JP2007530913A - 結合の普遍的な検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、リガンド結合のための普遍的検出システム、及びその使用方法に関する。普遍的検出システムは、物理的に変更可能な結合試薬を含み、そして、いくつかの態様において普遍的検出試薬を含む。

Description

発明の分野
［０００１］本発明は、リガンド結合についての普遍的検出システム、及びその使用方法に関する。普遍的検出システムは、物理的に変更可能な結合試薬（Ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）、及びいくつかの態様では普遍的検出試薬（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を含む。物理的に変更可能な結合試薬は、リガンド結合部位を有するタンパク質類、リガンドのリガンド結合部位への結合に応じて物理的に変更されるようになるドメイン、及び、場合によっては、結合試薬の固体支持体へのカップリングに有用な配列を含む。普遍的検出試薬の物理的に変更可能な結合試薬に対する結合親和性は、リガンド結合に応じて変更される。又は、リガンド結合に応じて物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化は、限定されないが、コンホメーション変化に起因するスペクトル特性、エンタルピー、見かけの分子量、表面積、及び密度における変化の測定を含む物理的な方法によって検出することができる。この方法は、リガンド結合の検出が、診断、探索使用及び工業利用のような期待されるいずれかの応用に有用である。

発明の背景
［０００２］抗体は、抗原を検出し、そのレベルを定量するために頻繁に使用される。これらのアッセイにおける抗体試薬の結合特性は、典型的には、特異性及び感受性の高い程度を分け与える。これらのアッセイの挑戦は、結合イベントを検出することである。共通の実施におけるいくつかの解決法がある。最も共通な方法は、「サンドイッチ」アッセイの使用である。この形態において、捕捉抗体は、表面に固相化され、興味ある抗原を含有する未知試料と反応する。未結合の抗原を除去する適切な洗浄工程に続き、結合成分は二次的な抗特異的抗体を用いて検出される。結合した二次抗体を視覚化する戦略は、検出試薬に化学的にカップルした二次抗体を用いること、又は「サンドイッチ」の二次抗体（例えば、マウス捕捉抗体、ウサギ二次抗体、及びヤギ抗ウサギＩｇアルカリホスファターゼ結合検出抗体を用いて）に特異的に認識し結合する三次検出抗体（同様に、検出試薬に化学的にカップルした）を用いることを含む。この基本アッセイの多様な相互作用において、結合した抗体の視覚化についての検出試薬は、例えば、基質と反応し、異なる（例えば、着色した）産物、蛍光染色、又は金粒子を与える酵素を含む。この検出または、結合した二次抗体の増加量が入射反射光と反応する方法で変化による表面上に直接視覚化される表面プラズモン共鳴によってもよい。

［０００３］いずれかの粒子抗原の検出について、この基本の「サンドイッチ」アッセイは、１）非干渉方法で１つの抗原分子に結合する２つの抗原特異的抗体（又はリガンドに対して高い特異的結合を結合を示すタンパク質）、及び２）結合した二次抗体／結合タンパク質を検出する手段を要求する。１つの抗原分子に同時に結合するであろう２つの抗体の要求性は、ある種の環境においてこのアッセイフォーマットの使用を制限し、又は複雑にする。それは、抗原の検出についてのこのフォーマットの使用を制限し、小さい一価のハプテン及び小さいペプチド（例えば、小さいペプチドホルモン）を含む。それはまた、大多数の抗原の存在を同時に検出する抗体アレイプロテオミクスチップにおける使用についてのこの一般的なフォーマットの使用を複雑にする。この場合において、抗原−特異的二次抗体の必要が開発しなければならない抗体試薬の数を２倍にする。

［０００４］現在、抗原：抗体の複合体の同定は、多くの異なる形体を採用している。非制限的な例として、１）抗体を固相化し、試料と反応させる。次いで、結合した抗体は、二次的な標識した分子、例えば、抗原についてのリガンド又は抗原の別のエピトープに指向される別の抗体の結合によって検出される；２）抗体を固相化し、次いで、試料と反応させる。試料由来の抗原による抗原結合部位の占有は、標識した抗原とのその後又は同時の反応によって決定される；３）抗体は、スライドのような基質に固相化し、次いで、試料と反応させる。抗原：抗体の複合体は、例えば、表面プラズモン共鳴のような方法によって検出される；４）溶液中の抗体は、試料及び標識したリガンドと反応する。抗原量は、標識した抗原を表示し、及び、試料中の抗原量は、分極化の減少に反映される；そして、５）試料の全ての成分は、化学的に標識され（例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５のような蛍光色素を用いて）、及び、次いで、固相化した抗体で反応させる。特異的抗体スポットに結合する抗体は、蛍光によって評価される。これらの技術はすべて、抗原特異的試薬及び／又は抗原又は抗体単独に対する抗原：抗体の複合体の分子量のいずれかを利用する。

［０００５］特にこれらの応用について、及び、固相免疫アッセイを用いた一般的な使用について、抗原−抗体結合を検出し、関連する特定の抗原に特異的なでない方法で抗原−抗体結合を検出する１つの「普遍的な」試薬又は物理方法を利用することは有利な利益となろう。

［０００６］大部分の脊椎動物は、免疫グロブリンの重鎖の定常領域によって区別され、特定化された生物学的特性を有する免疫グロブリンのいくつかのアイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）を生産する。基本的な免疫グロブリンの構造ユニットは、４つのペプチド鎖、２つの独立した重鎖及び２つの独立した軽鎖からなり、Ｙ型の分子を形成する。各ユニットは、２つの抗原結合部位（「Ｙ」の各先端のもの）を含有する。「Ｙ」の幹の追加ドメインは、様々なエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体結合及び古典的経路を介した補体活性化に導く補体成分Ｃ１ｑ結合を様々なエフェクター機能を仲介する。

［０００７］ＩｇＭは、典型的には、上述したような５つのＩｇＧ様サブユニットから成る５量体の分子、プラス追加の１ペプチド、Ｊ鎖として見出される。５つのサブユニット及びＪ鎖は、内部鎖のジスルフィド結合によって５量体に互いに維持される。一量体、及び６量体を含むより高い多量体の形体が観察されている。Ｊ鎖を伴う及び伴わない多量体が観察されている。５量体は、結合抗原の不存在で溶液中で平らな平面分子を形成する。特異的抗原の結合に応じて、分子中の十分に証明された劇的なコンホメーション変化があり、現在、「主要な」形態を仮定し、一量体のサブユニットのＦａｂとＦｃとの間に殆ど９０度で形成する。このコンホメーション変化は、本発明において活用される重要な生物学的結果を有する。特に、ＩｇＭへのＣ１ｑ結合の親和性は、抗原結合に対する応答において変化する。コンホメーション変化は、抗Ｊ鎖特異的抗体との相互作用に対するＩｇＭのＪ鎖の接近性を変更する。本発明は、コンホメーションに依存的であるが、しかし、特異的な抗原に依存しない検出試薬（例えば、Ｃ１ｑ又はＣ１ｑ結合部位又は抗Ｊ鎖特異的抗体）によって示されるように、その特異的抗原に結合したＩｇＭを検出するために、このＩｇＭコンホメーション変化を用いる利点を示す。さらに、抗原結合によって誘導されたＩｇＭにおける劇的なコンホメーション変化は、物理的方法によって検出することもできる。これらは、物理的な方法によって検出することができ、限定されないが、コンホメーション変化に起因するスペクトル特性、エンタルピー、見かけの分子量、表面積、及び密度の変化の測定を含む。

［０００８］多くの文献は、ＩｇＭとその特異的抗原との相互作用について記載し、結果のコンホメーション変化は多量体の抗原（調査では、特異的ＩｇＭと反応する多くの抗原性部位を含有する１つの分子又は粒子）を使用している。一量体の抗原又はハプテンとの相互作用について利用可能な制限されたデータが存在する。それにもかかわらず、１）多量体のＩｇＭとハプテン又は一量体の抗原との相互作用（例えば、大部分のプロテオミクス応用のための関連する形態）は、例えば、Ｃ１ｑの抗Ｊ鎖特異的抗体との結合又は反応によって示されるように、ＩｇＭのコンホメーション変化を誘導するのに十分であり、２）「一量体（モノマー）」ＩｇＭ（上述したような１つのＩｇＧ様のサブユニットを構築するＩｇＭは、２つの別々のＩｇミュー重鎖及び２つの別々のＩｇ軽鎖から構成され、しかし、Ｊ鎖を欠如し、多量体に集合しない）はまた、抗原依存の方法でＣ１ｑに結合し、そのため、多分、多量体のそれに類似するコンホメーション変化を被り、３）抗Ｊ鎖特異的抗体に結合又は反応を殆どしないか又は全くしないＣ１ｑが、抗原の不存在下でＩｇＭ又はＩｇＭ（複数）を用いて検出される（凝集しないＩｇＧとは対照的である）、という説得力のある意見を支持するデータが存在する。

