JP3549833B2 - アフラトキシンとアルブミンの結合物の検出用放射免疫試薬セット及びその検出方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アフラトキシンとアルブミンの結合物の検出用放射免疫試薬セット及びその検出方法に係るもので、特に血清サンプルの例の検査に利用できると共に、臨床ではアフラトキシンの影響による肝臓ガンにかかるリスクを評価できる方法に係るものである。
【０００２】
【従来の技術】
アフラトキシン（Ａｆｌａｔｏｘｉｎ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＦｌａｖｕｓとＡ．Ｐａｗａｓｉｔｉｃｎｓ菌が高温多湿の環境で成形した有毒代謝物であり、特にアフラトキシンＢ１が多くの動物試験の場合ではすべて肝臓ガンにかかる恐れがあり、Ｇｏｌｄ氏の評価では（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３；５３：９―１１の評価では、５０％のネズミの肝臓細胞ガンを引き起こす使用量は９．３ｘ１０―４ミリグラム／体重キロ毎／毎日であると認められ、このガンを生じる毒性はＢｅｎｚｏｐｙｒｅｎｅの千倍となり、そのため、アフラトキシンＢ１は既に国際ガン研究組織（ＩＡＲＣ）に既知の最も強いガンにかかる毒性を有する化合物の１つになるように認められる。
【０００３】
アフラトキシンＢ１のガンにかかることはまず肝臓細胞の酵素の活性化が起こることによって引き起こされるものである。言い換えれば、アフラトキシンＢ１は直接にガンを生じるものではなく、まず細胞内酵素の代謝活性化によりガンにかかる可能性のある物質を生じることによってガンにかかるようになるものであり、即ち、アフラトキシンＢ１のエポキシド（ＡＦＢＩ−ｅｐｏｘｉｄｅ、ＡＦＢＯ）こそが細胞内のＲＮＡやＤＮＡや蛋白質や内部物質網などの大分子と結合できるようになり、ＩＡＲＣ単行本第５６巻第３０３ページ１９９３年（ＩＡＲＣ ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ ｒｉｓｋｓ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ １９９３；５６：３０３）を参照すること。
【０００４】
１９８７年にアメリカのＳａｂｂｉｏｎｉ氏などは、アフラトキシン−ＤＮＡ結合物が単に２４―４８時間のアフラトキシンの影響のことしか反応できず、流行病学の研究にはより長期の半衰期の蛋白質結合物によって生物剤の量の指標を生じる必要があると認める。ヘマチンの半衰期が１２０にも達するが、アフラトキシンとが殆ど結合できず、それに対して、血清アルブミンが大部分のアフラトキシンと結合できると共に、共有結合によって結合され、且つ長期的に累積する。アフラトキシン−アルブミン結合物の半衰期は２０日間にも達するので、過去１乃至２ヶ月のアフラトキシンの影響の状況を評価できる（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ８：８１９−８２４、１９８７参照）。
【０００５】
１９９６年以前、アフラトキシン−アルブミン結合物の分析と検査方法は過去のアフラトキシンを測定する方法を援用するが、血清サンプルが蛋白分解と酵素加水分解と有機溶剤の前処理を行ってから進めてそれぞれの分析方法を実行できるようになり、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や放射免疫分析方法や競争型酵素連結免疫吸着方法などによって量を決めるツールとして使用できるようになり、しかしながら、抽出や純化などの前処理を実行する必要があるので臨床での大量の使用に該当しない。
【０００６】
本発明は前記の課題を突破し、臨床で大量に例の直接に血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物を測定できる方法と検出試薬セットを提供し、血清サンプルが前処理を要せず、且つ臨床で実験した結果に基づいて臨床ではアフラトキシンによる影響によりガンにかかるリスクを検出できる方法を提案する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、間接競争型放射免疫分析方法によって実行でき、検出の際、抽出や加水分解などの前処理工程を要さず、血清の基本成分に干渉されることのない、臨床で大量に血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物を測定できる方法を提供することをその主な目的とする。
