JP6002379B2 - 癌の再発リスクの判定方法及びその利用 - Google Patents
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Description
そこで、本発明は、癌の再発リスクをより正確に判定可能な方法を提供することを目的とする。また、本発明は、そのような判定方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
癌患者から採取した生体試料から、第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とを取得するステップと、
取得した第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定するステップとを含む、癌の再発リスクの判定方法が提供される。
癌患者から採取した生体試料から取得した第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とを受信するステップと、
受信した第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定するステップと、
得られた判定結果を出力するステップとをコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが提供される。
本明細書において、「再発リスク」とは、原発癌を治療した患者の身体に癌が再発する危険と、癌が再発することによって患者が死亡する危険の両方を意味する。
本明細書において、「再発リスクスコア」とは、癌の再発リスクを再発確率として数値的に評価するための指標である。
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA)とは、セリンプロテアーゼの一種であり、プラスミノーゲンを基質とする。uPAは、細胞表面に存在するウロキナーゼ受容体と結合して、腫瘍の増殖及び転移に関与するシグナル伝達を誘発することが知られている。
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1(PAI−1)とは、血中の組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)の活性を消失させて、線溶系を抑制する分子である。PAI−1は、血管内皮細胞より放出されると速やかにtPAと結合し、その活性を阻害するので、血中の線溶活性を規定する因子として知られている。
本明細書において、「発現量」とは、生体試料(測定用試料)に含まれる目的のタンパク質又はmRNAの量を反映する値を意味する。発現量は、測定値自体又はその値に基づいて算出された値であってもよい。また、発現量は、質量(重量)、濃度、比、強度、レベルなどのいずれの形式又は単位で表されてもよい。
(1-1)生体試料
本発明の癌の再発リスクの判定方法(以下、単に「判定方法」ともいう)では、まず、癌患者から採取した生体試料から、第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とを取得する。
本発明の実施形態においては、第1CDKの活性値及び発現量、第2CDKの活性値及び発現量、並びにuPA及びPAI−1の発現量を取得するために、上記の生体試料から測定用試料を調製することが望ましい。そのような測定用試料は、後述するように当該技術において公知の方法により調製できる。
上記の可溶化液は、緩衝液と同様の緩衝剤を含むことが好ましい。また、緩衝液及び可溶化液は、必要に応じて、当該技術において公知のプロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化酵素阻害剤、還元剤などをさらに含んでいてもよい。
本発明の実施形態において、第1及び第2CDK、並びにuPA及びPAI−1の各発現量は、生体試料から調製した測定用試料を、当該技術において公知の方法により測定することによって取得することができる。なお、第1及び第2CDK、並びにuPA及びPAI−1の各発現量は、タンパク質及びmRNAのいずれの発現量であってもよいが、好ましくはタンパク質の発現量である。
