DE69521253T2

DE69521253T2 - Schnellnachweis von analyten mit auf löslichen submikron-teilchen immobilisierten rezeptoren

Info

Publication number: DE69521253T2
Application number: DE69521253T
Authority: DE
Inventors: Peter Cronin; Charles Ferzli; Kent Koshi; Spencer Lin; Moll, Iii; Richard Saul; Pratap Singh
Original assignee: Dade International Inc
Current assignee: Dade International Inc
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2015-04-12
Also published as: AU2243195A; EP0704058B1; JP3530957B2; DE69521253D1; WO1995028641A1; CA2164939A1; US5898005A; JPH09501503A; EP0704058A1; ATE202213T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Immobilisieren von spezifischen Bindungsassay-Reagenzien auf einem festen Träger. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Vermischen von Reagenzien mit Proben in Lösung, um Reagens-Probenkomplexe zu bilden, und zum Immobilisieren der Reagens-Probenkomplexe auf einem Festphasenträger unter Einsatz von wasserlöslichen Polymeren.

Hintergrund der Erfindung

Diagnostische In vitro-Assays können angewandt werden, um Mengen eines Analyten zu messen, der in einer Körperfluidprobe oder in einer Gewebeprobe gefunden worden ist. Der Analyt muß von anderen in der Probe gefundenen Komponenten unterschieden werden. Analyten können von anderen Probenkomponenten unterschieden werden, indem der Analyt mit einem spezifischen Rezeptor für diesen Analyten zur Reaktion gebracht wird. Assays, die von spezifischen Rezeptoren Gebrauch machen, um Analyten zu unterscheiden und quantitativ zu bestimmen, werden häufig spezifische Bindungsassays genannt.
Die üblichsten Rezeptoren sind Antikörper und spezifische Bindungsproteine wie etwa der Intrinsic-Faktor oder das Folat- Bindungsprotein. Rezeptoren zeichnen sich dadurch aus, daß sie eine reversible spezifische Bindungsaffinität für einen Analyten oder ein Analogon dieses Analyten haben. In den vorliegenden Unterlagen bedeutet ein Analogon allgemein ein Analytenderivat, das einen nachweisbaren Marker wie etwa ein Enzym, ein fluoreszierendes Molekül oder eine andere bekannte Markierung trägt. Das Analogon ist imstande, an einen Rezeptor mit ungefähr der gleichen Spezifität und Affinität wie der Analyt zu binden.
Bei heterogenen spezifischen Bindungsassays, die in der technischen und der Patentliteratur beschrieben sind, wird der Rezeptor oder ein sonstiges Assay-Reagens der spezifischen Bindungsreaktion häufig auf einer Festphase immobilisiert. Die Immobilisierung der Reagenzien ist erforderlich, um die gebundenen Komponenten (beispielsweise einen an einen Rezeptor gebundenen Analyten) von den ungebundenen Komponenten zu trennen.
Die verschiedenen Verfahren, durch die ein Rezeptor oder ein anderes Reagens auf einer Festphase immobilisiert werden kann, umfassen Adsorption, Absorption oder kovalentes Binden. Viele der in solchen Assays verwendeten Festphasenträger sind jedoch nicht inert und können Proteine und andere Substanzen von der Probe durch nichtspezifische Bindung maskieren. Obwohl Glas ein relativ inertes Substrat ist, ist allgemein festgestellt worden, daß es zur Verwendung in Festphasen-Bindungsassays unbefriedigend ist. Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 3 790 653 hinsichtlich einer Erörterung der Unzulänglichkeiten von Glassubstraten.
In letzter Zeit sind jedoch Verfahren zum Immobilisieren eines im wesentlichen löslichen Immunkomplexes eines Reagenses und von Antiserum für das Reagens auf einem inerten Glasfaser- Festphasenträger beschrieben worden. Diese Verfahren sind in dem US-Patent Nr. 4 517 288 angegeben.
Die WO-94/19693 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen für spezifische Bindungsassays, in denen spezifische Bindungsreagenzien auf einer Festphase immobilisiert werden. Die Immobilisierung wird durch kovalentes Koppeln spezifischer Bindungsassay-Reagenzien wie etwa Polypeptidrezeptoren oder Analyten mit wasserlöslichen Polymeren wie etwa Dendrimeren erleichtert. Die WO-94/03774 beschreibt Verfahren und Vorrichtungen zum Analysieren einer optischen Oberfläche für einen interessierenden Analyten in einer Testprobe, wobei ein fester Träger Dendrimere aufweisen kann.
Bei diesen immunologischen Immobilisierungsverfahren werden lösliche Immunkomplexe zubereitet, indem wenigstens zwei immunchemisch reaktionsfähige Substanzen miteinander in Lösung vereinigt werden. Wenigstens eines dieser immunchemisch reaktionsfähigen Materialien wird wegen seiner immunchemischen Spezifität für einen interessierenden Analyten ausgewählt. Wenn beispielsweise der lösliche Immunkomplex in einem Immungssay zum Nachweis des die Schilddrüse stimulierenden Hormons (TSH) verwendet werden soll, dann wird eine Komponente des Immunkomplexes wegen seiner immunchemischen Spezifität für TSH ausgewählt. Ein typisches Beispiel wäre ein Antikörper mit Spezifität für TSH, d. h. ein Anti-TSH-Antikörper. Die zweite Komponente des Immunkomplexes könnte eine Antikörperzubereitung aufweisen, die gegen den Anti-TSH-Antikörper gerichtet ist. Antiserum für Anti-Analyten-Antikörper, beispielsweise für Maus-Anti-TSH- Antikörper, kann zubereitet werden, indem gereinigtes Maus- Immunglobulin G (IgG) in ein Wirtstier (d. h. eine Ziege) injiziert und danach das Antiserum für Maus-IgG geerntet wird. Danach werden der Maus-Anti-TSH-Antikörper und das Ziegen- Antiserum für Maus-IgG als Standard-Stammlösungen aufbereitet. Nach der Herstellung dieser Stammlösungen wird ein Anteil von jeder in einem Puffermedium vereinigt. Der resultierende Immunkomplex kann in einem geeigneten Puffervolumen auf eine begrenzte Fläche eines Glasfaserfilters getüpfelt werden. Alternativ kann man die zwei Komponenten des Immunkomplexes als getrennte Pufferlösungen auf den Filter aufbringen und in situ reagieren lassen. In beiden Fällen definiert die Aufbringstelle des Immunkomplexes eine Reaktionszone innerhalb der Festphase. Die aufgebrachten Immunkomplexe werden adsorbiert und in den Zwischenräumen der Faserbetten in dem Glasfaserfilter eingeschlossen. Das Aufbringverfahren kann die Abgabe der Immunkomplexlösung mit einer manuellen oder automatischen Pipette oder mit einer anderen automatischen Einrichtung einschließlich Assay-Analysatorinstrumenten umfassen. Anschließend an die Aufbringung des Immunkomplexes auf die Festphase und den Ablauf einer angemessenen Inkubationszeit wird die Festphase unter kontrollierten Bedingungen getrocknet, so daß ein stabiles reaktionsfähiges Reagens erhalten wird, das in einem von einer Reihe von spezifischen Festphasen-Bindungsassay-Protokollen verwendet werden kann.
Man hat festgestellt, daß die immunologische Immobilisierung zwar bei vielen verschiedenen Assay-Formaten brauchbar ist, jedoch eine Reihe von inhärenten Nachteilen hat. Faktoren wie etwa Temperatur, Salz, pH-Wert und Proteinkonzentration haben einen Einfluß auf die Ausbildung des Doppelimmunkomplexes. Es kann schwierig sein, diese Bedingungen zu optimieren, um den Doppelimmunkomplex wirksam zu bilden. Die Anwesenheit der zusätzlichen Immunglobuline an dem Filter (beispielsweise Antiserum für Anti-Analyt-Antikörper) kann zu einer nichtspezifischen Bindung von proteinhaltigen und anderen biologischen Materialien führen. Dies kann die Assay-Empfindlichkeit und die Gesamtleistung erheblich senken. Außerdem muß bei gegebener inhärenter Veränderlichkeit von IgG-Zubereitungen aus getrennten Immunisierungen der gleichen oder verschiedener Wirtstiere eine Veränderlichkeit von Partie zu Partie hinsichtlich des Titers, der Reinheit, Spezifität und Affinität von IgG-Zubereitungen in Herstellungsverfahren in Betracht gezogen werden. Gleichermaßen kann es aufgrund der Tendenz von Immunkomplexen, in Stammlösungen inhomogen verteilt zu werden, zu einer Veränderlichkeit bei der Herstellung von Festphasenreagenzien kommen. Das heißt, es kann sein, daß solche Immunkomplexe, die zwar im wesentlichen löslich sind, nicht vollständig löslich bleiben und über die Zeit eine gewisse Sedimentierung aus der Lösung erfahren. Selbst bei periodischem Vermischen von Stammlösungen können Schwerkrafteinflüsse, Temperaturgradienten und andere physikalische Einflüsse in auf die Festphasenreagenzien aufgebrachten Lösungen subtile Inhomogenitäten verursachen. Diese inhomogenen Lösungen, die aus Proteinaggregationen resultieren, können eine Blockierung der Herstellungsanlagen, die dazu verwendet werden, den Immunkomplex auf die Festphase zu tüpfeln, und andere Schwierigkeiten bewirken.