【０００８】
また、本発明は血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物の量を正確的に決められ、当たり程度が１００．９±１４％にもなるアフラトキシン−アルブミン結合物の測定用の試薬セットを提供することをその次の目的とする。
【０００９】
また、本発明は、臨床実験の統計によってアフラトキシンによる影響と臨床で肝臓ガンにかかることとの関連性を分析でき、個体の未来の肝臓ガンにかかるリスクを評価できる臨床でアフラトキシンの影響を検出できる方法を提供することをそのまた他の目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、検出の実行の際、血清は抽出や加水分解などの前処理工程を受ける必要がなく、且つ血清の基本成分に干渉されることもなく、且つ、アフラトキシンに影響される疑いを有する血清にキャリヤと唯一性の第１抗体とを加入し、所定の時間の接触培養後に、キャリヤに粘着されないものをろ過除去し得た免疫複合物を使用する工程（１）と、ヨウ素１２５ラベリングの第２抗体によってキャリヤに粘着された免疫複合物を検出する工程（２）とを用いて、臨床の大量の例のアフラトキシンに影響されることによる肝臓ガンのリスクの評価を実行することを特徴とする放射免疫試薬セットによる血清におけるアフラトキシンとアルブミンの結合物の検出方法により達成される。
【００１１】
本発明を達成しようとするその目的とその機能を明白に解明するために、以下に添付図面を参照しながら本発明の好適な実施の形態を詳細に説明するが、それらの手段は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明の範囲をそれらのことに制限するものではないことを予め言明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物を検出する方法を提供し、間接競争型の放射免疫分析方法によってその目的を達成するものである。本発明の方法によって検出を行う際、血清が抽出や加水分解などの前処理を受ける必要がなく、好ましい検出方法を提供できる。その方法のプロセスを図１に示し、下記のような工程を含む。つまり、アフラトキシンに影響される疑いのある血清にキャリヤと唯一性の第１抗体とを入れて所定の時間の接触培養後にキャリヤに付着されないものをろ過除去し得た免疫複合物を使用するステップ（ａ）と、ヨウ素１２５ラベリングの第２抗体によってキャリヤに粘着される免疫複合物を検出するステップ（ｂ）とのステップを有する工程を提供する。
【００１３】
そのうち、キャリヤとして微小量反応盤を採用し、当該キャリヤに所定量のアフラトキシン−アルブミン結合物が付着され、第１抗体はマルチブランチ（Ｍｕｌｔｉ−Ｂｒａｎｃｈ）抗体であり、アフラトキシンＢ１−ＫＬＨ蛋白（Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、Ｈ：ヒスタミン）によってウサギを免疫させて生じるもので、そのものとアフラトキシンＢ１―アルブミン結合物とが親和力を有し、しかしながらアルブミンと交差反応しない。また、第２抗体は他の種のマルチブランチ抗体であり、ウサギ免疫グロブリンによって他の動物を免疫させて生じるものであり、ウサギ免疫グロブリンと親和力を有するが、牛や人間の血清蛋白と交差反応しない。反応曲線から分かるように血清基本物質が使用量値曲線と干渉機能を生じない。図３に示すようである。
【００１４】
本発明はアフラトキシン−アルブミン結合物を免疫測定するための試薬セットを提供することをその他の目的とし、当該試薬セットには６ｍｇ／ｍＬの唯一性の第１抗体を有し、使用の際、希釈緩衝液によって２０００倍希釈する必要があり、それらとアフラトキシン−アルブミン結合物との免疫結合反応は血清基本物質の成分に抑制または増強されることがなく、図３に示すように、正確的に血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物の量を決められ、且つヨウ素１２５ラベリングされ、放射活性度が５乃至２０μＣｉ／μｇである第２抗体を有し、使用の際、希釈緩衝液によって５０００倍希釈する必要があり、それが第１抗体とアフラトキシン−アルブミン結合物との免疫複合物を検出でき、また、０乃至２５０ｎｇ／ｍＬのアフラトキシン−アルブミン結合物の標準物を有し、それがアフラトキシン−アルブミン結合物の濃度と放射性の値の標準曲線を設定でき、また、キャリヤを有し、その上には２０ｎｇのアフラトキシン−アルブミン結合物が粘着される。本試薬セットは図１に示す間接競争型放射免疫分析方法を合わせる必要があり、その合わせることによって血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物の検出を実行でき、当該試薬は１００．９±１４％の当たり程度を有し、表１に示す。
