JPH08240583A - 毒性物質を検出する方法 - Google Patents
毒性物質を検出する方法Info
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- JPH08240583A JPH08240583A JP7294877A JP29487795A JPH08240583A JP H08240583 A JPH08240583 A JP H08240583A JP 7294877 A JP7294877 A JP 7294877A JP 29487795 A JP29487795 A JP 29487795A JP H08240583 A JPH08240583 A JP H08240583A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡便にかつ正確に毒物を測定することができ
る、毒性物質の検出方法を提供すること。 【解決手段】 毒性物質（アフラトキシンを除く）を含
んでいるかもしれない試料を準備する工程と、固相吸着
剤とこの上に固定化され、前記毒性物質に対して特異的
なモノクローナル抗体とを含む親和性カラム上に該試料
を載せる工程と、溶媒をカラムに通し、第１の流出物を
回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクローナ
ル抗体によって前記カラム上に保持する工程と、溶離剤
をカラムに通して第２の流出物を回収し、それによって
前記毒性物質を前記モノクローナル抗体から溶離させて
前記第２の流出物中に回収する工程と、前記毒性物質の
存在を検出するために前記第２の流出物をさらに精製す
ることなく紫外線にさらすことによって蛍光分析を行な
う工程とを含む、被検試料中の毒性物質を検出する方
法。
る、毒性物質の検出方法を提供すること。 【解決手段】 毒性物質（アフラトキシンを除く）を含
んでいるかもしれない試料を準備する工程と、固相吸着
剤とこの上に固定化され、前記毒性物質に対して特異的
なモノクローナル抗体とを含む親和性カラム上に該試料
を載せる工程と、溶媒をカラムに通し、第１の流出物を
回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクローナ
ル抗体によって前記カラム上に保持する工程と、溶離剤
をカラムに通して第２の流出物を回収し、それによって
前記毒性物質を前記モノクローナル抗体から溶離させて
前記第２の流出物中に回収する工程と、前記毒性物質の
存在を検出するために前記第２の流出物をさらに精製す
ることなく紫外線にさらすことによって蛍光分析を行な
う工程とを含む、被検試料中の毒性物質を検出する方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、毒物を検出する方
法に関する。すなわち、本発明は、環境的に発生してい
る毒素に対するヒト及び動物の暴露を評価するための非
侵入性免疫学的スクリーニング操作に関する。さらに詳
細に言うと、本発明は、世界の多くの地域に存在する突
然変異原物質及び発癌物質を検出するための免疫学的方
法に関する。
法に関する。すなわち、本発明は、環境的に発生してい
る毒素に対するヒト及び動物の暴露を評価するための非
侵入性免疫学的スクリーニング操作に関する。さらに詳
細に言うと、本発明は、世界の多くの地域に存在する突
然変異原物質及び発癌物質を検出するための免疫学的方
法に関する。
【０００２】ヒト及び他の動物が、食物、水及び空気を
介して毒性物質にさらされること及びその効果は我々の
生存にとって極めて重大な問題である。一般的な毒性物
質群の中で、アフラトキシン（aflatoxin)類、フルオラ
ンテン、ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニトロ
クリセン及びアミノビフェニルのような低分子量（１０
００ダルトン又はそれ以下）の突然変異原物質及び／又
は発癌物質を検出することがより重要になってきてい
る。特に、アフラトキシンのような物質にヒトがされさ
れているかどうかを評価する非侵入性スクリーニング方
法は、毒物そのものと、その代謝物、特に血清や尿のよ
うな体液中でＤＮＡ及びタンパク質と形成される共有結
合付加物の両方を検出できなければならない。
介して毒性物質にさらされること及びその効果は我々の
生存にとって極めて重大な問題である。一般的な毒性物
質群の中で、アフラトキシン（aflatoxin)類、フルオラ
ンテン、ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニトロ
クリセン及びアミノビフェニルのような低分子量（１０
００ダルトン又はそれ以下）の突然変異原物質及び／又
は発癌物質を検出することがより重要になってきてい
る。特に、アフラトキシンのような物質にヒトがされさ
れているかどうかを評価する非侵入性スクリーニング方
法は、毒物そのものと、その代謝物、特に血清や尿のよ
うな体液中でＤＮＡ及びタンパク質と形成される共有結
合付加物の両方を検出できなければならない。
【０００３】アフラトキシンは、この群に含まれる毒性
及び発癌性化合物の代表的なものである。アフラトキシ
ンはマイコトキシンと呼ばれる、菌類の二次代謝物であ
り、アスパラギルス・フラブス（Aspergillus flavus)
及びアスパラギルス・パラシティカス（Aspergillus pa
rasiticus)によって生産され、構造的には縮合ジヒドロ
フロフラン部分を含む置換フマリン類である。アフラト
キシンはピーナツ、ピーナツミール、綿実ミール、トウ
モロコシ、乾燥チリ胡椒等に天然に含まれている。しか
しながら、カビの生育自体によっては、この毒素の存在
及び濃度を予測することができない。なぜなら、アフラ
トキシンの産出量は、カビの生育条件及びその種の遺伝
的性質に依存するからである。種々のアフラトキシン、
すなわちＢ1 型、Ｂ2 型、Ｇ1 型、Ｇ2 型、Ｍ1 型及び
Ｍ2 型は単離され、特徴づけられている。アフラトキシ
ンＢ1 型（以下、ＡＦＢ1 という）はこれらの化合物の
中で最も生物的に活性で、多くの動物種に対して毒的
で、突然変異原物質及び発癌物質として作用する。この
マイコトキシンは世界の多くの地域でヒトの食物にしば
しば混入しており、これらの地域、特にアジア及びアフ
リカでは、ヒト肝臓癌の発生頻度が高くなっているとい
う統計がある（ブスビーら、Food-Born Infections and
Intoxications（リーマン及びブリアン編）、第２版、
アカデミック・プレス社、1979, pp.519-610）、ウォー
ガン・ジー・エヌ、Methods Cancer Res. 7: pp.309-34
4 (1973)) 。
及び発癌性化合物の代表的なものである。アフラトキシ
ンはマイコトキシンと呼ばれる、菌類の二次代謝物であ
り、アスパラギルス・フラブス（Aspergillus flavus)
及びアスパラギルス・パラシティカス（Aspergillus pa
rasiticus)によって生産され、構造的には縮合ジヒドロ
フロフラン部分を含む置換フマリン類である。アフラト
キシンはピーナツ、ピーナツミール、綿実ミール、トウ
モロコシ、乾燥チリ胡椒等に天然に含まれている。しか
しながら、カビの生育自体によっては、この毒素の存在
及び濃度を予測することができない。なぜなら、アフラ
トキシンの産出量は、カビの生育条件及びその種の遺伝
的性質に依存するからである。種々のアフラトキシン、
すなわちＢ1 型、Ｂ2 型、Ｇ1 型、Ｇ2 型、Ｍ1 型及び
Ｍ2 型は単離され、特徴づけられている。アフラトキシ
ンＢ1 型（以下、ＡＦＢ1 という）はこれらの化合物の
中で最も生物的に活性で、多くの動物種に対して毒的
で、突然変異原物質及び発癌物質として作用する。この
マイコトキシンは世界の多くの地域でヒトの食物にしば
しば混入しており、これらの地域、特にアジア及びアフ
リカでは、ヒト肝臓癌の発生頻度が高くなっているとい
う統計がある（ブスビーら、Food-Born Infections and
Intoxications（リーマン及びブリアン編）、第２版、
アカデミック・プレス社、1979, pp.519-610）、ウォー
ガン・ジー・エヌ、Methods Cancer Res. 7: pp.309-34
4 (1973)) 。
【０００４】ＡＦＢ1 はまた、酸化的代謝を受けた後Ｄ
ＮＡ中のグアニンと共有結合性の付加物を形成して非常
に反応性に富んだ２，３−エポキシドになる。代表的な
付加物は２，３−ジヒドロ−２−（Ｎ7 −グアニル）−
３−ヒドロキシアフラトキシンＢ（以下、AFB1-N7-Gua
と記載する）である（リンら、Cancer Res. 37: pp.443
0-4438 (1977);マーチンら、Nature（ロンドン）、267:
pp.863-865 (1977))。AFB1-N7-Gua 付加物及びその推
定される誘導体である2,3-ジヒドロ-2-(N5- ホルミル-
2',5',6'-トリアミノ-4'-オキソ-N5-ピリミジル）-3-
ヒドロキシアフラトキシンＢ1 （以下、AF-N7-Gua と記
載する）は、ラットの生体肝臓、ヒト気管支及び結腸組
織培養物、ヒト肺臓細胞培養物のような組織及び系中
で、一時的に又は慢性的に投与した後同定されている
（ハウゲンら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:pp.4124
-4127 (1987))。
ＮＡ中のグアニンと共有結合性の付加物を形成して非常
に反応性に富んだ２，３−エポキシドになる。代表的な
付加物は２，３−ジヒドロ−２−（Ｎ7 −グアニル）−
３−ヒドロキシアフラトキシンＢ（以下、AFB1-N7-Gua
と記載する）である（リンら、Cancer Res. 37: pp.443
0-4438 (1977);マーチンら、Nature（ロンドン）、267:
pp.863-865 (1977))。AFB1-N7-Gua 付加物及びその推
定される誘導体である2,3-ジヒドロ-2-(N5- ホルミル-
2',5',6'-トリアミノ-4'-オキソ-N5-ピリミジル）-3-
ヒドロキシアフラトキシンＢ1 （以下、AF-N7-Gua と記
載する）は、ラットの生体肝臓、ヒト気管支及び結腸組
織培養物、ヒト肺臓細胞培養物のような組織及び系中
で、一時的に又は慢性的に投与した後同定されている
（ハウゲンら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:pp.4124
-4127 (1987))。
【０００５】免疫学的方法及びモノクローナル抗体を用
いた、ＡＦＢ1 及びそのＤＮＡ付加物を包含する代謝物
質の定量方法が研究されている（ハーツォグら、Carcin
ogenesis 3: pp.825-828 (1982);ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981))。同様な
研究が、免疫学的方法及び試薬を用いて、我々の環境中
に見出される他の低分子量の毒物について行われている