測定用試料に含まれる第1及び第2CDK、並びにuPA及びPAI−1のタンパク質の発現量は、例えばELISA法、ウェスタンブロット法、又は特開2003−130871号に開示されるタンパク定量方法などにより測定することができる。なお、これらの方法においては、第1及び第2CDK、並びにuPA及びPAI−1の各タンパク質を捕捉するために、それぞれのタンパク質を特異的に認識して結合する抗体が用いられる。例えば、抗CDK1抗体を用いた場合、測定用試料に含まれる全ての形態のCDK1(CDK1単体、CDK1とサイクリン及び/又はCDKインヒビターの複合体、CDK1とその他の化合物との複合体を含む)が捕捉される。
本発明の判定方法では、上記のようにして取得した第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定する。
本発明の一つの実施形態では、第1CDKの活性値及び発現量と、第2CDKの活性値及び発現量とに基づいて再発リスクスコアを取得し、取得した再発リスクスコアと、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定する。
(再発リスクスコア)=F(x)×G(y) ・・・(1)
[式中、
xは第1CDKの比活性を表し、この第1CDKの比活性は、(第1CDKの活性値)/(第1CDKの発現量)で示され;
yは比活性の比を表し、この比活性の比は、(第2CDKの比活性)/(第1CDKの比活性)で示され、第2CDKの比活性は、(第2CDKの活性値)/(第2CDKの発現量)で示される]
F(x)=a/(1+Exp(−(x1−b)×c)) ・・・(2)
G(y)=d/(1+Exp(−(y1−e)×f)) ・・・(3)
[式中、
a、b及びcは、xと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり;
d、e及びfは、yと癌の再発率との相関関係から定められた定数である]
式(3)は、CDK2比活性値とCDK1比活性値との比に対する再発率の変化をロジスティックカーブによりフィッティングさせた際に得られる式である。定数d(例えば、0.25)は、比活性の比が与えうる最大の再発率(例えば、25%)を意味している。定数eおよびfは、上記のカーブの形を規定する。
CDKの比活性は、(CDK活性値)/(CDK発現量)で示されることから理解できるように、CDKの発現量に対する活性値の比である。すなわち、CDK比活性は、生体試料中の細胞に存在するCDKのうち、キナーゼ活性を示したCDKの割合に相当する。したがって、CDK比活性は、癌細胞の増殖状態に基づくCDK活性レベルを反映する。
したがって、例えば、G2期からM期に移行する際に活性を示すCDK1を第1CDKとし、G1期からS期に移行する際に活性を示すCDK2を第2CDKとして用いて、これらの活性値及び発現量に基づいてCDKの比活性の比を算出した場合、得られた比活性の比は、S期又はG2期にある細胞が、M期にある細胞に比べてどれだけ多く存在するかを反映する数値である。よって、比活性の比は、細胞の増殖能を正確に反映する指標として用いることができる。
上述したように、CDK比活性及び比活性の比は、癌細胞の増殖状態及び増殖能を反映する指標であるので、本発明の実施形態においては、再発リスクスコアを、第1CDKの比活性についての式(2)と、第1CDKと第2CDKの比活性の比についての式(3)との積から取得できる値として規定される。
この実施形態では、再発リスクスコアが第1閾値未満であり、uPAの発現量が第2閾値未満であり、PAI−1の発現量が第3閾値未満であり、且つ第1CDKの比活性が第4閾値未満であるとき、癌の再発リスクが低いと判定される。また、再発リスクスコアが第1閾値以上であるか、uPAの発現量が第2閾値以上であるか、PAI−1の発現量が第3閾値以上であるか又は第1CDKの比活性が第4閾値以上であるとき、癌の再発リスクが高いと判定される。
以下に、癌の再発リスクの判定方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム(以下、単に「プログラム」ともいう)について説明する。
この癌の再発リスク判定用システムは、判定装置100と測定用試料の測定装置200とを備え、これらの装置はケーブル300で接続されている。判定装置100は、測定装置200により測定された第1CDKの活性値及び発現量、第2CDKの活性値及び発現量、uPAの発現量、並びにPAI−1の発現量のデータ(以下、「癌患者のデータ」ともいう)を、ケーブル300を介して受信する。そして、判定装置100は、測定装置200から出力されたデータを解析して、癌患者の癌の再発リスクの感受性を判定し、判定結果を出力する。
