DE69409643T2

DE69409643T2 - Verfahren, agenzien und kits zum nachweis von phosphororganischen verbindungen

Info

Publication number: DE69409643T2
Application number: DE69409643T
Authority: DE
Inventors: John Nicholas Slough Berkshire Sl3 7Hj Banks; Mohamed Qasim Slough Berkshire Sl3 7Hj Chaudhry; Wendy Alison Slough Berkshire Sl3 7Hj Matthews
Original assignee: Minister of Agriculture Fisheries and Food UK
Current assignee: Minister of Agriculture Fisheries and Food UK
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1998-08-06
Anticipated expiration: 2014-05-19
Also published as: ES2114686T3; JPH08510231A; GB9522508D0; GB2293384B; ATE165165T1; DK0699305T3; EP0699305B1; GR3026668T3; GB9310238D0; AU6656694A; US6133049A; GB2293384A; WO1994027149A1; DE69409643D1; US5830770A; EP0699305A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue allgemeine Antikörper, die für phosphororganische Gruppen spezifisch sind, und zwar insbesondere für eine Klasse allgemein verwendeter phosphororganischer Pesticide. Ferner werden Hapten-Verbindungen und Verfahren zu deren Verwendung zur Fiervorrufung dieser Antikörper, diese enthaltende Testkits und Verfahren zu ihrer Anwendung bereitgestellt.
Zum Nachweis verschiedener biologisch wichtiger Verbindungen ist eine Reihe von Immunoassays verfügbar. Diese Verbindungen umfassen die wichtige Klasse phosphororganischer (OP) Pesticide (vgl. z.B. WO 91/00294). Diese Immunoassays sind zwar verhältnismäßig empfindlich, aber gegen einzelne OP-Moleküle gerichtet, so daß mehrere getrennte Assays zur effektiven Durchmusterung eines Materials auf das Vorliegen von OPs erforderlich sind.
Eine Gruppe dieser phosphororganischen Pesticide, die üblicherweise zum Schutz von Nahrungsmitteln, z.B. Getreide, verwendet werden, umfaßt die Verbindungen Methacrifos, Pirimphosmethyl, Fenitrothion, Etrimfos, Propetamphos, Chlorpyrifosmethyl und Dichlorvos, und das Durchmustern eines Materials auf das Vorliegen einer beliebigen dieser potentiell toxischen Verbindungen macht gewöhnlich die Verwendung von sieben getrennten Agenzien erforderlich. Diese Verbindungen haben zwar einige gemeinsame chemische Merkmale, beispielsweise die OP-Gruppe selber, aber andere üblicherweise verwendete Pesticide unterscheiden sich durch variierende OP-Gruppen. In Malathion ist beispielsweise eine Gruppe (CH&sub3;O)&sub2;P(S)-S- vorhanden, während in den oben angegebenen Verbindungen die Gruppe (CH&sub3;O)&sub2;P(S)-O- vorhanden ist.
Die Erfinder geben nun eine neue Strategie zur Hervorrufung von Antikörpern an, so daß diese spezifisch zur Bindung an zwei oder mehrere dieser spezifizierten pesticiden phosphororganischen Verbindungen ausgerichtet sind, und stellen ferner Verfahren zu ihrer Verwendung und sie enthaltende Kits bereit, so daß Materialien mit einem einzigen Antikörperreagens auf das Vorliegen eines Mitglieds einer ausgewählten Gruppe durchmustert werden können. Außerdem stellen sie organische Haptene und ihre Konjugate bereit, die spezifisch zur Hervorrufung dieser Antikörper oder sie enthaltender Antiseren in Form von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden können. Insbesondere werden Antikörper bereitgestellt, die spezifisch an zwei oder mehrere, noch bevorzugter drei oder mehrere und am bevorzugtesten an sämtliche der Verbindungen Methacrifos, Fenitrothion, Etrimfos, Propetamphos, Dichlorvos und gegebenenfalls