（ジョンソンら、J. Analyt. Toxicol. 4:pp.86-90; ヒ
ューら、J. Food Prot. 47: pp.562-569 (1984))。それ
にもかかわらず、現在知られている限りでは、このよう
な環境中に存在する発癌物質にヒト及び動物がさらされ
ているかどうかを評価する一般的な非侵入性スクリーニ
ング方法は未だ確立されていない。
いた、ＡＦＢ1 及びそのＤＮＡ付加物を包含する代謝物
質の定量方法が研究されている（ハーツォグら、Carcin
ogenesis 3: pp.825-828 (1982);ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981))。同様な
研究が、免疫学的方法及び試薬を用いて、我々の環境中
に見出される他の低分子量の毒物について行われている
（ジョンソンら、J. Analyt. Toxicol. 4:pp.86-90; ヒ
ューら、J. Food Prot. 47: pp.562-569 (1984))。それ
にもかかわらず、現在知られている限りでは、このよう
な環境中に存在する発癌物質にヒト及び動物がさらされ
ているかどうかを評価する一般的な非侵入性スクリーニ
ング方法は未だ確立されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
にかつ正確に毒物を測定することができる、毒性物質の
検出方法を提供することである。
にかつ正確に毒物を測定することができる、毒性物質の
検出方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、毒性物質（ア
フラトキシンを除く）を含んでいるかもしれない試料を
準備する工程と、固相吸着剤とこの上に固定化され、前
記毒性物質に対して特異的なモノクローナル抗体とを含
む親和性カラム上に該試料を載せる工程と、溶媒をカラ
ムに通し、第１の流出物を回収し、それによって前記毒
性物質を前記モノクローナル抗体によって前記カラム上
に保持する工程と、溶離剤をカラムに通して第２の流出
物を回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクロ
ーナル抗体から溶離させて前記第２の流出物中に回収す
る工程と、前記毒性物質の存在を検出するために前記第
２の流出物をさらに精製することなく紫外線にさらすこ
とによって蛍光分析を行なう工程とを含む、被検試料中
の毒性物質を検出する方法を提供する。なお、本明細書
で言う「検出」には存在の検出及び定量の両者が包含さ
れる。
フラトキシンを除く）を含んでいるかもしれない試料を
準備する工程と、固相吸着剤とこの上に固定化され、前
記毒性物質に対して特異的なモノクローナル抗体とを含
む親和性カラム上に該試料を載せる工程と、溶媒をカラ
ムに通し、第１の流出物を回収し、それによって前記毒
性物質を前記モノクローナル抗体によって前記カラム上
に保持する工程と、溶離剤をカラムに通して第２の流出
物を回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクロ
ーナル抗体から溶離させて前記第２の流出物中に回収す
る工程と、前記毒性物質の存在を検出するために前記第
２の流出物をさらに精製することなく紫外線にさらすこ
とによって蛍光分析を行なう工程とを含む、被検試料中
の毒性物質を検出する方法を提供する。なお、本明細書
で言う「検出」には存在の検出及び定量の両者が包含さ
れる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、毒性物質が次の２つの
性質を有する限り、毒性物質一般の検出及び単離に有用
である。第１の性質は分子量が約１０００ダルトン以下
であること、第２の性質は、その毒性物質が単独で又は
他の化合物と結合して、動物生体中で免疫応答を誘起す
ることができることである。
性質を有する限り、毒性物質一般の検出及び単離に有用
である。第１の性質は分子量が約１０００ダルトン以下
であること、第２の性質は、その毒性物質が単独で又は
他の化合物と結合して、動物生体中で免疫応答を誘起す
ることができることである。
【０００９】分子量が約１０００以下であるという第１
の要件は、あらゆる毒性物質について容易に決定でき
る。ここで用いる「毒性物質」という語は、生体外試験
又は生体試験（疫学試験を含む）において、有害、危険
的、又は破壊的であることが示されている全ての化合物
を包含する。最も注目すべきものは、この分野において
用いられ認められている意味において突然変異原的、遺
伝毒的、及び／又は発癌的であることが示されている化
合物である。
の要件は、あらゆる毒性物質について容易に決定でき
る。ここで用いる「毒性物質」という語は、生体外試験
又は生体試験（疫学試験を含む）において、有害、危険
的、又は破壊的であることが示されている全ての化合物
を包含する。最も注目すべきものは、この分野において
用いられ認められている意味において突然変異原的、遺
伝毒的、及び／又は発癌的であることが示されている化
合物である。
【００１０】被検動物体内に導入された場合に免疫応答
を誘起するという、毒性物質の第２の性質は、主として
（排他的ではないが）その抗体形成を誘起する能力に依
存する。抗体の産生は、しばしば、他の免疫応答の前及
び後のいずれでも起こり、抗体の生産は抗原（又はハプ
テン）の製造方法及び導入方法に依存し、これらは定量
的及び定性的抗体反応に直接影響することが認められて
いる。このため、ある種の免疫応答が観察される限り、
この分野において現在知られている方法及び操作を用い
て特異的抗体を産生できることが理解されるべきであ
る。
を誘起するという、毒性物質の第２の性質は、主として
（排他的ではないが）その抗体形成を誘起する能力に依
存する。抗体の産生は、しばしば、他の免疫応答の前及
び後のいずれでも起こり、抗体の生産は抗原（又はハプ
テン）の製造方法及び導入方法に依存し、これらは定量
的及び定性的抗体反応に直接影響することが認められて
いる。このため、ある種の免疫応答が観察される限り、
この分野において現在知られている方法及び操作を用い
て特異的抗体を産生できることが理解されるべきであ
る。
【００１１】本発明は従って、上記２つの要件に合致す
る全ての毒性物質に一般的に適用される。この群の化合
物に特に包含されるものとしてフルオランテン、ニトロ
ピレン、ニトロソピレン、ニトロフルオランテン、ニト
ロクリセン及びアミノビフェニル類（及びそれらの誘導
体）のような多核芳香族炭化水素を挙げることができ
る。この芳香族炭化水素類及び上述した例はいずれも認
められた免疫原であり、その性質上変異原的／発癌的な
ものである。免疫原でもある毒性物質を全て列挙するこ
とは広範囲にわたり、化学組成及び構造が多岐にわた
り、米国健康及び人間サービス局の増え続けるリストに
鑑みて増え続けるものである。このことに鑑み、毒性物
質を全て完全に列挙することは不可能でもあり望ましく
もないのでここでは試みない。その代わり、代表的な毒
性物質であるＡＦＢ1 を、検出される毒性物質として記
載するが、その説明は、本発明の方法が適用される、上
記２つの基本的要件を満たす全ての群の毒性物質に適用
される。
る全ての毒性物質に一般的に適用される。この群の化合
物に特に包含されるものとしてフルオランテン、ニトロ
ピレン、ニトロソピレン、ニトロフルオランテン、ニト
ロクリセン及びアミノビフェニル類（及びそれらの誘導
体）のような多核芳香族炭化水素を挙げることができ
る。この芳香族炭化水素類及び上述した例はいずれも認
められた免疫原であり、その性質上変異原的／発癌的な
ものである。免疫原でもある毒性物質を全て列挙するこ
とは広範囲にわたり、化学組成及び構造が多岐にわた
り、米国健康及び人間サービス局の増え続けるリストに
鑑みて増え続けるものである。このことに鑑み、毒性物
質を全て完全に列挙することは不可能でもあり望ましく
もないのでここでは試みない。その代わり、代表的な毒
性物質であるＡＦＢ1 を、検出される毒性物質として記
載するが、その説明は、本発明の方法が適用される、上
記２つの基本的要件を満たす全ての群の毒性物質に適用
される。
【００１２】以下、本発明のここの部分を別々のセクシ
ョンに分離して記載する。なお、以下の実施例で得られ
たハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託してあり、その受託番号はATCC HB8
719 である。
ョンに分離して記載する。なお、以下の実施例で得られ
たハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託してあり、その受託番号はATCC HB8
719 である。
【００１３】Ｉ．アフラトキシン免疫原の製造 好ましい免疫原は、ウシガンマグロブリン（以下ＢＧＧ
という）にＡＦＢ1 が結合されたものを含む組成物であ
る。先ず、ＢＧＧをｐＨ７．０のリン酸緩衝液（以下、
ＰＢＳという）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ｍ
−クロロパーオキシ安息香酸を用いた方法（マーチン
ら、ネイチャー誌（ロンドン）267:pp.863-865）を修飾
した方法によってＡＦＢ1 をＢＧＧに結合した。典型的
には１ｍｇのＡＦＢ1 （３．２μｍｏｌ）を２．０ｍｌ
の塩化メチレンに溶かし、これを、予め２．０ｍｌの塩
化メチレンに溶解された５モル過剰のｍ−クロロパーオ
キシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）に加えた。この反応混合物
に、ＰＢＳ中に溶けたＢＧＧを加え、タンパク含量に対
し５モル過剰のアフラトキシンを生成した。反応混合物
を室温で一夜激しく混合し、次の２０００ｇで２０分間
遠心することによって反応を停止した。修飾ＢＧＧタン
パク質を含む水性の上層（上清）をｐＨ７．４のＰＢＳ
に対し十分に透析した。３６２ｎｍにおける吸光度を測
定し、モル消衰係数が１８０００であることを利用して
修飾グロブリンタンパク質の濃度を測定した。上記方法
により得られた反応生成物ＡＦＢ1 −ＢＧＧは、平均し
て１分子のＢＧＧに４０ないし５０のＡＦＢ1 残基が結
合していた。
という）にＡＦＢ1 が結合されたものを含む組成物であ
る。先ず、ＢＧＧをｐＨ７．０のリン酸緩衝液（以下、
ＰＢＳという）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ｍ
−クロロパーオキシ安息香酸を用いた方法（マーチン
ら、ネイチャー誌（ロンドン）267:pp.863-865）を修飾
した方法によってＡＦＢ1 をＢＧＧに結合した。典型的
には１ｍｇのＡＦＢ1 （３．２μｍｏｌ）を２．０ｍｌ
の塩化メチレンに溶かし、これを、予め２．０ｍｌの塩
化メチレンに溶解された５モル過剰のｍ−クロロパーオ
キシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）に加えた。この反応混合物
に、ＰＢＳ中に溶けたＢＧＧを加え、タンパク含量に対