発明の概要
［０００９］本発明は、一般的な、普遍的結合検出システム、及びその使用の方法に関する。発明の一態様は、少なくとも２つの試薬：１）物理的に変更可能な結合試薬、及び２）普遍的検出試薬を要求する。物理的に変更可能な結合試薬は、リガンド結合部位を有するタンパク質類、リガンドのリガンド結合部位への結合に応じて物理的に変更されるようになるドメイン、及び、場合によっては、結合試薬の固体支持体へのカップリングに有用な配列を含む。普遍的検出試薬の物理的に変更可能な結合試薬への結合親和性は、物理的に変更可能な結合試薬−リガンド結合に応じて変更される。普遍的検出試薬は物理的に変更可能な結合試薬に結合する。普遍的検出試薬は、物理的に変更可能な結合試薬によるリガンドの結合後、物理的に変更可能な結合試薬に対して変更した親和性を提示する。場合によっては、普遍的検出試薬はレポーター部分を有する。さらに、このシステムは、一般的に、結合に応じてコンホメーション変化があるいずれかの結合タンパク質へのリガンドの結合に利用可能であり、試薬はその変化に特異的である。

［００１０］第二の態様において、物理的に変更可能な結合試薬は、第二の検出試薬を使用せずに、物理的な手段によって直接検出することができるコンホメーション変化を被る。この態様は、リガンドが小さく、サンドイッチ型のアッセイに利用できない場合に有用である。

［００１１］一態様において、本発明が抗原−抗体結合イベントを検出するための一般的システムである場合には、物理的に変更可能な結合試薬は、抗体融合であり、そして、リガンドはその同種の抗原である。そのシステムは、ある種の抗体分子がそれらの同種の特異的な抗原に結合する場合に正常に起こるコンホメーション変化の検出に基づく。この応答はＩｇＭについて特に劇的であるが、他のアイソタイプを有する優位な範囲に起こってもよい。抗原結合に応じた抗体のコンホメーション変化は、様々な物理的手法によって、又は、補体成分のＣ１ｑの複合体への変化した親和性によって、又は、抗体との相互作用がコンホメーションに依存する他のタンパク質、例えば、コンホメーション特異的抗体試薬及び（天然に発生するか又は操作された）抗体結合タンパク質、例えば、Ｆｃ受容体及び関連する分子によって検出される。

［００１２］本発明は、リガンド結合の検出が期待されるいずれかの応用、例えば、診断、探索使用及び産業上の応用において有用である。この方法は、タンパク質又は抗体のマイクロアレイのいずれかにおける抗原−抗体複合体を検出するのに特に十分に適しており、ただし、可溶性の成分を使用する液相の応用もまた想像される。

［００１３］本発明の新規な側面は、コンホメーション変化が物理的手段によって直接的に測定することができ、又は、個々の抗原特異性に無関係な多くの（全部でないにしても）抗体種（少なくともＩｇＭアイソタイプの抗体について）に対して抗原−抗体結合を検出するであろう１つの試薬を開発することができる。

［００１４］本発明はまた、上述したシステムの使用の方法を包含する。

発明の詳細な説明
［００１７］本発明は、リガンド結合、具体的には、抗原：抗体複合体を検出するための一般的な方法を提供する。本発明のシステムは、物理的手段又は普遍的検出試薬によって物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化の直接的な測定に関係する。本発明の一態様において、システムは２つの試薬：１）物理的に変更可能な結合試薬、及び２）普遍的検出試薬を含む。

［００１８］次の用語は、本明細書において使用されるような下記の一般的な意味を有することが意図される。
Ａ．定義
［００１９］「物理的に変更可能な結合試薬」又は「結合試薬」は、リガンド結合部位を有するタンパク質類、リガンドのリガンド結合部位への結合に応じて物理的に変更されるようになる部分、及び、場合によっては、タグとしても知られる、結合試薬の固体支持体へのカップリングに有用な配列を含む。物理的に変更可能な結合試薬は、リガンドを特異的に結合し、そのような結合の結果として物理的に変更されるようになるいずれかの分子であり得て、限定されないが、抗体又は受容体結合ドメインを含む。物理的に変更可能な結合試薬は、典型的には、モジュラー分子であり、限定されないが、融合（「キメラ」）分子を含み、結合部位、及び、リガンドのリガンド結合部位への結合に応じて物理的に変更されるようになる部分を有する。一般的に、この分子は、天然に発生してもよく、又は遺伝子工学を通じて作製されてもよいが、同じ目的を達成する他の方法が企図される。リガンド結合部位は、免疫グロブリン分子の特異性の幅を含む。リガンド部位の一態様は、免疫グロブリン分子の可変領域又は免疫グロブリン分子のＦａｂ配列で含有した抗原連結部位である。リガンド結合に応じて物理的変化を被る部分は、当該技術分野において現在知られている幅広い部分を含むことができ、限定されないが、膜貫通リガンド特異的受容体の部分及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）を含む。リガンド結合に応じて物理的変化を被る部分の一態様は、ＩｇＭ分子の定常領域である。リガンド結合に応じて、ＩｇＭ分子は、補体因子Ｃ１ｑに対する結合部位を晒す物理的変化を被る。本発明の目的について、ＩｇＭは、単量体又は多量体であり得て、関連するＪ鎖を伴う又は伴わない５量体及び６量体を含む。さらに、ＩｇＭは、天然であり、修飾されており、又は操作されてあってもよい。

［００２０］「普遍的検出試薬」又は「検出試薬」は、リガンドの結合後に物理的に変更可能な結合試薬に結合し、そして、場合によっては、レポーター部分を有する。非制限的な例として、リガンドのＩｇＭへの結合はＣ１ｑ結合親和性を変化し、及び、この場合、Ｃ１ｑは普遍的結合試薬の実質的な部分であろう。Ｃ１ｑは、いずれかの数のレポーター部分にカップルすることができ、限定されないが、蛍光レポーター分子、酵素、及びナノビーズを含む。普遍的検出試薬の他の非制限的な例は、リガンドの様々な受容体への結合が結合のための又は酵素反応のための物理的に区別される部位、例えば、キナーゼ活性の活性化又は不活性化に帰着するものを含み；普遍的検出試薬は、この物理的に区別される部位で物理的に変更可能な結合試薬のための基質又はリガンドである。又は、普遍的検出試薬は、物理的に変更可能な結合試薬のためのコンホメーション依存のエピトープに特異的な抗体となり得る。

［００２１］「物理的手段又は方法による測定」は、リガンドの結合に応じて物理的に変更可能な結合試薬における変化を検出することができるいずれかの物理的測定である。物理的手段は、限定されないが、吸光度又は発光スペクトルにおけるシフト又は光散乱及び伝達行為又はその他の方法を含み、結合したリガンドを有する試薬と結合したリガンドを有しない試薬との間のコンホメーション変化は、電磁放射で変更した相互作用の手段によって検出することができる。物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化を検出することができる現在使用されるそのような物理的方法は、限定されないが、第二の誘導的測定及びＷｏｏｄ異常を含む蛍光発光スペクトル、ラマンシフト分光、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光クエンチング、及び表面プラズモン共鳴を含む。密度、見かけの分子量、限定されないが、原子間力顕微鏡を含む表面積における変化を測定する他の方法は、物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化を検出するために使用することができる。

［００２２］「リガンド」は、結合部位において捕捉され得るいずれかの分子である。抗原は、抗体に対するリガンドである。リガンドは、典型的には、様々な応用において測定することが期待される分子であり、タンパク質、ペプチド、小分子、糖質、薬物等を含むことができる。