an eine oder mehrere der Verbindungen Malathion, Dimethoat, Chlorfenvinphos, Chlorpyrifosmethyl, Tetrachlorvinphos und Pirimiphos-methyl binden können, wobei die relative Bindungsaffinität für jede dieser gebundenen Verbindungen derart ist, daß ein Antikörperreagens mit einer einzigen Konzentration zu ihrer Bindung verwendet werden kann. Vorzugsweise sind die gebundenen OPs dazu in der Lage, bei einer Konzentration von 100 ug/ml prozentual das gebundene Hapten von dem Antikörper zu verdrängen, und zwar jeweils mit einem Faktor von 20, noch bevorzugter 5 und am bevorzugtesten 2. Ferner werden Haptene und Hapten-Protein-Konjugate bereitgestellt, welche die Bildung von derartigen Antikörpern hervorrufen, wenn sie Tieren verabreicht werden.
Das Konzept, das ein allgemeiner Antikörper oder ein allgemeines Antiserum gebildet werden kann, um zum Nachweis einer Anzahl von Organophosphaten in der Lage zu sein, ist bereits früher bei einer Gelegenheit von Suedi und Heesham Kiel, Milchwirt. Forsch. 40, 179-202 (1988) in Betracht gezogen worden, allerdings war damit die Verwendung einer Anzahl von Modellpesticidmolekülen zur Bereitstellung einer Anzahl von Protein-Konjugaten verbunden. Darüber hinaus konnten die erhalten Antikörper-Reagenzien nicht zur verläßlichen Durchmusterung verwendet werden.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hapten-Protein-Konjugat bereitgestellt, das die Bildung von Antikörpern mit spezifischer Bindungsaffinität für phosphororganische Pesticid-Verbindungen stimulieren kann.
Die Hapten-Protein-Konjugate der Erfindung haben die Formel (I):
(RO)&sub2;-P(S)-Z-[Y]-B-Protein (I)
worin bedeuten:
R niederes Alkyl,
z O, S oder -NH-,
Y eine Spacergruppe des Formats -(CH&sub2;)n- mit oder ohne Seitenketten, wobei n derart ist, daß sich eine Kohlenstoffkettenlänge von 4 bis 6 ergibt,
B -CO- oder -O-CO- und
"Protein ein zur Verwendung als Protein in einem Hapten-Protein-Konjugat zur Bildung von Antikörpern und Antiseren geeignetes Protein.
Typische und bevorzugte Proteine sind Rinderserumalbumin, Ovalbumin aus Hühnereiern, Schlüssellochnapfschnecken- Hämocyanin und Gemische daraus. Vorzugsweise erfolgt die Bindung an Proteine durch eine ihrer Aminogruppen.
Die Spacergruppe des Konjugats hat das Format-(CH&sub2;)n-B-, wobei n derart ist, daß die Kohlenstoffkettenlänge 4 bis 6 beträgt, und B CO oder O(CO) ist, oder es handelt sich bei dem Spacer um einen Pyridin- oder Pyrimidinring mit einer Gruppe CO oder O(CO). Der Spacer kann gegebenenfalls Seitenketten haben, z.B. wie in Verbindungen wie β-Alanin wie in WO 9100294 offenbart, wobei aber die bevorzugtesten Konjugate der Erfindung eine gerade Kette mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen haben, z.B. ein 1, 4-Butandiol-Spacer, wobei Z O und B -O(CO)- ist, der durch Aktivierung der Endgruppe -OH mit Carbodiimid bereitgestellt wird. Beispiele für geeignete Haptene sind nachstehend angegeben:
(CH&sub3;O)&sub2;-P(S)-O-(CH&sub2;)&sub4;-O-CO-NH-Protein (Butandiol-Spacer)
(CH&sub3;O)&sub2;-P(S)-O-(CH&sub2;)&sub4;-CO-NH-Protein (Butandiol-Spacer)
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung werden Hapten- Verbindungen der Formel (II) zur Herstellung der Verbindungen (I) bereitgestellt:
(RO)&sub2;-P(S)-Z-(Y)-B-(D) (II)