し５モル過剰のアフラトキシンを生成した。反応混合物
を室温で一夜激しく混合し、次の２０００ｇで２０分間
遠心することによって反応を停止した。修飾ＢＧＧタン
パク質を含む水性の上層（上清）をｐＨ７．４のＰＢＳ
に対し十分に透析した。３６２ｎｍにおける吸光度を測
定し、モル消衰係数が１８０００であることを利用して
修飾グロブリンタンパク質の濃度を測定した。上記方法
により得られた反応生成物ＡＦＢ1 −ＢＧＧは、平均し
て１分子のＢＧＧに４０ないし５０のＡＦＢ1 残基が結
合していた。
【００１４】上記方法を用いてＡＦＢ1 を他の担体に結
合することもできる。例えば、ＡＦＢ1 がウシ血清アル
ブミン（以下、ＢＳＡという）に結合されたものは有用
な代替物である。しかしながら、ウシ血清アルブミンへ
のＡＦＢ1 の結合は、通常、１分子のＢＳＡに対しアフ
ラトキシンが２０ないし３０分子である。他の有用な担
体も、この分野において知られた方法を用いてＡＦＢ1
と結合することができる。このような結合体の例を列挙
すると以下のとおりである。ＡＦＢ1 −ＢＧＧ（ｍＣＰ
ＢＡ）、一本鎖ＡＦＢ1 −ＤＮＡ−ｍｅＢＳＡ、ＡＦＢ
1 −Ｎ7-Gua-BGG-PABA（パラ安息香酸）、ＡＦＢ1 −カ
ルボキシメチルオキシム−ＫＬＨ（キーホール・リンペ
ット・ヘモシアニン）、ＡＦＢ1 −ポリ−Gua-BGG 。
合することもできる。例えば、ＡＦＢ1 がウシ血清アル
ブミン（以下、ＢＳＡという）に結合されたものは有用
な代替物である。しかしながら、ウシ血清アルブミンへ
のＡＦＢ1 の結合は、通常、１分子のＢＳＡに対しアフ
ラトキシンが２０ないし３０分子である。他の有用な担
体も、この分野において知られた方法を用いてＡＦＢ1
と結合することができる。このような結合体の例を列挙
すると以下のとおりである。ＡＦＢ1 −ＢＧＧ（ｍＣＰ
ＢＡ）、一本鎖ＡＦＢ1 −ＤＮＡ−ｍｅＢＳＡ、ＡＦＢ
1 −Ｎ7-Gua-BGG-PABA（パラ安息香酸）、ＡＦＢ1 −カ
ルボキシメチルオキシム−ＫＬＨ（キーホール・リンペ
ット・ヘモシアニン）、ＡＦＢ1 −ポリ−Gua-BGG 。
【００１５】II. マウスの免疫化 約１６週齢のメスのＢＡＬＢ／Ｂｙ（ジャクソン・ラボ
ラトリー）を、ＰＢＳに溶解され、等体積のフロインド
の完全アジュバントで乳化したＡＦＢ1 −ＢＧＧで免疫
化した。それぞれ５匹のマウスから成る２群を用い、免
疫化は３７．５μｇ又は１２μｇのＡＦＢ1 −ＢＧＧ
（アジュバントを含む）のＰＢＳ溶液（終体積０．２ｍ
ｌ）を腹腔内投与することによって行った。最初の注射
から５週間及び９週間後、それぞれのマウスに、フロイ
ンドの不完全アジュバントで乳化した同量のＡＦＢ1 −
ＢＧＧを投与した。２回目の注射から約１０日後、尾か
ら出血させて血清試料を取り、ＥＬＩＳＡ免疫定量によ
って抗アフラトキシン抗体活性を測定した。血清中に特
異的抗体が見出されたマウスに対し、殺す３日前に同じ
ＡＦＢ1 −ＢＧＧのＰＢＳ溶液（０．１ｍｌ）を尾の静
脈に注射した。
ラトリー）を、ＰＢＳに溶解され、等体積のフロインド
の完全アジュバントで乳化したＡＦＢ1 −ＢＧＧで免疫
化した。それぞれ５匹のマウスから成る２群を用い、免
疫化は３７．５μｇ又は１２μｇのＡＦＢ1 −ＢＧＧ
（アジュバントを含む）のＰＢＳ溶液（終体積０．２ｍ
ｌ）を腹腔内投与することによって行った。最初の注射
から５週間及び９週間後、それぞれのマウスに、フロイ
ンドの不完全アジュバントで乳化した同量のＡＦＢ1 −
ＢＧＧを投与した。２回目の注射から約１０日後、尾か
ら出血させて血清試料を取り、ＥＬＩＳＡ免疫定量によ
って抗アフラトキシン抗体活性を測定した。血清中に特
異的抗体が見出されたマウスに対し、殺す３日前に同じ
ＡＦＢ1 −ＢＧＧのＰＢＳ溶液（０．１ｍｌ）を尾の静
脈に注射した。
【００１６】ＥＬＩＳＡ免疫定量はまた、マウス血清中
のＡＦＢ1 に対する特異的抗体の存在を調べるためにも
（そして次に特異的ハイブリドーマを同定するために
も）用いた。これらの定量方法は、この分野において公
知の方法を修飾したものである（ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981) 、グロー
プマンら、Cancer Res. 42:pp.3120-3124 (1982)）。こ
の方法を簡単に要約すると、ＡＦＢ1 −ＢＳＡを２．０
μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳに溶かし、この液体混合物の
５０μｌをポリビニルマイクロタイタープレートのそれ
ぞれのウェルに入れ、室温で２ないし４時間インキュベ
ートした。ウェルのいくつかには、２μｇ／ｍｌの濃度
のＢＳＡのＰＢＳ溶液５０μｌを入れ、対照とした。そ
れぞれのウェル中の液体を吸引し、ウェルを水で３回洗
った。次に、それぞれのウェルに、０．２％ＢＳＡ又は
０．２％ゼラチン（タイプIV、シグマ社）を含むＰＢＳ
溶液を入れ、プレートを室温でさらに１時間インキュベ
ートした。この操作は抗体の非特異的結合を制限するた
めに行った。プレートを次に水中で洗い、５０μｌのマ
ウス血清試料又はハイブリドーマ培地をそれぞれのウェ
ルに入れた。マウス血清を滴定するために、１０％のウ
シ胎児血清を含むＰＢＳ中に連続する３倍希釈により、
１：５０ないし３：５００００の範囲の希釈物をつくっ
た。ハイブリドーマ培地を用いた場合には、希釈物と共
に５０μｌを用いた。どちらの場合も、マイクロタイタ
ープレートを３７℃で９０分間インキュベートし、その
後水で完全に洗った。それぞれのウェルの表面に結合し
た特的抗体は、それぞれのウェルに、アルカリフォスフ
ァターゼに結合されたラットの抗マウスカッパ抗体の
１：２００希釈物を５０μｌ加え、室温で４時間又は４
℃で一夜インキュベートすることによって測定した。そ
れぞれのプレートのウェルは次に、水で再び洗った。ｐ
Ｈ９．８の０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液中でつく
った１．０ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ート溶液１００μｌをそれぞれのウェルに加え、１ない
し２時間反応させた。マイクロタイタープレートリーダ
ー（ダイナテック・ラボラトリー）を用いて４０５ｎｍ
でのウェルの吸光度を測定することによってｐ−ニトロ
フェノール反応生成物を定量した。
のＡＦＢ1 に対する特異的抗体の存在を調べるためにも
（そして次に特異的ハイブリドーマを同定するために
も）用いた。これらの定量方法は、この分野において公
知の方法を修飾したものである（ハウゲンら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:pp.4124-4127 (1981) 、グロー
プマンら、Cancer Res. 42:pp.3120-3124 (1982)）。こ
の方法を簡単に要約すると、ＡＦＢ1 −ＢＳＡを２．０
μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳに溶かし、この液体混合物の
５０μｌをポリビニルマイクロタイタープレートのそれ
ぞれのウェルに入れ、室温で２ないし４時間インキュベ
ートした。ウェルのいくつかには、２μｇ／ｍｌの濃度
のＢＳＡのＰＢＳ溶液５０μｌを入れ、対照とした。そ
れぞれのウェル中の液体を吸引し、ウェルを水で３回洗
った。次に、それぞれのウェルに、０．２％ＢＳＡ又は
０．２％ゼラチン（タイプIV、シグマ社）を含むＰＢＳ
溶液を入れ、プレートを室温でさらに１時間インキュベ
ートした。この操作は抗体の非特異的結合を制限するた
めに行った。プレートを次に水中で洗い、５０μｌのマ
ウス血清試料又はハイブリドーマ培地をそれぞれのウェ
ルに入れた。マウス血清を滴定するために、１０％のウ
シ胎児血清を含むＰＢＳ中に連続する３倍希釈により、
１：５０ないし３：５００００の範囲の希釈物をつくっ
た。ハイブリドーマ培地を用いた場合には、希釈物と共
に５０μｌを用いた。どちらの場合も、マイクロタイタ
ープレートを３７℃で９０分間インキュベートし、その
後水で完全に洗った。それぞれのウェルの表面に結合し
た特的抗体は、それぞれのウェルに、アルカリフォスフ
ァターゼに結合されたラットの抗マウスカッパ抗体の
１：２００希釈物を５０μｌ加え、室温で４時間又は４
℃で一夜インキュベートすることによって測定した。そ
れぞれのプレートのウェルは次に、水で再び洗った。ｐ
Ｈ９．８の０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液中でつく
った１．０ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ート溶液１００μｌをそれぞれのウェルに加え、１ない
し２時間反応させた。マイクロタイタープレートリーダ
ー（ダイナテック・ラボラトリー）を用いて４０５ｎｍ
でのウェルの吸光度を測定することによってｐ−ニトロ
フェノール反応生成物を定量した。
【００１７】マウス免疫グロブリンのサブタイプの同定
のための市販のキット（ベーリンガー−マンハイム社）
を用いた非競合的ＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗
体のイソタイプを決定した（すなわち、異なる抗体Ｈ鎖
群を同定した）。
のための市販のキット（ベーリンガー−マンハイム社）
を用いた非競合的ＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗
体のイソタイプを決定した（すなわち、異なる抗体Ｈ鎖
群を同定した）。
【００１８】III.ハイブリドーマの製造及びモノクロー
ナル抗体産生細胞の単離 予めフロインドの完全アジュバント中にＡＦＢ1 −ＢＧ
Ｇで免疫化したメスのＢＡＬＢ／Ｂｙ ＣＪマウスが有
意の抗ＡＦＢ1 血清タイターを有しているかどうかを上
述の非競合的ＥＬＩＳＡを用いて調べた。抗タイターを
示すマウスを殺し、マーシャク−ロスシュタインら、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー、１２２、pp.2491-24
97(1979)に記載された方法に従ってハイブリドーマをつ
くった。２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５８０μｇ
／ｍｌのグルタミン、１０ユニット／ｍｌのペニシリ
ン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び非必
須アミノ酸（ギブコ社）を加えたダルベッコの修飾イー
グル培地（以下、ＤＭＥ培地という）中に維持したＳＰ
２／０ミエローマ株細胞を融合細胞のために用いた。マ
スを殺し、０．０１Ｍのリン酸で緩衝された、ｐＨ７．
２のハンクの平衡塩溶液（以下、ＨＰＢＳという）を用
いて脾細胞の懸濁液をつくった。
ナル抗体産生細胞の単離 予めフロインドの完全アジュバント中にＡＦＢ1 −ＢＧ
Ｇで免疫化したメスのＢＡＬＢ／Ｂｙ ＣＪマウスが有
意の抗ＡＦＢ1 血清タイターを有しているかどうかを上
