DE69226148T2

DE69226148T2 - Radioimmunologisches Untersuchungsverfahren zum PTHrP nachweis

Info

Publication number: DE69226148T2
Application number: DE69226148T
Authority: DE
Inventors: Mayumi C/O Tsukuba Research Center Ami-Machi Inashiki-Gun Ibaraki-Ken Goto; Kinya C/O Tsukuba Research Center Ami-Machi Inashiki-Gun Ibaraki-Ken Miyoshi; Masato C/O Tsukuba Research Center Ami-Machi Inashiki-Gun Ibaraki-Ken Okada; Makoto C/O Tsukuba Research Center Ami-Machi Inashiki-Gun Ibaraki-Ken Takada
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 1998-12-17
Anticipated expiration: 2012-10-31
Also published as: ES2120427T3; US5366859A; EP0540021B1; EP0540021A1; DE69226148D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Radio- Immuntestverfahren.

Diskussion des Standes der Technik

In herkömmlichen "Sandwich"-Immuntests wird im allgemeinen eine Reaktion zwischen einem Antigen und einem ereten Antikörper, der auf einem unlöslichen Feststoff immobilisiert ist, angewandt, und dann wird ein zweiter, mit einem Radioisotop oder Enzym markierter Antikörper mit dem Immunkomplex umgesetzt, und letztendlich wird die Radioaktivität oder die enzyrnatische Aktivität gemessen. Unter den Sandwich-Tests, in denen ein zweiter, mit einem Enzym markierter Antikörper verwendet wird, besteht hinsichtlich der Menge des verwendbaren markierten zweiten Antikörpers keine Beschränkung, so daß selbst dann, wenn der zweite Antikörper keine hohe Empfindlichkeit besitzt (d.h. die Dissoziationskonstante zwischen Antikörper und Antigen groß ist), die Gesamtempfindlichkeit des Tests durch Verwendung des zweiten Antikörpers in hoher Konzentration erhöht werden kann. Die Enzymaktivitat ist jedoch schwieriger nachzuweisen als die spezifische Aktivität von Radioisotopen, so daß mit enzymatischen Systemen im allgemeinen keine extrem hohe Empfindlichkeit erreicht werden kann. Daher wurde ein verbessertes Verfahren angewandt, worin viele markierte Enzyme pro Molekül des verwendeten "zweiten Antikörpers", der zur Bindung an ein Antigen verwendet wird, gebunden sind, z.B. das Avidinbiotinkomplex-Verfahren (Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen, Elsevier, 1985). Jedoch, selbst wenn diese Verfahren angewandt werden, kann die Meßempfindlichkeit in Enzymimmunotests nicht die Empfindlichkeit eines radioaktiven Markers erreichen, und es ist schwierig, ein Meßsystem mit hoher Empfindlichkeit zu erhalten (s. JP-OS Nr. 118656/1988).
Andererseits liefern Radioirnmuntests, in denen ein zweiter, mit einem Radioisotop markierter Antikörper verwendet wird, eine hohe Meßempfindlichkeit, da im Vergleich zur Enzymaktivität die Radioaktivität bei einer geringeren Konzentration nachgewiesen werden kann. Die Menge an Radioaktivität, die einem Meßsystem zugeführt werden kann, ist jedoch beschränkt, so daß die Konzentration des zweiten Antikörpers auf relativ niedrige Werte beschränkt ist. Wenn darüber hinaus der einzige zur Verfügung stehende zweite Antikörper inhärent eine niedrige Empfindlichkeit besitzt, findet keine ausreichende Bindung des zweiten Antikörpers an das Antigen statt, wodurch die Gesamtempfindlichkeit des Meßsystems nicht ausreichend durch ledigliche Anhebung der Konzentration des zweiten Antikörpers verbessert werden kann.
Genauer dargestellt ist die Situation so, daß das Verhältnis des an einen zweiten Antikörper gebundenen Antigens zur Menge des nicht an einen zweiten Antikörper gebundenen Antigens ([AGAB2J/[AgJ) in einer Reaktionsmischung durch die Konzentration des zweiten Antikörpers [Ab2] und die Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antigen (Kd) gemäß der folgenden Formel bestimmt wird.
Das heißt, je höher die Konzentration des zweiten Antikörpers und je kleiner die Dissoziationskonstante ist, desto größer ist die Menge des an das Antigen gebundenen zweiten Antiköpers, wodurch die Meßempfindlichkeit erhöht wird.
Die in einem Meßsystem anwendbare Radioaktivitätdosis ist jedoch beschränkt, so daß die Konzentration des zweiten Antikörpers limitiert ist. Wenn die Dissoziationskonstante des zweiten Antikörpers groß ist, kann ein Meßsystem mit einer ausreichenden Empfindlichkeit nicht erhalten werden (Kodo Obata et al., The Japanese Journal of "Nuclear Medicine", Band 26, Nr. 3 (1989)).