なお、測定装置200は、複数の測定装置から構成されていてもよい。例えば、測定装置200は、CDKのキナーゼ活性を測定する装置、CDKの発現量を測定する装置、並びにuPA及びPAI−1の発現量を測定する装置から構成され得る。また、判定装置100及び測定装置200は、一体の装置として構成されてもよい。
RAM110cは、SRAM(Static Random Access Memory)またはDRAM(Dynamic Random Access Memory)などによって構成される。RAM110cは、ROM110bおよびハードディスク110dに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、RAM110cは、CPU110aがこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
可搬型記憶媒体140には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム140a及び各閾値のデータが格納されている。CPU110aが可搬型記憶媒体140から該アプリケーションプログラム140aを読み出し、これらのプログラム及び閾値のデータをハードディスク110dにインストールすることができる。
以下、本発明のプログラム(コンピュータプログラム140a)は、該オペレーティングシステム上で動作するプログラムとして説明する。
測定装置200は、測定用試料の測定により取得された癌患者のデータを、コンピュータ本体110に直接送信する。
ステップ3−2では、CPU110aは、第2閾値とuPAの発現量の値とを比較する。uPAの発現量の値が第2閾値よりも小さい場合(Yes)、処理をステップS3−3に進める。反対に、uPAの発現量の値が第2閾値よりも小さくない場合(No)、処理をステップS4−2に進める。
ステップ3−3では、CPU110aは、第3閾値とPAI−1の発現量の値とを比較する。PAI−1の発現量の値が第3閾値よりも小さい場合(Yes)、処理をステップS4−1に進める。反対に、PAI−1の発現量の値が第3閾値よりも小さくない場合(No)、処理をステップS4−2に進める。
なお、図2−1及び図2−2から理解できるように、処理フローにおいて、ステップ3−1、3−2、3−3及び3−4の順序は入れ替えることができる。また、上記の説明では、癌患者のデータは、測定装置200からコンピュータ本体110に直接送信されたが、本発明はそのような実施の形態に限定されない。例えば、癌患者のデータは、ユーザによる入力デバイス130に対する入力操作により、入出力インターフェース110fを介してコンピュータ本体110に入力されてもよい。
なお、ここでは、CPU110aは判定結果のみを出力したが、生体試料を採取した癌患者に対して補助療法を行うか否かの指示をさらに出力してもよい。すなわち、CPU110aが、癌の再発リスクが低いと判定した場合には、判定結果と共に補助療法を行わない指示を表示部120に出力する。
実施例1では、生体試料の採取後の癌の再発の有無が確認されている生体試料について、本発明の判定方法及び従来の判定方法によって癌の再発リスクを検討し、その判定精度を検討することを目的とする。
なお、この実施例では、従来の判定方法として、第1及び第2CDKの活性値及び発現量に基づく方法(以下、「従来法1」という)と、uPA及びPAI−1の発現量に基づく方法(以下、「従来法2」という)とを用いた。
生体試料として、ミュンヘン工科大学医学部が管理する腫瘍バンクより、39名の乳癌患者から採取した組織片(39検体)を入手した。これら39検体については、患者に施行された治療法、検体採取後の癌の再発の有無など様々な臨床情報が得られている。また、これら39検体は、検体採取後に癌が再発した症例と再発が一定期間認められなかった症例とが、ほぼ1:1となるように選択された。すなわち、本実施例では、癌の再発率は約50%に設定されている。
各検体(50〜3000 mg)と破砕用ボールとをチューブに入れ、破砕機(Mikro-Dismembrator S;Sartorius社製)により検体を回転速度3000/分で30秒間粉砕した。チューブに1mLの可溶化液(トリス緩衝食塩水(TBS)、pH8.5)を添加し、チューブを4℃にて4時間回転させて検体を可溶化した。チューブを遠心分離(100,000 x g、4℃、4時間)し、得られた上清を測定用試料として回収した。得られた測定用試料は、各測定に用いられるまで凍結保存した。
(3-1)フィルタープレートへのタンパク質の固相化