述の非競合的ＥＬＩＳＡを用いて調べた。抗タイターを
示すマウスを殺し、マーシャク−ロスシュタインら、ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー、１２２、pp.2491-24
97(1979)に記載された方法に従ってハイブリドーマをつ
くった。２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、５８０μｇ
／ｍｌのグルタミン、１０ユニット／ｍｌのペニシリ
ン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び非必
須アミノ酸（ギブコ社）を加えたダルベッコの修飾イー
グル培地（以下、ＤＭＥ培地という）中に維持したＳＰ
２／０ミエローマ株細胞を融合細胞のために用いた。マ
スを殺し、０．０１Ｍのリン酸で緩衝された、ｐＨ７．
２のハンクの平衡塩溶液（以下、ＨＰＢＳという）を用
いて脾細胞の懸濁液をつくった。
【００１９】これらのマウスからの脾細胞を、ゲフター
ら、Somatic Cell Genet. 3: pp.321(1977) に記載され
た方法を修飾した方法を用いてＳＰ２／０ミエローマ細
胞と融合した。他に断りがない限り、全ての遠心は室温
で７００ｇで５分間行った。好ましくは、５ｘ１０6 個
のＳＰ２／０ミエローマ細胞と５ｘ１０7 個の免疫脾細
胞とを丸底プラスチック管中で１つにし、遠心し、血清
を含まない１０ｍｌのＤＭＥ培地で再懸濁し、再び遠心
した。上清を慎重に捨て、遠心管中に残った細胞ペレッ
トを分散させるように、蛇口の水をペレット中に鋭くか
けた。次に細胞を無血清ＤＭＥ中に溶けた３０％（ｖ／
ｖ）のポリエチレングリコール１０００（ベーカー・ケ
ミカル社）の溶液０．５ｍｌに６分間さらした。この６
分の間に細胞をゆっくりと遠心した（１５０ｇで３分
間）。次に細胞ペレットに４．０ｍｌの無血清ＤＭＥを
加え、細胞を蛇口の水で再び懸濁した。管の内容物を１
００．１７ｍｍのペトリ皿に移し、２０％のウシ胎児血
清を含むＤＭＥ培地中で１日培養した。次に細胞を再び
懸濁し、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む生育培地（以下、ＨＡＴ培地という）中で再懸濁
した。平底マイクロタイタープレートのそれぞれのウェ
ルに、細胞を０．１ｍｌ（約１０5 個のＳＰ２／０細胞
を含む）ずつ入れた。１週間インキュベートした後、ヒ
ポキサンチン及びチミジンのみを含む生育培地（以下、
ＨＡＴ培地という）を０．０５ｍｌずつそれぞれのウェ
ルに加えた。融合２週間後、それぞれの培養物につい
て、上述したＥＬＩＳＡ免疫定量法を用いて特異的抗Ａ
ＦＢ1 抗体の有無を調べた。
ら、Somatic Cell Genet. 3: pp.321(1977) に記載され
た方法を修飾した方法を用いてＳＰ２／０ミエローマ細
胞と融合した。他に断りがない限り、全ての遠心は室温
で７００ｇで５分間行った。好ましくは、５ｘ１０6 個
のＳＰ２／０ミエローマ細胞と５ｘ１０7 個の免疫脾細
胞とを丸底プラスチック管中で１つにし、遠心し、血清
を含まない１０ｍｌのＤＭＥ培地で再懸濁し、再び遠心
した。上清を慎重に捨て、遠心管中に残った細胞ペレッ
トを分散させるように、蛇口の水をペレット中に鋭くか
けた。次に細胞を無血清ＤＭＥ中に溶けた３０％（ｖ／
ｖ）のポリエチレングリコール１０００（ベーカー・ケ
ミカル社）の溶液０．５ｍｌに６分間さらした。この６
分の間に細胞をゆっくりと遠心した（１５０ｇで３分
間）。次に細胞ペレットに４．０ｍｌの無血清ＤＭＥを
加え、細胞を蛇口の水で再び懸濁した。管の内容物を１
００．１７ｍｍのペトリ皿に移し、２０％のウシ胎児血
清を含むＤＭＥ培地中で１日培養した。次に細胞を再び
懸濁し、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む生育培地（以下、ＨＡＴ培地という）中で再懸濁
した。平底マイクロタイタープレートのそれぞれのウェ
ルに、細胞を０．１ｍｌ（約１０5 個のＳＰ２／０細胞
を含む）ずつ入れた。１週間インキュベートした後、ヒ
ポキサンチン及びチミジンのみを含む生育培地（以下、
ＨＡＴ培地という）を０．０５ｍｌずつそれぞれのウェ
ルに加えた。融合２週間後、それぞれの培養物につい
て、上述したＥＬＩＳＡ免疫定量法を用いて特異的抗Ａ
ＦＢ1 抗体の有無を調べた。
【００２０】ＡＦＢ1 に対し高い親和性を有するＩｇＭ
抗体を分泌しているハイブリドーマを、予め０．５ｍｌ
のプリステン（アドリッチ社）を注射したＢＡＬＢ／ｃ
マウス中に腹水腫瘍細胞として生育した。マウス中で生
育したハイブリドーマは特異的ＩｇＭ抗体を多量に生産
し、これはマウスが死ぬ前に腹水として回収された。こ
れらの動物からの腹水を貯蔵し、そのまま又は飽和硫酸
アンモニウム沈殿及びＰＢＳに対する透析によりさらに
精製して免疫定量法に用いた。肉眼で病理調査を行った
ところ、全てのマウスは、広範囲に広がる腫瘍の侵入、
すなわち、注射されたハイブリドーマ細胞の増殖の結果
死んだことがわかった。
抗体を分泌しているハイブリドーマを、予め０．５ｍｌ
のプリステン（アドリッチ社）を注射したＢＡＬＢ／ｃ
マウス中に腹水腫瘍細胞として生育した。マウス中で生
育したハイブリドーマは特異的ＩｇＭ抗体を多量に生産
し、これはマウスが死ぬ前に腹水として回収された。こ
れらの動物からの腹水を貯蔵し、そのまま又は飽和硫酸
アンモニウム沈殿及びＰＢＳに対する透析によりさらに
精製して免疫定量法に用いた。肉眼で病理調査を行った
ところ、全てのマウスは、広範囲に広がる腫瘍の侵入、
すなわち、注射されたハイブリドーマ細胞の増殖の結果
死んだことがわかった。
【００２１】この方法により得られたモノクローナル抗
体はＡＦＢ1 分子に対して特異性を有する抗親和性Ｉｇ
Ｍ抗体であることが示された。この抗体の親和定数をス
カッチャード（Scatchard)プロット分析及びミュラーの
方法（J. Immunol. Meth: 34, pp.345-352 (1980))によ
り決定したところ、８ｘ１０8 及び１ｘ１０9 リットル
／モルであった。これらの値は、下記の競合的ＲＩＡ法
により得られたデータから導かれたものである。
体はＡＦＢ1 分子に対して特異性を有する抗親和性Ｉｇ
Ｍ抗体であることが示された。この抗体の親和定数をス
カッチャード（Scatchard)プロット分析及びミュラーの
方法（J. Immunol. Meth: 34, pp.345-352 (1980))によ
り決定したところ、８ｘ１０8 及び１ｘ１０9 リットル
／モルであった。これらの値は、下記の競合的ＲＩＡ法
により得られたデータから導かれたものである。
【００２２】この分析は３００μｌの試料を用いて行
い、その１００μｌはモラベク・バイオケミカルズ社か
ら購入した［3H]-AFB1、トレーサー（非活性３．４Ｃｉ
／ｍｍｏｌ）から成る。トレーサー原液を、０．１％の
ＢＳＡを含む通常マウス血清の１％ＰＢＳ溶液で希釈
し、約２０２００ｃｐｍ／１００μｌの濃度にした。モ
ノクローナル抗体を、ＡＦＢ1 トレーサーの３０ないし
５０％が沈殿する濃度にまで希釈した。１０％ウシ胎児
血清ＰＢＳ溶液を含む抗体を１００μｌずつ反応混合物
に加えた。非放射標識ＡＦＢ1 又は、主なＡＦＢ1 −Ｄ
ＮＡ付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrを包含するそ
の代謝物から成る試料を１００μｌずつ管に加えた。反
応混合物を室温で２時間インキュベートし、次いで混合
物をＰＢＳで１．０ｍｌの体積になるように希釈した。
次に等量の氷冷飽和硫酸アンモニウムを加え、試料を混
合し、氷中に１５分間立てた。試料を次に２０００ｇで
１５分間遠心し、ミュラー法を用いて反応の阻害率
（％）を求めた。
い、その１００μｌはモラベク・バイオケミカルズ社か
ら購入した［3H]-AFB1、トレーサー（非活性３．４Ｃｉ
／ｍｍｏｌ）から成る。トレーサー原液を、０．１％の
ＢＳＡを含む通常マウス血清の１％ＰＢＳ溶液で希釈
し、約２０２００ｃｐｍ／１００μｌの濃度にした。モ
ノクローナル抗体を、ＡＦＢ1 トレーサーの３０ないし
５０％が沈殿する濃度にまで希釈した。１０％ウシ胎児
血清ＰＢＳ溶液を含む抗体を１００μｌずつ反応混合物
に加えた。非放射標識ＡＦＢ1 又は、主なＡＦＢ1 −Ｄ
ＮＡ付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrを包含するそ
の代謝物から成る試料を１００μｌずつ管に加えた。反
応混合物を室温で２時間インキュベートし、次いで混合
物をＰＢＳで１．０ｍｌの体積になるように希釈した。
次に等量の氷冷飽和硫酸アンモニウムを加え、試料を混
合し、氷中に１５分間立てた。試料を次に２０００ｇで
１５分間遠心し、ミュラー法を用いて反応の阻害率
（％）を求めた。
【００２３】ＡＦＢ1 及びその代謝物に対するＩｇＭ抗
体の特異性が図１及び図２に示されている。なお、これ
らの結果は、飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ、ＰＢＳ
に対して透析することによって最初に分画された高親和
性の精製ＩｇＭ抗体を用いて得られたものである。抗体
を次に高圧液体クロマトグラフィーで精製した。この
際、ＩｇＭ抗体の分子量が大きなこと（９０００００ダ
ルトン）を利用して、立体的排他性により分離した。こ
こに記載する方法において用いたものは、その特性及び
高親和性を有するこの精製ＩｇＭ抗体の特徴及び性質で
ある。競合的ＲＩＡ法において、アフラトキシンＢ1 、
アフラトキシンＢ2 、及びアフラトキシンＭ1 について
阻害率が５０％となるのは３．０ピコモルであったが、
アフラトキシンＧ1 、アフラトキシンＧ2 、及びアフラ
トキシンＱ1 についてはそれぞれ６０．０、８４．０、
及び２７５．０ピコモルであった。図２に示されたデー
タは、ＡＦＢ1 及び２つの主たるアフラトキシン−ＤＮ
Ａ付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrに対するＩｇＭ
抗体の特異性及び阻害率が５０％となる点を示してい
る。５０％阻害値はそれぞれ３．０、２４．０、及び８
９．０ピコモルであった。従って、データは、このＩｇ
Ｍ抗体がAF-FAPyr付加物を検出する感度がAF-N7-Gua 付
加物を検出する感度よりも約４倍高いことを示してい
る。
体の特異性が図１及び図２に示されている。なお、これ
らの結果は、飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ、ＰＢＳ
に対して透析することによって最初に分画された高親和
性の精製ＩｇＭ抗体を用いて得られたものである。抗体
を次に高圧液体クロマトグラフィーで精製した。この
際、ＩｇＭ抗体の分子量が大きなこと（９０００００ダ
ルトン）を利用して、立体的排他性により分離した。こ
こに記載する方法において用いたものは、その特性及び
高親和性を有するこの精製ＩｇＭ抗体の特徴及び性質で
ある。競合的ＲＩＡ法において、アフラトキシンＢ1 、