Wie oben beschrieben, wurde es üblicherweise als sehr wichtig angesehen, einen zweiten Antikörper mit hoher Empfindlichkeit zu erhalten, damit ein Immuntestsystem mit hoher Empfindlichkeit erzielt werden kann. Es ist jedoch häufig schwierig, einen Antikörper mit ausreichend hoher Empfindlichkeit zu erhalten, und es wurden zu diesem Zwecke große Anstrengungen unternommen.
Ferner wird in herkömmlichen Techniken der zweite Antikörper direkt markiert. Wenn zwei oder mehr Meßsysteme zur Messung von zwei oder mehr Antigenen hergestellt werden sollen, müssen daher zwei oder mehr sekundäre Antikörper, die die jeweiligen Antigene identifizieren, getrennt voneinander markiert werden. Dieses Erfordernis führt zu einer Kostensteigerung.
US-A-4 034 074 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines quantitativen radiometrischen Immuntests auf eine unbekannte Menge eines bekannten Antigens einer ersten Tierart, das die folgenden Schritte umfaßt:
a. Herstellung eines Antikörpers des Antigens der ersten Tierart in einer zweiten Tierart,
b. Bindung des Antikörpers an einen Reaktionsort,
c. Umsetzung und Verbindung des bekannten Antigens mit dem gebundenen Antikörper,
d. Herstellung eines Antikörpers für das bekannte Antigen in einer dritten Tierart und Umsetzung und Verbindung desselben mit dem gebundenen bekannten Antigen aus c,
e. Herstellung eines gereinigten radioaktiv markierten Antikörpers zu dem Immunoglobulin der dritten Tierart in der zweiten Tierart und Umsetzung und Verbindung desselben mit dem gebundenen Material aus d,
f. Entfernen des nicht umgesetzten Materials von dem Reaktionsort, und
g. Messung der Radioaktivität des gebundenen Materials, wodurch die Menge des bekannten Antigens bestimmt wird.
Diese Literaturstelle offenbart nicht die Einstellung der Konzentration des in Schritt d verwendeten Antikörpers in einer solchen Weise, daß es mehr als 1,0 und bis zu 10mal der Dissoziationskonstante zwischen diesem Antikörper und dem Antigen entspricht.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wurde mit dem Ziel gemacht, einen Radioimmuntest zur Messung von Parathyroidhormon-verwandtem Protein auf Basis eines vollständig neuen Konzeptes bereitzustellen, worin eine hohe Konzentration des zweiten Antikörpers unabhängig von der Menge der Radioaktivität verwendet werden kann. Das Verfahren stellt einen Immuntest mit hoher Empfindlichkeit bereit, selbst wenn der zweite Antikörper eine niedrige Empfindlichkeit besitzt.
Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Messung von Parathyroidhormon-verwandtem Protein, das die folgenden Schritte umfaßt:
(i) Umsetzung von:
(a) einem ersten Antikörper (A), der für ein Parathyroidhormon-verwandetes Protein (B) spezifisch ist, und auf einem unlöslichen Feststoff immobilisiert ist;
(b) einem Parathyroidhormon-verwandtem Protein (B); und
(c) einem zweiten Antikörper (C), der aus einer anderen Tierspezies abgeleitet ist als der Antikörper (A) und dessen Konzentration mehr als 1,0- und bis zu 10-mal der Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper (C) und dem Parathyroidhormon-verwandten Protein (B) entspricht,
wodurch ein Immunkomplex (D) erhalten wird;
(ii) Umsetzung des Immunkomplexes (D) mit einer radiomarkierten Sonde (E), die für den zweiten Antikörper (c) spezifisch ist; und
(iii)Messung der Radioaktivität des unlöslichen Feststoffes oder der in Schritt (ii) erhaltenen Reaktionsmischung und Bestimmung der Menge des Parathyroidhormon-verwandten Proteins (B).

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine Scatchard-Auftragung eines Anti- Parathyroidhormon-verwandtem Protein (PTHRP) -Antikörpers, der in Beispiel 1 (d) erhalten wurde.
Fig. 2 ist eine Eichkurve der in Beispiel 1 erhaltenen PTHrP-Messung.
Fig. 3 ist eine Eichkurve der in Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen PTHrP-Messung.
Fig. 4 ist eine Eichkurve der in Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen PTHrP-Messung.