【００１５】

【００１６】
本発明は臨床でアフラトキシンの影響によるガンにかかるリスクを検出できる方法を提供する。本発明の提供するアフラトキシン−アルブミン結合物の測定方法は、ガンにかかるリスクを予測できないが、ｍｇ単位のアルブミンにおけるｎｇアフラトキシン−アルブミン結合物の測定と肝臓ガンにかかることと統計関連性を有する。５．３２ｎｇ以下のアフラトキシン−アルブミン結合物／それぞれｎｇ単位のアルブミンを正常の参考値とする場合、且つ正常参考値を１倍のリストと決める場合、臨床実験の統計データが正常参考値を超える場合７．９７のガンにかかるリスクを有することを表示する。そのうち、アフラトキシン−アルブミン結合物の測定には図２に示す薬剤セットと図１に示す間接競争型放射免疫分析方法とを合わせる必要があり、また、アルブミンの測定はＢＣＧ（Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ）とアルブミン複合物との６２８ｎｍの場合の吸収のあることによって測定する必要がある。
【００１７】
実施例１：血清基本物質反応の研究
キャリヤにおいて、１セットに緩衝液に溶解されるアフラトキシン−アルブミン結合物の標準物を加入し、他のセットには血清基本物質に溶解されるアフラトキシン−アルブミン結合物を加入し、両セットの標準物の濃度の範囲はすべて０乃至２５０ｎｇ／ｍＬであり、図１に示すステップのように、唯一性の第１抗体と所定の時間接触培養後にキャリヤに粘着されないものをろ過除去し得た免疫複合物を使用し、それから、ヨウ素１２５ラベリングの第２抗体によってキャリヤに付着される免疫複合物を検出する。両セットの薬剤の量の値の曲線が平行すると共に、ほぼ一致になり、図３に示すように、アフラトキシン−アルブミン結合物と第１抗体との免疫結合反応を反映し、血清基本成分による干渉が生ずることなく、そのため、血清を測定する時前処理を要しない。
【００１８】
実施例２：第１抗体の唯一性の研究
１セットに緩衝液に溶解されるアフラトキシン−アルブミン結合物の標準物を加入し、他のセットには血清基本物質に溶解されるアフラトキシン−アルブミン結合物を加入し、両セットの標準物の濃度の範囲はすべて０乃至２５０ｎｇ／ｍＬであり、図１に示すステップのように、唯一性の第１抗体と所定の時間接触培養後にキャリヤに粘着されないものをろ過除去し得た免疫複合物を使用し、それから、ヨウ素１２５ラベリングの第２抗体によってキャリヤに付着される免疫複合物を検出する。両セットの量の値の曲線を観察した結果、第１抗体とアフラトキシン−アルブミン結合物とが親和力を有するが、アルブミンと交差反応しない、図４に示すように、第１抗体の唯一性を表現した。それも本発明のアフラトキシン−アルブミン結合物と第１抗体との結合の唯一性を示している。即ち、間接競争型放射免疫分析方法によって抗体のアフラトキシン−アルブミン結合物との反応の結果を表示し、且つアルブミンとの相対的実験結果を示す。
【００１９】
実施例３：アフラトキシン−アルブミン結合物の検出試薬の検出範囲
キャリヤに図２に示す濃度が０乃至２５０ｎｇ／ｍＬのアフラトキシン−アルブミン結合物の標準物を加入し、その濃度−薬剤量の値の曲線よりその検出限度が３．８ｎｇ／ｍＬであると決められ、ここで述べた“検出限度”とはゼロと区別する濃度を定義するものであり、検出範囲は少なくとも３．８乃至２５０ｎｇ／ｍＬを包含し、図５に示すように、１５．５乃至１２５ｎｇ／ｍＬとはリニア関係を有する。
【００２０】
実施例４：アフラトキシン−アルブミン結合物検出試薬の当たり程度の研究