発現量測定用フィルタープレート(Filter Plate MultiScreen HTS PSQPlate;ミリポア社製)の各ウェルに30%エタノールを100μLずつ加えた。プレートを、吸引装置(吸引/加圧両用ポンプ及びマルチスクリーンHTSバキュームマニホールド;ミリポア社製)に設置し、吸引装置の設定を「-5 in Hg」にしてウェル内の溶液を吸引した(以下、吸引は、吸引装置の設定を「-5 in Hg」にして行った)。吸引後、装置のバルブを閉じ、マニホールドからプレートを取り外した。プレートの各ウェルにメンブレン洗浄液(25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl)を200μLずつ加え、プレートを再びマニホールドに設置して、ウェル内の溶液を吸引した。そして、上記の測定用試料の希釈液を100μLずつウェルに分注した。また、検量線作成のためのCDK標準品溶液を100μLずつウェルに分注した。
なお、測定用試料の希釈液は下記のようにして調製した。また、CDK標準品溶液として、下記の濃度のCDK1溶液及びCDK2溶液を用いた。
メンブレン洗浄液(25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl) :475μL
検体希釈液(0.005% NP-40、25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl) :300μL
測定用試料 : 25μL
合計 :800μL
・CDK1標準品:340、170及び85 ng/mLの3点の希釈系列
・CDK2標準品:130、65及び32.5 ng/mLの3点の希釈系列
分注後、プレートをマニホールドに設置し、ウェル内の溶液を吸引することにより、溶液中のタンパク質をフィルタープレートに吸着させた。各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、再度吸引してフィルタープレートを洗浄した。
上記フィルタープレートの各ウェルにブロッキング試薬(4%BSA、TBS(pH7.4))を100μLずつ分注し、溶液を吸引した。そして、各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、再度吸引してフィルタープレートを洗浄した。
CDK1の発現量を測定するためのウェルには、抗CDK1ポリクローナル抗体(120μg/mL)を50μLずつ分注した。また、CDK2の発現量を測定するためのウェルには、抗CDK2ポリクローナル抗体(75μg/mL)を50μLずつ分注した。そして、ウェル内の溶液を吸引した。再度、各抗体溶液を50μLずつ添加して、23℃に設定した恒温器内で2時間インキュベートした。プレートをマニホールドに設置し、ウェル内の溶液を吸引した。そして、各ウェルにメンブレン洗浄液を300μLずつ加えた後、吸引する洗浄工程を4回繰り返した。
蛍光標識物質からの蛍光の検出にはプレートリーダー(InfiniteF200;テカン社製)を用いた。プレートリーダーの励起波長を485nm、蛍光波長を535nmに設定して、プレートの各ウェルの蛍光強度を測定した。CDK標準品溶液を分注したウェルの測定値から、蛍光強度とCDKの量との関係を示す検量線を作成した。この検量線と得られた測定値とから、各測定用試料に含まれるCDK1及びCDK2の発現量を定量した。
(4-1)20%プロテインAビーズ懸濁液の調製
プロテインAビーズ(カタログNo. 17-5280-04;GEヘルスケア社)の試薬容器を転倒混和してビーズを懸濁させ、免疫沈降緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH7.4)、0.1 % NP-40)を加えて20%のビーズ懸濁液を調製した。
免疫沈降用フィルタープレート(製品名:MultiScreen(登録商標)HTS FilterPlate Hydrophilic, Millipore社製, 型番:MSHVN4550)の各ウェルに、上記の20%プロテインAビーズ懸濁液を30μLずつ分注した。該プレートにおいて、CDK1の活性値を取得するためのウェルには、抗CDK1抗体(8μg/ウェル)を、CDK2の活性値を取得するためのウェルには、抗CDK2抗体(3μg/ウェル)を、バックグラウンド測定のためのウェルには、ウサギIgG(5μg/ウェル)(CALBIOCHEM社)を添加した。そして、上記(3-1)で調製した測定用試料の希釈液を90μLずつウェルに分注した。また、検量線作成のためのCDK標準品溶液を30μLずつウェルに分注した。なお、CDK標準品溶液として、CDK1標準品溶液(5、2.5及び1.25 ng)とCDK2標準品溶液(40、20及び10 ng)との混合液である、3点の希釈系列を用いた。