アフラトキシンＢ2 、及びアフラトキシンＭ1 について
阻害率が５０％となるのは３．０ピコモルであったが、
アフラトキシンＧ1 、アフラトキシンＧ2 、及びアフラ
トキシンＱ1 についてはそれぞれ６０．０、８４．０、
及び２７５．０ピコモルであった。図２に示されたデー
タは、ＡＦＢ1 及び２つの主たるアフラトキシン−ＤＮ
Ａ付加物であるAF-N7-Gua 及びAF-FAPyrに対するＩｇＭ
抗体の特異性及び阻害率が５０％となる点を示してい
る。５０％阻害値はそれぞれ３．０、２４．０、及び８
９．０ピコモルであった。従って、データは、このＩｇ
Ｍ抗体がAF-FAPyr付加物を検出する感度がAF-N7-Gua 付
加物を検出する感度よりも約４倍高いことを示してい
る。
【００２４】IV. 固定化抗ＡＦＢ1 ＩｇＭモノクローナ
ル抗体を含む親和性マトリックス この精製されたＩｇＭモノクローナル抗体を用いて、フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の
方法によって親和性マトリックス材料をつくった。十分
量（２．０ｍｇ）のモノクローナル抗体を、０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 と０．５Ｍ ＮａＣｌとを含む結合緩衝液
（ｐＨ８．３）に溶解した。この抗体溶液を、予め８．
０ｍｌの０．００１Ｍ ＨＣｌ中で一夜インキュベート
した、臭化シアノーゲンによって活性化されたセファロ
ース−４Ｂ（シグマ社）に加えた。セファロースと抗体
溶液とを１時間反応させた後、この固相吸着材料を、
１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で１時間イ
ンキュベートすることによって、抗体が結合されたゲル
の未結合部位をブロックした。固相吸着材料上に固定化
されたＩｇＭ抗体によって親和性マトリックスが形成さ
れ、これを次に１ないし２ｍｌの体積ずつ用いた。
ル抗体を含む親和性マトリックス この精製されたＩｇＭモノクローナル抗体を用いて、フ
ァーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の
方法によって親和性マトリックス材料をつくった。十分
量（２．０ｍｇ）のモノクローナル抗体を、０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 と０．５Ｍ ＮａＣｌとを含む結合緩衝液
（ｐＨ８．３）に溶解した。この抗体溶液を、予め８．
０ｍｌの０．００１Ｍ ＨＣｌ中で一夜インキュベート
した、臭化シアノーゲンによって活性化されたセファロ
ース−４Ｂ（シグマ社）に加えた。セファロースと抗体
溶液とを１時間反応させた後、この固相吸着材料を、
１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で１時間イ
ンキュベートすることによって、抗体が結合されたゲル
の未結合部位をブロックした。固相吸着材料上に固定化
されたＩｇＭ抗体によって親和性マトリックスが形成さ
れ、これを次に１ないし２ｍｌの体積ずつ用いた。
【００２５】好ましい固相吸着材料は活性化されたセフ
ァロース４Ｂゲルであるけれども、他の多くの材料を固
相材料として用いることができることが認められてい
る。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、
ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げるこ
とができる。同様に、抗親和性ＩｇＭ抗体をそれぞれの
化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知
であり、記載されている。
ァロース４Ｂゲルであるけれども、他の多くの材料を固
相材料として用いることができることが認められてい
る。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、
ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げるこ
とができる。同様に、抗親和性ＩｇＭ抗体をそれぞれの
化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知
であり、記載されている。
【００２６】V.液体試料中のアフラトキシンを検出し単
離する方法 被検試料中のアフラトキシン及びアフラトキシン−ＤＮ
Ａ付加物を検出する方法は、次の工程を含む親和性クロ
マトグラフィー法である。(1) アフラトキシン又は目的
のアフラトキシン−ＤＮＡ付加物に対して特異的な抗親
和性ＩｇＭ抗体が固相吸着材料上に固定化された、均一
な親和性マトリックスを製造する。(2)被検試料中のア
フラトキシンが、親和性マトリックスのＩｇＭ抗体によ
って結合され保持されるように、被検試料と親和性マト
リックスとを接触させる。(3) ＩｇＭ抗体からアフラト
キシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックス
に加える。この溶離剤は、ジメチルスルフォキシド、ジ
メチルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドから成
る群より選ばれる非プロトン性溶媒の、５０％（ｖ／
ｖ）以上の濃度の水溶液である。(4) 親和性マトリック
スからの回収された流出物中にアフラトキシンが存在す
るかどうかを同定する。
離する方法 被検試料中のアフラトキシン及びアフラトキシン−ＤＮ
Ａ付加物を検出する方法は、次の工程を含む親和性クロ
マトグラフィー法である。(1) アフラトキシン又は目的
のアフラトキシン−ＤＮＡ付加物に対して特異的な抗親
和性ＩｇＭ抗体が固相吸着材料上に固定化された、均一
な親和性マトリックスを製造する。(2)被検試料中のア
フラトキシンが、親和性マトリックスのＩｇＭ抗体によ
って結合され保持されるように、被検試料と親和性マト
リックスとを接触させる。(3) ＩｇＭ抗体からアフラト
キシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックス
に加える。この溶離剤は、ジメチルスルフォキシド、ジ
メチルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドから成
る群より選ばれる非プロトン性溶媒の、５０％（ｖ／
ｖ）以上の濃度の水溶液である。(4) 親和性マトリック
スからの回収された流出物中にアフラトキシンが存在す
るかどうかを同定する。
【００２７】抗アフラトキシンＩｇＭモノクローナル抗
体の重要な特徴は、ＡＦＢ1 抗原に対する特異性だけで
はなく、その高い親和定数（少なくとも約１ｘ１０8 リ
ットル／モル、好ましくは１ｘ１０9 リットル／モル）
も重要な特徴である。従って、親和性カラム中に共有結
合されている抗体に目的のアフラトキシンが結合した
後、これを溶離するための溶離剤には特殊なものを使わ
なければならない。このことは次の参考例に示されてい
る。すなわち、次の参考例では、吸着剤に結合した抗体
が、目的のアフラトキシンに結合する能力を示すのみな
らず、アフラトキシンが親和性カラムに吸着した後、こ
れを選択的に解離させるのに、従来の溶離剤を用いたの
ではこれを行い得ないことを示している。
体の重要な特徴は、ＡＦＢ1 抗原に対する特異性だけで
はなく、その高い親和定数（少なくとも約１ｘ１０8 リ
ットル／モル、好ましくは１ｘ１０9 リットル／モル）
も重要な特徴である。従って、親和性カラム中に共有結
合されている抗体に目的のアフラトキシンが結合した
後、これを溶離するための溶離剤には特殊なものを使わ
なければならない。このことは次の参考例に示されてい
る。すなわち、次の参考例では、吸着剤に結合した抗体
が、目的のアフラトキシンに結合する能力を示すのみな
らず、アフラトキシンが親和性カラムに吸着した後、こ
れを選択的に解離させるのに、従来の溶離剤を用いたの
ではこれを行い得ないことを示している。
【００２８】参考例１ 最初の実験は、セファロース４Ｂ上に固定化された抗Ａ
ＦＢ1 ＩｇＭ抗体がＡＦＢ1 を結合する能力を測定する
ために行った。これらの実験では、放射標識した3H-AFB
1 を１０ｍｌのＰＢＳ中に１ｎｇの濃度で用いた。この
濃度は、汚染された食品にさらされたヒトの体液中に検
出されるであろうと予想されるアフラトキシンの濃度で
ある。先ず、１００μｌの3H-AFB1 トレーサーと、０．
１％のＢＳＡと、１０ｍＭのＮａＮ3 と、０．１ｍｌの
通常マウス血清と、３μｌの3H-AFB1 とを含むＰＢＳ１
０．０ｍｌを約１．０ｍｌのゲル床に加えた。流出カラ
ム流速は０．２５ｍｌ／分よりも少し大きかった。約２
００μｌのＰＢＳをトレーサーに加え、親和性マトリッ
クスの頂部が空気にさらされるまで（カラムが乾燥する
ことなしに）カラムを加工させることによってカラムに
移した。さらに２．０ｍｌのＰＢＳを加えてトレーサー
をカラムから洗い出し、流出液をガラスビンに単一の分
画として集めた（Ｎｏ．１）。このようにして約２４４
８６ｃｐｍのトレーサーをカラムに加え、それぞれの分
画が回収されるごとにシンチレーションによって放射標
識物質の含量を測定した。次に異なる溶離剤を親和性マ
トリックスに加え、ＡＦＢ1 トレーサーを放出する能力
を測定した。これらの結果は以下の表１に示されてい
る。
ＦＢ1 ＩｇＭ抗体がＡＦＢ1 を結合する能力を測定する
ために行った。これらの実験では、放射標識した3H-AFB
1 を１０ｍｌのＰＢＳ中に１ｎｇの濃度で用いた。この
濃度は、汚染された食品にさらされたヒトの体液中に検
出されるであろうと予想されるアフラトキシンの濃度で
ある。先ず、１００μｌの3H-AFB1 トレーサーと、０．
１％のＢＳＡと、１０ｍＭのＮａＮ3 と、０．１ｍｌの
通常マウス血清と、３μｌの3H-AFB1 とを含むＰＢＳ１
０．０ｍｌを約１．０ｍｌのゲル床に加えた。流出カラ
ム流速は０．２５ｍｌ／分よりも少し大きかった。約２
００μｌのＰＢＳをトレーサーに加え、親和性マトリッ
クスの頂部が空気にさらされるまで（カラムが乾燥する
ことなしに）カラムを加工させることによってカラムに
移した。さらに２．０ｍｌのＰＢＳを加えてトレーサー
をカラムから洗い出し、流出液をガラスビンに単一の分
画として集めた（Ｎｏ．１）。このようにして約２４４
８６ｃｐｍのトレーサーをカラムに加え、それぞれの分
画が回収されるごとにシンチレーションによって放射標
識物質の含量を測定した。次に異なる溶離剤を親和性マ
トリックスに加え、ＡＦＢ1 トレーサーを放出する能力
を測定した。これらの結果は以下の表１に示されてい
る。
【００２９】
【表１】
【００３０】明らかなように、元のトレーサーの約１０
％は親和性マトリックスに吸着されず、溶離剤を加える
前に流出分画Ｎｏ．１として回収された。これはトレー
サー中の非特異的トリチウム交換に起因する。引き続き
行った、列挙した個々の溶離剤との反応により、流出分
画２〜７においては、マトリックスのＩｇＭ抗体によっ