DETAILLIERTEN BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜRUNGSFOREEN

Das Antigen (B) in der vorliegenden Erfindung ist Parathyroidhormon-verwandtes Protein (PTHrP).
Der erfindungsgemäß bereitgestellte Test mußte sehr empfindlich sein, da die Konzentration an PTHrP in einer Probe, wie beispielsweise Blut, sehr gering ist, und wenn, wie beispielsweise im Test vom Sandwich-Typ, das Antigen einen Antikörper mit hoher Empfindlichkeit für einen Ort oder alle Orte von zwei oder mehr antigen-bestimmenden Orten auf dem Molekül erfordert, ist der erfindungsgemäße Test besonders wirksam.
Der erfindungsgemäß bereitgestellte Test ist ferner vorteilhaft, weil es schwierig ist, für einen herkömmlichen Test einen PTHRP-Antikörper mit ausreichend hoher Empfindlichkeit zu erhalten.
Als erster Antikörper (A) seien polyklonale Antikörper genannt, die durch Inokulierung des Antigens (PTHrP) in einem Wirbeltier wie beispielsweise einem Hasen, einer Ziege, einem Schaf oder Hamster gemäß herkömmlichen Verfahren erhalten werden, oder monoklonale Antikörper, die aus Hybridomazellen erhalten werden, die aus Zellfusionen zwischen Zellen, die den benötigten Antikörper erzeugen, und Myeloma-Zellinien erhalten werden, gemäß dem Verfahren, wie es in G. Köhler und C. Milstein, Nature 256, 495 (1975) beschrieben ist. Die bevorzugten Fusionspartner werden aus Mäusen erhalten. Die Myelomazellen werden vorzugsweise von derselben Art und demselben Stamm wie die Antikörper erzeugenden Zellen gewonnen. Diese Antikörper werden nach Reinigung durch Ammoniumsulfatfraktionierung, DEAE-cellulose-chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie vor der Anwendung verwendet (Antibodies A Laboratory Manual by Ed Harlow und David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 283 (1988)). Der unlösliche Feststoff kann ein anorganischer Träger wie beispielsweise Glas (z.B. poröses Glas und mattiertes Glas), ein siliciumhaltiger Träger wie beispielsweise Silicagel und Bentonit, oder ein magnetisches Material sein. Geeignete organische Träger schließen Kunststoffe, Polymergel (z.B. Polysaccharide wie Dextran und Agarose oder Polyacrylamidgel) und Filter ein. Von diesen sind Glas (z.B. Glaskügelchen und Glasteströhrchen) und Kunststoffe (z.B. Kunststoffkügelchen, Kunststoffröhren und Kunststoffschalen) bevorzugt, da der Antikörper einfach, leicht und stabil gebunden werden kann und deren Handhabung einfach ist.
Verfahren zur Bindung des ersten Antikörpers an den unlöslichen Feststoff schließen ein Verfahren der chemischen Verbindung von Glas mit einem Antikörper ein, beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung eines Silankupplungsmittels und, bei Bedarf, eines Vernetzungsmittels (JP-OS 108696/1979), sowie ein Verfahren der physikalischen Adsorption (USP 4,280,992 und 3,682,761), ein Verfahren der physikalischen Adsorption eines Antikörpers an Kunststoff (Antibodies A Laboratory Manual von Ed Harlow und David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 605, (1988)), oder ein Verfahren der Umsetzung von auf einem Feststoff immobilisierten Avidin mit chemisch an einen Antikörper gebundenem Biotin, wodurch eine effiziente Immobilisierung bewirkt wird.
Als zweiter Antikörper (C) sind polyklonale Antikörper zu nennen, die von Tierarten erhalten werden, die das Antigen (B) identifizieren, und die von dem ersten Antikörper verschieden sind. Wenn beispielsweise der erste Antikörper aus Hasen erhalten wird, kann der zweite Antikörper aus Ziegen, Schafen, Hamstern usw. erhalten werden, und wenn der erste Antikörper aus Schafen erhalten wird, kann der zweite Antikörper aus Hasen, Ziegen, Hamstern usw. erhalten werden. Wenn der erste Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, kann ein für das gleiche Antigen spezifischer polyklonaler Antikörper als zweiter Antikörper verwendet werden. Der zweite Antikörper kann ein Antiserum, eine Hybridoma- Kulturlösung, Ascites und durch deren Reinigung erhaltene Immunoglobuline einschließen. Wenn Avidin oder Streptavidin als Sonde verwendet wird, wird der zweite Antikörper nach bekannten Verfahren gereinigt, und anschließend wird Biotin chemisch daran gebunden.
Nach dem erfindungsgemäßen Test kann die Meßempfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren wirksam verbessert werden, insbesondere wenn die Empfindlichkeit des zweiten Antikörpers niedrig ist, nämlich wenn die Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antigen groß ist. Wenn die Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antigen 10&supmin;&sup6; bis 9 × 10&supmin;¹² mol/l, vorzugsweise 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;¹¹ mol/l, beträgt, kann die Meßempfindlichkeit im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren besonders verbessert werden. Die Dissoziationskonstante ist jedoch nicht auf den obigen Wert beschränkt und kann in Abhängigkeit von der Konzentration des zu messenden Antigens variieren.