［００２３］「抗体」又は「Ａｂ」又は「免疫グロブリン」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質であり、及び抗体を得るために使用されるタンパク質のエピトープ若しくは他の抗原性基質の少なくとも１つに選択に結合することができるタンパク質、又は対応する動物の領域をコードする免疫グロブリンから全体若しくは部分的に誘導するタンパク質である。抗体分子は、それらの「可変領域ドメイン」のアミノ酸配列に可変性に基づくその特異性において異なる。本発明に使用される抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかであり得る。本発明の抗体は、抗体断片及び遺伝子工学的に操作した抗体のような機能的な均等物を含み、一本鎖抗体を含む。本発明の抗体はまた、１つ以上のエピトープに結合することができるキメラ抗体を含む。

［００２４］「タグ」は、１つの分子におけるいずれかのドメインを意味し、その分子は別の分子でその関係を促進する。一態様において、タグは、物理的に変更可能な結合試薬の部分として発現することができるペプチド配列であり、物理的に変更可能な結合試薬を固体支持体に固定化するのに役立てることができる抗体を含む。加えて、タグは、化学的固定化に使用することができる化学基であり得る。一態様において、ペプチド配列は、ビオチン又は糖質のような非タンパク性分子又はタンパク質のいずれか他の翻訳後修飾を関連付ける酵素についての認識配列のためのペプチドタグをコードすることができる。関連付けは、共有的又は非共有的のいずれかであり得る。タグは、これらの特性を有するいずれかのペプチド配列であり得る。タグの特性を有する多くのペプチド配列は知られ、そして、本発明に使用することができる。非制限的な例として、下記のペプチド配列は、本発明のタグとなり得る：ビオチン受諾ペプチド配列、ヘキサ−Ｈｉｓペプチド、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、キチン結合タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、セルロース結合ドメイン、Ｓ−タグ、ＦＩＡｓＨ、ＲｓａＡ、及び、別の分子との関連を促進する能力を有する他の類似型のペプチドである。本発明の一態様において、抗体は、それらのコード配列の部分として、タグの中のリジン残基にビオチンの酵素的結合を可能にする、Ｓｃｈａｔｚによって発見された短いアミノ酸配列であるビオチン受諾ペプチド配列を含む。Ｓｃｈａｔｚによるビオチン受諾ペプチド配列は、１９９８年３月３日に発行された米国特許第５，７２３，５８４号、１９９９年２月２３日に発行された米国特許第５，８７４，２３９号、１９９９年８月３日に発行された米国特許第５，９３２，４３３号、及び２００１年７月に発行された米国特許第６，２６５，５５２号に記載されている。一般に、ビオチン受諾ペプチド配列は、下記の配列：ＬｅｕＸａａ_１Ｘａａ_２ＩｌｅＸａａ_３Ｘａａ_４Ｘａａ_５Ｘａａ_６ＬｙｓＸａａ_７Ｘａａ_８Ｘａａ_９Ｘａａ_１０（配列番号：１）を有し、ここで、Ｘａａ_１は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘａａ_２は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、又はＴｒｙ以外のいずれかのアミノ酸であり；Ｘａａ_３は、Ｐｈｅ又はＬｅｕであり；Ｘａａ_４は、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり；Ｘａａ_５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであり；Ｘａａ_６は、Ｇｌｎ又はＭｅｔであり；Ｘａａ_７は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌであり；Ｘａａ_８は、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、又はＩｌｅであり；Ｘａａ_９は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであり；及び、Ｘａａ_１０は、Ａｓｐ又はＧｌｕ以外のいずれかのアミノ酸であり、ここで、前記ビオチン化−ペプチドは、Ｘａａ_６に隣接しているリジン残基でビオチンリガーゼによってビオチン化され得る。

［００２５］ビオチン受諾ペプチド配列の一態様は、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｇｌｕ（配列番号：２）であり、及び、この配列は、ＡｖｉＴａｇ（商標）と称する。ペプチドタグは、場合によっては、物理的に変更可能な結合試薬のいずれかの部分に連結していてもよい。一態様において、ペプチドタグは、物理的に変更可能な結合試薬の部分である免疫グロブリンの遺伝子座の定常領域に導入される。又は、物理的に変更可能な結合試薬は、タグ内のいずれかの固体支持体に共有結合することができる。

［００２６］「固体支持体」は、結合反応についてのいずれかの適切な支持体、及び／又は、分子が、共有又は非共有結合のいずれかを通して付着していてもよいいずれかの表面を含む。これは、限定されないが、膜、プラスチック、常磁性ビーズ、荷電した紙、ナイロン、Ｌｕｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、官能化したガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ガリウム・アルセニド、金及びシルバーを含む。表面に導入した官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール又はヒドロキシを有することができる、当該技術分野において既知のいずれかの他の材料もまた企図される。これは、いずれかのトポロジーを有する表面を含み、限定されないが、平面、球面、溝面、及びシリンダー表面、例えば、カラムを含む。多数の物理的に変更可能な結合試薬、異なるリガンドにそれぞれ特異的であり、アレイを形成するアドレス可能なフォーマットにおける固体支持体の表面上の特異的な表面に接触してもよく、「マイクロアレイ」又は「バイオチップ」として称されもする。

Ｂ．一般的な方法
［００２７］本発明の一態様は、２つの化合物試薬：ＩｇＭ又はＩｇＭ様の物理的に変更可能な結合試薬、及び物理的に変更可能な結合試薬のコンホメーション変化を検出する普遍的検出試薬（Ｃ１ｑのような）から構成される。物理的に変更可能な結合試薬は下記のように作製される。物理的に変更可能な結合試薬が、抗体、抗体断片、又は抗体様分子である場合、それは、当該技術分野において既知のいずれかの方法、例えば、ハイブリドーマ方法を介したモノクロ−ナル抗体の調製、抗体ファージディスプレイライブラリーの使用等によって調製することができる。抗体がハイブリドーマ又はＢ細胞によって発現したＩｇＭである場合、抗体は、この供給源から直接精製することができる。次いで、抗体がハイブリドーマ又はＢ細胞によって発現した非ＩｇＭである場合、抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのセグメントは、可変領域が、コンホメーション変化を被ることができる物理的に変更可能な結合試薬の部分、例えばＩｇＭの定常領域についてのコード配列に操作的に連結しているような発現ベクターにクローニングされる。発現ベクターは、細胞株に導入され、そして、キメラＩｇＭのような物理的に変更可能な結合試薬が精製される。精製したキメラＩｇＭは、組換えＩｇＭが期待される抗原特異性及び親和性を保持することを確かめるために試験される。「特異性」によって、ＩｇＭは特定のタンパク質又は他の抗原を選択的に結合することが意味される。免疫ブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体アッセイ、及び免疫電子マイクロアッセイを含む当業者に既知の様々な方法を用いて結合を測定することができる。検出に適したレベルで特異的結合を提示する抗体は、物理的に変更可能な結合試薬として使用することができる。

［００２８］この態様において、物理的に変更可能な結合試薬は、固体支持体に固定化され、関連する抗原を含有するものと疑われる試験流体を加える。関連する抗原が物理的に変更可能な結合試薬に結合すれば、その分子のＩｇＭ部分がコンホメーションを変化し、物理的な手段、Ｃ１ｑを結合する能力、又はコンホメーション変化を認識する別の分子を結合する能力のいずれかによって検出可能である。この場合、普遍的検出試薬は、結合したレポーター分子を有するＣ１ｑである。普遍的検出試薬を加え、そして、結合したレポーター分子の量を測定する。

［００２９］本明細書に記載した方法は、リガンドの結合によって誘導された受容体分子における物理的な変化の測定を含む。そのような変化は、リガンドの性質に独立であり、つまり、異なる受容体：リガンド（抗原：抗体）複合体の刺激性測定に適している。例えば、多くの異なる抗体がスライドに固定化され、試料と反応するようにした場合、この試料中の抗原は、スライドの異なる領域に固定化されたそれらの同種の受容体／抗体に結合する。次いで、結合した抗原を有するこれらの抗体は、結合したリガンド／抗原を有する受容体／抗体に特異的に結合する第２の試薬と反応させるようにすることによって検出することができる。

［００３０］本発明のこの態様は、抗原−ＩｇＭ抗体結合イベントを検出する一般的な方法を提供する。方法は、使用される特異的抗原と独立し、そして、代わって、特異的抗原の結合がＩｇＭ分子におけるコンホメーション変化に帰着するＩｇＭの一般的な特徴に基づき、この変化が補体成分、Ｃ１ｑ；抗Ｊ鎖特異的抗体；又はコンホメーション変化を認識する抗体のような試薬を用いて検出することができる。