Einige spezifische Bindungsassays sind automatisiert. Die Mehrzahl der zur Zeit verfügbaren automatischen Assay-Systeme ermöglicht jedoch den Nachweis von nur einem Analyten pro Zyklus. Um mehr als einen Analyten in einer einzigen Probe zu analysieren, muß man also warten, bis der Testzyklus eines ersten Analyten abgeschlossen ist, bevor ein zweiter Analyt in derselben Probe geprüft und quantitativ bestimmt werden kann. Bei den meisten automatischen Instrumenten ist eine Zyklusdauer gewöhnlich wenigstens 40 min. Alternativ könnte die zu analysierende Probe in eine Vielzahl von Testproben-Teilmengen aufgeteilt und gleichzeitig analysiert werden, um die gewünschte quantitative Information zu erhalten. Diese zweite Vorgehensweise benötigt nicht nur eine größere Menge der Patientenprobe, sondern macht zusätzliche Investitionsausgaben erforderlich, um die Vielzahl von Analysatoren gleichzeitig zu betreiben.
Eine begrenzte Anzahl von Enzym-Immunoassay-Systemen (EIA) mit Direktzugriff macht von der Idee einer Dosiseinheit Gebrauch, um mehr als einen Analyten in einer gegebenen Probe zu analysieren. In diesen Systemen werden sämtliche erforderlichen Reagenzien wie etwa der immobilisierte Antikörper, das Antikörperenzym oder das Arzneimittel-Enzym-Konjugat und das für die Erzeugung des Signals erforderliche Substrat gemeinsam in ein einziges Paket gepackt, und jedes Paket enthält Reagenzien, die für eine einzelne Analyse ausreichen. Dieses Einzelpaketsystem ist teurer als die Massenaufbewahrung und -verpackung. Die zusätzlichen Kosten reflektieren beispielsweise die Kosten des getrennten Packens jeder für einen Assay benötigten Komponente, spezifische Anforderungen an das Packmaterial, die eine maximale Stabilität der Reagenzien ermöglichen, und den für jede Dosiseinheit erforderlichen Extralagerplatz. Außerdem bewirkt die Zeit, die für Inkubationen in verschiedenen Schritten des Assäys benötigt wird, daß die Gesamtzeit zur Erzeugung von Ergebnissen bei Assay-Systemen mit Direktzugriff länger ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren zum Immobilisieren einer Vielzahl von spezifischen Bindungsassay-Reagenzien auf einer Festphase. Es wird eine Dendrimer-Reagenslösung bereitgestellt, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenszubereitungen enthält. Jede der Zubereitungen enthält eine Vielzahl von Dendrimer-Reagenskomplexen, wobei jeder der Dendrimer- Reagenskomplexe eine definierte Spezifität für wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat. Die Komplexe sind Dendrimere, die an ein spezifisches Bindungsassay-Reagens gekoppelt sind. Die Dendrimere können E5- oder N5-Dendrimere sein. Die Dendrimere können durch C-S- Bindung, die durch Vereinigen von SIAB-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, oder durch C-S-Bindung, die durch Vereinigen von SMCC-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Alternativ können die Dendrimere durch C-N-Bindung, die durch Vereinigen von Aldehyd-markierten Anteilen mit nichtmodifizierten Anteilen durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Die Reagenzien können ohne Einschränkung Antikörper, Antikörperfragmente, spezifische Bindungsproteine oder Analyten sein. Die Probe wird der Dendrimer- Reagenslösung hinzugefügt, um eine Assay-Lösung zu bilden. Eine ausgewählte Menge eines Indikators oder eines markierten spezifischen kompetitiven Reagenses kann zu der Assay-Lösung hinzugefügt werden. Das spezifische kompetitive Reagens kann ein markiertes Analogon des wenigstens einen Analyten sein. Eine wirksame Menge der Assay-Lösung wird unter Bedingungen auf eine Festphase aufgebracht, die die Immobilisierung des Dendrimer- Reagenskomplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Verfahren zum Durchführen von spezifischen Bindungsassays, um die Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in einer Probe zu bestimmen. Es wird eine Dendrimer-Reagenslösung bereitgestellt, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenszubereitungen enthält. Jede der Zubereitungen enthält eine Vielzahl von Dendrimer- Reagenskomplexen, wobei jeder der Dendrimer-Reagenskomplexe eine definierte Spezifität für wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat. Die Komplexe sind Dendrimere, die kovalent an ein spezifisches Bindungsassay-Reagens gekoppelt sind. Die Dendrimere können E5- oder N5- Dendrimere sein. Die Dendrimere können durch C-S-Bindung, die durch Vereinigen von SIAB-markierten Anteilen mit Sulfhydrylenthaltenden Anteilen durchgeführt wird, oder durch C-S- Kopplung, die durch Vereinigen von SMCC-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Alternativ können die Dendrimere durch C-N-Bindung, die durch Vereinigen von Aldehyd-markierten Anteilen mit nichtmodifizierten Dendrimeren durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Die Reagenzien können ohne Einschränkung Antikörper, Antikörperfragmente, spezifische Bindungsproteine oder Analyten sein. Die Probe wird der Dendrimer- Reagenslösung hinzugefügt, um eine Assay-Lösung zu bilden. Eine wirksame Menge der Assay-Lösung wird unter Bedingungen auf eine Festphase aufgebracht, die die Immobilisierung des Dendrimer- Reagenskomplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken. Eine ausgewählte Menge eines Indikators wird unter Bindungsbedingungen auf die begrenzte Fläche der Festphase aufgebracht. Die an die Festphase gebundene Indikatormenge wird bestimmt und mit der Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in der Probe korreliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Durchführen von spezifischen Bindungsassays unter Verwendung eines kompetitiven Assay-Formats, um die Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in einer Probe zu bestimmen. Es wird eine Dendrimer-Reagenslösung bereitgestellt, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenszubereitungen enthält. Jede der Zubereitungen enthält eine Vielzahl von Dendrimer- Reagenskomplexen, wobei jeder der Dendrimer-Reagenskomplexe eine definierte Spezifität für wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat. Die Komplexe sind Dendrimere, die kovalent an ein spezifisches Bindungsassay-Reagens gekoppelt sind. Die Dendrimere können E5- oder N5-Dendrimere sein. Die Dendrimere können durch C-S-Bindung, die durch Vereinigen von SIAB-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, oder durch C-S- Bindung, die durch Vereinigen von SMCC-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Alternativ können die Dendrimere durch C-N-Bindung, die durch Vereinigen von Aldehyd-markierten Anteilen mit nichtmodifizierten Dendrimeren durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Die Reagenzien können ohne Einschränkung Antikörper, Antikörperfragmente, spezifische Bindungsproteine oder Analyten sein. Die Probe und ein markiertes spezifisches kompetitives Reagens werden der Dendrimer- Reagenslösung hinzugefügt, um eine kompetitive Assay-Lösung zu bilden. Das spezifische kompetitive Reagens kann ein markiertes Analogon des wenigstens einen Analyten sein. Eine wirksame Menge der kompetitiven Assay-Lösung wird unter Bedingungen auf eine Festphase aufgebracht, die die Immobilisierung des Dendrimer-Reagenskomplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken. Eine ausgewählte Menge eines Indikators wird unter Bindungsbedingungen auf die begrenzte Fläche der Festphase aufgebracht. Die an die Festphase gebundene Indikatormenge wird bestimmt und mit der Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in der Probe korreliert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren zum Durchführen von spezifischen Bindungsassays, bei denen sämtliche Reagenzien vor der Immobilisierung auf einer Festphase gemeinsam in Lösung inkubiert werden. Es wird eine Dendrimer-Reagenslösung, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenszubereitungen enthält, bereitgestellt. Jede der Zubereitungen enthält eine Vielzahl von Dendrimer-Reagenskomplexen, wobei jeder der Dendrimer- Reagenskomplexe eine definierte Spezifität für wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat. Die Komplexe sind Dendrimere, die an ein spezifisches Bindungsassay-Reagens gekoppelt sind. Die Dendrimere können E5- oder N5-Dendrimere sein. Die Dendrimere können durch C-S- Bindung, die durch Vereinigen von SIAB-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, oder durch C-S-Bindung, die durch Vereinigen von SMCC-markierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Alternativ können die Dendrimere durch C-N-Bindung, die durch Vereinigen von Aldehyd-markierten Anteilen mit nichtmodifizierten Dendrimeren durchgeführt wird, an die Reagenzien gekoppelt werden. Die Reagenzien können ohne Einschränkung Antikörper, Antikörperfragmente, spezifische Bindungsproteine oder Analyten sein. Die Probe und eine ausgewählte Menge eines Indikators werden der Dendrimer-Reagenslösung hinzugefügt, um eine Assay-Lösung zu bilden. Eine wirksame Menge der Assay-Lösung wird unter Bedingungen auf eine Festphase aufgebracht, die die Immobilisierung des Dendrimer- Reagenskomplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken. Die an die Festphase gebundene Indikatormenge wird bestimmt und mit der Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in der Probe korreliert.