Die Konzentration des zweiten Antikörpers (Konzentration als Immunoglobulin) wird hauptsächlich durch die Dissoziationskonstante (Kd) der Reaktion zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antigen bestimmt und beträgt 1 bis 10 Kd.
Wenn Kd beispielsweise 10&supmin;&sup9; mol/l ist, ist die Konzentration des zweiten Antikörpers mehr als 1 × 10&supmin;&sup9; bis 1 × 10&supmin;&sup8; mol/l.
Die Dissoziationskonstante kann hier leicht nach einem allgemeinen Verfahren bestimmt werden (z.B. nach dem Scatchard-Plot-Analyseverfahren, wie es in P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" (1985) Elsevier Science Publishers beschrieben ist). Das heißt, die Dissoziationskonstante (Kd) wird durch die Konzentration eines Komplexes [Abag] zwischen einem Antikörper und einem Antigen, die Konzentration des Antigens [Ag], das nicht an den Antikörper gebunden ist, und die Konzentration des Antikörpers [Ab], das von dem Antigen frei ist, gemäß der folgenden Formel bestimmt.
Wenn (Ag] durch F, [AbAg] durch B und die Gesamtkonzentration des Antikörpers in der Reaktionsmischung durch [Ab]TOTAL repräsentiert wird; dann ist [Ab] = [AB]TOTAL - B, und die obige Formel kann wie folgt umformuliert werden.
In der obigen Formel kann das Verhältnis Gebunden/Gesamt (B/T) eines an einen Antikörper gebundenen Antigens zum gesamten Antigen und das Verhältnis B/F mittels eines Markierungsexperimentes gemessen werden. Ferner kann B aus der zu der Reaktionsmischung zugegebenen Gesamtmenge an Antigen und B/T berechnet werden. B und B/F können durch Veränderung der zu der Reaktionsmischung zugegebenen Menge an Antigen gemessen werden. Wenn die Ergebnisse in einem Graphen aufgetragen werden, der B als Abzisse und B/F als Ordinate aufweist, ergibt sich die Dissoziationskonstante als der Kehrwert der Steigung der Näherungsgerade.
Der Immunkomplex (D) kann durch gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Umsetzung des ersten Antikörpers (A), des Antigens (B) und des zweiten Antikörpers (C) in den obigen Konzentrationen erhalten werden. Beispielsweise kann der Immunkomplex durch gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Inkubierung einer Mischung einer Pufferlösung erhalten werden, die einen unlöslichen Feststoff enthält, an den der erste Antikörper gebunden ist, oder einen unlöslichen Feststoff, auf dem Avidin immobilisiert und der erste Antikörper biotinyliert ist, sowie einer zu untersuchenden, das Antigen enthaltenden Probe und einer den zweiten Antikörper enthaltenen Pufferlösung. Nach der Inkubierung wird die Reaktionsmischung von dem unlöslichen Feststoff entfernt. Anschließend wird eine Waschlösung wie beispielsweise destilliertes Wasser, Kochsalzlösung, eine phosphatgepufferte Lösung oder eine verdünnte Tensidlösung zugegeben, und der Vorgang des Waschens des unlöslichen Feststoffes wird mehrere Male wiederholt (z.B. ein- bis dreimal), wodurch der Immunkomplex von jeglichem nicht umgesetzten Produkt abgetrennt wird.
Die radiomarkierte Sonde (E) kann erhalten werden durch Markierung einer Sonde, die spezifisch mit dem zweiten Antikörper reagiert. Als eine solche Sonde ist ein Antikörper zu nennen, der Immunoglobulin, das aus der gleichen Tierart erhalten wurde wie der zweite Antikörper, identifiziert, z.B. - wenn der zweite Antikörper aus Hasen erhalten wird - ein Anti-Hasen-Immunoglobulin-Ziegen-Antikörper. Wenn Biotin an den zweiten Antikörper gebunden ist, können ferner Avidin oder Streptavidin als Sonde verwendet werden. Die Sonde wird unter Verwendung eines Radioisotops, z.B. ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³H und ¹&sup4;C markiert, vorzugsweise mit ¹²&sup5;I, das eine lange Halbwertzeit und eine hohe spezifische Aktivität besitzt und daher leicht gemessen werden kann. Verfahren zur Markierung von Verbindungen mit Radioisotopen sind in W.H. Hunter und F.C. Greenwood, Nature 194, 495 (1962) beschrieben.
Der Immunkomplex (D) und die radiomarkierte Sonde (E) reagieren während der Inkubierung des Immunkomplexes und einer Pufferlösung, die die markierte Sonde enthält. Die Inkubation kann unter herkömmlichen Bedingungen durchgeführt werden, z.B. bei 2 bis 50ºC, vorzugsweise 20 bis 30ºC, für 5 Minuten bis 2 Tage, vorzugsweise 5 Stunden bis ein Tag. Nach der Inkubierung wird das Reaktionsprodukt aus dem Immunkomplex und der radiomarkierten Sonde mit einer Waschlösung gewaschen, und die Radioaktivitat wird mit einem Quellentyp-Szintillations-Gammazähler (z.B. ARC-1000, Warenzeichen, hergestellt von Aloka Co.) gemessen.
Die Konzentration des Antigens in einer Testprobe kann durch Vergleich der beobachteten Radioaktivität der Probe mit der Radioaktivität einer Eichkurve, die mit einem Antigen bekanntem Konzentration hergestellt wurde, gemessen werden.