［００３１］本発明の基本形体は、抗体がガラススライドのような表面上に輸送した領域として固定化された場合、その同種のＩｇＭ抗体に結合している特異的抗原の検出である。ＩｇＭは、既存の又は採用した技術を用いてスライド上に固定化される。方法の一態様は、抗体を一定の配向で繋ぎとめるようにし、そして、抗体が検出試薬に結合している抗原に応じてそのコンホメーション変化を被り、又は抗体についての十分な柔軟性が検出試薬の結合を妨げるようにする遺伝子工学的に操作した接続リンカー又はタグを使用するであろう。例えば、ＡｖｉＴａｇを含有するように遺伝子工学的に操作したＩｇＭ、及びＩｇ重鎖のＣ末端への伸長した柔軟なリンカーは、ストレプトアビジンを被服した表面に丈夫であるが、しかし柔軟にＩｇＭを繋ぎとめるであろう。

［００３２］固定化したＩｇＭ抗体を含有するスライドは、次いで、抗原を含有する試験材料と反応させ、適切な洗浄によって未結合の材料を除去する。特定の抗原に結合した固定化した抗体の分子は、抗原結合と関連した特徴的なコンホメーション変化を被るであろう。

［００３３］この方法において、抗原の固定化したＩｇＭへの結合は、抗体構造におけるコンホメーション変化によって間接的に検出される。方法のこの反復において、抗体のコンホメーションは、抗原を結合したＩｇＭののコンホメーションへのＣ１ｑ（又はＣ１ｑ誘導分子）の異なる結合によって検出される。

［００３４］試験材料中に同種の抗原が存在する固定化した抗体は、同種の抗原を結合するであろうし、そして、抗体は、コンホメーション的に変化するようになるであろう。試験材料中に同種の抗原が存在しない抗体スポットは、抗原を結合しないし、コンホメーション的に変更されない。特異なＣ１ｑ結合は、被らない抗体とコンホメーション変化を被る抗体とを区別するために使用することができる。

［００３５］抗原−抗体複合体に結合したＣ１ｑの検出は、いくつかの可能な方法の１つによって達成することができる。例えば、Ｃ１ｑ検出試薬は、蛍光シグナルを発生するであろうＣ１ｑ蛍光コンジュゲート（例えば、蛍光、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）であり、又は固定化した抗体と関連した変更した屈折指標は、ＳＰＲによって直接検出することができる。又は、抗原−抗体複合体に結合したＣ１ｑは、ＦＲＥＴ技術によって検出してもよい。Ｃ１ｑ結合は、ポリクローナルＣ１ｑ抗体の添加によって（例えば、蛍光をコンジュゲートしたＣ１ｑ抗体を用いた蛍光によって、又はＳＰＲ検出での非コンジュゲートな抗Ｃ１ｑ抗体によって）類似的に視覚化することができる。後者の方法は、ポリクローナル抗Ｃ１ｑ抗体がＣ１ｑ分子上の異なるエピトープを認識し、同時に結合するいくつかの抗体種を含有するため、増殖したシグナルを発生する。

Ｃ．物理的に変更可能な結合試薬の調製
［００３６］本発明の方法は、同種リガンドへの結合に応じて、結合試薬におけるコンホメーション変化、具体的には、同種抗原への結合に応じて、抗体におけるコンホメーション変化に基づく。一態様において、物理的に変更可能な結合試薬は、ＩｇＭ又はＩｇＭ様分子である。適切なＩｇＭは、いくつかの供給源のいずれか１つから得ることができる。免疫した動物からのポリクローナルＩｇＭは、血清又は分泌物から得ることができ、ミュー鎖及び／又は抗原特異性に基づくアフィニティー精製によって精製することができる。これらの天然に発生するＩｇＭ分子は、Ｃ１ｑの異なる結合によって容易に検出される適切なコンホメーション変化を被る。

［００３７］過免疫血清由来又はモノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる有力なＩｇタイプは、ＩｇＧである。これらの供給源からの適切なＩｇＭの物理的に変更可能な結合試薬を調製する一般的な方法は、本明細書に記載される。ＩｇＭ産生細胞株をデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）で、例えば、標準的な細胞融合手法又はＩｇＭ産生Ｂ細胞をエプステイン−バールウイルスで免疫することによって免疫動物から生産することができ、そして、得られた細胞株は、所望の抗原特異性でＩｇＭを産生する細胞をスクリーニングする。一態様において、関心のある抗原特異性を有するが、しかしＩｇＭ以外のアイソタイプのＩｇを産生する既存のハイブリドーマを使用して、原型のＩｇ分子由来のＩｇ重鎖及びＩｇ軽鎖可変領域（及び、したがって抗原結合親和性及び特異性）、及びＩｇＭ誘導のミュー重鎖定常領域を有するキメラＩｇＭを産生する細胞株を作成することができる。例えば、一態様において、ＩｇＧ産生ハイブリドーマ由来のｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲに使用され、発現したＩｇ軽鎖及び重鎖の重鎖及び軽鎖可変領域を増幅し、それぞれ軽鎖及びミュー重鎖発現ベクターにクローニングされる。ベクターは、カッパ（又はラムダ）軽鎖、又はミュー重鎖定常領域のそのままのｃＤＮＡを含有し、例えば、各鎖のそれぞれの可変領域は、他の各定常領域に加えることができるようなものである。得られた構築物は、発現用の適切な細胞株（例えば、非Ｉｇ産生ミエローマ）において同時発現（Ｊ鎖の発現を伴う又は伴わない）される。又は、ＩｇＧ（又は他のもの）産生ハイブリドーマは、同じ可変領域をもち、同じ抗原特異性及び親和性を有するＩｇＭを産生するように遺伝子工学的に操作することができる。これは、ミュー重鎖の定常領域がそれぞれ再配列し発現した重鎖可変領域の遺伝子に並べられた染色体内に挿入される標的とされた遺伝子置換によって達成することができる。得られる構築物は、（ａ）原型の可変領域、及び（ｂ）導入したミュー定常領域由来の重鎖を有するキメラＩｇＭを発現する。この方法の実施例は、実施例６に記載される。この例示において、マウスＩｇＧ産生ハイブリドーマ由来のＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢＶ−ｓＡｇ）結合領域が使用される。この方法はまた、抗体のいずれかのクラス（例えば、ＩｇＹ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）由来の可変領域又はリガンド結合ドメイン、又は免疫グロブリン様細胞表面受容体分子（例えば、Ｔ細胞受容体及び他の細胞表面受容体分子）、又は哺乳動物種（限定されないが、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、ラマ）の幅広いアレイ由来、若しくはニワトリのような鳥種由来、若しくは魚種（限定されないが、サメ及びゼブラフィッシュを含む）由来の他のリガンド結合タンパク質を利用することもできる。

［００３８］抗体様分子、例えば、ファージディスプレイ由来の１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）抗体はまた、本発明によって使用に適した真性のＩｇＭに「変換」してもよく、原型の抗体様分子の抗原特異性を有する。例えば、関心のある１本鎖抗体遺伝子の各可変領域は、クローニングされ、実施例７に記載されるように、適した軽鎖及びミュー重鎖の発現ベクターに挿入されてもよい。

［００３９］実施例６は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｌｐ−Ｉｎ（商標）ベクターの使用を記載するが、この方法は、発現ベクターのＤＮＡを細胞に導入する当該技術分野において既知のいずれかの手法（例えば、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション又は感染）を使用してもよい。「細胞」は、真核細胞、原核細胞、及び古細菌（ａｒｃｈａｅ）を含む。又は、細胞内の細胞質における複製及び安定な維持を可能とし、染色体への統合を要求しない発現ベクターは、ＩｇＭ普遍的検出試薬を発現するために使用することができた。この種のベクターの例は、限定されないが、ウシパピローマウイルス発現又はＥ型肝炎レプリコンを用いるベクターを含む。

［００４０］親のベクターは、ＩｇＭ重鎖定常領域を含み、限定されないが、サメ及び他の魚、ウマ、ロバ、ラマ、ヤギ、ブタ、げっ歯動物及びウサギを含む哺乳動物、ニワトリのような鳥種を含む様々な種の免疫グロブリン分子由来の多様な結合ドメインは受容体分子、特にＴ細胞受容体のような免疫グロブリン様受容体用である。

