들) 중 하나를 사용하여 컷오프를 초과하는 출력 값을 기록하였으며, 그러므로 본원에 기재된 방법에 기초하여 상응하는 표적화된 치료제로 치료되도록 선택될 것이다. 그러므로, 이들 14명의 환자에 대해, 이 방법의 결과를 사용하여 투여되는 표적화된 치료제는 현재의 치료 표준 치료 가이드라인에서 권장하는 표적화된 요법과 상이하다. 이 실시예는 암 환자의 GPCR 신호전달 경로의 활성을 측정하는 것의 중요성을 시사하며, 이는 많은 경우에, 근본적인 질환 메커니즘, 즉, 해당 환자에서 입증된 특정 신호전달 경로 기능장애가 상응하는 유전적 돌연변이와 연관되지 않기 때문이다.
이 실시예는 또한 치료를 위해 환자를 선택하기 위해 본원에 기재된 방법이 활성화 작용제의 결합 부위와 상이한 결합 부위를 갖는 표적화된 치료제의 효과를 어떻게 평가할 수 있는지 입증한다. 이 실시예에서, GPCR 경로를 이의 수용체 (LPA1)에 결합하는 리간드로 활성화시키고, RAS 노드에 결합하는 표적화된 치료제 (GDC-0077, 코판리십, 게다톨리십, 나비토클락스, 트라메티닙, 라복세르티닙, PLX7904, 게다톨리십 및 트라메티닙, 게다톨리십 및 나비토클락스, 게다톨리십 및 라복세르티닙, 게다톨리십 및 PLX7904)의 효과를 측정하여 RAS 노드 억제제를 사용하는 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있는 결과를 제공하였다.

Claims (78)

  1. 하기 단계를 포함하는, RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
    (1) 샘플의 제1 부분을 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
    제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
  2. RAS 노드에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
    (1) 샘플의 제1 부분을 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달의 효능제 및 RAS 노드의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
    제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, GPCR이 리소인지질 GPCR인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질 GPCR이 LPA 수용체 (LPAR)인 방법.
  5. 제4항에 있어서, LPAR이 LPAR1, LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5 및 LPAR6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질 GPCR이 S1P 수용체 (S1PR)인 방법.
  7. 제6항에 있어서, S1PR이 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 단백질, 펩티드, 지질, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물질, 또는 이들의 조합인 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 리소포스파티드산 (LPA), FAP-10, FAP-12 및 OMPT인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 효능제가 LPA인 방법.
  11. 제10항에 있어서, LPA가 LPA 18:0, LPA 18:1, LPA 18:2, LPA 20:4 및 LPA 16:0으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 스핑고신-1-포스페이트 (S1P), FTY720, BAF312, A971432, 세랄리피모드, CS2100, CYM50260, CYM50308, CYM5442, CYM5520, CYM5541, GSK2018682, RP001 히드로클로라이드, SEW2871, TC-G1006 및 TC-SP14인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, RAS 노드가 포스포이노시티드 3 키나제 (PI3K), ERK, MEK, mTOR, RAF, BCL, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 제1 부분이 2종 이상의 억제제와 접촉되며, 이들 각각이 상이한 RAS 노드를 억제하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 2종 이상의 억제제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 RAS 노드의 조합을 억제하는 것인 방법:
    (a) PI3K, mTOR 및 BCL,
    (b) PI3K, mTOR 및 RAF,
    (c) PI3K, mTOR 및 ERK, 및
    (d) PI3K, mTOR 및 MEK.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 대상체가 상이한 RAS 노드를 억제하는 RAS 노드 표적화된 치료제의 조합으로 치료되거나 또는 그를 사용하는 치료를 위해 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 PI3K 억제제인 방법.
  18. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 PI3K의 p110α 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 PI3K의 p110β 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 PI3K의 p110γ 촉매 서브유닛을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 PI3K의 p110δ 서브유닛을 선택적으로 억제하는 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 PI3K의 p110 서브유닛의 하나 초과의 이소형을 억제하는 것인 방법.
  23. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 PI3K의 p110 서브유닛의 모든 이소형을 억제하는 것인 방법.