BEISPIELE

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung detailliert unter Bezugnahme auf ein Beispiel und Vergleichsbeispiele beschrieben, die nicht als beschränkend anzusehen sind.

Beispiel 1

Messung von Parathyroidhormon-verwandtem Protein (PTHRP)

(a) Herstellung einer PTHRP-Standardlösung Gemäß dem in Bjorn Nilsson, Lars Abrahamsen, "Method in Enzymology", 185 (1990) 144, beschriebenen Verfahren wurden PTHRP-Gene (cDNA) (Arthur E. Broadus et al., Proceedings of National Academy of Science, USA, 85 597 (1988)), die von der Yale-University (USA) erhalten wurden, in einen Protein A- verschmolzenen Protein-ausstoßenden Vektor pRIT2T (Warenzeichen, hergestellt von Farmacia Co.) integriert und in Escherichia coli (Stamm N4830-1, hergestellt von Farmacia Co.) eingeführt. Nach Aufzucht von Escherichia coli wurde ein verschmolzenes Protein aus PTHrP und Protein A hergestellt, das verschmolzene Protein wurde extrahiert und PTHrP und Protein A wurden chemisch durch Behandlung mit BrCN gespalten, wodurch rohes PTHrP erhalten wurde. Das rohe PTHrP wurde durch Affinitäts-Chromatographie, lonenaustasch- Chromatographie und Gelfiltration gereinigt. Nach Hydrolysierung des erhaltenen PTHrP wurde die Konzentration durch ein Aminosäure-Analyseverfahren quantifiziert, und dann wurde PTHrP in einer solchen Weise hergestellt, daß es eine Konzentration von 0,32 bis 1.000 pmol/l aufwies, wobei eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet wurde, die 5 % Rinderserumalbumin, 0,8 % Rinder-γ-Globulin und 0,05 % Polyoxyethylen(20) sorbitanmonolaurat enthielt.
(b) Herstellung von Anti-PTHRP monoklonalem Antikörper (erster Antikörper) -bindenden Kunststoffkügelchen
Aus Spleen-Zellen, die aus Mäusen (Balb/c) erhalten wurden, die mit PTHRP (1-34) (hergestellt von Peninsula Co.), das mit Thyroglobulin und Maus-Myelomazellen konjugiert war, erhalten wurden, wurde ein monoklonales Hybridom nach dem Verfahren erhalten, wie es in "Monoklonal Antibody Experiment Manual" (1987), Herausgeber Sakuji Tomiyama und Tamie Ando, veröffentlicht von Kodansha, beschrieben ist. Anschließend wurde das resultierende monoklonale Hybridom in Mäuse transplantiert, und die erhaltenen Ascites wurden unter Herstellung von monoklonalem Anti-PTHrP-Immunoglobulin gereinigt. Das monoklonale Anti-PTHrP-Immunoglobulin wurde nach dem in der obigen Literaturstelle "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" auf Kunststoffkügelchen beschichtet.
(c) Herstellung von polyklonalem Anti-PTHRP-Antikörper (zweiter Antikörper)
Nachdem PTHrP (50-83), das mit einem automatischen Festphasenpeptid-Synthesegerät von Applied Biosystems Co. synthetisiert wurde, an Thyroglobulin gebunden wurde, wurden Hasen damit immunisiert, wodurch Anti-PTHrP-Antiserum erhalten wurde. Dieses Antiserum wurde durch Affinitäts- Chromatographie gereinigt, wodurch ein polyklonaler Anti- PTHrP-Antikörper mit hoher Spezifität erhalten wurde. Der resultierende Antikörper wurde als zweiter Antikörper verwendet.
(d) Messung der Dissoziationskonstante zwischen polyklonalem Anti-PTHRP-Antikörper (zweiter Antikörper) und PTHrP (1-87) (Antigen)
(i) Herstellung von ¹²&sup5;I-PTHrP (1-87)
Das obige PTHRP (1-87) wurde mit 1251 gemäß dem in J.I. Thorell und B.G. Johansson, Biochem. Biophs. Acta 251, 263 (1971) beschriebenen Verfahren markiert, durch Umkehrphasen- HPLC gereinigt und dann so zubereitet, daß es eine Konzentration von 400 Bq/0,1 ml aufwies, wobei eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet wurde, die 2 % Rinderserumalbumin enthielt.
(ii) Herstellung eines B/F-Trennmittels
Es wurde eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung hergestellt, die Anti-Hasen-Immunoglobulin-Ziegenserum (in 256-facher Verdünnung) (hergestellt von Immunobiological Laboratories, Japan), normales Hasenserum (in 1024-facher Verdünnung) (hergestellt von Immunobiological Laboratories, Japan) und 12,5 % Polyethylenglykol enthielt, und als B/F-Trennmittel verwendet.