［００４１］ＩｇＭは、様々な形態で発現してもよい（例えば、多様なオリゴマー形体、単量体、５量体、６量体、及び、関連するＪ鎖を伴う又は伴わない形体、そして、重合した免疫グロブリン受容体由来の関連する「分泌成分」を伴う又は伴わない形体、そして、ＩｇＭ、ｓＩｇＭ、又はＩｇＭの可溶形体を含む）。ある種の応用において、これらの形体の１つまたは別のものは、最も利用可能であるかもしれない。多くの場合、抗体分子の定常領域は、抗原結合に応じて物理的な変化（アロステック又はコンホメーション）を被るようにはみえず、ＩｇＭは、例外であり；ＩｇＭは、１つの重鎖及び１つの軽鎖の部位を含む抗体と各々２量体の５量体（又はある場合では４量体若しくは６量体）であり、すべて「Ｊ鎖」に結合している。つまり、これらの分子は、抗原結合部位について１２量体である。最良の証拠は、この分子上の２以上の抗原結合部位の占有が補体成分Ｃ１（又はサブ因子Ｃ１ｑ）についての結合部位を晒すような変化を誘導することを示唆する。抗原に対してのＩｇＭの親和性は一般的に低いので、２つ以上の抗原結合部位の占有は、抗原が多量体である場合にだけ発生する。しかしながら、高親和性のＩｇＭについて選択すること、又は免疫グロブリンの他のクラス由来の高親和性の抗原結合部位（可変領域）を組換えＤＮＡ技術の手段によってＩｇＭに誘導することは可能である。ＩｇＭの物理的に変更可能な結合試薬を産生するように操作された、突然変異したハイブリドーマ細胞株を含む細胞株は、Ｊ鎖を伴って又は伴わずに調製することができる。Ｊ鎖は、Ｊ鎖を産生するベクターとＩｇＭ発現の同時トランスフェクションによって産生することができ、ＩｇＭを産生する発現ベクター上の異なるプロモーターを同時発現することができ、染色体に統合され、細胞質の発現複製の組合せによって、又は複数の又は複数サブユニットのタンパク質を発現するために現在使用されているいずれかの方法によって産生することができる。加えて、
Ｄ．コンホメーション変化を検出する直接的な物理的手法
［００４２］リガンドの結合に応じた物理的に変更可能な結合試薬のコンホメーション変化を伴って変化するいずれかの物理的パラメーターは、リガンドの測定として使用してもよい。物理的パラメーターは、限定されないが、吸収又は発光スペクトル又は光散乱及びトランスミッション行動、又は、結合したリガンドを伴う試薬と伴わない試薬との間のコンホメーション変化が電磁的放射との変更した相互作用の手法によって検出できる場合の他の方法を含む。物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化を検出することができる、現在使用中の物理的方法は、限定されないが、第二の輸送測定及びウッドアノマリーを含む蛍光発光スペクトル、ラマンシフト分光計、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光クエンチング、及び表面プラズモン共鳴を含む。密度、見かけの分子量、又は、限定されないが、原子間力顕微鏡を含む表面積における変化を測定する他の方法は、物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化を検出するために使用することができる。

Ｅ．普遍的検出試薬
［００４３］本発明において、リガンド結合は、物理的に変更可能な結合試薬の構造におけるコンホメーション変化によって直接的に検出される。物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化は、直接的な物理的変化（セクションＤ、上述）によって、又は「普遍的検出試薬」の使用によって検出してもよい。一態様において、リガンド結合は、ＩｇＭ分子の構造におけるコンホメーション変化によって間接的に検出される。上述したように、補体成分Ｃ１ｑは、ＩｇＭの抗原結合及び非結合形体について異なる結合親和性を提示する。したがって、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｑのＩｇ結合ドメイン、又は類似の結合特性及び特異性を有するいずれかの他の分子は、この方法において普遍的検出試薬として使用することができる試薬である。Ｃ１ｑは、脊椎動物の血清から精製してもよく、又は組換え遺伝子工学的方法によって発現させてもよい；Ｃ１ｑ Ｉｇ結合ドメインは、タンパク質の加水分解によって、又は単離したドメインとして組換え遺伝子工学的方法を発現させ、又は担体タンパク質に融合させることによって誘導してもよい。検出試薬として使用してもよい他の種の分子は、例えば、ペプチド核酸及び抗体（ファージディスプレイ方法由来のｓｃＦｖを含む天然又は組換え抗体様分子）を含み、ＩｇＭの抗原結合及び非結合形体の異なる結合親和性を提示するものである。

［００４４］代わりの普遍的検出試薬は、抗Ｊ鎖抗体である。ＩｇＭのいくつかの形体は、追加のペプチド、Ｊ鎖を含有する。Ｊ鎖は、ＩｇＭの抗原結合及び非結合形体における抗Ｊ鎖抗体に異なる接近性を提示する。

［００４５］代わりの検出は、蛍光共鳴エネルギー転移による。方法の本発明において、ＩｇＭは、抗原結合に応じてＩｇＭにおいて現われるカーブの反対側に適切な蛍光色素を含有するように操作されている。色素（例えば、ＧＦＰ、関連する蛍光タンパク質及びそれらのスペクトル変異体）の選択は、第一色素が独特の励起波長を有し、その発光スペクトルが第二色素の励起波長と適合するようなものである。この現象は、２つの色素が互いに接近している並べられた場合にだけ測定可能な範囲で起こり、即ち、この場合において、ＩｇＭは、特徴的なコンホメーション変化を被り、それにより、２つの色素を極めて近接に近づける。読み出しは、第二色素の発光波長特性での光検出による。

［００４６］Ｃ１ｑは、ＩｇＭ誘導の物理的に変更可能な結合試薬分子に対して、普遍的検出試薬として使用してもよい。ＩｇＭ分子は、Ｃ１ｑ結合部位のアミノ酸配列が変更されるように操作してもよい。このＩｇＭにおいて、抗原結合によって引き起こされるコンホメーション変化は、変更された部位を晒す。この新らたな部位は、別の受容体分子の結合部位であるように操作してもよく、Ｃ１ｑとは区別され、しかし、普遍的検出試薬としてその使用に関連して機能的に類似している。又は、変更された部位は、触媒活性を有し、酵素基質として使用してもよく、これらの活性は、物理的に変更可能な結合試薬のコンホメーション状態（即ち、リガンド結合又は非結合状態）に依存している。

Ｆ．検出
［００４７］いずれか適した検出システムは、本発明における普遍的検出試薬結合の定量について想起され、限定されないが、蛍光、酵素カップリング、放射活性、表面プラズモン共鳴、化学発光等を含む。ＩｇＭ−抗原複合体に対するＣ１ｑ検出試薬の結合（又はいずれか他のコンホメーション依存性分子の結合）を検出されるようにするであろういくつかの方法が想起される。これらは、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ）又は蛍光色素に対する検出試薬をカップリングすることを含む。視覚化は、それぞれ、適切な着色した又は蛍光性の基質で反応すること、又は蛍光の直接的な視覚化による。シグナルは、検出試薬（例えば、Ｃ１ｑ）との反応、続く蛍光又は酵素を結合したポリクローナル抗Ｃ１ｑとの反応によって増幅してもよい。ポリクローナル抗体によって認識され得る１つのＣ１ｑにおける多くのエピトープが存在するので、得られるシグナルは、Ｃ１ｑそれ自身を標識することによって達成され得るものよりも数倍増幅されるであろう。

［００４８］又は、検出試薬（例えば、Ｃ１ｑ）の結合は、表面プラズモン共鳴における変化によって視覚化してもよい。分子層は、一連の抗原、Ｃ１ｑの結合（さらにシグナルを増幅するためのポリクローナル抗Ｃ１ｑをともなって又は伴わずに）で厚くなるので、層の光反射特性が変化し、適切なやり方で測定され得る。

Ｇ．発明の使用
［００４９］発明は、リガンド結合を検出するための一般的な方法である。結合反応、例えば、抗原への抗体認識は、タンパク質及び他の分子の定量に幅広く使用されるため、そのような複合体の検出は、（限定されないが）体内の組織及び流体におけるタンパク質及び他の分子のプロテオミクス及び診断測定を含む多くの応用にとって重要である。