GENAUE BESCHREIBUNG

StarburstTM-Dendrimere (hergestellt von The Dow Chemical Company) sind Polymere von sphärischer oder anderer dreidimensionaler Gestalt, die genau definierte Zusammensetzungen und ein genau definiertes Molekulargewicht haben. Die dendritische (Baum ähnliche) Konfiguration leitet, sich aus einer strukturierten Verzweigung ab, wobei einzelnen Zweige von einem Nukleus oder Kernbereich ausgehen. Der mehrwertige Kern ist an wenigstens zwei geordnete dendritische Zweige kovalent gebunden, die sich durch wenigstens zwei Etagen oder Generationen erstrecken. Die äußerste Etage oder Generation kann derivatisiert sein, um in funktionellen Gruppen zu enden, die mit vielen verschiedenen anderen Molekülen chemisch reaktionsfähig sein können. Dendrimere sind also einheitliche molekulare Anordnungen, die drei architektonische Unterscheidungsmerkmale haben, nämlich (a) einen Initiatorkern, (b) innere Lagen (Generationen), die aus sich wiederholenden Einheiten bestehen, die radial an den Initiatorkern angeheftet sind, und (c) eine Außenoberfläche mit terminaler Funktionalität, die an die äußerste Generation angeheftet ist.
Die Größe, Gestalt und Reaktionsfähigkeit eines Dendrimers kann gesteuert werden durch die Wahl des Initiatorkerns, die Anzahl von Generationen, die bei der Schaffung des Dendrimers verwendet wird, und die Wahl der sich wiederholenden Einheiten, die an jeder Generation verwendet werden. In Abhängigkeit von der Anzahl von verwendeten Generationen werden ohne weiteres Dendrimere mit diskreten Größen erhalten. Außerdem kann eine chemische Modifikation sämtlicher Oberflächenanteile oder eines Teils davon neue Oberflächenfunktionalitäten schaffen, die für bestimmte diagnostische oder therapeutische Vorgänge zweckmäßig sind. Allgemeinsphärische Dendrimere mit Konfigurationen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in dem US-Patent Nr. 4 507 466 und dem US-Patent Nr. 4 568 737 beschrieben. Alternativ können Dendrimere mit nichtsphärischer Konfiguration wie etwa die in dem US-Patent Nr. 4 694 064 beschriebenen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung angepaßt werden. Bevorzugt haben die Dendrimere eine funktionalisierte äußere Oberfläche mit amino-endständigen funktionellen Gruppen. Ein E5-Dendrimer ist ein Ethylendiaminkern-Teilchen der fünften Generation mit 128 amino-endständigen End-(Oberflächen-)Gruppen und einem Molekulargewicht von 28.826. E5 hat einen geschätzten Teilchendurchmesser von 70 Å. Ein N5-Dendrimer ist ein Ammoniakkern-Teilchen der fünften Generation mit 96 endständigen Aminogruppen und einem Molekulargewicht von 21.563. N5 hat einen geschätzten Teilchendurchmesser von 53 Å. Die amino-endständigen Endgruppen geben den Oberflächen solcher Dendrimere unter normalen Assay-Bedingungen eine positive Nettoladung.
Dendrimere können durch geeignete Wahl interner und externer Anteile als wasserlösliche Makromoleküle synthetisiert werden. Siehe die US-Patente Nr. 4 507 466 und 4 568 737. Dendrimere können mit verschiedenen pharmazeutischen Materialien sowie mit verschiedenen zielgerichteten Molekülen konjugiert werden, die die Funktion haben können, die Konjugate für diagnostische oder therapeutische Anwendungen zu ausgewählten Körperstellen zu lenken. Siehe beispielsweise die WO 8801178. Starburst- Dendrimere werden verwendet, um synthetische Porphyrine (beispielsweise Häme und Chlorophyll) kovalent an Antikörpermoleküle zu koppeln als ein Mittel zum Steigern der spezifischen Aktivität von radiomarkierten Antikörpern für die Tumortherapie und -diagnose. Roberts, J. C. et al., Using Starburst Dendrimers as Linker Molecules to Radiolabel Antibodies, Bioconjug. Chemistry 1 : 305-308 (1990).
Spezifische Bindungsassay-Reagenzien können durch die Bildung von Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen (C-S-Bindungen) an Dendrimere angeheftet werden. Solche C-S-Bindungen werden vorgenommen, indem Dendrimere mit Sulfosuccinimidyl-[4- iodacetyl]aminobenzoat (Sulfo-SIAB) oder mit Succinimidyl-4-[N- maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) derivatisiert und die derivatisierten Dendrimere mit Sulfhydryl-enthaltenden Assay-Reagenzien vereinigt werden. Alternativ können die spezifischen Bindungsässay-Reagenzien durch die Bildung von Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen (C-N-Bindungen) oder Kohlenstoff- Sauerstoff-Bindungen (C-O-Bindungen) an die Dendrimere angeheftet werden. Siehe WO-94119693. Funktionelle Dendrimer- Oberflächengruppen weisen zusätzlich zu amino-endständigen Gruppen auf: Hydroxy-, Mercapto-, Carboxyl-, Alkenyl-, Allyl-, Vinyl-, Amido-, Halo-, Harnstoff-, Oxiranyl-, Aziridinyl-, Oxazolinyl-, Imidazolinyl-, Sulfonato-, Phosphonato-, Isocyanato- und Isothiocyanatogruppen. Es sind verschiedene bekannte Chemien mit diesem weiten Bereich von funktionellen Oberflächengruppen verwendbar und zum Anheften von Assay-Reagenzien an solche funktionellen Gruppen brauchbar.
Dendrimere können anstelle von Antiserum verwendet werden, um die Immobilisierung von Assay-Reagenzien auf der Festphase zu erleichtern. Das heißt, Dendrimere können kovalent an Assay- Reagenzien wie etwa Antikörper oder sogar relativ kleine Moleküle gekoppelt und dann auf verschiedenen Festphasen immobilisiert werden. Gegenüber einer immunologischen Immobilisierung bietet die Immobilisierung unter Verwendung von Dendrimer- Komplexen eine Reihe von deutlichen Vorteilen. Erstens können Dendrimere gleichbleibend so hergestellt werden, daß sie aufgrund ihrer genauen Polymerchemien Gleichmäßigkeit von Partie zu Partie beibehalten. Diese Parameter können über verschiedene Herstellungspartien gleichmäßig beibehalten werden. Zweitens können die Dendrimere so hergestellt werden, daß sie wasserlöslich sind, so daß die Dendrimer-Reagenskonjugate in Lösung bleiben und die Lösungshomogenität über die Zeit aufrechterhalten. Dadurch wird eine Ungleichmäßigkeit von Partie zu Partie aufgrund einer inhomogenen Verteilung von immunologischen Konjugaten in Lösung eliminiert. Drittens sind die Chemien zum Anheften von Reagenzien an die Dendrimere gut charakterisiert und unterliegen nicht den Veränderungen, die Assoziierungen von Antiseren und Antikörper bindenden Substanzen anhaften. Antiseren unterliegen Veränderungen der Affinität, Spezifität und Immunglobulinreinheit, denen man bei der Herstellung von Dendrimer- Reagenskonjugaten in keinem Fall begegnet.
Kurz gesagt, Festphasenreagenzien auf Dendrimer-Basis sind leicht herstellbar, weil sie von Los zu im wesentlichen gleichmäßig sind. Da außerdem Stamm- oder industrielle Lösungen von Dendrimer-Konjugaten über erhebliche Zeiträume die Homogenität beibehalten, können Endverbraucher von industriellen Assay- Instrumenten diese Festphasen-Reagenzien an Ort und Stelle präparieren. Die Verwendung von frisch hergestellten Festphasen- Reagenzien eliminiert ferner zusätzliche Variablen, die in die Verteilung und die gewerbliche Anwendung von vorgefertigten Festphasen-Reagenzien Eingang finden können, wie etwa Veränderungen aufgrund von Langzeitlagerung, der Lagertemperatur und aufgrund von anderen Lagerungsvariablen.
Dendrimer-Reagenskomplexe sind zwar für die Zubereitung verschiedener Festphasen-Reagenzien in Immunoassays und anderen Assays brauchbar; die Anmelder haben jedoch eine besonders nützliche Anwendung solcher Komplexe bei der Verwendung mit Glasfaserfiltersubstraten und Assays mit radialer Trennung gefunden. Ein Immunoassay mit radialer Trennung, wie er in Giegel et al., Clin. Chem. 28: 1894-98 (1982), und in dem US-Patent Nr. 4 517 288 beschrieben ist, ist ein Assay-Verfahren, bei dem sämtliche Schritte unmittelbar auf einer Festphase durchgeführt werden. Antikörper oder andere Reagenzien werden auf einer kleinen Fläche von Glasfaserfilterpapier immobilisiert. Verschiedene Kalibriermittel, die bekannte Mengen eines nachzuweisenden Analyten oder verschiedene potentiell einen solchen Analyten enthaltende, unbekannte Proben enthalten, läßt man dann mit diesem immobilisierten Rezeptor in Reaktion treten. Nach geeigneten Zugaben von markierten Analoga oder anderen Markierungsreagenzien werden durch Aufbringen eines Waschfluids überschüssige Reagenzien von der mittleren Fläche des Filterpapiers entfernt. Im Fall eines Enzym-Immunoassays kann das Waschfluid das Substrat für das Enzym enthalten, so daß die Enzymreaktion gleichzeitig mit dem Waschschritt initiiert wird. Bevorzugt erzeugt die Wirkung des Enzyms auf dem Substrat ein Fluoreszenzsignal. Die Enzymaktivität in einem Teil der mittleren Fläche ist dann durch Vorderflächenfluorometrie quantitativ bestimmbar. In Abhängigkeit von dem Assay-Format, d. h. davon, ob es sich um einen direkten Bindungsassay oder einen kompetitiven Assay handelt, ist die Fluoreszenzrate zu der Analytenkonzentration in der Probe direkt oder umgekehrt proportional.
Es wird bevorzugt, daß die Festphase eine relativ "inerte" Oberfläche bietet. Das heißt, die Oberfläche sollte mit biologischen Materialien relativ reaktionsunfähig sein, insbesondere hinsichtlich einer wahllosen Adsorption von proteinhaltigen Materialien. Bei den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die physische Form der Festphase derart, daß die Zwischenräume oder Poren in der Festphase ausreichend klein sind, so daß die Reaktionsfluide zurückgehalten und durch Kapillarwirkung transportiert werden. Die Festphasenporen oder -zwischenräume sollten dagegen nicht so klein sein, daß sie unerwünschte Komponenten, die falsche positive Signale auslösen könnten, zurückhalten.
Die Festphase besteht vorteilhafterweise aus einer Matte aus komprimierten Fasern wie etwa Glas- oder Synthetikfasern oder relativ inerten zelluloseartigen Materialien. Die Festphase kann ferner aus anderen porösen Bestandteilen wie etwa Sinterglas, Keramik und synthetischen Polymermaterialien hergestellt sein. Glasfaserfilterpapier ist der bevorzugte feste Träger der vorliegenden Erfindung, und zwar aufgrund seiner inerten Eigenschaft und aufgrund seiner Fähigkeit, die löslichen Komplexe der vorliegenden Erfindung in Mengen zu adsorbieren, die für eine quantitative Auswertung von Assay-Reagenzien ausreichen. Die Oberflächen der Glasfasern können eine negative Nettoladung tragen, was die Adsorption von Dendrimeren erleichtert, die im wesentlichen positiv geladene Oberflächen unter Assay- Bedingungen haben, d. h. von Dendrimeren mit amino-endständigen Oberflächengruppen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden "Tabs", wie sie von Baxter Diagnostics Inc. verkauft werden, aus GF/F-Glasfilterpapier, das von Whatman Inc. vertrieben wird, und aus Kunststoff bestehenden verrastbaren Tabteilen zusammengefügt, wie nachstehend beschrieben wird. Im allgemeinen werden die Dendrimer-Reagenskomplexe auf die mittleren Flächen solcher Tabs in einer geeigneten Pufferlösung aufgebracht. Im allgemeinen sollten solche Puffer Tenside, analytfreies Serumalbumin und ein Konservierungsmittel wie etwa Natriumazid enthalten. Die Dendrimer-Reagenskomplexe der vorliegenden Erfindung können, sobald sie auf einer geeigneten Festphase adsorbiert sind, in einer großen Vielfalt von analytischen Protokollen zur Analyse von vielen verschiedenen biologischen Materialien verwendet werden. Beispielsweise können Dendrimer- Rezeptorkomplexe beim Immunoassay von Blut oder Urin hinsichtlich des Vorhandenseins von therapeutischen Arzneimitteln, natürlichen oder synthetischen Steroiden, Hormonen, Enzymen, Antikörpern und anderen interessierenden Analyten nützlich sein. Therapeutische Mittel, die in solchen Protokollen analysiert werden können, umfassen ohne Einschränkung Digoxin, Dilantin, Phenobarbital, Theophyllin, Gentamicin, Chinidin und dergleichen. Auf die vorstehende Weise hergestellte Festphasen können ferner in Immunoassays zum Nachweis von Steroiden wie etwa Cortisol, Aldosteron, Testosteron, Progesteron und Estriol oder Serumprotein wie etwa Ferritin verwendet werden. Ferner können durch die Verwendung von Festphasen-Komplexen der vorliegenden Erfindung Hormonspiegel bestimmt werden. Diese Hormone umfassen ohne Einschränkung Schilddrüsenhormone wie etwa Tetraiodothyronin (T4) und Triiodothyronin und das die Schilddrüse stimulierende Hormon (TSH); Peptidhormone wie etwa Insulin, Corticotropin, Gastrin, Angiotensin und Proangiotensin; und Polypeptidhormone wie etwa Thyrotropin, Somatotropin und das menschliche Choriongonadotropinhormon (HCG). Andere Anwendungen der Komplexe der vorliegenden Erfindung umfassen den Assay von relativ kleinen Molekülen, die am Stoffwechsel beteiligt sind, d. h. Folat, bis zu dem Assay von Polypeptidantigenen und -antikörpern, die mit infektiösen Krankheiten zusammenhängen, d. h. Antigene und Antikörper im Zusammenhang mit HIV, Hepatitis, CMV, Syphilis, die Erreger der Lyme-Krankheit und zahlreiche andere infektiöse Agenzien.