  24. 제17항에 있어서, PI3K 억제제가 또한 mTOR을 억제하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K 억제제가 보르트만닌, LY294002, 히비스콘 C, 이델라리십 (GS-1101, CAL-101), 코판리십, 두벨리십, 알펠리십, (BYL719), 타셀리십 (GDC-0032), GDC-0077, 게다톨리십, 페리포신, 이데알리십, 필라랄리십 (XL147), 부파르리십 (BKM120), 두벨리십, 움브랄리십, PX-866, 닥톨리십, CUDC-907, 복스탈리십, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, 픽틸리십 (GDC-0941), 팔로미드 529, SAR260301, GSK1059615, GSK2636771, CH5132799, CZC24832, AZD6482, AZD8835, WX-037, AZD8186, KA2237, CAL-120, AMG-319, AMG-511, HS-173, INCB050465, INCB040093, TGR-1202, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, TGX221, CAL263, RP6530, PI-103, GNE-477, IPI-145, BAY 80-6946, BAY1082439, PX866, BEZ235, MKM120, MLN1117, SAR245408, AEZS-136, 세라벨리십 (TAK-117), 게다톨리십, 오미팔리십 및 필라르리십로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 ERK 억제제인 방법.
  27. 제26항에 있어서, ERK 억제제가 라복세르티닙, SCH772984, SCH900353 (MK8353), 울릭세르티닙, AZD0364 (ATG017), VX-11e (VTX-113), CC-90003, LY3214996, FR180204, E6201, ASN007 및 GDC0994로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 MEK 억제제인 방법.
  29. 제28항에 있어서, MEK 억제제가 트라메티닙, 비니메티닙, 피마세르팁, 코비메티닙, PD901, U0126, 셀루메티닙, PD325901, TAK733, CI-1040 (PD184352), PD198306, PD334581, PD98059 및 SL327로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 mTOR 억제제인 방법.
  31. 제30항에 있어서, mTOR 억제제가 게다톨리십, 오미팔리십, 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 닥톨리십, AZD8055, ABTL-0812, PQR620, GNE-493, KU0063794, 토르키닙, 리다포롤리무스, 사파니세르팁, 복스탈리십, 토린 1, 토린 2, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리십, GSK1059615, WYE-354, 비스투세르팁, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, WYE-687, WAY600, GDC-0349, XL388, 비미랄리십 (PQR309), 오나타세르팁 (CC-223), 사모톨리십, RMC-5552 및 GNE-477로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 RAF 억제제인 방법.
  33. 제32항에 있어서, RAF 억제제가 PLX7904, GDC-0879, 벨바라페닙 (GDC-5573), SB590885, 엔코라페닙, RAF265, RAF709, 다브라페닙 (GSK2118436), TAK-632, TAK580, PLX-4720, CEP-32796, 소라페닙, 베무라페닙 (PLX-4032), AZ-628, GW5074, ZM-336372, NVP-BHG712, CEP32496, PLX4032, PF-0728489 및 LGX-818로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 Bcl-xL 억제제인 방법.
  35. 제34항에 있어서, Bcl-xL 억제제가 나비토클락스 (ABT-263), GDC-0199 (ABT-199), 사부톡스락스 (Bl-97C1), ABT-737, AT101, TW037, A1331852, BXI-61 및 BXI-72로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, GPCR 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 접착 또는 부착이 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포가 비-돌연변이된 (야생형) RAS 노드 단백질을 발현하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, RAS 노드의 억제제가 비-돌연변이된 RAS 노드 단백질을 억제하는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포가 야생형 ERK, 야생형 MEK, 야생형 RAF, 야생형 mTOR 및/또는 야생형 Bcl-xL을 발현하는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포가 비-돌연변이된 (야생형) PI3K 효소를 발현하는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포가 돌연변이된 PI3K 효소를 발현하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플이 성장 인자를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플이 또한 항-아폽토시스제를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양되는 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 제3 부분이 억제제 단독과 접촉되는 것인 방법.
  47. 하기 단계를 포함하는, 수용체 티로신 키나제 (RTK) 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 암으로 진단된 인간 대상체를 선택하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
    (1) 샘플의 제1 부분을 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
    제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 사용하는 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계.
  48. 수용체 티로신 키나제 (RTK) 신호전달에 의해 매개되는 암으로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 암 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에서 시험된 것인 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포의 샘플을 배양하는 단계;
    (1) 샘플의 제1 부분을 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달의 효능제 및 RTK 신호전달의 억제제와 접촉시키고, (2) 샘플의 제2 부분을 효능제 단독과 접촉시키는 단계;
    제1 및 제2 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계;
    세포 접착 또는 부착의 변화가 제2 부분과 비교하여 제1 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하는 단계; 및
    세포 접착 또는 부착의 변화를 특징화하는 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우, 또는 출력 값 백분율이 30% 이상인 경우, 억제제와 동일한 RTK를 억제하는 RTK 표적화된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, GPCR이 리소인지질 GPCR인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 리소인지질 GPCR이 LPA 수용체 (LPAR)인 방법.