上記の洗浄操作後のプレートの各ウェルに、酵素反応試薬(200μg/mLヒストンH1タンパク質、5mM ATP-γ-S、20 mM Tris-HCl (pH7.4))を50μLずつ分注した。プレートにフタをして、37℃に設定した恒温振とう機を用いて、900 rpmで60分間撹拌し、酵素反応を行った。この反応により、基質タンパク質のヒストンH1がチオリン酸化される。プレートを恒温振とう機から取り出し、該プレートの下部に回収用プレート(Rigid Plate V Bottom Non-Sterile Clear;Sterilin社製)を重ねた。2つのプレートを重ねた状態で遠心分離(4℃、2000 rpm、5分間)して、回収用プレートに反応生成物の溶液を得た。
上記のようにして回収した反応生成物の溶液を、蛍光標識化反応用プレート(MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate;Applied Biosystems社製)の各ウェルに14μLずつ分注した。さらに、蛍光標識試薬(400 nM 5-インドアセトアミドフルオレセイン)を各ウェルに14μLずつ分注し、プレートを撹拌した。そして、プレートをアルミホイルに包んで遮光し、25℃に設定した恒温振とう機を用いて400 rpmで20分間撹拌して、蛍光標識反応を行った。反応停止液(2M MOPS、60 mM N-アセチルシステイン、pH7.4)を各ウェルに200μLずつ分注し、撹拌して蛍光標識反応を停止させた。
活性測定用フィルタープレート(MultiScreen HTS FilterPlate, Hydrophobic;ミリポア社製)の裏面のアンダードレインをゆっくりと取り外し、吸引装置に設置した。活性測定用フィルタープレートの各ウェルに70%エタノールを100μLずつ加え、これを吸引装置で吸引した。吸引後、装置のバルブを閉じ、ポンプをOFFにした。プレートの各ウェルにメンブレン洗浄液(25 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl)を200μLずつ加え、これを吸引装置で吸引した。そして、上記の蛍光標識化反応用プレート中の反応を停止させた溶液を、活性測定用プレートの各ウェルに100μLずつ移した。吸引装置のバルブを開いて、活性測定用プレートのウェル内の溶液を吸引した。メンブレン洗浄液を各ウェルに300μLずつ分注し、これを吸引装置で吸引した。プレートの底をキムタオル(登録商標)(日本製紙クレシア株式会社)に押し付けて、残った溶液を吸収させた。そして、60℃に設定した恒温器内にプレートを逆さまに置いて、充分乾燥させた。
蛍光標識物質からの蛍光の検出にはプレートリーダー(InfiniteF200;テカン社製)を用いた。プレートリーダーの励起波長を485nm、蛍光波長を535nmに設定して、活性測定用プレートの各ウェルの蛍光強度を測定した。CDK標準品溶液を分注したウェルの測定値から、蛍光強度とCDKの活性との関係を示す検量線を作成した。この検量線と得られた測定値から、各測定用試料に含まれるCDK1及びCDK2の活性値を定量した。
uPA及びPAI−1の発現量は、上記(3-1)で調製した測定用試料の希釈液を、American Diagnostica社製のELISA測定キット(uPA ELISA kit(製品番号894)及びPAI-1 ELISA kit(製品番号821))を用いて測定することにより取得した。なお、測定は、キットに添付されたマニュアルの記載に従って行った。具体的には、以下のとおりである。
抗uPA抗体が予めコートされたマイクロプレートの各ウェルに、測定用試料の希釈液及びキットに添付されたuPAの標準品溶液を100μLずつ加えた。抗PAI−1抗体が予めコートされたプレートについても同様に、測定用試料の希釈液及びキットに添付されたPAI−1の標準品溶液を100μLずつ加えた。これらのプレートを4℃で一晩インキュベートした。各プレートのウェルをキットに添付の洗浄用緩衝液で4回洗浄した。抗uPA抗体が予めコートされたマイクロプレートの各ウェルに、検出用の抗uPA抗体を100μLずつ加えた。抗PAI−1抗体が予めコートされたプレートについても同様に、検出用の抗PAI−1抗体を100μLずつ加えた。