Die Dendrimer-Reagenskomplex/Festphasen-Präparate der vorliegenden Erfindung sind auf viele verschiedene spezifische Bindungsassay-Formate anwendbar. Beispielsweise können mit diesen Reagenzien verschiedene Direktbindungsassays verwendet werden. Bei solchen Assays werden Rezeptoren wie etwa Antikörper oder Bindungsproteine kovalent an die Dendrimere gekoppelt. Die immobilisierten Dendrimer-Rezeptorkomplexe werden mit einer Probe in Kontakt gebracht, die den interessierenden Analyten enthält, und der Komplex wird auf der Festphase immobilisiert. Anschließend an die Immobilisierung des Komplexes wird die Festphase gewaschen und dann mit einem Indikator in Kontakt gebracht. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Indikator" ein markiertes Konjugat. Das Konjugat weist in Abhängigkeit von dem Assay-Format einen Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Bindungsprotein oder einen Analyten auf, und die Markierung ist ein fluoreszierendes, enzymatisches, kolorimetrisches, radiometrisches oder anderes Markierungsmolekül, das mit dem Konjugat entweder direkt oder indirekt assoziiert ist. Die Markierung kann eine enzymatische Verbindung aufweisen, die bei Kontakt mit einem Substrat Fluoreszenz erzeugt. Das Ausmaß, in dem der Indikator auf dem festen Träger vorhanden ist, kann mit der Menge an unbekanntem Analyten in Korrelation gebracht werden, wie beispielsweise in Tijssen, P., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, Seiten 173-219 (Kapitel 10) und Seiten 329-384 (Kapitel 14), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande, 1985, beschrieben ist.
Die Dendrimer-Reagenskomplexe können ferner in kompetitiven Assay-Formaten verwendet werden. Bei solchen Formaten werden die Komplexe mit einer Probe, die wahrscheinlich einen solchen Analyten enthält, und mit einem spezifischen kompetitiven Reagens vermischt. Das spezifische kompetitive Reagens kann ein markiertes Analogon des Analyten sein. Die Komplexe werden dann auf einer Festphase immobilisiert. Bei dieser Ausführungsform tritt das markierte Analogon mit dem Probenanalyten für die Bindung an einen Rezeptor in Konkurrenz. Die nach dem Waschen an die Festphase gebundene Markierungsmenge zeigt die Werte des Analyten in der Probe an. Das heißt, die an die lösliche Phase gebundene Markierungsmenge ist zu der Analytenmenge in der Probe umgekehrt proportional.
Es gibt verschiedene Instrumente zum Aufbringen der Dendrimer- Reagenskonjugate und verschiedener anderer Bindungsassay- Reagenzien auf eine Festphase, zum Waschen und Ablesen der an die Festphase gebundenen Indikatormengen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die Festphase die Glasfaserfiltertabs auf, wie sie oben beschrieben sind, und das Instrument weist das von Baxter Diagnostics Inc. beziehbare Stratus® Immunoassay System auf. Dieses Instrument ist ein Tischinstrument für partienweise Verarbeitung, das von Giegel et al., Clin. Chem. 28 : 1894-98 (1982) beschrieben ist. Das Instrument ist so ausgebildet, daß es Tabs in dem Immunoassay-Format mit radialer Trennung verarbeitet, das ebenfalls in Giegel et al. beschrieben ist. Das Instrument umfaßt Fluidspender für Proben-, Konjugat- und Substratwaschflüssigkeiten. Mikroprozessorgesteuerte Schrittmotoren saugen erforderliche Aliquote von Reagenzien an und geben sie ab. Alle zeitlichen Steuerungs- und Betriebsaspekte der Spender werden durch eine Programmroutine in dem Analysator vorbestimmt. Das Instrument weist ferner ein Tabtransportsystem, Heizplatten mit Temperaturüberwachung, Proben- und Reagensfluidpumpen, eine Meßstation, Datenverarbeitung und Mittel zur Tabentsorgung auf. Für die Qualitätskontrolle überprüft das Mikroprozessor-Steuerungsprogramm des Instruments periodisch kritische Betriebsbedingungen wie etwa Referenzspannungen, Temperaturen und Abgabeeinstellungen sowie Flags für Werte außerhalb der Grenzen.
Dendrimer-gekoppelte Antikörper haben eine sehr starke Affinität für die Glasfaser-Festphase, die in den Stratus®- Immunchemie-Analysatoren verwendet wird. In dem Tüpfelpuffer (pH 8,0) hat das Tab eine negative Nettoladung, wogegen das Dendrimer oder der Dendrimer-gekoppelte Antikörper aufgrund der Anwesenheit einer sehr großen Anzahl von freien Aminogruppen eine positive Nettoladung hat. Die Wechselwirkung entgegengesetzter Ladungen der Dendrimere und Glasfaser-Festphase kann in der Tat so stark sein, daß sich die Dendrimer-gekoppelten Antikörper an der Aufbringstelle auf der Festphase konzentrieren und sich nicht ausreichend verteilen, um eine Tüpfelgröße mit dem gewünschten Durchmesser zu bilden. Die derzeitige Stratus®- Optik erfordert für einen optimalen Nachweis der Reaktion in einer Reaktionszone von ungefähr 8 mm eine Tüpfelgröße von ca. 10 mm Durchmesser. Für den Vergleich verschiedener Datensätze, die mit dem Stratus®-System erzeugt werden, ist das Vorliegen einer einheitlichen Tüpfelgröße wichtig. Es wurde festgestellt, daß das Hinzufügen von Polylysin (Molekulargewicht 22K) oder von freien Dendrimeren (vierte oder fünfte Generation) dazu beitrug, die Tüpfelgröße auf der Glasfaser-Festphase zu vergrößern, und überraschenderweise auch das Signal verstärkte. Wenn die Konzentration von freien Dendrimeren oder Polylysin jedoch zu hoch ist, kann die Anzahl von Stellen auf der Glasfaser von den freien Dendrimeren oder von Polylysin ausgefüllt werden, was die Dendrimer-gekoppelten Antikörper an einer Bindung an die Festphase hindert. Deshalb sollten die Mengen an freien Dendrimeren oder Polylysin, die in dem Tüpfelpuffer anwesend sind, vor der Immobilisierung der spezifischen Dendrimergekoppelten Antikörperlösung routinemäßig titriert werden, um die Tüpfelgröße auf der Festphase zu optimieren.
Untersuchungen unter Verwendung von Ammoniakkern-Dendrimeren zeigten, daß zum Erhalt von Signalen, die mit dem Doppelantikörpersystem vergleichbar sind, bei einer angemessenen Proteinkonzentration Dendrimere der fünften Generation zum Koppeln am stärksten bevorzugt wurden. Dendrimere einer niedrigeren Generation ergaben ca. 40% des Signals gegenüber dem Signal mit den Dendrimeren der fünften Generation. Dendrimere einer höheren Generation ergaben ungefähr das gleiche Signal wie das, das für die Teilchen der fünften Generation erhalten wurde, erzeugten jedoch viel größere Aggregate. Weil festgestellt wurde, daß die Größe und die Gestalt der Teilchen einige Funktionsparameter beeinflussen, wurden in den Assays Dendrimere der fünften Generation bevorzugt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform läßt man Dendrimergekoppelten Antikörper in Lösung an den interessierenden Analyten binden. Aufgrund der Konformationsfreiheit unterliegen Lösungsphasen-Rezeptor-Analyt-Reaktionen im allgemeinen weniger sterischen Beschränkungen und Erfordernissen, als sie bei einem Festphasen-Reaktions-Format vorliegen würden. Dies führt zu einem schnelleren Erreichen des kinetischen Gleichgewichts, als wenn die Rezeptor-Analyt-Reaktion auf einer Festphase durchgeführt würde. Die den Dendrimer-gekoppelten Antikörper- Antigenkomplex enthaltende Lösung wird dann auf eine Glasfaser- Festphase wie etwa ein Stratus®-Tab getüpfelt, und das Tab wird in einem spezifischen Bindungsassay-Format verwendet. Der Antikörper-Antigenkomplex und etwaiger überschüssiger Dendrimergekoppelter Antikörper werden von der Festphase eingefangen, und die nichtspezifisch gebundenen Substanzen werden unter den Standard-Stratus®-Waschbedingungen weggewaschen. Ein für die Anwesenheit des Analyten spezifischer Detektor wie etwa ein enzymmarkiertes Anti-Analyt-Antikörper-Konjugat und ein Anzeigesubstrat werden auf die Reaktionszone aufgebracht. Das von dem Assay erzeugte Signal hängt direkt von der Konzentration des Analyten ab und wird durch die Anwesenheit irgendwelcher nichtspezifischer Reagenzien nicht beeinflußt.
Bei einer alternativen Ausführungsform wird Dendrimergekoppelter Antikörper mit dem interessierenden Analyten und ferner mit einem markierten spezifischen kompetitiven Reagens wie etwa einem Analogon des Analyten in Lösung eingebracht. Die den Dendrimer-gekoppelten Antikörper, den Analyten und das kompetitive Reagens enthaltende Lösung wird dann auf eine Glasfaser-Festphase wie etwa ein Stratus®-Tab getüpfelt, und das Tab wird in einem spezifischen Bindungsassay-Format verwendet. Überschüssiges ungebundenes kompetitives Reagens wird unter den Standard-Stratus®-Waschbedingungen weggewaschen. Das von, dem Assay erzeugte Signal ist zu der Konzentration des Analyten umgekehrt proportional.
Bei einer anderen Ausführungsform läßt man Dendrimergekoppelten Antikörper in Lösung an den interessierenden Analyten in Anwesenheit eines Indikators binden. Eine wirksame Menge der den Dendrimer-gekoppelten Antikörper, den Analyten und den Indikator enthaltenden Lösung wird auf eine Glasfaser-Festphase getüpfelt. Die Festphase wird anschließend unter geeigneten Waschbedingungen gewaschen, und die an die Festphase gekoppelte Indikatormenge wird bestimmt.
Zwei Möglichkeiten, die Bindung der Höchstmenge des Analyten in einem Stratus®-Zyklus zu erleichtern und also dazu beizutragen, das Gleichgewicht in der kürzest möglichen Zeit zum Abschluß zu treiben, sind, die Antikörperkonzentration zu erhöhen und die Konjugatkonzentration zu erhöhen. Bei der vorliegenden Erfindung können diese zwei Variablen eingestellt werden, um die erforderliche Reaktionszeit erheblich zu verkürzen.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Festphase kann eine Population von Dendrimer-Reagenskomplexen enthalten, die Spezifität für mehr als einen Analyten haben. Das heißt, die Lösung kann wenigstens zwei verschiedene Dendrimer- Reagenszubereitungen enthalten, wobei jede Zubereitung eine Spezifität für einen ausgewählten Analyten hat. Diese werden gemischte Antikörper-Dendrimer-Lösungen genannt. Die Dendrimer- Reagenskomplexe der Zubereitungen werden miteinander vermischt und auf eine begrenzte Fläche der Festphase aufgebracht, um eine Reaktionszone zu bilden, die für die Analyse von Vielfachanalyten nützlich ist. Alternativ kann die Lösung oder die Festphase eine einzige Dendrimer-Reagenszubereitung enthalten, wobei jeder Dendrimer-Reagenskomplex der Zubereitung eine Spezifität für wenigstens zwei verschiedene Analyten hat. Diese werden Dendrimer-Lösungen oder Festphasen mit Vielfachspezifität genannt.
Die gemischten Antikörper-Dendrimer-Lösungen und die Dendrimer- Lösungen mit Vielfachspezifität der vorliegenden Erfindung können in den Fällen besonders nützlich sein, in denen eine Patientenprobe für eine spezifische Diagnose unter Verwendung eines Testpanels einem Assay zu unterziehen ist, wobei jeder Test eine Anzeige einer anderen Stufe eines klinischen Symptoms ist.
Beispielsweise könnte ein kardiales Panel eine Untersuchung auf Creatinkinase-Isozym-MB (CKMB), Troponin, Myoglobin und Digoxin erfordern. Ein Krebsmarker-Panel könnte auf carcinoembryonales Antigen (CEA), alpha-Fetoprotein (AFP) und humanes Choriongonadotropinhormon (HCG) untersuchen.
Das Verständnis der Erfindung ergibt sich aus den nachstehenden erläuternden Ausführungsformen, die rein beispielhaft sind und den wahren Umfang der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Ansprüchen beschrieben ist, nicht einschränken sollen.