(iii) Messung der Dissoziationskonstante
Zu 0,1 ml einer Lösung des obigen zweiten Antikörpers (polyklonales Anti-PTHrP-Immunoglobulin) wurden 0,1 ml der Standard-PTHrP-Lösung und 0,1 ml der ¹²&sup5;I-PTHrP (1-87)-Lösung hinzugegeben, und die Mischung wurde bei 4ºC für 48 Stunden inkubiert. Dann wurden 0,5 ml des B/F-Trennmittels hinzugegeben, und der überstand durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Radioaktivität des Niederschlags wurde mittels eines quellenformigen Szintillations-Gammazählers ARC-1000 (Warenzeichen, hergestellt von Aloka Co.) gemessen. Nach diesem in der obigen Literatur "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", beschriebenen Verfahren wurde zur Bestimmung der Bindungskonstante eine Scatchard-Analyse durchgeführt. Deren Kehrwert wurde als Dissoziationskonstante angenommen.
Fig. 1 ist eine Scatchard-Auftragung von Beispiel 1. Ferner ist die in Beispiel 1 bestimmte Dissoziationskonstante unten angegeben.
Dissoziationskonstante: 0,3 nmol/l
(e) Herstellung einer Lösung des zweiten Antikörpers Aus der oben erhaltenen Dissoziationskonstante wurde bestimmt, daß der zweite Antikörper in einer Konzentration von 1,5 nmol/l verwendet werden sollte. Der zweite Antikörper wurde unter Verdünnung mit einer phoshatgepufferten Kochsalzlösung, die 2 % Rinderserumalbumin enthielt, in einer solchen Weise verwendet, daß die Endkonzentration in der Reaktionsmischung 1,5 nmol/l betrug.
(f) Herstellung von ¹²&sup5;I-markiertem Anti-Hasen- Immunoglobulin-Antikörper
Nach dem in W.H. Hunter und F.C. Greenwood, Nature 194, 495 (1962) beschriebenen Verfahren wurden 0,25 bis 40 ug eines Anti-Hasen-Immunoglobulin-Ziegen-Antikörpers (hergestellt von Dako Co.) mit 18,5 MBq ¹²&sup5;I markiert, und der markierte Antikörper wurde durch Gelf utration gereinigt und so zubereitet, daß er eine Konzentration von 4 KBq/0,3 ml aufwies, wobei eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet wurde, die 4 % Rinderserumalbumin und 0,55 % Rinder-γ-Globulin enthielt.
(g) PTHrP-Messsung
(i) Erstellung einer Eichkurve
Ein Teströhrchen wurde mit 0,2 ml der Standard-PTHrP-Lösung (0,32 bis 1.000 pmol/l) gefüllt, und dann wurden 0,1 ml der zweiten Antikörperlösung und ein Kunststoffkügelchen, an das der monoklonale Anti-PTHrP-Antikörper (erster Antikörper) gebunden war, hinzugefügt. Nach 20-stündiger Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung entfernt und das Kügelchen mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden 0,3 ml einer Lösung des mit ¹²&sup5;I markierten Anti-Hasen-Immunoglobulin-Ziegen-Antikörpers hinzugegeben. Nach 20-stündiger Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung entfernt und das Kügelchen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Radioaktivität des Kügelchens wurde mittels eines Quellentyp- Szintallations-Gammazählers ARC-1000 (Warenzeichen, hergestellt von Aloka Co.) gemessen.
Fig. 2 zeigt die Eichkurve aus Beispiel 1. Die Meßempf indlichkeit, der Meßbereich und die Meßgenauigkeit (Variationskoeffizient) bei einer PTHRP-Konzentration von 8 pmol/l oder 200 pmol/l sind unten angegeben.
Meßempfindlichkeit: 0,3 pmol/l
Meßbereich 0,3 bis 1.000 pmol/l
Meßgenauigkeit: 13 % (8 pmol/l) 3 % (200 pmol/l)
(ii) PTHRP-Messung in einer Probe aus humoraler
Hypercalcemia aus einem malignen Patienten
PTHRP wurde nach dem gleichen Meßverfahren gemessen, wie es oben beschrieben ist, mit dem Unterschied, daß das Serum aus einer humoralen Hypercalcemia aus einem malignen Patienten anstelle des Standard-PTHRP als zu untersuchende Testprobe verwendet wurde. Die PTHRP-Konzentration in der Testprobe wurde durch Vergleichen der oben hergestellten Eichkurve mit der Radioaktivität der Testprobe bestimmt. Die PTHRP- Konzentration in der getesteten Probe ist unten angegeben.
Gefundener Wert der Patientenprobe: 5,8 pmol/l und 6,0 pmol/l