てトレーサーＡＦＢ1 の放出は実質的に起こらないこと
がわかった。５０％ジメチルスルフォキシド（以下、Ｄ
ＭＳＯという）を用いて初めて多量（９０％）のＡＦＢ
1 トレーサーが親和性マトリックスから放出された。ま
た、ＤＭＳＯを親和性カラムに加えると、マトリックス
中の明確な色の変化が見えるようになり、カラム床自体
がより半透明になった。ＤＭＳＯ流出分画を回収した後
にＰＢＳを親和性マトリックスるに加えると、ゲル床は
元の不透明な通常の状態に戻った。
％は親和性マトリックスに吸着されず、溶離剤を加える
前に流出分画Ｎｏ．１として回収された。これはトレー
サー中の非特異的トリチウム交換に起因する。引き続き
行った、列挙した個々の溶離剤との反応により、流出分
画２〜７においては、マトリックスのＩｇＭ抗体によっ
てトレーサーＡＦＢ1 の放出は実質的に起こらないこと
がわかった。５０％ジメチルスルフォキシド（以下、Ｄ
ＭＳＯという）を用いて初めて多量（９０％）のＡＦＢ
1 トレーサーが親和性マトリックスから放出された。ま
た、ＤＭＳＯを親和性カラムに加えると、マトリックス
中の明確な色の変化が見えるようになり、カラム床自体
がより半透明になった。ＤＭＳＯ流出分画を回収した後
にＰＢＳを親和性マトリックスるに加えると、ゲル床は
元の不透明な通常の状態に戻った。
【００３１】親和性マトリックスは、セファロースゲル
に結合されたＩｇＭ抗体を損傷し又は修飾（変性、沈殿
等）することなくもとの状態に復帰した。このことは、
ＤＭＳＯ遊離剤を加えその後ＰＢＳで洗う実験を継続す
ることによって示された。
に結合されたＩｇＭ抗体を損傷し又は修飾（変性、沈殿
等）することなくもとの状態に復帰した。このことは、
ＤＭＳＯ遊離剤を加えその後ＰＢＳで洗う実験を継続す
ることによって示された。
【００３２】２００μｌのＰＢＳに溶けた第２の１００
μｌのトレーサー3H-AFB1 を、前に第１の3H-AFB1 トレ
ーサー試料を単離するのに用いた同じカラムに加えた。
第２のトレーサーを加えた後、２．０ｍｌのＰＢＳでカ
ラムをすすぎ、流出物を分画Ｎｏ．８として回収した。
次に２．０ｍｌのＤＭＳＯのＰＢＳ溶液を加え、流出物
を分画Ｎｏ．９として回収した。カラムを次に２回２．
０ｍｌＰＢＳでそれぞれ洗い、流出液を分画１０及び１
１として回収した。結果を下記表２に示す。
μｌのトレーサー3H-AFB1 を、前に第１の3H-AFB1 トレ
ーサー試料を単離するのに用いた同じカラムに加えた。
第２のトレーサーを加えた後、２．０ｍｌのＰＢＳでカ
ラムをすすぎ、流出物を分画Ｎｏ．８として回収した。
次に２．０ｍｌのＤＭＳＯのＰＢＳ溶液を加え、流出物
を分画Ｎｏ．９として回収した。カラムを次に２回２．
０ｍｌＰＢＳでそれぞれ洗い、流出液を分画１０及び１
１として回収した。結果を下記表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】第２のトレーサーは約２４４８６ｃｐｍの
総放射能を有していたが、また、その約１０％が親和性
マトリックスに保持されなかった。分画９はまた、多量
のＡＦＢ1 トレーサー（約６０％）がＤＭＳＯによって
溶離され、残りは、いくらかの残留ＤＭＳＯを含む第１
回目のＰＢＳ洗浄によって分画１０中に回収されること
を示している。
総放射能を有していたが、また、その約１０％が親和性
マトリックスに保持されなかった。分画９はまた、多量
のＡＦＢ1 トレーサー（約６０％）がＤＭＳＯによって
溶離され、残りは、いくらかの残留ＤＭＳＯを含む第１
回目のＰＢＳ洗浄によって分画１０中に回収されること
を示している。
【００３５】さらに、溶離効果をもたらすためには少な
くとも５０％の濃度のＤＭＳＯを用いることが必要であ
ることを示すために、この実験の変形を行った。この実
験に用いた１００μｌの3H-AFB1 は合計で約２７０００
なし２８０００ｃｐｍの3H-AFB1 を含んでいた。１００
μｌのトレーサーを親和性カラムに載せ、２００μｌの
ＰＢＳで洗浄して保持されていないトレーサーをカラム
から除去した。次にマトリックスを１．０ｍｌずつの、
濃度が増加するＤＭＳＯで洗った。結果を次の表３に示
す。
くとも５０％の濃度のＤＭＳＯを用いることが必要であ
ることを示すために、この実験の変形を行った。この実
験に用いた１００μｌの3H-AFB1 は合計で約２７０００
なし２８０００ｃｐｍの3H-AFB1 を含んでいた。１００
μｌのトレーサーを親和性カラムに載せ、２００μｌの
ＰＢＳで洗浄して保持されていないトレーサーをカラム
から除去した。次にマトリックスを１．０ｍｌずつの、
濃度が増加するＤＭＳＯで洗った。結果を次の表３に示
す。
【００３６】
【表３】
【００３７】表３より、ＤＭＳＯの５０％溶液を使用す
る前は、親和性マトリックスから3H-AFB1 が実質的に溶
離されないことがわかる。また、ＤＭＳＯの濃度を５０
％より大きくしても、親和性マトリックスからのＡＦＢ
1 の放出は検出可能な程度には増加しないことがわか
る。このため、ＤＭＳＯはその濃度が少なくとも５０％
あれば、この方法において溶離剤として用いるのに十分
である。この方法に用いるのに適した他の溶離剤はジメ
チルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドである。
有効な溶離剤とするためには、これらの溶離剤も少なく
とも５０％の濃度で用いなければならない。これらの溶
離剤、すなわち、さらに一般的に非プロトン性溶媒を用
いた場合、親和性マトリックスは繰り返し再使用するこ
とができる。このような非プロトン性溶媒で溶離しても
マトリックス材料は損傷されない。このことはマイコト
キシンの検出及び測定を産業的に行う場合に重要であ
る。産業的にこの方法を行う場合には、その経済的理由
により親和性マトリックスを再使用する必要があるが、
ＤＭＳＯのような非プロトン溶媒で溶出することはこの
要求に合致している。
る前は、親和性マトリックスから3H-AFB1 が実質的に溶
離されないことがわかる。また、ＤＭＳＯの濃度を５０
％より大きくしても、親和性マトリックスからのＡＦＢ
1 の放出は検出可能な程度には増加しないことがわか
る。このため、ＤＭＳＯはその濃度が少なくとも５０％
あれば、この方法において溶離剤として用いるのに十分
である。この方法に用いるのに適した他の溶離剤はジメ
チルフォルムアミド及びジメチルアセトアミドである。
有効な溶離剤とするためには、これらの溶離剤も少なく
とも５０％の濃度で用いなければならない。これらの溶
離剤、すなわち、さらに一般的に非プロトン性溶媒を用
いた場合、親和性マトリックスは繰り返し再使用するこ
とができる。このような非プロトン性溶媒で溶離しても
マトリックス材料は損傷されない。このことはマイコト
キシンの検出及び測定を産業的に行う場合に重要であ
る。産業的にこの方法を行う場合には、その経済的理由
により親和性マトリックスを再使用する必要があるが、
ＤＭＳＯのような非プロトン溶媒で溶出することはこの
要求に合致している。
【００３８】一方、溶離はメタノールやエタノールのよ
うな新油性溶媒を用いて行うこともできるが、親和性マ
トリックスあるいはカラムは実質的に再使用できなくな
る。本発明のこの局面では、好ましくは５０ないし１０
０％、特に好ましくは１００％のメタノール又はエタノ
ールを、ＤＭＳＯの代わりにこれらを用いることを除い
て上記した方法と同様にして用いることができる。
うな新油性溶媒を用いて行うこともできるが、親和性マ
トリックスあるいはカラムは実質的に再使用できなくな
る。本発明のこの局面では、好ましくは５０ないし１０
０％、特に好ましくは１００％のメタノール又はエタノ
ールを、ＤＭＳＯの代わりにこれらを用いることを除い
て上記した方法と同様にして用いることができる。
【００３９】VI. ヒトの尿、血清、及び母乳からのアフ
ラトキシンの生体外における単離 上で示されたように、放射滴定又は吸光度測定により示
されたＩｇＭ抗体親和性マトリックスのＡＦＢ1 を結合
する能力は、１ｍｌのカラム床当たり、１０ｍｌのＰＢ
ＳからのＡＦＢ1 １．０ないし１．３μｇである。これ
らのパラメーターは、ヒトの尿、血清、母乳試料から、
生体外でアフラトキシンを下記のようにして単離し検出
するのに用いることができる。
ラトキシンの生体外における単離 上で示されたように、放射滴定又は吸光度測定により示
されたＩｇＭ抗体親和性マトリックスのＡＦＢ1 を結合
する能力は、１ｍｌのカラム床当たり、１０ｍｌのＰＢ
ＳからのＡＦＢ1 １．０ないし１．３μｇである。これ
らのパラメーターは、ヒトの尿、血清、母乳試料から、
生体外でアフラトキシンを下記のようにして単離し検出
するのに用いることができる。
【００４０】ヒト血清（１０ｍｌずつ）又はヒト母乳
（１０ｍｌずつ）を、前処理することなしに直接抗体マ
トリックスに施すことができる。どちらの場合にも、液
体試料中のアフラトキシンが抗体マトリックスに定量的
に結合し、これらは、溶離剤として５０％濃度のＤＭＳ
Ｏを用いることによって定量的に回収される。このこと
は、上述したようにして、3H-AFB1 を１ｎｇずつ血清又
は母乳試料に直接加えることによって経験的に見出され
た。従って、血清又は母乳を試験する場合には、アフラ
トキシンを定量的に回収するためには、何らの準備工程
もいらない。
（１０ｍｌずつ）を、前処理することなしに直接抗体マ
トリックスに施すことができる。どちらの場合にも、液
体試料中のアフラトキシンが抗体マトリックスに定量的
に結合し、これらは、溶離剤として５０％濃度のＤＭＳ
Ｏを用いることによって定量的に回収される。このこと
は、上述したようにして、3H-AFB1 を１ｎｇずつ血清又
は母乳試料に直接加えることによって経験的に見出され
た。従って、血清又は母乳を試験する場合には、アフラ
トキシンを定量的に回収するためには、何らの準備工程
もいらない。
【００４１】しかしながら、尿は、試料中の妨害物質、
例えば塩を除くために、アフラトキシンの単離及び回収
を行う前に、クロマトグラフィーを包含する前処理を行
わなければならない。これは図３に模式的に示されてお
り、ここではセプパック（Sep-Pak)C18 カートリッジ
（ウォーターズ・アソシエイツ社）を用いて妨害物質を
除去した。尿試料を先ず、準備的な低圧液体クロマトグ
ラフィーカートリッジに通してタンパク質や他の妨害物
質を除去すれば、ヒトの尿試料中に存在するアフラトキ
シンの９０ないし９５％は本発明の方法により一貫して
定量的に回収できる。
例えば塩を除くために、アフラトキシンの単離及び回収
を行う前に、クロマトグラフィーを包含する前処理を行
わなければならない。これは図３に模式的に示されてお
り、ここではセプパック（Sep-Pak)C18 カートリッジ
（ウォーターズ・アソシエイツ社）を用いて妨害物質を
除去した。尿試料を先ず、準備的な低圧液体クロマトグ
ラフィーカートリッジに通してタンパク質や他の妨害物
質を除去すれば、ヒトの尿試料中に存在するアフラトキ
シンの９０ないし９５％は本発明の方法により一貫して
定量的に回収できる。
【００４２】また、ＡＦＢ1 に対して特異的である抗親
和性ＩｇＭ抗体を用いることは、ＡＦＢ1 −ＤＮＡ付加