wobei R, Z, B und Y das oben beschriebene bedeuten und D H oder eine Aktivatorgruppe ist. Typische Aktivatorgruppen sind beispielsweise Imidazol-Reste des bei der Aktivierung mit Carbodiimiden zurückgelassenen Typs, wobei aber Halogenatome ebenfalls verwendet werden können, wenn B CO ist, so daß Säurehalogenide gebildet werden, welche die Reaktion zwischen der Verbindung und den Aminogruppen des Proteins aktivieren können.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese der Haptene und Konjugate der Formel (I) und (II) bereit, bei dem ein Dialkylhalogenthiophosphat unter Bildung des Haptens mit einem Vorläufer der Spacergruppe umgesetzt wird. Das sich ergebende Hapten wird dann mit einem Aktivatorrest aktiviert, so daß sich das aktivierte Produkt ergibt, das dann auf übliche Weise mit dem Protein zur Bereitstellung eines Protein-Konjugats der Formel (I) konjugiert wird.
Die Dialkylhalogenthiophosphat/Spacergruppenreaktion wird bequem in einem organischen Lösungsmittel mit einer Base, z.B. Pyridin, und bei niedriger Temperatur, z.B. -5 und 10ºC, vorzugsweise 0 und 5ºC, durchgeführt. Es kann bequem Aceton als Lösungsmittel verwendet werden. Das Reaktionsgemisch wird vorzugsweise geschüttelt oder gerührt, wodurch die Spacergruppe sich in dem Lösungsmittel/Basen-Gemisch löst, worauf das Dialkylhalogenthiophosphat langsam dazugegeben und dann unter Rückfluß erhitzt wird, nämlich vorzugsweise auf etwa 60ºC und während eines Zeitraums von mehreren, am bevorzugtesten aber etwa zwei, Stunden. Die Aktivierung des Haptens wird bequem unter Verwendung eines Carbodiimids, z.B. Carbonyldiimidazol, auf die bekannte Weise durchgeführt, und dieses aktivierte Hapten wird dann mit dem ausgewählten Protein konjugiert.
Die unter Verwendung dieser Konjugate der Erfindung gebildeten Antikörper und Antiseren können mit einem beliebigen der herkömmlicherweise auf dem Fachgebiet unter Verwendung eines beliebigen herkömmlichen Tierspenders angewendeten Verfahren hergestellt werden. Darüber hinaus können die so gebildeten Antikörper polyklonal oder monoklonal sein. Letztere können durch die Hybridom-Technologie, die dem Fachmann gut bekannt ist, hergestellt werden. Die OP- Formeln sind in den Figuren 1 und 2 angegeben.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Testkits bereit, welche die Antikörper oder Antiseren der Erfindung neben speziellen anderen Bestandteilen zur Bestimmung des Vorliegens der phosphororganischen Zielverbindungen in einem Material enthalten. Diese Bestandteile können Kalibrierreagenzien umfassen, die eine bekannte Menge der OP-Zielverbindung enthalten, oder können die Form von auf einem Träger, z.B. Vertiefungen von Mikrotiterplatten oder dgl., immobilisierten Antikörpern haben, wodurch die Absorptionswerte bei einer geeigneten Wellenlänge, z.B. 450 nm, zur Bestimmung des Antikörpertiters leicht bestimmt werden können, oder andere Reagenzien wie spezielle Puffer, Blockiermittel oder Farbentwickler Typische Kit-Formate werden in WO 9100294 diskutiert.
Die Produktion von Antikörpern und sie enthaltenden Antiseren und ihre Verwendung in Assays kann unter Anwendung bekannter Verfahren erfolgen und wird in den Beispielen veranschaulicht. Die Haptene, Konjugate, Antikörper, Antiseren und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden nun lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: Synthese eines allgemeine Antikörper gegen phosphororganische Verbindungen hervorrufenden Hapten- Konjugat-Zwischenprodukts der Formel (II)