Vergleichsbeispiel 1

Messung von PTHrP (1-87) wenn die Konzentration des zweiten Antikörpers niedriger ist als die Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antigen.
(a) Die PTHrP-Standardlösung wurde wie in Beispiel 1(a) hergestellt.
(b) Die monoklonale Anti-PTHrP-Antikörper (erster Antikörper) bindenden Kunststoffkügelchen wurden gemäß Beispiel 1(b) hergestellt.
(c) Polyklonale Anti-PTHrP-Antikörper (zweiter Antikörper) wurde gemäß Beispiel 1 (c) hergestellt.
(d) Die zweite Antikörperlösung wurde gemäß Beispiel 1 (e) hergestellt.
Der zweite Antikörper wurde durch Verdünnung in einer solchen Weise verwendet, daß dessen Endkonzentration in der Reaktionsmischung 0,0015 nmol/l betrug.
(e) ¹²&sup5;I markierter Anti-Hasen-Immunoglobulin- Antikörper wurde gemäß Beispiel 1(f) hergestellt.
(f) PTHrP wurde gemäß Beispiel 1 (g) gemessen.
Fig. 3 zeigt die Eichkurve aus Vergleichsbeispiel 1. Die Meßempfindlichkeit, der Meßbereich und die Meßgenauigkeit (Variationskoeffizient) bei einer PTHrP-Konzentration von 40 pmol/l oder 200 pmol/l sind unten angegeben.
Meßempfindlichkeit: 20 pmol/l
Meßbereich 20 bis 1.000 pmol/l
Meßgenauigkeit: 3,7 % (40 pmol/l)
2,8 % (200 pmol/l)