これらのプレートを室温で1時間インキュベートし、各プレートのウェルを洗浄用緩衝液で4回洗浄した。各ウェルに、キットに添付の酵素コンジュゲート希釈液を100μLずつ加えた。これらのプレートを室温で1時間インキュベートし、各プレートのウェルを洗浄用緩衝液で4回洗浄した。各ウェルに、キットに添付の基質溶液を100μLずつ加えて、室温で20分間インキュベートした。そして、各ウェルに0.5N H2SO4を50μLずつ加えて反応を停止させた。そして、各ウェルの450 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。uPA及びPAI−1の標準品溶液を分注したウェルの測定値から、吸光度と発現量との関係を示す検量線を作成した。この検量線と得られた測定値から、各測定用試料に含まれるuPA及びPAI−1の発現量を定量した。
(6-1)再発リスクスコア及びCDK1の比活性の算出
上記のようにして得たCDK1及びCDK2の発現量及び活性値を用いて、下記の式(1)〜(3)に基づいて再発リスクスコア(RRS)を算出した。また、下記の式(4)に基づいてCDK1の比活性を算出した。
F(x)=0.15/(1+Exp(−(x−1.6)×7) ・・・(2)
G(y)=0.25/(1+Exp(−(y−1.0)×6) ・・・(3)
[ただし、式(2)及び式(3)において、
x=(CDK1活性値)/(CDK1発現量)であり、
y=[(CDK2活性値)×(CDK1発現量)]/[(CDK2発現量)×(CDK1活性値)]である。]
(CDK1比活性)=(CDK1活性値)/(CDK1発現量) ・・・(4)
従来法1による再発リスクの判定では、各検体について算出したRRS及びCDK1の比活性の値を、それぞれの閾値と比較して、癌患者を再発リスクの高い群(Highグループ)と、再発リスクの低い群(Lowグループ)とに分類した。すなわち、(RRS)≧0.45であるか又は(CDK1比活性)≧70(maU/eU)である検体の患者をHighグループと判定した。また、(RRS)<0.45であり、且つ(CDK1比活性)<70(maU/eU)である検体の患者をLowグループと判定した。
従来法2による再発リスクの判定では、各検体について取得したuPA及びPAI−1の発現量の値を、それぞれの閾値と比較して、癌患者を再発リスクの高い群(Highグループ)と、再発リスクの低い群(Lowグループ)とに分類した。すなわち、(uPAの発現量)≧3(ng/mg総タンパク量)であるか又は(PAI−1の発現量)≧14(ng/mg総タンパク量)である検体の患者をHighグループと判定した。また(uPAの発現量)<3(ng/mg総タンパク量)であり、且つ(PAI−1の発現量)<14(ng/mg総タンパク量)である検体の患者をLowグループと判定した。
本発明の判定方法による再発リスクの判定では、各検体について算出したRRS及びCDK1の比活性の値、並びに取得したuPA及びPAI−1の発現量の値を、それぞれの閾値と比較して、癌患者を再発リスクの高い群(Highグループ)と、再発リスクの低い群(Lowグループ)とに分類した。すなわち、(RRS)≧0.45であるか、(CDK1比活性)≧70(maU/eU)であるか、(uPAの発現量)≧3(ng/mg総タンパク量)であるか又は(PAI−1の発現量)≧14(ng/mg総タンパク量)である検体の患者をHighグループと判定した。また、(RRS)<0.45であり、(CDK1比活性)<70(maU/eU)であり、(uPAの発現量)<3(ng/mg総タンパク量)であり、且つ(PAI−1の発現量)<14(ng/mg総タンパク量)である検体の患者をLowグループと判定した。
従来法1では、Highグループに分類された20例のうちの12例(60%)およびLowグループに分類された19例のうちの6例(32%)が、再発により死亡した患者の検体であった。また、従来法2では、Highグループに分類された25例のうちの14例(56%)およびLowグループに分類された14例のうちの4例(29%)が、再発により死亡した患者の検体であった。すなわち、従来法1及び2では、再発リスクが低いと判定されたLowグループの5年後の無再発生存率は、いずれも90%未満であった。さらに、従来法1及び2により分類されたHighグループとLowグループとの間には、統計学的有意差は認められなかった(それぞれ、P=0.0976およびP=0.1)。