BEISPIEL 1

Zubereitung von Festphasenträgern (Tabs)

In den vorliegenden Experimenten verwendete Festphasenträger wiesen "Tabs" auf, wie sie mit dem Analysatorinstrument Stratus® oder dem Analysatorinstrument Stratus® II verwendet werden, die beide von Baxter Diagnostics Inc. vertrieben werden. Diese Tabs werden von 2,5 cm (1 in.) breiten Rollen aus GF/F- Glasfilterpapier (Whatman Inc.) und verrastbaren Tabteilen aus Kunststoff zusammengesetzt, wie in Giegel et al., Radial Partition Immunoassay, Clin. Chem. 28: 1894-98 (1982) beschrieben ist. Angemessene Konzentrationen von Dendrimer-Lösungen, Antikörperlösungen oder anderen Protein- oder Kontrollösungen werden in Tüpfelpuffer hergestellt. Die Tüpfelpufferzusammensetzung kann verändert werden, um sie an bestimmte experimentelle oder Herstellungsparameter anzupassen. Im allgemeinen kann der Tüpfelpuffer beispielsweise 20mM bis 200 mN Tris, pH 7,0 bis 9,0, ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel bzw. Tensid wie etwa Zonyl® FSN (E. I. DuPont deNemours & Co., Cat. No. CH 7152S) in einem Konzentrationsbereich von 0,1% bis 1,0%, Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,5% bis 4,0% und 0,1% Natriumazid aufweisen. Bevorzugt weist der Tüpfelpuffer 30 bis 100mM Tris, pH 7,0 bis 8,5, 0,1% bis 0,5% Zonyl® FSN, 1,0% bis 3,0% BSA und 0,1% Natriumazid auf. Am stärksten bevorzugt weist der Tüpfelpuffer 50mM Tris, pH 8,0, 0,1% Zonyl® FSN und 2,0% BSA auf. Fluorierte Tenside (beispielsweise 3M Cat. No. FC 171 und FC 170C) und andere dem Fachmann bekannte geeignete Tenside können für Zonyl® FSN substituiert werden. Der Tüpfelpuffer weist ferner 0,01 bis 0,1% Polylysin (Molekulargewicht 15.000 bis 30.000; Sigma Cat. No. P7890) oder freie Dendrimere (vierte oder höhere Generation) auf. Bevorzugt weist der Tüpfelpuffer 0,03 bis 0,05% eines freien Dendrimers der fünften Generation auf. Andere gleich geladene Moleküle, die in der wissenschaftlichen Literatur bekannt sind, können für das freie Dendrimer substituiert werden.
Aliquote von 76 ul einer ausgewählten Lösung werden auf die Mitten von leeren Tabs getüpfelt. Nach einer angemessenen Inkubationszeit des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers werden der Analyt, das Konjugat und die Substratwaschflüssigkeit auf das feuchte Tab aufgebracht. Die Tabs können bis zum Gebrauch bei 2ºC bis 8ºC gelagert werden. Das Tüpfeln der Lösungen auf die Tabs kann mit einer Pipettiereinrichtung manuell durchgeführt werden, oder es kann mit automatischen Herstellungsverfahren durchgeführt werden. Alternativ können die Tabs mit dem Instrument Stratus® II selbst betüpfelt und verarbeitet werden, nachdem eine geeignete Programmierung von Maschinenparametern zum Aufbringen ausgewählter Aliquote von Stammlösungen auf die Mitten von Tabs durchgeführt wurde.

BEISPIEL 2

Herstellung von IgG-Dendrimer über Schiffsche-Bäsen-Kopplung Eine IgG-Konzentratlösung, bestehend aus 4 bis 5 mg IgG/ml in Acetatpuffer (0,1 M NaOAc/0,1 M NaCl), pH 4,5, wird hergestellt und auf Eis gekühlt. Ein 2/3 Volumen von gekühltem 0,1 M NaIO&sub4; in Acetatpuffer, pH 4, 5, wird der IgG-Lösung zugegeben, und die vereinigte IgG/NaIO&sub4;-Lösung wird für 2 h bei 2ºC bis 8ºC im Dunkeln inkubiert. Ethylenglycol mit 10 u1/ml IgG- Originalkonzentratlösung wird zugegeben, und die Inkubation wird für eine weitere 1/2 h bei 2ºC bis 8ºC fortgesetzt. Die resultierende Lösung von IgG-Aldehydderivat (IgG-CHO) wird durch Leiten über eine geeignet bemessene Sephadex G-25-Säule, äquilibriert mit Acetatpuffer mit pH 4,5, entsalzt. Proteinfraktionen werden gesammelt und vereinigt, und die Konzentration von IgG-CHO wird spektralphotometrisch bei 280 nm unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,48 ml&supmin;¹·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹ bestimmt. Der Aldehydgehalt des Periodat-oxidierten IgG kann unter Anwendung des Aldehydmodifikationsreagenses Purpald (Aldrich, Cat. No. 16-289-2) mit geeigneten Formaldehydkonzentrationen als Kalibriermittel quantitativ bestimmt werden. Dendrimere (mit einer Teilohengröße von ca. 50 bis 70 Å) in wäßriger Lösung (Michigan Molecular Institute, Midland, Michigan) werden der entsalzten IgG-CHO-Lösung in einem Molverhältnis von 3 : 1 von Dendrimer IgG-CHO zugegeben. Die Kombination aus Dendrimer/IgG-CHO wird einem Pufferaustausch in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,4, unterzogen, und das Lösungsvolumen wird so eingestellt, daß eine IgG-Endkonzentration von ungefähr 1,0 mg IgG/ml erhalten wird. Die Lösung wird dann für 16 bis 24 h bei 2ºC bis 8ºC inkubiert. Dann wird ein Volumen von frisch präparierter NaBH&sub4;-Lösung (4 mg/ml in Wasser), gleich 1/20 des Volumens des Dendrimer/IgG-CHO-Reaktionsgemischs, langsam zugegeben und für weitere 2 h bei 2ºC bis 8ºC inkubiert. Die resultierende Lösung wird, falls erforderlich, mittels Filtration durch einen Filter von 0,22 um geklärt. Es wird eine geeignet bemessene Säule aus Polyacrylamid- Agarosegelmatrix (AcA-44 Ultrogel, IBF, Cat. No. 230161) präpariert und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)/0,1% NaN&sub3; äquilibriert. Das Dendrimer/IgG-CHO-Endreaktionsgefflisch wird auf ein Volumen von weniger als 3% des AcA-44- Bettvolumens eingeengt, dann auf die Säule geladen und mit einer geeigneten Durchflußrate eluiert. Fraktionen, die den ersten Proteinpeak enthalten, der die gekoppelte IgG-Dendrimer- Zubereitung (IgG-DEND) aufweist, werden dann vereinigt. Die Konzentration von IgG in der IgG-DEND-Zubereitung wird spektralphotometrisch bei 280 nm unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1, 48 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹ bestimmt.

BEISPIEL 3

Herstellung von IgG-Dendrimer über SIAB-Kopplung Ein I/5 Volumen Natriumphosphatpuffet (0,5 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,1) wird der vom Hersteller gelieferten wäßrigen Dendrimer-Lösung von 54 Å (MMI, Midland, Michigan) zugegeben. Die resultierende Lösung wird mit 1 N HCl oder 1 N NaOH auf einen pH von 7, 6 eingestellt. Ein geeignetes Volumen von 15 mg/ml Sulfo-SIAB in Wasser wird der Dendrimer-Lösung zugegeben, so daß das Molverhältnis von Sulfo-SIAB : Dendrimer gleich 20 : 1 ist, und dann für 1 h bei 30ºC inkubiert. Die resultierende Lösung von SIAB- Dendrimer-Derivat (SIAB-DEND) wird auf eine geeignet bemessene Sephadex G-25-Säule geladen, die mit 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,6, vorher äquilibriert wurde. Nach Eluieren mit einer Durchflußrate von ungefähr 0,5 ml/min werden die SIAB-DEND-Fraktionen vereinigt, und die SIAB-DEND-Konzentration wird mit Fluorescamin, einem fluorogenen Reagens, das für den Assay von primären Aminen eingesetzt wird, bestimmt, wie in Weigele et al., J. Am. Chem. Soc. 94: 5927 (1972) und in Udenfriend et al., Science 178: 871 (1972) beschrieben ist. Geeignete Konzentrationen von nichtderivatisiertem Dendrimer von 54 A werden als Kalibriermittel eingesetzt.
Für die Herstellung von Sulfhydryl-IgG-Derivat (IgG-SH) wird eine Lösung von 5 mg IgG/ml in Reduktionspuffer (0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, 5 mm EDTA, pH 6,0) präpariert. Dithioerythritol (DTE) oder Dithiothreitol (DTT) wird in dem Reduktionspuffer in einer Konzentration von 11,4 mg/ml gelöst. Die DTE-Lösung wird der IgG- Lösung in einem Volumen gleich 1/9 des Volumens der 5 mg/ml IgG-Lösung zugegeben und dann für 1 h bei 37ºC inkubiert. Die resultierende IgG-SH-Lösung wird dann durch Leiten über eine geeignet bemessene Sephadex G-25-Säule entsalzt, und die IgG- SH-Konzentration und der SH-Gehalt werden mit Standardmethoden bestimmt.
Um schließlich das IgG-DEND herzustellen, wird die SIAB-DEND- Lösung mit der IgG-SH-Lösung in einem Molverhältnis von SIAB-DEND : IgG-SH von 3 : 1 vereinigt und dann einem Pufferaustausch in Natriumphosphatpuffer (0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,6) unterzogen. Das Volumen der Lösung wird auf eine IgG- Endkonzentration von ungefähr 5 mg/ml eingestellt und die Lösung dann für 16 bis 24 h bei 2ºC bis 8ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe eines 1/50 Volumens Abschrecklösung; bestehend aus 10 mg/ml N-Ethylmaleiimid (NEM) in N,N- Dimethylformamid (DMF) gestoppt, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur (23ºC bis 25ºC). Das abgeschreckte Reaktionsgemisch wird, falls erforderlich, durch Leiten durch einen Filter von 0,22 um geklärt und dann entweder durch Diafiltration (Amicon, YM-100) oder durch Leiten über eine AcA-44 Ultrogel-Säule, wie oben in Beispiel 2 beschrieben, ausgereinigt.

BEISPIEL 4

Kopplung von Anti-hTSH-Antikörper (CA2) an Dendrimere

Ungefähr 12 ml Aszitesfluid, enthaltend ungefähr 60 mg AntihTSH-(CA2)-Antikörper, wurde über einer Q-Sepharose-Säule (1,0 · 13,0 cm) unter Verwendung eines Gradienten zwischen 20mM Tris; pH 8,5, und 20 mN Tris/0,3 M NaCl, pH 7,0, gereinigt und ergab 54 mg des gereinigten Antikörperproteins. CA2 ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 1437 hinterlegt. Die Antikörperlösung, enthaltend 35 mg Protein, wurde mit einem gleichen Volumen an Bindungspuffer (Bio-Rad) verdünnt und über einer Protein-A-Säule (1,0 · 6,5 cm (Bio-Rad AffiPrep) durch Absorption des Antikörpers an der Säule und anschließendes Eluieren des gebundenen Proteins mit 0,1 M Natriumacetat-0,1 M Natriumchlorid, pH 5,0, gereinigt und ergab 26,0 mg des Antikörpers in Lösung.
Das E5-Dendrimer (MMI, Midland, Mich.) wurde nach der oben in Beispiel 3 beschriebenen allgemeinen Vorgehensweise iodacetyliert. Ein 20-facher molarer Überschuß an Sulfo-SIAB wurde der wäßrigen Dendrimer-Lösung zugegeben. Jedes Dendrimer-Teilchen nahm ungefähr 2,5 Iodacetyle auf.
Die Antikörperlösung (2,0 ml bei 5,0 mg/ml) wurde nach der oben in Beispiel 3 angegebenen allgemeinen Vorgehensweise für 1 h bei 37ºC mit DTE oder DTT (0,23 ml von 4,5 mg/ml) in 0,1 M Natriumphosphat-5,0 mM EDTA, pH 6,5, reduziert. Nach dem Entsalzen über einer G-25-Säule in dem Reduktionspuffer zeigte das Produkt die Anwesenheit von ca. 10 Sulfhydrylen pro IgG.
Der reduzierte Antikörper wurde dann in einem Molverhältnis von 1 : 3 an das iodacetylierte Dendrimer gekoppelt, wie in dem oben in Beispiel 3 angegebenen allgemeinen Kopplungsverfahren beschrieben ist. Das Endprodukt wurde entweder durch Diafiltration (Amicon YM-100) oder durch Leiten über eine AcA-44-Säule in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ausgereinigt. Es wurde festgestellt, daß die Stöchiometrie von Dendrimeren zu Antikörper in dem gereinigten Endprodukt 1,0 ± 0,3 war.
Die E5-gekoppelte Antikörperlösung kann für wenigstens ein Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden. Gemäß der Überwachung des Kalibriermittels F (enthaltend 50 uIU/mL hTSH) trat eine Änderung der Raten von nur ca. 7% auf, wenn die Lösung für ein Jahr bei Raumtemperatur gelagert wurde.

BEISPIEL 5

Kopplung von Anti-CKMB-Antikörper an Dendrimer

Die Reinigung eines gegen Creatinkinase-Isozym MB (CKMB, Conan, ATTC-Hinterlegungsnummer HB8939) gerichteten Antikörpers wurde, wie oben in Beispiel 3 beschrieben, über Q-Sepharose durchgeführt und ergab eine Ausbeute von ca. 65%. Das E5-Dendrimer wurde mit einem 20fachen molaren Überschuß an Sulfo-SIAB herausgefordert, ungefähr 2,5 Iodacetyle pro Dendrimer aufzunehmen. Die Antikörperlösung wurde nach der oben in Beispiel 3 angegebenen allgemeinen Vorgehensweise für 1 h bei 37ºC mit DTE oder DTT mit pH 6,5 reduziert. Nach dem Entsalzen über einer G-25-Säule in dem Reduktionspuffer zeigte das Produkt die Anwesenheit von ca. 8,5 Sulfhydrylen pro IgG. Die Kopplung des derivatisierten E5 an das reduzierte IgG erfolgte, wie im Fall von hTSH (Beispiel 4) beschrieben. Die Reinigung des Endprodukts wurde entweder durch Diafiltration (Amicon, YM-100) oder über einer mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung präparierten und eluierten AcA-44-Säule durchgeführt.