物、AF-N7-Gua を定量的に検出し回収するのに有用であ
る。これらのアフラトキシンＤＮＡ付加物は、血清や他
の体液から、何らの前処理を行うことなく検出され、定
量的に回収される。ヒト又は動物からの尿を被検試料と
する場合には、試料を親和性マトリックスに加える前
に、先ずカーボンクロマトグラフィーカートリッジを通
す高圧液体クロマトグラフィーにより試料を前処理する
ことが好ましい。このようにして、環境的に汚染された
人々からの複雑な生物学的試料からのＡＦＢ1 及びその
代謝物を定量的及び定性的に単離し精製することができ
る。さらに、この方法は、アフラトキシン自体を検出す
る分析法としても働く。
和性ＩｇＭ抗体を用いることは、ＡＦＢ1 −ＤＮＡ付加
物、AF-N7-Gua を定量的に検出し回収するのに有用であ
る。これらのアフラトキシンＤＮＡ付加物は、血清や他
の体液から、何らの前処理を行うことなく検出され、定
量的に回収される。ヒト又は動物からの尿を被検試料と
する場合には、試料を親和性マトリックスに加える前
に、先ずカーボンクロマトグラフィーカートリッジを通
す高圧液体クロマトグラフィーにより試料を前処理する
ことが好ましい。このようにして、環境的に汚染された
人々からの複雑な生物学的試料からのＡＦＢ1 及びその
代謝物を定量的及び定性的に単離し精製することができ
る。さらに、この方法は、アフラトキシン自体を検出す
る分析法としても働く。
【００４３】上述したことより、本発明は、試料中の種
々の濃度の毒物を簡単に正確に検出することができるこ
とがわかる。本発明の重要な局面は特異的モノクローナ
ル抗体が結合された親和性マトリックスすなわちカラム
である。固相吸着剤上に固定化された抗体を含むこのよ
うな親和性マトリックスを用いることは、迅速で効率の
高い、被検試料の精製手段を提供する。モノクローナル
抗体の高親和性及び選択性の故に、試料の粗抽出物を抗
体マトリックスカラムに通し、それによって目的の毒物
が抗体に結合され、該試料抽出物の他の全ての成分は通
過する。ＤＭＳＯ又はメタノールのような適当な溶離剤
で溶離することによって、元の粗試料から、定量的な収
量で高度に精製された毒物が溶離され、回収される。こ
のような効率的な１工程精製方法は、特に毒物の分析の
分野において遊離である。
々の濃度の毒物を簡単に正確に検出することができるこ
とがわかる。本発明の重要な局面は特異的モノクローナ
ル抗体が結合された親和性マトリックスすなわちカラム
である。固相吸着剤上に固定化された抗体を含むこのよ
うな親和性マトリックスを用いることは、迅速で効率の
高い、被検試料の精製手段を提供する。モノクローナル
抗体の高親和性及び選択性の故に、試料の粗抽出物を抗
体マトリックスカラムに通し、それによって目的の毒物
が抗体に結合され、該試料抽出物の他の全ての成分は通
過する。ＤＭＳＯ又はメタノールのような適当な溶離剤
で溶離することによって、元の粗試料から、定量的な収
量で高度に精製された毒物が溶離され、回収される。こ
のような効率的な１工程精製方法は、特に毒物の分析の
分野において遊離である。
【００４４】本発明のこの重要な局面は、目的の毒物に
対して特異的なモノクローナル抗体が結合されたマトリ
ックス又はカラムを用いることによって、他の毒物、特
にマイコトキシンを検出し、測定するのに広範囲に適用
することができる。抗体マトリックス材料によって毒物
が一旦精製されたならば、所望により、蛍光法、免疫分
析、放射免疫分析、ＥＬＩＳＡ法、薄層クロマトグラフ
ィー、高圧液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、比色定量等の種々の方法により毒物を検出する
ことができる。どの検出方法を用いるかは、毒物の性
質、毒物の予想濃度、検出データの用途を包含する種々
の因子に依存する。いずれにせよ、この発明は、モノク
ローナル抗体が結合された親和性的を用い、分析し検出
するための試料を親和性マトリックスに１回通すことに
よる簡単で迅速な精製方法を提供する。なお、親和性マ
トリックスを通した後は、さらに精製することを要しな
い。
対して特異的なモノクローナル抗体が結合されたマトリ
ックス又はカラムを用いることによって、他の毒物、特
にマイコトキシンを検出し、測定するのに広範囲に適用
することができる。抗体マトリックス材料によって毒物
が一旦精製されたならば、所望により、蛍光法、免疫分
析、放射免疫分析、ＥＬＩＳＡ法、薄層クロマトグラフ
ィー、高圧液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー、比色定量等の種々の方法により毒物を検出する
ことができる。どの検出方法を用いるかは、毒物の性
質、毒物の予想濃度、検出データの用途を包含する種々
の因子に依存する。いずれにせよ、この発明は、モノク
ローナル抗体が結合された親和性的を用い、分析し検出
するための試料を親和性マトリックスに１回通すことに
よる簡単で迅速な精製方法を提供する。なお、親和性マ
トリックスを通した後は、さらに精製することを要しな
い。
【００４５】アフラトキシンについては、１つの好まし
い検出方法は蛍光分析である。すなわち、精製した試料
を紫外線（３６５ｎｍ）に当てるとアフラトキシンは４
２５ｎｍの蛍光を発する。この型の分析方法は、その分
析性能及び、ある程度の定量分析も可能であるというこ
とにより、特に好ましい。このような蛍光分析操作は、
ＡＯＡＣ法（ＡＯＡＣ Method,第２６章、pp.414-429(1
980)) の方法に従うことによって行うことができる。
い検出方法は蛍光分析である。すなわち、精製した試料
を紫外線（３６５ｎｍ）に当てるとアフラトキシンは４
２５ｎｍの蛍光を発する。この型の分析方法は、その分
析性能及び、ある程度の定量分析も可能であるというこ
とにより、特に好ましい。このような蛍光分析操作は、
ＡＯＡＣ法（ＡＯＡＣ Method,第２６章、pp.414-429(1
980)) の方法に従うことによって行うことができる。
【００４６】抗体結合マトリックスにより毒物を含む試
料の１工程精製が可能になるので、本発明は、産業廃棄
物やトウモロコシ、ピーナッツのような食品、及び体液
中に含まれる種々の毒物を検査するのに適用することが
できる。トウモロコシ試料を例として、全体的な操作方
法を図４に示す。
料の１工程精製が可能になるので、本発明は、産業廃棄
物やトウモロコシ、ピーナッツのような食品、及び体液
中に含まれる種々の毒物を検査するのに適用することが
できる。トウモロコシ試料を例として、全体的な操作方
法を図４に示す。
【００４７】上記からわかるように、共通の重要な工程
は、特異的モノクローナル抗体が結合した親和性カラム
を用いることによる試料の精製にあることが明らかであ
る。試料が一旦精製されると、毒物の濃度又は存在は種
々の方法により定性的に又は定量的に測定することがで
きる。
は、特異的モノクローナル抗体が結合した親和性カラム
を用いることによる試料の精製にあることが明らかであ
る。試料が一旦精製されると、毒物の濃度又は存在は種
々の方法により定性的に又は定量的に測定することがで
きる。
【００４８】定性分析 この発明によると毒物は先ず定性的に検出することがで
きる。例えば、トウモロコシ試料中のアフラトキシン
は、次の工程により検出することができる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの５０ｇを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) １分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラム（好ましくはシリンジに含まれたも
の）にメタノールを通し、蛍光照明手段を有する反応容
器にこれを回収する。 (10)蛍光照明手段を有する容器を取り、蛍光量を可視的
に測定（定量的ではない）するための装置に入れる。 (11)容器を取り、捨てる。
きる。例えば、トウモロコシ試料中のアフラトキシン
は、次の工程により検出することができる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの５０ｇを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) １分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラム（好ましくはシリンジに含まれたも
の）にメタノールを通し、蛍光照明手段を有する反応容
器にこれを回収する。 (10)蛍光照明手段を有する容器を取り、蛍光量を可視的
に測定（定量的ではない）するための装置に入れる。 (11)容器を取り、捨てる。
【００４９】定量分析 一方、毒物の濃度は次の操作により定量的に測定するこ
とができる。再び、トウモロコシ中のアフラトキシンの
測定を例として挙げる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの５０ｇを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) １分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラムにメタノールを通し、測定装置に含ま
れた試験キュベットに回収する。 (10)測定値を読む。 (11)試料を取り出し捨てる。
とができる。再び、トウモロコシ中のアフラトキシンの
測定を例として挙げる。 (1) すりつぶしたトウモロコシの５０ｇを計量する。 (2) すりつぶしたトウモロコシを混合機中に置く。 (3) メタノールを混合機に加える。 (4) １分間混合する。 (5) 混合物に蒸留水を加え混合する。 (6) フィルターを介して混合機から抽出物を取る。 (7) 抽出物をアフラトキシン親和性カラムに架ける。 (8) 蒸留水をアフラトキシン親和性カラムに通す。 (9) 親和性カラムにメタノールを通し、測定装置に含ま
れた試験キュベットに回収する。 (10)測定値を読む。 (11)試料を取り出し捨てる。
【図１】3H-AFB1 と種々のアフラトキシンを用いてＩｇ
Ｍ抗体の特異性を測定するための競合的放射免疫分析の
結果を示すグラフである。
Ｍ抗体の特異性を測定するための競合的放射免疫分析の
結果を示すグラフである。
【図２】3H-AFB1 トレーサーとアフラトキシンＢ1 及び
主たる代謝的アフラトキシン−ＤＮＡ付加物を用い、Ｉ
ｇＭ抗体を用いた競合的放射免疫分析の結果を示すグラ
フである。
主たる代謝的アフラトキシン−ＤＮＡ付加物を用い、Ｉ
ｇＭ抗体を用いた競合的放射免疫分析の結果を示すグラ
フである。
【図３】毒物を検出し単離するための一般的な方法の概
略を示す模式フローチャートである。
略を示す模式フローチャートである。
【図４】トウモロコシ中の毒物を定性分析及び定量分析
する方法の概略を示す模式フローチャートである。