アフラトキシン−アルブミン結合物を血清基本物質に溶解する標準物と図１に示す間接競争型放射免疫分析方法によって、濃度−薬剤量の値の曲線を設定し、且つ７．７ｎｇ／ｍＬ及び３１ｎｇ／ｍＬのアフラトキシン−アルブミン結合物の血清基本物質に溶解されるサンプルによって標準物とまったく同じな反応を実行し、その薬剤量の値について“標準濃度―薬剤量の値の曲線を参照することによって測定値が８．３±１．４ｎｇ／ｍＬ及び２９．７±３．６ｎｇ／ｍＬの結果を獲得し、希望値と比較する場合、測定し得た回収率を当たり程度とする場合、１００．９±１４．７％の結果を示す（表１参照）。
【００２１】
実施例５：病例対照法によって判断する場合、アフラトキシン−アルブミン結合物の測定と肝臓ガンの関連性を求める。
【００２２】
２つの病例対照セットを採用し、且つ共に５３才の患者を採用し、そのうちの１セットには正常なアルブミンとＧＯＴとＧＰＴと腹部超音波検査と胎児蛋白を有すると共に、肝臓ガンの病気の例がない者を正常セットとし、他のセットを肝臓差し込み診断により肝臓ガンにかかる者であると認め、それを肝臓ガンセットと定義する。まず、少量の正常セット１６人と肝臓ガンセット１６人を採用して研究を進め、図２に示す試薬セットに図１に示す間接競争型放射免疫分析方法を合わせることによって血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物を測定し、その９５％の信頼区間の平均値は６．８乃至１２．６ｎｇ／ｍＬ及び１０．７乃至７１．３ｎｇ／ｍＬであり、重なることがあり、表２に示すようである。しかしながら、血清におけるアルブミン単位のアフラトキシン−アルブミン結合物の含有量を測定する場合、その９５％信頼区間の平均値が１．４乃至２．８ｎｇ／ｍＬ及び２．９乃至１９．７ｎｇ／ｍＬになり、表３に示すようである。統計する場合、アフラトキシンの影響と肝臓ガンの生じることとは臨床では関連性を有することが確認でき、実験データに基づいてアルブミン単位におけるアフラトキシン−アルブミン結合物の含有量を定める場合、臨床でアフラトキシンに影響されることがあるかを判断できるようになる。
【００２３】
表２ 正常セット１６人と肝臓ガンセット１６人に対するアフラトキシン−アルブミン結合物の測定結果

【００２４】
表３ 正常セット１６人と肝臓ガンセット１６人のｍｇ単位のアルブミン
どのぐらいのｎｇのアフラトキシン−アルブミン結合物の含有量の

【００２５】
実施例６：アフラトキシンの影響の正常参考値を定める
ランダムに正常セット９９人と肝臓ガンセット９６人を選択し、図２に示す試薬セットに図１に示す間接競争型放射免疫分析方法を合わせることによって、血清単位におけるアルブミンにおけるアフラトキシン−アルブミン結合物の含有量を測定し、その９５％信頼空間の平均値は３．９乃至５．３ｎｇ／ｍｇ及び１１乃至１７ｎｇ／ｍｇであり、再びアフラトキシンの影響と肝臓ガンにかかることとの統計関連性を確認すると共に、正常参考値が５．３２ｎｇ／ｍｇであることを確認する（表４参照）。
【００２６】
表４ 正常セット９９人と肝臓ガンセット９６人とのｍｇ単位のアルブミン
どのぐらいのｎｇアフラトキシン−アルブミン結合物を含有することの測定結果

【００２７】
実施例７：アフラトキシンの影響によるガンにかかるリスクの評価
前記のランダムに選択される１９６人を採用し、５．３２ｎｇ／ｍｇを正常参考値とし、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌの統計方法によってアフラトキシンの影響によるガンにかかるリスクの程度を統計する。肝臓ガンの病例の対照的研究の結果、９６名のガンにかかる患者の中に７０名がアフラトキシンの影響を受けている。年と家の地点とが合わせている９９名の健康の対照セットの中に、２５名だけアフラトキシンに影響される。このデータを表５に示す。
【００２８】
表５のデータに基づいてアフラトキシンの影響による肝臓ガンにかかるリスクの対応値を計算できる。
ＯＲ（Ｏｄｄｓ Ｒａｔｉｏ）＝（７０Ｘ７４）／（２５Ｘ２６）＝７．９７
このリスク対応値の９５％信頼区間の平均値は
７．９７Ｘｅｘｐ「±１．９６ （１／７０＋１／７４＋１／２６＋１／２５）」
＝４．２乃至１５．１
【００２９】

【００３０】
前記に説明したのは本発明の好適な実施の形態の詳細な説明と図に過ぎず、本発明を制限するものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲の包括する範囲であり、本発明の特許請求の範囲の精神に基づいて実施した改造や変更や一部転用などすべて本発明の範囲に包含されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の間接競争型放射免疫分析方法のフローチャートである。