［００５０］技術は、抗体の結合における抗原又はハプテンとして行動することができるいずれかの分子を検出するために使用することができる。これは、疾患の診断又は生物体の生物学的状態を評価する動物又はヒトの血清若しくは組織試料における環境試験のための水若しくは空気中の農薬、病原、及び他の汚染物質の検出のための応用、生物学的マーカーが新規薬物における可能な副作用を評価するために利用可能である治療薬の評価のための応用、治療応用のための化合物をハイスループットするための応用、及び分子の異種群における分子の検出又は定量が期待される他の応用を含む。

［００５１］本明細書に言及されるすべての特許及び刊行物は、参照により完全に明確に引用される。下記の実施例は、本発明のある種の態様及側面を例証するために使用され、発明の範囲を限定するために構成されていない。

実施例
実施例１
［００５２］特異的抗原に対する高親和性抗体を産生するハイブリドーマは、標準的な手法によって選択される。このハイブリドーマによって発現されるＩｇ重鎖及び軽鎖の可変領域は、標準的な手法によってクローニングされ、ＩｇＭ発現ベクターに導入される。このベクターは、これらの可変領域の適した軽鎖遺伝子（カッパ又はラムダ）及びＩｇＭ重鎖遺伝子への融合を可能にする。これらのＤＮＡ構築物は、次いで、発現及び分泌に適した細胞、例えば、ミエローマ細胞株に導入される。これらの細胞によって産生される融合ＩｇＭ分子は、標準的な手法によって精製され、標準的な手法によって再びスライド上に固定化される。

［００５３］次いで、試料（組織又は体液）は、スライド表面で反応することができ、試料中の抗原は抗体に結合する。抗体：抗原複合体は、次いで、カップルしたＣ１ｑを伴う試薬で検出される。これは、蛍光化合物であってもよく、又は屈折率若しくは光散乱のような光学特性における変化を与えるのに十分な巨大分子の大きさであってもよい。

実施例２
［００５４］この実施例は、実施例１に記載されるのと同じプロトコールを使用し、しかしながら、ＩｇＭ発現ベクターにおけるＣ１ｑ結合部位は変化している。次いで、抗体は、この新規なＩｇＭ部位で発生し、抗原が突然変異したＩｇＭに結合する場合にのみ接近することができる。これらの抗体は、次いで、蛍光化合物、又は屈折率若しくは光散乱のような光学特性において変化を与えるのに十分な大きさの巨大分子のようなＣ１ｑと同じ方法でカップルすることができる。

実施例３
［００５５］可溶性細菌受容体のクラスは、細菌の２成分シグナル伝達システム（ＴＣＳＴＳ）のセンサー成分によって例証される。ある種のＴＣＳＴＳのセンサー成分（例えば、大腸菌ＮｔｒＢ）は、２つのドメイン：リガンド結合ドメイン及びエフェクター（又は「トランスミッター」）ドメインから構成される可溶性細胞質タンパク質である。リガンド結合ドメインの配列は、このクラスのタンパク質のメンバーのうちでは全く異なり、１つの特異的リガンドを結合するための各タンパク質の特異性を反映している。しかしながら、エフェクタードメインの配列は、非常に保存されており、リガンド結合ドメインへのリガンドの結合に応じて活性化されるタンパク質キナーゼ活性を有する。つまり、エフェクタードメインの活性化は、リガンド結合によって達成され得る。

実施例４
［００５６］この実施例は、実施例１において作成した融合ＩｇＭ分子を使用する。ＩｇＭ分子は、ＩｇＭについてのリガンドを含有する試料と反応させることができえる。ＩｇＭ分子がそれらの同種のリガンドを結合する場合、コンホメーション変化を被る。コンホメーション変化は、ＳＰＲのような物理的手段によって検出される。

実施例５
［００５７］普遍的検出を可能とする高親和性ＩｇＭ ＡｖｉＴａｇｇｅｄ抗体は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を認識する抗体を産生する既存のハイブリドーマ細胞株から構築した。異なるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹ）由来又はラマ若しくは鳥のような異なる種由来、又はＩｇ様分子（例えば、限定されないが、Ｔ細胞受容体）の結合領域由来のＩｇＭ分子を構築するために、多種の可変ドメインを付加することができるＩｇＭ定常領域を含有するベクターを構築することがまず必要である。この親のベクターは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦＬＰ−ＩＮ（商標）ベクターにおいて構築し、マウス脾臓ｃＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡのＰＣＲ、及び製品プロトコールを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｔ：４５−００３０）の−ＴＯＰＯ（登録商標）のようなシークエンシングベクターに平滑末端のクローニングによる。

［００５８］ＩｇＭ定常領域をクローニングするためのＰＣＲプライマーは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｌｐ−Ｉｎ（商標）にサブクローニングできるように定常重鎖の配列周辺で設計した。それらは、ＡｖｉＴａｇが３’末端に添加できるようにＳＴＯＰコドンを伴って又は伴わすに設計された。ＩｇＭ定常領域が正しくクローニングされたことを確かめて、ＡｖｉＴａｇビオチン受諾ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、当業者に親しい手法を用いて、フレームに合わせてクローニングした。

［００５９］ＨＢｓＡｇのＩｇＧ可変領域をＩｇＭ骨格に付加するために、ＩｇＧ ＨＢｓＡｇ抗体を産生するハイブリドーマからＩｇＧ可変領域（重鎖及び軽鎖）を含有するｃＤＮＡを作成することが必要である。ＨｂＳＡｇハイブリドーマのｍＲＮＡを下記のプロトコールを通して、抽出しペレットとした：
［００６０］Ａ．抗ＨＢｓＡｇハイブリドーマのＲＮＡ抽出。１，５００万個のハイブリドーマ細胞をペレットとし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。

［００６１］１ｍｌのＳＴＡＴ６０（商標）ＲＮＡ抽出試薬（ＢｉｏＧｅｎｅｓｉｓ Ｃａｔ：ＣＳ−１１０）で再懸濁させ、室温で５分間インキュベートし、２０μｌのクロロホルムを添加した。懸濁駅を１５秒間激しく振とうし、３分間室温でインキュベートした後、５分間４℃で１２０００ｒｐｍで遠心した。

［００６２］これは２層形成した：下部、赤いフェノールクロロホルム層；そして、上部、ＲＮＡを含有する無色層。中間は、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する。
［００６３］上部の水層に０．５ｍｌのイソプロパノールを混合し、室温で１０分間インキュベートし、１０分間４℃で１２０００ｒｐｍで遠心した。

［００６４］ＲＮＡペレットは、７５％エタノールで洗浄し、５分間４℃で７５００ｒｐｍで遠心した。ペレットを乾燥させ、８０μｌのＲＮアーゼ無しの水に溶解した。
［００６５］Ｂ．Ｉｇ特異的ＤＮＡのクローニング。製品取扱説明書に従って、ＰｒｏｍｅｇａのＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商標）逆転写キット（Ｃａｔ：Ａ３８００）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって精製したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製品のプロコールに従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰｈａｒｍａｃｉａのＩｇ特異的可変重鎖及び可変軽鎖プライマー（重プライマーＣａｔ：２７−１５８６−０１；軽プライマーＣａｔ：２７−１５８３−０１）を用いてｃＤＮＡのＰＣＲによって、ＩｇＧ重鎖のＩｇ可変領域、そして定常領域及び重領域の両方を含む完全なＩｇＧカッパ軽鎖をクローニングした。ＰＣＲ生産物は、製品のプロトコールを用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｃａｔ：４５−００３０）にクローニングし、配列決定をした。ＩｇポジティブＤＮＡ配列は、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）ベクターにサブクローニングするための制限部位を含む特異的プライマーを用いてＴＯＰＯベクターからＰＣＲによって増幅した。ＶＨ配列は、Ｎｈｅ１制限エンドヌクレアーゼで重鎖可変領域ＰＣＲ産物の切断によってクローニングし、そして、軽鎖ＰＣＲ産物は、標準的なプロトコールに従って、Ｃｌａ１制限エンドヌクレアーゼを用いてクローニングした。最終の発現ベクターは、図１に図示的に示される。抗ＨＢｓＡＧ発現ベクターは、安定な哺乳動物のタンパク質発現細胞株の発生のためにＦｌｐ−Ｉｎ（商標）ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＨｂＳＡｇについては、可変軽鎖は、ＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてベクターにクローニングし、可変軽鎖は、ＮｈｅＩ部位を用いて発現ベクターにクローニングした。