する方法の概略を示す模式フローチャートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２１ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (72)発明者 ジョン ディー グロープマン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 リ ンフィールド メロウ ロード 25 (72)発明者 ジェラルド エヌ ウォーガン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ベ ルモントクラフリン ストリート 125 (72)発明者 アン マーシヤク−ロスステイン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ュートンロイス ロード 40
Claims (7)
- 【請求項１】 毒性物質（アフラトキシンを除く）を含
んでいるかもしれない試料を準備する工程と、固相吸着
剤とこの上に固定化され、前記毒性物質に対して特異的
なモノクローナル抗体とを含む親和性カラム上に該試料
を載せる工程と、溶媒をカラムに通し、第１の流出物を
回収し、それによって前記毒性物質を前記モノクローナ
ル抗体によって前記カラム上に保持する工程と、溶離剤
をカラムに通して第２の流出物を回収し、それによって
前記毒性物質を前記モノクローナル抗体から溶離させて
前記第２の流出物中に回収する工程と、前記毒性物質の
存在を検出するために前記第２の流出物をさらに精製す
ることなく紫外線にさらすことによって蛍光分析を行な
う工程とを含む、被検試料中の毒性物質を検出する方
法。 - 【請求項２】 前記溶離剤は濃度５０％以上の非プロト
ン性溶媒の溶液である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】 前記非プロトン性溶媒はジメチルスルフ
ォキシド、ジメチルホルムアミド又はジメチルアセトア
ミドである特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】 前記溶離剤は親油性溶媒の５０ないし１
００％溶液である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】 前記親油性溶媒は１００％メタノール又
は１００％エタノールである特許請求の範囲第４項記載
の方法。 - 【請求項６】 前記毒性物質は分子量約1,000 ダルトン
以下のマイコトキシンである特許請求の範囲第１項ない
し５項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記毒性物質はフルオランタン、ニトロ
ソピレン、ニトロピレン、ニトロフルオランテン、ニト
ロクリセン、アミノビフェニル並びにこれらの結合体及
び誘導体から成る群より選ばれる特許請求の範囲第６項
記載の方法。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| US02/667,069 US4818687A (en) | 1985-02-28 | 1985-02-28 | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| US06/820,388 US4859611A (en) | 1985-02-28 | 1986-01-21 | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| CA000502910A CA1320688C (en) | 1985-02-28 | 1986-02-27 | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| EP86301462A EP0196787B2 (en) | 1985-02-28 | 1986-02-28 | Process for detection of aflatoxins |
| JP61042076A JP2551406B2 (ja) | 1985-02-28 | 1986-02-28 | アフラトキシンを検出する方法 |
| JP7294877A JP2787767B2 (ja) | 1985-02-28 | 1995-10-18 | 毒性物質を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70698385A | 1985-02-28 | 1985-02-28 | |
| US70698485A | 1985-02-28 | 1985-02-28 | |
| US02/667,069 US4818687A (en) | 1985-02-28 | 1985-02-28 | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| US06/820,388 US4859611A (en) | 1985-02-28 | 1986-01-21 | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| JP7294877A JP2787767B2 (ja) | 1985-02-28 | 1995-10-18 | 毒性物質を検出する方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61042076A Division JP2551406B2 (ja) | 1985-02-28 | 1986-02-28 | アフラトキシンを検出する方法 |
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| JPH08240583A true JPH08240583A (ja) | 1996-09-17 |
| JP2787767B2 JP2787767B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=27530855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7294877A Expired - Lifetime JP2787767B2 (ja) | 1985-02-28 | 1995-10-18 | 毒性物質を検出する方法 |
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|---|---|
| US (1) | US4818687A (ja) |
| EP (1) | EP0196787B2 (ja) |
| JP (1) | JP2787767B2 (ja) |
| CA (1) | CA1320688C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102590519A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-18 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条 |
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| FR2601781B1 (fr) * | 1986-07-18 | 1993-02-12 | Ube Industries | Reactif de dosage de mycotoxine et methode l'utilisant pour doser une mycotoxine |
| IL83342A0 (en) * | 1986-08-22 | 1987-12-31 | Westinghouse Electric Corp | Monoclonal antibodies,their preparation and their use |
| DK157709C (da) * | 1987-07-03 | 1990-07-09 | Danske Sukkerfab | Fremgangsmaade til proeveekstraktion, oprensning, opkoncentrering og kvantitativ bestemmelse af lavmolekylaere organiske forbindelser samt analysesaet til udfoerelse af naevnte fremgangsmaade, og anvendelse af dette saet ved fremgangsmaaden |
| US5236830A (en) * | 1988-11-10 | 1993-08-17 | Eiji Ishikawa | Method of assay for antigen |
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| DE69941557D1 (de) * | 1998-01-15 | 2009-12-03 | Regenesis Biomedical Inc | Verbesserte vorrichtung zur behandlung mittels pulsierter elektromagnetischer energie |
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| EP1787699A1 (en) * | 2005-11-17 | 2007-05-23 | Vicam, L.P. | Multi-analyte affinity column |
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1986
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- 1986-02-28 EP EP86301462A patent/EP0196787B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-18 JP JP7294877A patent/JP2787767B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| CN102590519B (zh) * | 2012-02-24 | 2014-06-25 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条 |
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|---|---|
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| CA1320688C (en) | 1993-07-27 |
| JP2787767B2 (ja) | 1998-08-20 |
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| EP0196787B1 (en) | 1990-07-04 |
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