10 mmol Pyridin (0,79 g) wurden in 5 ml Aceton gelöst und die Lösung auf Eis gehalten. Dazu wurden 10 mmol 1,4- Butandiol (0,90 g) gegeben, worauf unter konstanten Rühren des gekühlten Gemisches unter Verwendung eines Magnetrührers 10 mmol Dimethylchlorthiophosphat (CH&sub3;O)&sub2;-P(S)Cl (1,61 g) langsam dazugegeben wurden. Die Reaktanten wurden bei 60ºC 2 h unter Rückfluß erhitzt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gelassen (Reaktion A).
Das Endprodukt wurde durch Extraktion des Gemisches aus den Reaktanten mit 3 x 25 ml Diethylether, Waschen mit 3 x 10 ml H&sub2;O und anschließendes Eindampfen auf ein Endvolumen von etwa 2 bis 3 ml gereinigt. Die Bildung von (CH&sub3;O)&sub2;P(S)-O-(CH&sub2;)&sub4;-OH (Mol-Gew. 214) wurde durch TLC angezeigt (Rf = 0,1 in Chloroform:Aceton 70:30) und durch GC/MS bestätigt. Reaktion A Pyridin

Beispiel 2: Aktivierung des Haptens

Die Ether-Lösung des Produkts aus Beispiel 1 wurde mit 10 mmol (1,62 g) Carbonyldiimidazol behandelt, wodurch sich eine Lösung des aktivierten Haptens ergab (NB: Wenn B eine Carboxygruppe ist, kann ein Thionylhalogenid zur Herstellung des entsprechenden Säurehalogenids auf bekannte Weise verwendet werden).

Beispiel 3: Bildung des Protein-Koniugats

3 mmol des aktivierten Haptens von Beispiel 2 in Form von 1 ml der etherischen Lösung wurden sehr langsam - alle 5 min ein Tropfen - unter konstantem Rühren unter Verwendung eines Magnetrührers zu jeder der drei Protein- Lösungen gegeben, die 30 umol BSA oder Ovalbumin bzw. 3 nmol Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4, enthielten. Die Reaktanten wurden langsam 2 h gerührt, über Nacht bei Raumtemperatur und dann 72 h bei 4ºC gelassen (vgl. Reaktion B). Die Protein-Konzentration der Konjugatlösungen wurde unter Anwendung des Coomassie-Blau-Verfahrens von Bradford: Analytical Biochem. (1976), 72:248-254, bestimmt. Das Konjugationsverhältnis wurde nach dem auf den freien Aminogruppen basierenden Verfahren von Habeeb, Analytical Biochem. (1966), 14:328-336 bestimmt und ergab OP:BSA gleich 10 und OP:Ovalbumin gleich 4.
Die Reinigung des Konjugats wurde durch Aufbringen auf Sephadex(PD 10)-Säulen durchgeführt, wobei als Präparationsschritt vor der Aufbringung unlösliche oder schwerlösliche Konjugate gegen destilliertes Wasser dialysiert wurden. Reaktion B Protein

Beispiel 4: Herstellung von polykolonalen Antikörpern gegen das allgemeine Konjugat