［００６６］Ｃ．安定なＦｌｐ−Ｉｎ（商標）細胞株の発生。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）細胞は、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）培地で通常に増殖させ、Ｚｅｃｏｃｉｎ（商標）成長培地１０ｍｌ中に１．５×１０^６細胞／ｍｌの密度で、Ｐ９０組織培養プレートに播種した。細胞は、２４時間インキュベート後、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６を用いてトランスフェクトした。

［００６７］Ｄ．トランスフェクション。８７．５μｌの無血清ハムＦ１２栄養混合培地及び７．５μｌのＦｕＧＥＮＥ（商標）を４本の滅菌エッペンドルフ・マイクロチューブに連続的に分配した。各トランスフェクションについては、ｐｃＤＮＡ ５／ＦＲＴ中のＡｖｉｔａｇｇｅｄ抗ＨｅｐＢ ＩｇＧ及びＩｇＭについてコードするベクターＤＮＡ、空のベクター対照又は無血清培地対照をＦｕＧＥＮＥ（商標）無血清培地混合物に添加した。全てのトランスフェクション混合物に、４．５μｌのｐＯＧ４４：ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴプラスミドＤＮＡを添加し、トランスフェクション混合物は緩やかに叩き、３０分間室温でインキュベートした。

［００６８］５ｍｌの培地をＦｌｐ−Ｉｎ（商標）ＣＨＯ細胞から吸引し、そして、適切なトランスフェクション混合物を培養液に注意深く添加した。トランスフェクトした細胞を一晩インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、培地を細胞から除去し、１０ｍｌのＺｅｏｃｉｎ成長培地で置換した。

［００６９］トランスフェクションの４８時間後、２５％未満のコンフルエントで成長培地を含有するハイグロマイシン培地に細胞を播種した。さらに、フォーカス（ｆｏｃｉ）が同定できるまで、２−３日ごとにハイグロマイシン培地を再添加して細胞を培養した。２０個のハイグロマイシン・フォーカスを同定し、細胞を成長させる。次いで、細胞をＺｅｏｃｉｎ感受性について試験することによって、ｐｃＤＮＡ／５ＦＲＴ構築物の蓄積をチェックした。次いで、Ａｖｉｔａｇｇｅｄ抗体の発現について、クローンをさらに培養する。

［００７０］Ｅ．細胞培養／培地。Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）チャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）及びｍＣＡＴ ＣＨＯ細胞を、１０％のウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１．０ＩＵ ｍｌ^−１）及びストレプトマイシン（１．０ｍｇ ｍｌ^−１）を添加したハムＦ１２栄養培地に維持した。加えて、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）ＣＨＯ細胞についての培地を１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含有し、ｍＣＡＴ ＣＨＯ細胞培地は３００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有した。

［００７１］Ｐｌａｔ．−Ｅ細胞を１０％の胎児ウシ血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１．０ＩＵ ｍｌ^−１）及びストレプトマイシン（１．０ｍｇ ｍｌ^−１）で添加したダルベッコ修飾培地に維持した。

［００７２］記述がない限り、３７℃、６％ＣＯ_２で細胞をインキュベートし、全ての細胞培養の調製方法を無菌の状況下で、層流生物学的安全キャビネットで実行した。
実施例７
［００７３］実施例６に記載されるような既存のハイブリドーマを用いる代わりに、物理的に変更可能な結合試薬についてのＩｇＭ抗体を利用可能な抗体ＤＮＡ配列から構築することができた。ＨＢｓＡｇ抗体ＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースに掲載される。配列は、ＮＣＢＩデータベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＦ２３６８１６）で寄託したｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ抗体）配列を記載する。

［００７４］可変重鎖ドメイン：

（配列番号：３；翻訳されたタンパク質配列、配列番号：５）。
［００７５］可変軽鎖ドメイン：

（配列番号：６；翻訳したタンパク質配列、配列番号：８）。
［００７６］ＩｇＭクラス抗体ではなく、一本鎖抗体は物理的に変更可能な結合試薬としての使用に適切ではない。これは、リガンド結合に応じてコンホメーション変化（ＩｇＭに類似する）を被ると知られていないからである；しかしながら、物理的に変更可能な結合試薬としてのＡｖｉＴａｇｇｅｄ ＩｇＭ抗体の適した使用は、可変重鎖ドメイン配列及び軽鎖ドメイン配列（可変及び定常領域）を用いて構築することができ、伴にＨＢｓＡｇ抗体結合ドメインを含有する。実施例６に記載されるように、免疫グロブリンの重鎖可変領域、又は他のタンパク質結合ドメインをコードするＤＮＡは、ＩｇＭ定常領域を含有するベクターにフレームを合わせてクローニングし、当業者に既知の方法を用いてクローニングした免疫グロブリン軽鎖と同時発現させる。ＡｖｉＴａｇビオチン受諾ペプチドをコードするＤＮＡは、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を用いて表面又は分子上に物理的に変更可能な結合試薬を固定化できるようにＩｇＭ重鎖のＣ末端にクローニングするであろう。

［００７７］これらの可変重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列のオリゴヌクレオチドは、安定な導入及びタンパク質の発現のために設計した発現ベクターに連結に適した末端で合成できた。ＤＮＡ配列の長さのため、複数の相補オリゴは配列において重なるように合成され、アニリーングされ、耐熱性ポリメラーゼを用いて伸長し、「ジャンプＰＣＲ」手法を用いる。

実施例８
［００７８］物理的に変更可能な結合試薬としてのＩｇＭ様分子の使用の拡張として、ある種の動物（例えば、ラマ及びサメ）が免疫グロブリンのクラス又はＩｇ様分子を産生し、軽鎖を欠如していることが知られ、抗原複合部位は、重鎖だけから誘導される。ＩｇＭ様キメラ物理的に変更可能な結合試薬分子は、本出願の他の部分に記載されるＩｇＭミュー鎖定常領域骨格を用いて組換えＤＮＡ技術によって構築することができ、これらの１本鎖抗体の重鎖に含有した完全な可変領域抗原複合部位に連結される。同様に、ｓｃＦｖ（例えば、ファージディスプレイ技術）は、免疫グロブリン誘導分子であり、軽鎖及び重鎖誘導可変領域は、一本のポリペプチド鎖に隣接する。併せて、これらの２つの隣接する可変領域は、機能的抗原複合部位を構築する。ＩｇＭ様キメラの物理的に変更可能な結合試薬分子は、本出願の他の部分に記載されたＩｇＭミュー鎖定常領域骨格を用いて組換えＤＮＡ技術によって構築することができ、ｓｃＦｖに含有した、完全であり、隣接した可変領域抗原複合部位に連結される。

実施例９
［００７９］複数の物理的に変更可能な結合試薬は、各々独特の抗原特異性を有し、アドレス可能なアレイフォーマットにおける固体支持体に固相化され得る。これは、１回のテストで各抗原の刺激性検出を可能にする。アレイは、同時及び別々に、ヒト及び動物の血清中の複数のウイルス性病原体の存在を検出するために構築することができる。図２に言及されるように、ＨＩＶ（カラムＡ）、ＨＢＶ（カラムＢ）、ＨＣＶ（カラムＣ）及びＳＡＲＳ（カラムＤ）のそれぞれに特異的な４つのＡｖｉＴａｇｇｅｄ ＩｇＭの物理的に変更可能な結合試薬は、二重にアレイを行った（行１及び２）。非免疫の正常なヒト血液から単離した総ＩｇＭは、各カラム（行３）について対照スポットとして役立つ。これらの１２スポットの各グループは、複数の患者の血清の刺激性テストを可能にするために、スライド（本実施例では４つ）上に複数回繰り返す。スライド（ロウ１−３）上の各アレイのグループは、患者試料を物理的に分割するために、漏れ止めのプラスチック分割器によって分離する。試験の血清及び正常な血清を載せ、患者血清において存在するかもしれない各ウイルスは、特異的なＩｇＭの物理的に変更可能な結合試薬によって捕捉されるであろう。物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化は、ウイルス粒子の結合に応じて発生し、普遍的検出試薬を用いて検出される。