これに対して、本発明の方法では、Highグループに分類された29例のうちの17例(59%)およびLowグループに分類された10例のうちの1例(10%)が、再発により死亡した患者の検体であった。すなわち、本発明の判定方法では、Lowグループの5年後の無再発生存率は90%であった。また、HighグループとLowグループとの間には、統計学的有意差が認められた(P=0.0087)。
よって、本発明の判定方法は、従来法に比べて高い判定精度を有しており、この方法に用いられる判定項目の組み合わせは、強力な再発リスク予測因子となり得ることが示唆された。
表2より、従来法1及び2では、それぞれ危険率が2.2及び1.7であったが、本発明の判定方法では危険率が9.2と著しく高くなった。この値は、従来法1及び2の危険率の値の和(3.9)よりも高いことから、本発明の判定方法では、再発リスクの予測性能が相乗的に向上していることが示唆された。
この参考例では、上記の生体試料について、従来法1又は従来法2に種々の病理学的診断項目を組み合わせた場合、癌の再発リスクの判定精度がどの程度向上するのかを検討することを目的とする。
用いられた病理学的診断項目は、患者の年齢、腫瘍径、リンパ節転移の有無、組織学的グレード分類、ホルモン受容体(プロゲステロン受容体(PR))の発現、Her2の発現である。それぞれの項目のリスク分類のための閾値は、以下の表3に示す。
従来法2に種々の病理学的診断項目を組み合わせた場合、患者の癌の再発リスクの判定は次のようにして行った。従来法2及び病理学的診断項目の両方で低リスクと判定された検体の患者を、Lowグループと判定した。また、従来法2又は病理学的診断項目のいずれかで高リスクと判定された検体の患者を、Highグループと判定した。
各組み合わせのハザード比(Lowグループ対Highグループ、Cox比例ハザードモデル)を、以下の表5に示す。また、各組み合わせのハザード比を、各項目のハザード比の和で除した値を、表5及び図4に示す。
これに対し、本発明の判定方法である従来法1と従来法2とを組み合わせた場合、得られたハザード比は9.177であった。この値は、それぞれのハザード比を足した値「3.962」よりも有意に高い値であった。図4は、表5に示す各項目の組み合わせによって得られたハザード比を、各項目それぞれのハザード比の和によって除した値を、組み合わせ毎に示すグラフである。
図4を参照して、従来法1と従来法2とを組み合わせた本発明の判定方法は、他の組合せによる判定方法と比較して、判定精度が顕著に向上していることがわかる。
110 本体
110a CPU
110b ROM
110c RAM
110d ハードディスク(HD)
110e 読出装置
110f 入出力インターフェース
110g 画像出力インターフェース
110h バス
120 表示部
130 入力デバイス
140 可搬型記憶媒体
140a アプリケーションプログラム
200 測定装置
300 ケーブル
Claims (9)
- 乳癌患者から採取した生体試料から、CDK1の活性値及び発現量と、CDK2の活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とを取得するステップと、
取得したCDK1の活性値及び発現量と、CDK2の活性値及び発現量とに基づいて再発リスクスコアを取得し、取得した再発リスクスコアと、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定するステップと
を含み、
前記再発リスクスコアが、下記の式(1):
(再発リスクスコア)=F(x)×G(y) ・・・(1)
[式中、
xはCDK1の比活性を表し、このCDK1の比活性は、(CDK1の活性値)/(CDK1の発現量)で示され;
yは比活性の比を表し、この比活性の比は、(CDK2の比活性)/(CDK1の比活性)で示され、CDK2の比活性は、(CDK2の活性値)/(CDK2の発現量)で示される]
に基づいて取得される値であり、
前記F(x)及びG(y)が、それぞれ下記の式(2)及び(3):
F(x)=a/(1+Exp(−(x−b)×c)) ・・・(2)
G(y)=d/(1+Exp(−(y−e)×f)) ・・・(3)
[式中、
a、b及びcは、xと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり;
d、e及びfは、yと癌の再発率との相関関係から定められた定数である]
であり、
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第1の閾値未満であり、uPAの発現量が第2の閾値未満であり、且つPAI−1の発現量が第3の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定する、