Halbhängeohr-Kaninchen "Simone Noir" wurden einzeln gehalten und sich 3 Wochen eingewöhnen gelassen, bevor Vorimmunisierungs-Blutproben entnommen und mit der Immunisierung begonnen wurde. Hapten-Rinderserumalbumin(BSA)-Konjugate wurden zuerst mit gleichen Volumina Freudsches Adjuvans vermischt, so daß die Endkonzentration etwa 1 mg/ml Protein betrug.
Nach der Überprüfung, daß mit den Konjugaten reaktive native Antikörper nicht vorhanden waren, wurden jedem Kaninchen subkutan Injektionen zu 1 ml des allgemeinen BSA- Konjugats aus Beispiel 3 über 4 Stellen verteilt (0,25 ml pro Stelle) in vollständigem Adjuvans verabreicht. Anschließend wurden nach 4, 8 und 12 Wochen Injektionen in inkomplettem Adjuvans verabreicht. Wenn der Antikörpertiter abzufallen begann, wurden die Kaninchen mit einem weiteren ml des Konjugats in inkomplettem Freudschen Adjuvans über vier Stellen verteilt geboostet. In den nachstehend angegebenen Tabellen wurden die Kaninchen R19, 20, 21 mit diesem allgemeinen Konjugat, Verhältnis OP-Hapten:Protein 10:1, der Erfindung immunisiert.
Vor der Immunisierung wurde zur Überprüfung der Antikörper Blut aus der sich am Rand befindlichen Ohrvene entnommen und dann 4 und 14 Wochen nach der Injektion, so daß Antiserumstammlösungen aufgebaut werden konnten. Die Antiseren wurden hergestellt, indem das Blut über Nacht bei 4ºC gerinnen gelassen und dann zum Erhalt eines klaren Fluids zentrifugiert wurde. Daraus könnten die Antikörper isoliert werden, wenn dies erforderlich ist, indem die Ionenaustausch- oder Affinitätssäulenchromatographie mit immobilisierten phosphororganischen Zielgruppen auf herkömmliche Weise angewendet wird.

Beispiel 5: Indirekter enzymgebundener Antikörpereinfang- Immunosorbent-Assay (ELISA) zur Demonstration der Affinität von Antiseren gegen phosphororganische Pesticid-Verbindungen

Zur Durchmusterung der Antiseren auf polyklonale Antikörper gegen das allgemeine Hapten/Konjugat der Erfindung wurde unter Anwendung des folgenden Protokolls ein ELISA angewendet. Mikrotiterplatten (Costar) wurden mit dem geeigneten Hapten-Konjugat mit Ovalbumin beschichtet, indem es in 0,05 M Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,6) zum Erhalt einer optimalen Protein-Konzentration von 1 ug/ml, die vorher durch Schachbrettitration bestimmt worden war, verdünnt wurde. Das Protein wurde mit dem Bradford-Assay bestimmt. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatten wurden 100 ul gegeben, worauf die Platten über Nacht in eine Feuchtkammer gegeben und dann dreimal mit 0,15 phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2, mit 0,05 % Tween 20 [RTM]: PBST gewaschen und dann trockengeblottet wurden. Die Blockierung wurde durchgeführt, indem pro Vertiefung 250 ul 5%iger entrahmter Milch gegeben wurden, und zwar 1 h lang bei 25ºC.
Nach zwei weiteren Waschungen wurden die beschichteten Mikroplatten bei -20ºC aufbewahrt bis sie benötigt wurden, worauf sie einmal mit PBST gewaschen wurden. Die Antiseren wurden in PSBT verdünnt (1/1000 zur allgemeinen Durchmusterung oder verdoppelnde Verdünnungen bis 1/512 000 für Titrationsassays), dreifach in Mengen von 50 ul in die Vertiefungen von Mikrotiterschalen gegeben und in einer Feuchtkammer 1 h bei 25ºC inkubiert (es wurden geeignete positive und negative Kontrollen vorgesehen, nämlich PBST, negatives Kaninchenserum und positives Serum, wenn es gebildet wurde). Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit PBST gewaschen, worauf in jede Vertiefung 200 ul einer 1:1500-Verdünnung eines an Meerrettichperoxidase konjugierten Schweine-Anti-Kaninchen-Immunglobulins (DAKO) gegeben wurden. Die Platten wurden nochmal 1 h bei 25ºC inkubiert und dann dreimal mit PBST gewaschen.
Die Tetramethylbenzidin(TMB)-Enzymsubstratlösung wurde hergestellt, indem 400 ul 6,0 g/l TMB in DMSO zu 24,5 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5, mit 100 ul 1%igem H&sub2;O&sub2; gegeben und 100 ul in die Vertiefungen gegeben wurden. Die Mikroplatten wurden 15 min in der Dunkelheit bei 25ºC inkubiert, worauf die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2,5 M H&sub2;SO&sub4; beendet und die Absorption bei 450 nm gegen Luft abgelesen wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen mit denen von Beispiel 6 angegeben.