実施例１０
［００８０］大腸菌ベータガラクトシダーゼ又は哺乳動物のｃ−ｅｒｂＢ３のいずれかに対する商業的に利用可能なＩｇＭ抗体は、Ｐｉｅｒｃｅマレイミドカップリングを通して９６ウェルのマイクロタイタートレイのウェルにカップルした。次いで、プレート上の非特異的な部位は、塩溶液中の血清アルブミンによる処理によって遮断した。商業的に利用可能なベータ ガラクトシダーゼの３つの異なる希釈液は、抗ベータ ガラクトシダーゼ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ３抗体と一緒にウェルに添加した。非結合のベータ ガラクトシダーゼは、次いで、ウェルから洗浄され、そして、蛍光的に標識されたＣ１ｑを添加した。プレートから非結合のＣ１ｑを洗浄後、結合したＣ１ｑの量を蛍光標識を測定することによって決定した。２つの顕著な結果が存在した：第一に、低イオン強度結合緩衝液では、ｃ−ｅｒｂＢ３抗体（非特異的）を含有するウェルはバックグランドに対してシグナルを示さなかった。抗ベータ ガラクトシダーゼ抗体を含有するウェルは、Ｃ１ｑ濃度で変化した抗原（即ち、ベータ−ガラクトシダーゼ）に依存してバックグランドより有意なシグナルを与えた。これらの結果は、Ｃ１ｑ結合は、結合した抗原量、そして、即ち、試料中の抗原濃度を検出するために抗体のある種の連結している配列を用いて使用することができることを示す。

実施例１１
［００８１］特異的な物理的に変更可能な結合試薬及び抗原複合体はまた、溶液で形成してもよい。本実施例では、ＩｇＭの物理的に変更可能な結合試薬は、試験試料に添加し、特異的な抗原は物理的に変更可能な結合試薬に結合する。Ｃ１ｑは、物理的に変更可能な結合試薬−抗原−Ｃ１ｑの４つの複合体を形成するために混合物に添加される。この複合体は、固体支持体に固相化したＩｇＭ特異的試薬［例えば、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ）_２］によって捕捉される。非結合のＣ１ｑ及び他の成分は、洗浄によって除去され、そして、複合体のＣ１ｑ成分は、Ｃｙ５標識した抗Ｃ１ｑ抗体を用いて検出される。

［００１５］図１は、抗ＨＢｓＡｇ ｐｃＤＮＡベクターを示す。抗ＨＢｓＡｇ ＩｇＭ重鎖：８９８−２７２４塩基対。抗ＨＢｓＡｇ ＩｇＫ軽鎖：３４１１−４１６３塩基対。 ［００１６］図２は、ウイルスチップ（Ｖｉｒａｌ Ｃｈｉｐ）を用いた普遍的検出システムの図解的な解説を示す。ＨＩＶ（カラムＡ）、ＨＢＶ（カラムＢ）、ＨＣＶ（カラムＣ）及びＳＡＲＳ（カラムＣ）に対するＡｖｉＴａｇｇｅｄ ＩｇＭは、二重に（行１及び２）アレイを実行し、又は、全ＩｇＭは、各カラムについて対照のスポットとして使われるであろう正常のヒト血液（行３）から単離した。スライド上のアレイの各グループ（行１−３）は、ＥＬＩＳＡプレートに類似したウェルを創作するであろう漏れ止めのプラスチック分割器で積層するであろう。試験及び正常の血清を載せ、そして、ウイルスは特異的抗体によって捕捉されるであろう。ＩｇＭにおけるコンメーション変化は、ウイルス粒子の結合により生じる。この変化は、普遍的検出試薬で検出されるであろう。

Claims (20)

1. 結合検出方法であって、下記：
   ａ）物理的に変更可能な結合試薬（Ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）を与えること、
   ｂ）物理的に変更可能な結合試薬が特異的に結合するリガンドを与えること；
   ｃ）物理的に変更可能な結合試薬におけるコンホメーション変化を検出することにより、物理的に変更可能な結合試薬のリガンドへの結合が検出されること
   を含む、前記方法。
2. 請求項１に記載の方法を含む結合検出方法であって、前記物理的に変更可能な結合試薬のコンホメーション変化を検出することが、下記：
   ａ）普遍的検出試薬（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を与えること；そして
   ｂ）普遍的検出試薬の物理的に変更可能な結合試薬への結合を検出することにより、物理的に変更可能な結合試薬のリガンドへの結合が検出されること
   を含む、前記方法。
3. 検出が定量的である、請求項１に記載の方法。
4. 物理的に変更可能な結合試薬が
   ａ）リガンド結合部位；
   ｂ）リガンドのリガンド結合部位への結合に応じて物理的に変更されるようになるドメイン；そして
   ｃ）場合によっては、結合試薬の固体支持体へのカップリングに有用な部位
   を含む、請求項１に記載の方法。
5. 物理的に変更可能な結合試薬が抗体又は受容体結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記抗体が、モノマーＩｇＭ、オリゴマーＩｇＭ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、遺伝子工学的に操作した抗体及びキメラ抗体から成る群から選択される抗体を含む、請求項５に記載の方法。
7. 物理的に変更可能な結合試薬は、物理的に変更可能な結合試薬の固体支持体へのカップリングのためのタグを含む、請求項１に記載の方法。
8. タグが、ビオチン受諾ペプチド配列、ヘキサ−Ｈｉｓペプチド、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ、ＦＬＡＧ、エピトープタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、キチン結合タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、セルロース結合ドメイン、Ｓ−タグ、ＦＩＡｓＨ、ＲｓａＡ、及びソルターゼ認識配列から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. ビオチン受諾ペプチド配列は、ＬｅｕＸａａ_１Ｘａａ_２ＩｌｅＸａａ_３Ｘａａ_４Ｘａａ_５Ｘａａ_６ＬｙｓＸａａ_７Ｘａａ_８Ｘａａ_９Ｘａａ_１０であり、ここで、Ｘａａ_１は、いずれかのアミノ酸であり；Ｘａａ_２は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒ以外のいずれかのアミノ酸であり；Ｘａａ_３は、Ｐｈｅ又はＬｅｕであり；Ｘａａ_４は、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり；Ｘａａ_５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであり；Ｘａａ_６は、Ｇｌｎ又はＭｅｔであり；Ｘａａ_７は、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌであり、Ｘａａ_８は、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、又はＩｌｅであり；Ｘａａ_９は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであり；そして、Ｘａａ_１０は、Ａｓｐ又はＧｌｕ以外のいずれかのアミノ酸であり、前記ビオチニル化ペプチドが、Ｘａａ_６に隣接したリジン残基でビオチンリガーゼによってビオチン化することができる、請求項８に記載の方法。
10. ビオチン受諾ペプチド配列が、配列番号：２である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ビオチン化配列が、ビオチンリガーゼによってビオチン化されている、請求項８に記載の方法。
12. 普遍的検出試薬が、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｑ結合部位特異的抗体、及び抗Ｊ鎖特異的抗体から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
13. 普遍的検出試薬が、レポーター分子を含む、請求項３に記載の方法。
14. レポーター分子が、基質と反応して異なる産物を与える酵素、蛍光色素、及び金粒子から成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 物理的に変更可能な結合試薬におけるリガンドに対するコンホメーション変化を検出することが、蛍光発光、ラマンシフト分光、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴、及び原子間力顕微鏡から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
16. 下記：
    ａ）抗体を与えること；
    ｂ）抗体が特異的に結合するリガンドを与えること；
    ｃ）普遍的検出試薬を与えること；そして
    ｄ）普遍的検出試薬の物理的に変更可能な結合試薬への結合を検出することによって、物理的に変更可能な結合試薬のリガンドへの結合が検出されること
    を含む、結合検出方法。
17. 抗体がＩｇＭタンパク質を含み、そして、普遍的検出試薬がレポーター分子を含むＣ１ｑを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 抗体がＩｇＭタンパク質を含み、そして、普遍的検出試薬がＣ１ｑ、Ｃ１ｑ結合部位特異的抗体、及び抗Ｊ鎖特異的抗体から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. アドレス可能なフォーマットにおける固体支持体の表面上で特異的な局所での複数の物理的に変更可能な結合試薬を含むマイクロアレイ。
20. 結合検出方法であって、下記：
    ａ）請求項１９に記載のマイクロアレイを調製すること；
    ｂ）物理的に変更可能な結合試薬が特異的に結合するリガンドを含有するリガンドであると疑わしい試料を与えること；
    ｃ）普遍的検出試薬を与えること；そして
    ｄ）普遍的検出試薬の物理的に変更可能な結合試薬への結合を検出することによって、物理的に変更可能な結合試薬のリガンドへの結合が検出されること
    を含む、前記方法。

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