  51. 제50항에 있어서, LPAR이 LPAR1, LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5 및 LPAR6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 리소인지질 GPCR이 S1P 수용체 (S1PR)인 방법.
  53. 제52항에 있어서, S1PR이 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 단백질, 펩티드, 지질, 핵산, 대사물, 리간드, 시약, 유기 분자, 신호전달 인자, 성장 인자, 생화학물질, 또는 이들의 조합인 방법.
  55. 제47항 내지 제51항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 리소포스파티드산 (LPA), FAP-10, FAP-12 및 OMPT인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 효능제가 LPA인 방법.
  57. 제56항에 있어서, LPA가 LPA 18:0, LPA 18:1, LPA 18:2, LPA 20:4 및 LPA 16:0으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제47항 내지 제49항 및 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제가 스핑고신-1-포스페이트 (S1P), FTY720, BAF312, A971432, 세랄리피모드, CS2100, CYM50260, CYM50308, CYM5442, CYM5520, CYM5541, GSK2018682, RP001 히드로클로라이드, SEW2871, TC-G1006 및 TC-SP14인 방법.
  59. 제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, RTK가 EGFR/ERBB, MuSK, HGFR, NGFR, FGFR, IR, CCK, EphR, RYK, RET, ROS, PDGFR, DDR, LTK, VEGFR, TIE, AXL, ROR, LMR 또는 RTK106 패밀리의 구성원으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, RTK가 ErbB 패밀리의 구성원인 방법.
  61. 제60항에 있어서, RTK가 HER2인 방법.
  62. 제47항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, RTK 억제제가 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 반데타닙, 아파티닙, 파니투무맙, 세툭시맙, 브리가티닙, 이코티닙, 오시메르티닙, 네라티닙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 페르투주맙, 트라스투주맙, 다코미티닙, 아코미티닙, BIBW2992, 테세바티닙, 아무바티닙, 네시투무맙, REGN955, MM-151, 나자르티닙, ASP8273, 올무티닙, TDM1, MEDI4276, ZW25, ZW33, 투카티닙, 로실레티닙, 이브루티닙, DS-8201, TAS07828, XMT-1522, TAK-788, Sym013, LIM716, 세리반투맙, AMG888, 룸레투주맙, PF-06804103, ARX788, 포지오티닙, 피로티닙, 둘리고투주맙, MCLA-128, MM-111, 카보잔티닙, 티반티닙, 크리조티닙 (PF-2341066), 테포티닙, 캅마티닙, 사볼리티닙, K252a, SU11274, PHA-665752, ARQ197, 포레티닙, SGX523, MP470, AV229, AMG102, CGEN241, DN30, OA5D5, 릴로투무맙, 오나르투주맙, SAR125844, 에미베투주맙, ABBV-399, sym015, 피클라투주맙, 메레스티닙, JNJ-61186372, 알티라티닙, Indo5, BMS-754807, BMS-777607, 글레사티닙, CEP-751, ANA-12, 시클로트락신 B, 고시페틴, 엔트렉티닙, 라로트렉티닙, LOXO-101, 도보티닙, 렌바티닙, 포나티닙, 레고라페닙, 루시타닙, 세디라닙, 인테다닙, 브리바닙, PD173074, AZD4547, BGJ398, JNJ42756493, GP369, BAY1187982, MFGR1877S, FP1039, 파조파닙, 에르다피티닙, Debio-1347, B-701, 피소가티닙, FIIN-2, FIIN-3, BLU9931, LY2874455, LY3076226, 수니티닙, AG538, AG1024, NVP-AEW541, 피기투무맙, 린시티닙, 달로투주맙, MEDI-573, 테프로투무맙, 가니투맙, 세리티닙, MM-141, 코페투주맙 펠리도틴 (PF-06647020), 다사티닙, 닐로티닙, NVP-BHG712, 시트라바티닙, ALW-II-41-27, JI-101, 123C4, 소라페닙, 아파티닙, AST487, 알렉티닙, 도비티닙, 크리조티닙, 로라티닙, TPX-0005, DS-6051b, 이마티닙, 리니파닙, KTN0182A, 길테리티닙, 퀴자르티닙, 미도스타우린, 레스타우르티닙, 리프레티닙, 마시티닙, 아바프리티닙, 펙시다르티닙, 텔라티닙, 모테사닙, PLX7486, ARRY386, JNJ-40346527, BLZ945, 에막투주맙, AMG820, IMC-CS4, 카비랄리주맙, CHMFL-KIT-033, SU14813, Ki20227, OSI-930, 플루마티닙, 토세라닙, AZD3229, AC710, AZD2932, ICK03, PLX647, c-Kit-IN-3, 바탈라닙, 베바시주맙, 레바스티닙, BAY-826, 벰센티닙, R428 (BGB324), YW327.6S2, GL2I.T, TP-0903, LY2801653, 보수티닙, MGCD265, ASP2215, SGI-7079, BGB324, HuMax-AXL-ADC 및 UC-961로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  63. 제47항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, GPCR 신호전달 경로가 대상체의 암 세포에서 비정상적으로 활성인 방법.