【図２】本発明の試薬セットを示す図である。
【図３】本発明の血清基本物質が薬剤量の曲線に対し干渉しない場合の実験の結果を示す図である。
【図４】本発明のアフラトキシン−アルブミン結合物の反応を測定する実験結果を示す図である。
【図５】本発明の試薬セットの包括する測定範囲を示す図である。

Claims (6)

1. 検出の実行の際、血清は抽出や加水分解などの前処理工程を受ける必要がなく、且つ血清の基本成分に干渉されることもなく、且つ、アフラトキシンに影響される疑いを有する血清を、アフラトキシン−アルブミン結合物を付着させたキャリヤに、アフラトキシン−アルブミン結合物に特異的な第１抗体とともに加入し、所定の時間の接触培養後に、前記の付着したアフラトキシン−アルブミン結合物を介してキャリヤに粘着されないものをろ過除去し得た免疫複合物を使用する工程（１）と、ヨウ素１２５ラベリングの第２抗体によって、前記の付着したアフラトキシン−アルブミン結合物を介してキャリヤに粘着された免疫複合物を検出する工程（２）とを用いて、臨床の大量の例のアフラトキシンに影響されることによる肝臓ガンのリスクの評価を実行することを特徴とする放射免疫試薬セットによる血清におけるアフラトキシンとアルブミンの結合物の検出方法。
2. 前記キャリヤとして微小量反応盤を採用すると共に、当該キャリヤに所定量のアフラトキシンとアルブミンとの結合物が付着されることを特徴とする請求項１に記載の放射免疫試薬セットによる血清におけるアフラトキシンとアルブミンの結合物の検出方法。
3. 前記第１抗体はマルチブランチ抗体であり、アフラトキシンＢ１−ＫＨＬ蛋白によってウサギを免疫させることにより生じるもので、アフラトキシンＢ１−アルブミン結合物と親和力を有するが、アルブミンと交差反応しないものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の放射免疫試薬セットによる血清におけるアフラトキシンとアルブミンの結合物の検出方法。
4. 前記第２抗体は他のマルチブランチ抗体であり、ウサギ免疫グロブリンによって他の動物を免疫させることにより生じるもので、ウサギ免疫グロブリンと親和力を有するが、牛と人間の血清蛋白と交差反応しないものであることを特徴とする請求項３に記載の放射免疫試薬セットによる血清におけるアフラトキシンとアルブミンの結合物の検出方法。
5. アフラトキシン−アルブミン結合物との免疫結合反応は血清基本成分に邪魔されることがなく、血清におけるアフラトキシン−アルブミン結合物の量を正確に決められるアフラトキシン−アルブミン結合物に特異的な第１抗体と、
   第１抗体とアフラトキシン−アルブミン結合物との免疫複合物を検出できるヨウ素１２５ラベリングの第２抗体と、
   アフラトキシン−アルブミン結合物の濃度と放射性の値の標準曲線を設定できるアフラトキシン−アルブミン結合物の標準物と、
   本体に所定量のアフラトキシン−アルブミン結合物が付着されるキャリヤと、
   を有するアフラトキシン−アルブミンの結合物の検出用の放射免疫試薬セット。
6. アフラトキシンに影響される疑いのある血清を、アフラトキシン−アルブミン結合物を付着させたキャリヤに、アフラトキシン−アルブミン結合物に特異的な第１抗体とともに入れて所定の時間の接触培養後に前記の付着したフラトキシン−アルブミン結合物を介してキャリヤに付着されないものをろ過除去し得た免疫複合物を使用するステップ（ａ）と、ヨウ素１２５ラベリングの第２抗体によって、前記の付着したアフラトキシン−アルブミン結合物を介してキャリヤに粘着される免疫複合物を検出するステップ（ｂ）とのステップを有するアフラトキシン−アルブミン結合物を検出する工程（１）と、ＢＣＧとアルブミン複合物の６２８ｎｍにおける吸収現象のあることによってアルブミンを検出する工程（２）とを有し、５．３２ｎｇ以下のアフラトキシン−アルブミン結合物／それぞれのｍｇ単位のアルブミンのことを正常参考値とし、当該正常参考値を１倍のリスクになるように設定し、当該正常参考値より統計して７．９７倍高くなる場合ガンにかかるリスクを有すると推定することを特徴とする、肝臓ガンのリスクを評価できる、臨床で大量に血清のアフラトキシンに影響される量を快速的に検出可能な方法。

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