Beispiel 6: Assay auf kompetitive Inhibition

Dieser Assay wurde auf die gleiche Weise wie der von Beispiel 5 mit den folgenden Abänderungen durchgeführt. Nach der Beschichtung der Platte wurden die verschiedenen Verdünnungen der Antiseren mit verschiedenen Konzentrationen der Analyt-Lösung 1 bis 2 h bei 25ºC oder über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die untersuchten Antiserumverdünnungen betrugen 1/1000, 1/2000, 1/5000 und 1/10000, und die Konzentrationen des Analyten lagen im Bereich von 200 bis 0,001 ug/ml. Die Beschichtung aus dem allgemeinen Hapten-Ovalbumin betrug 1 ug/ml, wobei später andere Beschichtungsstärken im Bereich von 400 bis 12,5 ng/ml untersucht wurden. Anmerkung: in sämtlichen Fällen wurde die Kreuzreaktivität durch Durchführung eines indirekten ELISA überprüft, indem Platten mit den Blockierungsmitteln oder BSA oder Ovalbumin mit 1 ug/ml beschichtet wurden. Hierfür wurden entrahmte Milch, fötales Kälberserum (beide 5%ig), Casein (0,3%ig) oder Fischhautgelatine (0,5%ig) als Blockierungsmittel ausgewählt. Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität wird bevorzugt der kompetitive Assay angewendet.
Ergebnisse: Die nach 4 und 16 Wochen gesammelten Seren zeigten Reaktivität mit dem Konjugat, und durch Schachbrettitrationen nach 16 Wochen (vgl. Tabelle 1 und 2) ergab sich, daß sämtliche drei Kaninchenseren stark reaktiv waren. Es ergab sich, daß die optimale Beschichtung der Vertiefungen mit dem Konjugat mit etwa 1 ug/ml erreicht wurde, wodurch sich eine hohe Absorption mit den Antiseren und eine geringe Absorption mit den negativen Kontrollen ergab. Es sei darauf hingewiesen, daß es zur Kreuzreaktion mit dem Spacerrest oder dem Protein alleine kommen kann. Es wurde gezeigt, daß mit entrahmter Milch oder Gelatine blockierte Platten diese in einem für einen erfolgreichen ELISA ausreichendem Maße nicht zeigten.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse des ELISAS für die kompetitive Inhibition, aus denen sich ergibt, daß die Beschichtungsmengen zur optimalen Empfindlichkeit weniger als 1 ug/ml betragen sollten, z.B. 400 bis 0,012 ug/ml Konjugat für den Nachweis von 200 bis 0,001 ug/ml Analyt. Tabelle 1 Schachbrettabsorption mit den Werten für nach 16 Wochen gewonnen allgemeinen BSA-Konjugat-Antiseren (1/1000) mit Beschichtungskonzentrationen von 20 bis 0,16 ug/ml OP-Ova Tabelle 2 Absorptionswerte der Durchmusterung nach 16 Wochen gewonnener allgemeiner BSA-Konjugat-Antiseren, wobei im negativen Fall (Absorption < 0,2) verdünnt wurde, bei einer Plattenbeschichtung von 1 ug/ml mit OP-Ova mit 1 ug/ml Tabelle 3 Assay auf kompetitive Inhibition für die Antiseren aus den Kaninchen 19, 20, 21, die mit verschiedenen Konzentrationen der unkonjugierten phosphororganischen Verbindung (OP) 1 h bei 25ºC vorinkubiert worden waren: 1 ug/ml OP-Ova Tabelle 4 Assay auf kompetitive Inhibition für mit OP 2 h bei 25ºC vorinkubierte Antiseren. Platten mit 400 ng/ml OP-Ova beschichtet