  64. 제47항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 접착 또는 부착이 임피던스 바이오센서 또는 광학 바이오센서를 사용하여 측정되는 것인 방법.
  65. 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 결장직장암, 방광암, 신장암, 난소암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제47항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포가 RTK를 과다발현하지 않는 것인 (즉, 암 세포가 RTK 음성 암 세포임) 방법.
  67. 제66항에 있어서, 대상체로부터 수득된 암 세포가 HER2를 과다발현하지 않는 것인 (즉, 암 세포가 HER2 음성 암 세포임) 방법.
  68. 제47항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플이 성장 인자를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 샘플이 또한 항-아폽토시스제를 포함하고 혈청을 함유하지 않는 배지에서 배양되는 것인 방법.
  70. 제47항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 암 세포의 제3 부분이 억제제 단독과 접촉되는 것인 방법.
  71. 하기 단계를 포함하는, 암으로 진단된 인간 대상체가 비정상적으로 활성인 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달을 갖는지 여부를 결정하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키는 단계;
    효능제와 접촉되지 않은 샘플의 부분에 비해 효능제와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계; 및
    세포 접착 또는 부착의 변화가 효능제와 접촉되지 않은 샘플의 부분과 비교하여 효능제와 접촉된 샘플의 부분에서 발생하였는지 여부를 특징화하는 효능제에 대한 샘플의 민감성 및 효능제에 대한 출력 값을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하며, 여기서 GPCR 신호전달 경로는 효능제에 대한 출력 값이 미리 결정된 컷오프 값 이상인 경우 비정상적으로 활성인 것으로 간주되는 것인 단계.
  72. 하기 단계를 포함하는, 암으로 진단된 인간 대상체가 비정상적으로 활성인 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 신호전달을 갖는지 여부를 결정하는 방법:
    대상체로부터 수득된 생존가능한 암 세포를 포함하는 샘플을 배양하는 단계;
    샘플을 GPCR 신호전달 경로의 효능제와 접촉시키며, 여기서 샘플의 일부분은 효능제의 더 높은 농도와 접촉되고 샘플의 일부분은 효능제의 더 낮은 농도와 접촉되는 것인 단계;
    효능제의 더 낮은 농도와 접촉된 샘플의 부분에 비해 효능제의 더 높은 농도와 접촉된 샘플의 부분에서 생존가능한 암 세포의 세포 접착 또는 부착을 연속적으로 측정하는 단계; 및
    효능제에 대한 신호전달 경로의 민감성을 연속적 측정치의 수학적 분석에 의해 결정하며, 여기서 GPCR 신호전달 경로는 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성인 경우 비정상적으로 활성인 것으로 간주되는 것인 단계.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, GPCR 신호전달 경로가 리소인지질 GPCR 신호전달 경로인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 리소인지질 GPCR이 리소포스파티드산 (LPA) 수용체 또는 스핑고신 1-포스페이트 (S1P) 수용체인 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제의 더 높은 농도가 EC90이고 효능제의 더 낮은 농도가 EC10인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 81 미만의 EC90:EC10 비율이 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성임을 나타내는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 효능제에 대한 신호전달 경로의 민감성이 힐 계수를 결정하기 위해 힐 방정식을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 1 초과의 힐 계수 값이 신호전달 경로가 효능제에 대해 초민감성임을 나타내는 것인 방법.
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