BEISPIEL 6

Herstellung einer Lösung aus mehreren Dendrimer-gekoppelten Antikörperzubereitungen

Ein Lösungsgemisch, enthaltend zwei Zubereitungen aus Dendrimer-gekoppelten Antikörpern, d. h. eine Zubereitung aus E5- gekoppelten Antikörpern gegen CKMB und eine Zubereitung aus E5- gekoppelten Antikörpern gegen hTSH, wurde hergestellt. Die optimierte Arbeitskonzentration wurde für jede Dendrimergekoppelte Antikörperzubereitung in separaten Experimenten auf einem Stratus® TI bestimmt. Es wurde festgestellt, daß für die CKMB- und hTSH-Assays die optimierte Konzentration des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers 10 ug/ml war. Es wurde festgestellt, daß die optimierte Konzentration für den Tetraiodothyronin-Assay (T4-Assay) 0,56 ug/l war. Eine Lösung aus den optimierten Proteinkonzentrationen wurde geprüft und in 50 mM Tris, 0,1% V/V FSN, 0,033% Gew.-V unmodifiziertem E5, pH 8,0, aufbewahrt.
Es wurde ferner ein Lösungsgemisch, enthaltend drei Zubereitungen aus für hTSH, CKMB und T4 spezifischen monoklonalen Antikörpern, die separat an E5 gekoppelt waren, nach dem oben in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt. Identische Kalibrierkurven wurden für den spezifischen Analyten erzeugt, wenn die Lösung entweder einzelne Analyt-spezifische E5- gekoppelte Antikörperoder ein Gemisch aus den drei E5- gekoppelten Antikörperzubereitungen enthielt. Die Anwesenheit von nichtspezifischen E5-gekoppelten monoklonalen Antikörpern hatte also keinen Einfluß auf die spezifische Analyt- Antikörper-Reaktion. Wie unten in Tabelle 1 gezeigt ist, war außerdem, wenn eine ein Gemisch von Analyten enthaltende Lösung geprüft wurde, die Konzentration des nachgewiesenen spezifischen Analyten sehr ähnlich, unabhängig davon, ob die Lösung den spezifischen E5-gekoppelten Antikörper oder das Gemisch aus Dendrimer-gekoppelten Antikörperzubereitungen enthielt. Für den Zufallsnachweis eines Analyten kann also eine Lösung, die ein Gemisch aus Dendrimer-gekoppelten Antikörperzubereitungen enthält, anstelle einer Reihe von Lösungen eingesetzt werden, die anderenfalls für diesen Zweck benötigt würden. TABELLE 1 ZUFALLSNACHWEIS VON MEHREREN ANALYTEN IN EINER EINZIGEN PROBE MIT EINEM EINZIGEN TYP VON DENDRIMER-GEKOPPELTEM ANTIKÖRPER ODER EINEM GEMISCH, DAS DREI TYPEN VON DENDRIMER-GEKOPPELTEN ANTIKÖRPERN ENTHÄLT
* Mittelwert aus drei Tests.
^ Konzentration, die aus MV/MIN bestimmt wurde. Analytenkonzentrationseinheiten sind ng/ml, uIU/ml und ug/dl für CKMB, hTSH bzw. T4.

BEISPIEL 7

Herstellung von Dendrimeren mit Mehrfachspezifität

Die Dendrimere werden nach der oben in Beispiel 2 beschriebenen allgemeinen Vorgehensweise iodacetyliert. Ein 20- bis 50-facher molarer Überschuß an Sulfo-SIAB wird der wäßrigen Dendrimer- Lösung zugegeben. Jedes Dendrimer-Teilchen enthält ungefähr 6-Iodacetyle.
Ein Gemisch aus gereinigten Anti-CKMB- und Anti-hTSH- Antikörpern in einem (Gewichts-)Verhältnis von 1 : 1 wird nach der oben in Beispiel 3 beschriebenenallgemeinen Vorgehensweise für 1 h bei 37ºC mit DTT in dem Reduktionspuffer reduziert. Nach dem Entsalzen über einer G-25-Säule, die mit dem Reaktionspuffer präpariert und eluiert wurde, zeigt das Produkt die Anwesenheit von ca. 10 Sulfhydrylen pro IgG.
Das reduzierte Antikörpergemisch wird dann in einem Molverhältnis von 1 : 5 bis 1 : 10 an das iodacetylierte Dendrimer gekoppelt, wie in dem oben in Beispiel 3 angegebenen allgemeinen Kopplungsvorgang beschrieben ist. Der in der Endproduktlösung anwesende überschüssige nichtgekoppelte Antikörper wird durch Gelfiltrationsreinigung entweder unter Verwendung einer AcA-34- Säule (oder einer äquivalenten Säule) oder auf FPLC unter Verwendung einer Superdex-200-Säule (Pharmacia) in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt. Die IgG-E5 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, und die Proteinkonzentration wird durch BCA-Assay bestimmt. Wenn ein Gemisch aus Anti-T4, Anti- CKMB und Anti-hTSH zum Koppeln verwendet wird, wird die Dendrimer-gekoppelte Antikörperlösung auf eine Gesamtproteinkonzentration von 10,3 ug/ml in 50 mM Tris, 0,1% FSN, pH 8,0, verdünnt und auf einem Stratus II geprüft. Die aus einem Gemisch aus Anti-CKMB- und Anti-hTSH-Antikörpern hergestellte Dendrimer-gekoppelte Antikörperlösung wird für die Prüfung und Aufbewahrung auf eine Gesamtproteinkonzentration von 10 ug/ml in 50 mM Tris, 2% BSA und 0,1% FSN, pH 8,0, verdünnt.

BEISPIEL 8

Lösungs-basierter Dendrimergekoppelter Antikörper-Assay

Eine Stammlösung des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers wurde in Tüpfelpuffer, enthaltend 50 mM Tris, 0,1% V/V Zonyl® FSN, 2,0% proteasefreiem BSA und 0,03% des freien Dendrimers, pH 8,0, hergestellt. 38 ul dieser Stammlösung wurden mit 132 ul einer den Analyten enthaltenden Probe vorinkubiert. Der Assay wurde durch Ansaugen und Abgeben von 76 ul dieses Gemischs auf ein leeres Tab, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, auf einem Stratus® II durchgeführt. Nach einem angemessenen Zeitintervall wurden dann 20 ul des geeigneten alkalischen Phosphatasekonjugats (0,75 ug/ml) auf jedes Tab abgegeben. Die Substratsonde des Stratus®-Instruments saugte dann 70 ul der Substratwaschflüssigkeit (Tris-Puffer mit pH 9,0, enthaltend 1,0 mM 4- Methylumbelliferylphosphat, alkalischen Phosphataseinhibitor, Stabilisatoren, blauen Farbstoff, Tensid und 0,1% Natriumazid) an und gab sequentiell 20 ul und 50 ul an das Tab ab. Das so erzeugte Signal wurde mittels Vorderflächenfluorometrie in dem Stratus®-Instrument gemessen und im Speicher des Instruments gespeichert, wie in Giegel et al., Clin. Chem. 28: 1894-98 (1982) beschrieben ist.
Das in Giegel et al. beschriebene radiale Trennungs-Assay- Format wurde in sämtlichen Experimenten angewandt. Kalibriermittellösungen A, B, C, D, E und F wurden entweder in normalem Humanserum oder in einer Tris-gepufferten Lösung (pH 7,5) hergestellt, die BSA, einen Stabilisator und 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel enthielt. Die Kalibriermittellösungen A, B, C, D, E und F für hTSH enthielten Konzentrationen von 0, 0,25, 0,75, 3, 12 bzw. 50 uIU/ml; die Kalibriermittellösungen für CKMB enthielten Konzentrationen von 0,0, 4,80, 11,60, 26,90, 61,10 und 127,80 ng/ml.
Durch Erhöhen der Dendrimer-gekoppelten Antikörperkonzentration in einem CKMB-Assay, während gleichzeitig die Konjugatinkubationszeit bei 60 s gehalten wurde, wurde sehr rasch (d. h. in weniger als 80 s) das Gleichgewicht etabliert, wie durch die Änderung des erzeugten Signals festgestellt wurde. Fortgesetzte Inkubation über den anfänglichen Anstieg des Signals hinaus verbe serte das Signal nicht erheblich. Diese Verkürzung der Inkubationszeit des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers mit dem Analyten hat den Vorteil, daß die Gesamtzeit bis zum Abschluß des Assay verkürzt wird. Die Assay-Gesamtzeiten sind in Tabelle 2 gezeigt.

TABELLE 2

VERGLEICH DER ASSAY-GESAMTZEITEN

DEN-Ab-INKUBATIONSZEIT (s) ASSAY-GESAMTZEIT (min)