Beispiel 7: Modifizierter Assay auf kompetitive Inhibition

Der Assay wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 mit den folgenden Änderungen durchgeführt. Die Antiseren wurden 1:2000 mit 1 % BSA in PBST verdünnt und 100 ul davon 2 h bei 25ºC mit 100 ul jeder Konzentration des unkonjugierten OPS - in diesem Fall des allgemeinen Teils - in einer Mikrotitrationsplatte inkubiert. Die OP-Konzentrationen lagen im Bereich von 200 bis 0,001 ug ml&supmin;¹.
Die Kreuzreaktivität von Antiseren aus den Kaninchen 19, 20 und 21 nach dem Inhibitions-ELISA mit den verschiedenen phosphororganischen Pesticiden ist in Tabelle 5 angegeben, in der die Konzentration (ug ml&supmin;¹) zur 50%igen Inhibition zusammen mit dem Verdünnungsmittel, in dem diese erreicht wird, angegeben ist, nämlich PBST oder % Methanol in PBST im Falle von Zahlen. Tabelle 5 +++ stark ++ mittelstark + schwache Reaktion schlecht - leichte Reaktio n
Die relativen Affinitäten der verschiedenen phosphororganischen Verbindungen für die allgemeinen Konjugat- Antikörper gemäß den Ergebnissen von Beispiel 7 werden nachstehend angegeben, und wurden erhalten, indem die Stärke der Inhibition der Bindung bei einer Konzentration von 0,1 ug/ml phosphororganische Verbindung von der mit 100 ug/ml phospororganischer Verbindung erhaltenen abgezogen wurden. Die Ergebnisse sind in Form der prozentual erhaltenen Inhibition ausgedrückt, die mit dem Hapten einschließlich Spacer als Inhibitor erhalten wurde. Tabelle 6 Relative Inhibition der Bindung von allgemeinen Antikörpern an das Hapten-Konjugat in Form der Inhibition durch Hapten + Spacer in %

Claims

1. Hapten-Protein-Konjugat, das zur Hervorrufung der Bildung von Antikörpern mit spezifischer Bindungsaffinität für phosphororganische Pesticid-Verbindungen in der Lage ist, wobei das Konjugat die Formel (I) hat:

(RO)&sub2;-P(S)-Z-[Y]-B-Protein (I)

in der bedeuten:

R niederes Alkohol,

Z O, S oder -NH-,

Y eine Spacergruppe des Formats -(CH&sub2;)n- mit oder ohne Seitenkette, wobei n derart ist, daß sich eine Kohlenstoffkettenlänge von 4 bis 6 ergibt,

B -CO- oder -O-CO- und

"Protein" ein Protein, das sich zur Verwendung als Protein in einem Hapten-Protein-Konjugat zur Bildung von Antikörpern und Antiseren eignet.

2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Spacergruppe mit einer oder mehreren Seitenketten substituiert ist.

3. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Spacergruppe -(CH&sub2;)&sub4;- und B -O-CO- ist.

4. Konjugat nach Anspruch 1 mit der Formel:

(CH&sub3;O)&sub2;-P(S)-O-(CH&sub2;)&sub4;-O-CO-NH-Protein oder

(CH&sub3;O)&sub2;-P(S)-O-(CH&sub2;)&sub4;-CO-NH-Protein

5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein ausgewählt ist unter: Rinderserumalbumin, Ovalbumin aus Hühnerei und Schlüssellochnapfschnecken- Hämocyanin.