乳癌の再発リスクの判定方法。 - 前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第1の閾値以上であるか、uPAの発現量が第2の閾値以上であるか又はPAI−1の発現量が第3の閾値以上であるとき、乳癌の再発リスクが高いと判定する請求項1に記載の判定方法。
- 前記判定ステップにおいて、さらに、(CDK1の活性値)/(CDK1の発現量)で示されるCDK1の比活性を取得し、
取得したCDK1の比活性と、再発リスクスコアと、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定する請求項1に記載の判定方法。 - 前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第1の閾値未満であり、CDK1の比活性が第4の閾値未満であり、uPAの発現量が第2の閾値未満であり、且つPAI−1の発現量が第3の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定する請求項3に記載の判定方法。
- 前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第1の閾値以上であるか、uPAの発現量が第2の閾値以上であるか、PAI−1の発現量が第3の閾値以上であるか又はCDK1の比活性が第4の閾値以上であるとき、乳癌の再発リスクが高いと判定する請求項3または4に記載の判定方法。
- 乳癌患者から採取した生体試料が、乳腺組織である請求項1〜5のいずれか1項に記載の判定方法。
- 乳癌患者から採取した生体試料から取得したCDK1の活性値及び発現量と、CDK2の活性値及び発現量と、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とを受信するステップと、
受信したCDK1の活性値及び発現量と、CDK2の活性値及び発現量とに基づいて再発リスクスコアを算出し、算出した再発リスクスコアと、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定するステップと、
得られた判定結果を出力するステップと
をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、
前記再発リスクスコアが、下記の式(1):
(再発リスクスコア)=F(x)×G(y) ・・・(1)
[式中、
xはCDK1の比活性を表し、このCDK1の比活性は、(CDK1の活性値)/(CDK1の発現量)で示され;
yは比活性の比を表し、この比活性の比は、(CDK2の比活性)/(CDK1の比活性)で示され、CDK2の比活性は、(CDK2の活性値)/(CDK2の発現量)で示される]
に基づいて算出される値であり、
前記F(x)及びG(y)が、それぞれ下記の式(2)及び(3):
F(x)=a/(1+Exp(−(x−b)×c)) ・・・(2)
G(y)=d/(1+Exp(−(y−e)×f)) ・・・(3)
[式中、
a、b及びcは、xと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり;
d、e及びfは、yと癌の再発率との相関関係から定められた定数である]
であり、
前記判定ステップにおいて、再発リスクスコアが第1の閾値未満であり、uPAの発現量が第2の閾値未満であり、且つPAI−1の発現量が第3の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定する、
前記コンピュータプログラム。 - 前記判定ステップが、
さらに、(CDK1の活性値)/(CDK1の発現量)で示されるCDK1の比活性を算出し、
算出したCDK1の比活性と、再発リスクスコアと、uPAの発現量と、PAI−1の発現量とに基づいて乳癌の再発リスクを判定するステップである請求項7に記載のコンピュータプログラム。 - 前記判定ステップが、
再発リスクスコアが第1の閾値未満であり、uPAの発現量が第2の閾値未満であり、PAI−1の発現量が第3の閾値未満であり、且つCDK1の比活性が第4の閾値未満であるとき、乳癌の再発リスクが低いと判定するステップである請求項8に記載のコンピュータプログラム。
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