10 3,77
30 4,1
60 4, 6
120 5, 6
180 6, 6
CKMB- und hTSH-Assays wurden unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung durchgeführt. Durch Erhöhen der Konzentration des Konjugats in dem CKMB-Assay, wurde, wie der Signalanstieg zeigt, die Maximalwirkung während der anfänglichen Inkubationsperioden von 100 s oder weniger offenbar. Eine zusätzliche Inkubationszeit bot keinen erheblichen Vorteil. Hinsichtlich des hTSH-Assays schien die Erhöhung der Konjugatkonzentration einen Signalanstieg über einen breiteren Bereich der Inkubationsperioden zu bewirken. Es war ferner möglich, die Kinetik der Reaktion durch Einstellen der Zeiten und Konzentrationen des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers sowie derjenigen des Konjugats zu manipulieren.
Volle Kalibrierkurven wurden für hTSH- und CKMB-Assays unter Anwendung der oben beschriebenen Manipulationen erstellt. Im Nachstehenden werden die Begriffe "8-Minuten-Assay" und "aktueller Assay" austauschbar mit dem Begriff "Doppelantikörper- Immunkomplex-Format" verwendet. Alle diese Begriffe beziehen sich auf ein Assay-Format, das die Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern erfordert: eines ersten Antikörpers, der für den Analyten spezifisch ist, und eines zweiten Antikörpers, der für den Anti-Analyt-Antikörper spezifisch ist. Die Antikörper werden in einem Puffer vereinigt, und der resultierende Doppelantikörper-Immunkomplex wird vor der Zugabe der Probe und des Indikators zu einer Festphase auf der Festphase immobilisiert. Der Begriff "In-Lösung-Assay" wird austauschbar mit "Lösungsphasen-Format", "4-Minuten-Assay", "Schnell-Assay" und "Vormisch-Assay" verwendet. Diese Begriffe beziehen sich sämtlich auf ein Assay-Format, bei dem der Dendrimer-gekoppelte Antikörper, die Probe und/oder der Indikator zunächst in einer Reaktionslösung miteinander vermischt werden, bevor sie für den Rest des Assays auf die Festphase aufgebracht werden.
Für den hTSH-Assay war die Form der Kalibrierkurven für zwei Veränderungen des In-Lösung-Assays mit der Form der Kalibrierkurve für den Doppelantikörper-Immunkomplex-Assay gut vergleichbar. Die Konzentrationen des Konjugats und des Dendrimergekoppelten Antikörpers wurden zwischen den beiden Assays unter Anwendung des Dendrimer-gekoppelten Antikörper-Formats verändert. Der Assay, bei dem die höheren Konzentrationen des Konjugats und des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers verwendet wurden, führte am raschesten zu dem kinetischen Gleichgewicht und ermöglichte den Abschluß des Assays in 3,93 min gegenüber 4,5 min bei dem anderen Dendrimer-gekoppelten Antikörper-Assay und 8 min bei dem Doppelantikörper-Assay-Format.
Die Empfindlichkeit am unteren Ende bei dem hTSH-Assay in dem In-Lösung-Format wird erheblich verbessert. Tatsächlich wurde die Empfindlichkeit am unteren Ende in dem In-Lösung-Assay ebenfalls gegenüber sowohl dem immobilisierten Dendrimergekoppelten Antikörper-Format als auch einem immunologischen Immobilisierungs-Format (Doppelantikörperkomplex-Format) verbessert. Diese Verbesserung ist auf sehr geringe nichtspezifische Bindung zurückzuführen. Das Verhältnis der Kalibriermittel Cal B/Cal A und Cal F/Cal A war 4,50 und 719,5 für den In- Lösung-Assay gegenüber den entsprechenden Werten von 1,67 bzw. 91,7 für das Doppelantikörperkomplex-Format.
Tabelle 3 zeigt einen Vergleich der Assay-Empfindlichkeit und der Antikörpermenge, die für das aktuelle Doppelantikörper- Format erforderlich ist, gegenüber dem In-Lösung-Dendrimer- Antikörper-Format für drei verschiedene Analyten. Diese Assays wurden an einem Instrument Stratus® II durch Aspirieren und Abgeben von 76 ul eines die Probe und den Dendrimer-gekoppelten Antikörper oder den Doppelantikörper-Immunkomplex enthaltenden Gemischs auf ein leeres Tab durchgeführt, wie oben beschrieben wurde. Der Assay wurde dann durch Aufbringen des Konjugats und der Substratwaschflüssigkeit, wie oben beschrieben, abgeschlossen. TABELLE 3 VERGLEICH DES AKTUELLEN DOPPELANTIKÖRPER-FORMATS UND DES IN-LÖSUNG-FORMATS UNTER VERWENDUNG VON E5-ANTIKÖRPER-TABS
Myoglobin 0,37 ng/ml 0,05 ng/ml 3,8 0,17 Es wurden Kalibrierkurven für einen CKMB-Assay im In-Lösung- Format erstellt. Diese Kurven wurden durch Manipulationen der Konzentrationen des Konjugats und des Dendrimer-gekoppelten Antikörpers erhalten. Diese Manipulationen führten rascher zu einem kinetischen Gleichgewicht und ermöglichten den Abschluß des Assays in 4 oder 5 min. Ein CKMB-Assay, bei dem das Doppelantikörper-Immunkomplex-Format verwendet wurde, wurde mit dem des In-Lösung-Forirtats verglichen. Ein R²-Wert von 0,999047 unter Anwendung einer linearen Regressionsanalyse zeigt deutlich, daß die zwei Assays vergleichbare Ergebnisse produzieren und die gleiche Analytenkonzentration ergeben. Die schnellere Kinetik des In-Lösung-Assays der vorliegenden Erfindung bietet jedoch den deutlichen Vorteil, daß gegenüber dem Doppelantikörper- Immunkomplex-Format die Ergebnisse in der halben Zeit vorliegen. Ein ähnlicher Vergleich von Kalibrierkurven für einen hTSH-Assay unter Anwendung des Doppelantikörper-Formats und Von zwei verschiedenen Formaten des Dendrimer-gekoppelten Antikörper-Assays wurde durchgeführt. Das "Vormisch"-Format bezieht sich auf den In-Lösung-Assay, und das "Trockentab"-Format bezieht sich auf ein Assay-Format, bei dem der Dendrimergekoppelte Antikörper auf der Festphase immobilisiert wird, bevor die Probe und der Indikator der Festphase zugegeben werden. Für diese Kurven waren die Mengen an pro Tab verwendetem primärem Antikörper 1,14 ug bei dem Doppelantikörper-Format, 1,14 ug bei dem immobilisierten Dendrimer-gekoppelten. Antikörper-Format und 0,38 ug bei dem Dendrimer-gekoppelten Antikörper-In-Lösung- Format. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, daß die Verwendung eines Dendrimer-gekoppelten Antikörpers in einer Reaktionslösung vor der Immobilisierung auf einem Glasfaserfilter die Assay-Empfindlichkeit für einen Analyten verbessert und auch zu rascheren Ergebnissen führt.

Claims

1. Verfahren zum Immobilisieren einer Vielzahl von spezifischen Bindungsassay-Reagenzien auf einer Festphase, das die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bereitstellen einer Dendrimer-Reagenzlösung, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenzzubereitungen aufweist, wobei jede dieser Zubereitungen eine Vielzahl von Dendrimer-Reagenz-Komplexen aufweist und jeder dieser Komplexe eine definierte Spezifität für wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat;

(b) Hinzufügen einer Probe unter spezifischen Bindungsbedingungen zu der Dendrimer-Reagenzlösung, um eine Assay-Lösung zu bilden; und

(c) Aufbringen einer wirksamen Menge der Assay-Lösung auf eine Festphase unter Bedingungen, die die Immobilisierung des Dendrimer-Reagenz-Komplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den folgenden Schritt aufweist: Hinzufügen einer ausgewählten Menge eines Indikators zu der Dendrimer- Reagenzlösung.

3. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den folgenden Schritt aufweist: Hinzufügen eines markierten spezifischen kompetitiven Reagenzes zu der Dendrimer-Reagenzlösung.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das spezifische kompetitive Reagenz ein markiertes Analogon des wenigstens einen Analyten ist.

5. Verfahren zum Durchführen eines spezifischen Bindungsassays, um die Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in einer Probe zu bestimmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bereitstellen einer Dendrimer-Reagenzlösung, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenzzubereitungen aufweist, wobei jede dieser Zubereitungen eine Vielzahl von Dendrimer-Reagenz-Komplexen aufweist und jeder dieser Komplexe eine definierte Spezifität für den wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat;

(b) Hinzufügen der Probe unter spezifischen Bindungsbedingungen zu der Dendrimer-Reagenzlösung, um eine Assay-Lösung zu bilden;

(c) Hinzufügen einer wirksamen Menge der Assay-Lösung zu einer Festphase unter Bedingungen, die die Immobilisierung des Dendrimer-Reagenz-Komplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken;

(d) Aufbringen einer ausgewählten Menge eines Indikators unter Bindungsbedingungen auf die begrenzte Fläche;

(e) Bestimmen der Menge des Indikators, die an die Festphase gekoppelt ist; und

(f) Korrelieren der Menge des Indikators mit der Konzentration oder Anwesenheit des wenigstens einen Analyten in der Probe.

6. Verfahren zum Durchführen eines spezifischen Bindungsassays, um die Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in einer Probe zu bestimmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bereitstellen einer Dendrimer-Reagenzlösung, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenzzubereitungen aufweist, wobei jede dieser Zubereitungen eine Vielzahl von Dendrimer-Reagenz-Komplexen aufweist und jeder dieser Komplexe eine definierte Spezifität für den wenigstens einen Analyten oder für einen Rezeptor des wenigstens einen Analysten hat;

(b) Hinzufügen der Probe und eines markierten spezifischen kompetitiven Reagenzes unter spezifischen Bindungsbedingungen zu der Dendrimer-Reagenzlösung, um eine kompetitive Assay-Lösung zu bilden;

(c) Hinzufügen einer wirksamen Menge der kompetitiven Assay-Lösung zu einer Festphase unter Bedingungen, die die Immobilisierung des Dendrimer-Reagenz-Komplexes auf einer begrenzten Fläche der Festphase bewirken;

(d) Bestimmen der Menge der Markierung, die an die Festphase gekoppelt ist; und

(e) Korrelieren der Menge der Markierung mit der Konzentration oder Anwesenheit des Analyten in der Probe.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das spezifische kompetitive Reagenz ein markiertes Analogon des wenigstens einen Analyten ist.

8. Verfahren zum Durchführen eines spezifischen Bindungsassays, um die Konzentration oder Anwesenheit von wenigstens einem Analyten in einer Probe zu bestimmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bereitstellen einer Dendrimer-Reagenzlösung, die eine oder mehrere Dendrimer-Reagenzzubereitungen aufweist, wobei jede dieser Zubereitungen eine Vielzahl von Dendrimer-Reagenzkomplexen aufweist und jeder dieser Komplexe eine definierte Spezifität für den wenigstens einen Analyten oder für einen. Rezeptor des wenigstens einen Analyten hat;

(b) Hinzufügen der Probe und einer ausgewählten Menge eines Indikators unter spezifischen Bindungsbedingungen zu der Dendrimer-Reagenzlösung, um eine Assay-Lösung zu bilden;

(d) Bestimmen der Menge des Indikators, die an die Festphase gekoppelt ist; und

(e) Korrelieren der Menge des Indikators mit der Konzentration oder Anwesenheit des wenigstens einen Analyten in der Probe.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jeder der Komplexe ein Dendrimer aufweist, das an ein spezifisches Bindungsassay-Reagenz gekoppelt ist, und das Reagenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, spezifischen Bindungsproteinen und Analyten besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Koppeln des Reagenzes an das Dendrimer durch C-S-Bindung erfolgt, die durch Vereinigen von SIABmarkierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Koppeln des Reagenzes an das Dendrimer durch C- S-Bindung erfolgt, die durch Vereinigen von SMCCmarkierten Anteilen mit Sulfhydryl-enthaltenden Anteilen durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Koppeln des Reagenzes an das Dendrimer durch C- N-Bindung erfolgt, die durch Vereinigen von Aldehydmarkierten Anteilen mit nichtmodifizierten Dendrimeren durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Dendrimer ein E5-Dendrimer ist.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Dendrimer ein N5-Dendrimer ist.