Vergleichsbeispiel 2

Messung von PTHrP (1-87) gemäß einem herkömmlichen Sandwich- Testverfahren, d.h. worin der zweite Antikörper eine radioaktive Markierung enthält.
(a) Die PTHrP-Standardlösung wurde wie in Beispiel 1(a) hergestellt.
(b) Die monoklonalen Anti-PTHrP-Antikörper (erster Antikörper) bindenden Kunststoffkügelchen wurden gemäß Beispiel 1(b) hergestellt.
(c) Polyklonale Anti-PTHrP-Antikörper (zweiter Antikörper) wurde gemäß Beispiel 1 (c) hergestellt.
(d) ¹²&sup5;I markierte polyklonale Anti-PTHrP polyklonaler Antikörper (markierter zweiter Antikörper).
Der polyklonale Anti-PTHrP-Antikörper (zweiter Antikörper) wurde gemäß Beispiel 1(f) markiert und gereinigt und so hergestellt, daß er eine Konzentration von 4 KBq/0,1 ml aufwies, wobei eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet wurde, die 2 % Rinderserumalbumin enthielt.
(e) PTHrP-Messung
Ein Teströhrchen wurde mit der Standard-PTHrP-Lösung (0,32 bis 200 pmol/l) oder 0,2 ml der zu untersuchenden Serumprobe eines humoralen Hypercalcemia-Patienten gefüllt, und dann wurden 0,1 ml der ¹²&sup5;I-markierten polyklonalen Anti- PTHrP-Antikörperlösung und ein Kunststoffkügelchen, an das der monoklonale Anti-PTHrP-Antikörper gebunden war, hinzugegeben. Nach 20-stündigem Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung entfernt und das Kügelchen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Radioaktivität des Kügelchens wurde mittels eines γ-Zählers gemessen.
Fig. 4 zeigt die Eichkurve aus Vergleichsbeispiel 2. Die Messempfindlichkeit, der Meßbereich, die Meßgenauigkeit (Variationskoeffizient) bei einer PTHrP-Konzentration von 40 pmol/l oder 200 pmol/l und die gefundenen Werte der Patientenprobe sind unten angegeben.
Meßempf indlichkeit: 20 pmol/l
Meßbereich: 20 bis 200 pmol/l
Meßgenauigkeit: 2,4 % (40 pmol/l)
3,4 % (200 pmol/l)
Gefundene Werte der Patientenprobe: Alle Werte lagen unterhalb der Meßempfindlichkeit.

Claims

1. Verfahren zur Messung von Parathyroidhormon-verwandtem Protein, das folgende Schritte umfaßt:

(i) Umsetzung von:

(a) einem ersten Antikörper (A), der für ein Parathyroidhormon-verwandetes Protein (B) spezifisch ist, und auf einem unlöslichen Feststoff immobilisiert ist;

(b) einem Parathyroidhormon-verwandtem Protein (B); und

(c) einem zweiten Antikörper (C), der aus einer anderen Tierspezies abgeleitet ist als der Antikörper (A) und dessen Konzentration mehr als 1,0- und bis zu 10-mal der Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper (C) und dem Parathyroidhormon-verwandten Protein (B) entspricht,

wodurch ein Immunkomplex (D) erhalten wird:

(ii) Umsetzung des Immunkomplexes (D) mit einer radiomarkierten Sonde (E), die für den zweiten Antikörper (C) spezifisch ist; und

(iii)Messung der Radioaktivität des unlöslichen Feststoffes oder der in Schritt (ii) erhaltenen Reaktionsmischung und Bestimmung der Menge des Parathyroidhormon-verwandten Proteins (B).

2. Testverfahren gemäß Anspruch 1, worin der erste Antikz"rper (A) eine polyklonaler Antikörper ist.

3. Testverfahren gemäß Anspruch 1, worin der erste Antikörper (A) ein monoklonaler Antikörper ist.

4. Testverfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der unlösliche Feststoff Glas, Kieselgel, Bentonit, ein magnetisches Material, ein Kunststoff, ein Polymergel oder ein Filter ist.

5. Testverfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der zweite Antikörper (C) ein polyklonaler Antikörper ist.

6. Testverfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der erste Antikörper (A) auf dem unlöslichen Feststoff ein biotylierter erster Antikörper ist, der auf einem festphasengebundenem Avidin immobilisiert ist.

7. Testverfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Sonde (E) ein Antikörper ist, der Immunoglobulin identifiziert, das von der gleichen Tierspezies abgeleitet ist wie der zweite Antikörper (C).

8. Testverfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Anspruche, worin der zweite Antikörper (C) an Biotin gebunden ist.

9. Testverfahren gemäß Anspruch 8, worin die Sonde (E) Avidin oder Streptavidin ist.

10. Testverfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Dissoziationskonstante zwischen dem zweiten Antikörper und dem Parathyrodidhormonverwandten Protein (B) im Bereich von 10&supmin;&sup6; bis 9 × 10&supmin;¹² mol/l liegt.