6. Hapten-Verbindung der Formel (II):

(RO)&sub2;-P(S)-Z-(Y)-B-(D) (II)

zur Verwendung zur Herstellung eines Hapten-Protein- Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei:

R, Z, Y und B das in Anspruch 1 angegebene bedeuten und

D H oder eine Aktivatorgruppe ist, welche die Reaktion zwischen der Verbindung und einem Protein verstärken kann.

7. Hapten-Verbindung nach Anspruch 6, wobei die Aktivatorgruppe ein Carbonylimidazol-Rest des durch Aktivierung mit einem Carbodiimid zurückgelassenen Typs ist, wenn B -O-CO- ist und die Aktivatorgruppe ein Halogenatom ist, wenn B CO ist.

8. Hapten-Verbindung nach Anspruch 6 oder 7, wobei Z und Y eine Spacer mit einer Länge von 4 Kohlenstoffatomen mit oder ohne Seitenketten ist.

9. Hapten-Verbindung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei Y der Rest -(CH&sub2;)&sub4;- ist.

10. Verfahren zur Synthese des Haptens nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem ein Dialkylhalogenthiophosphat mit der Spacergruppe zur Bildung eines Haptens umgesetzt wird.

11. Verfahren zur Synthese des Hapten-Protein-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das ein Verfahren nach Anspruch 10 umfaßt, wobei dann das sich ergebende Hapten mit einem Aktivatorrest zur Bereitstellung des aktvierten Produkts aktiviert und das Produkt mit dem Protein umgesetzt wird.

12. Antiseren, oder daraus erhaltene isolierte oder gereinigte Antikörper, die durch Immunisierung eines Tiers mit einem Hapten-Protein-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gegebenenfalls in Gegenwart von inkomplettem oder komplettem Adjuvans, Entnahme von Blut aus dem Tier nach der Induktionsperiode für die Antikörper und Abtrennung des Serums und/oder der Antikörper daraus erhältlich sind.

13. Antikörper nach Anspruch 12, der aus den Antiseren durch Anwendung der Affinitätsbindung mit einer immobilisierten Verbindung der Formel (II) nach Anspruch 6 erhalten wurde.

14. Antikörper nach Anspruch 13, wobei die Affinitätsbindung unter Anwendung der Affinitätssäulenchromatographie durchgeführt wird.

15. Antikörper nach einem der Ansprüche 12 bis 14 mit einer spezifischen Bindungsaffinität für sämtliche der Verbindungen: Methacrifos, Fenitrothion, Propetamphos, Dichlorvos und Dimethoat.

16. Antikörper nach Anspruch 15 mit einer spezifischen Bindungsaffinität für sämtliche der Verbindungen: Methacrifos, Fenitrothion, Propetamphos, Dichlorvos, Dimethoat, Malathion, Chlorfenvinphos und Etrimfos.

17. Antikörper nach Anspruch 15 oder 16, der die Verbindungen mit einer solchen Affinität bindet, daß sie bei einer Konzentration von 100 g/ml innerhalb eines Faktors von jeweils 20 prozentual gebundenes Hapten vom Antikörper verdrängen.

18. Antikörper nach Anspruch 17, wobei die relativen Bindungsaffinitäten derart sind, daß die Prozentsätze innerhalb eines Faktors von 5 liegen.

19. Immunoassay-Testkit, der Antiseren und/oder Antikörper nach einem der Ansprüche 12 bis 18 sowie weitere Antikörper gegen Immunglobuline des Tiers in markierter Form enthält.

20. Immunoassay-Testkit nach Anspruch 19, wobei die markierte Form an Meerrettichperoxidase konjugierte Antikörper umfaßt.

21. Immunosassay-Testkit nach Anspruch 19 oder 20, der außerdem ein Reagens, das eine bekannte Menge der OP- Zielverbindungen enthält oder eine Hapten-Verbindung der Formel (II) nach Anspruch 6 aufweist.

22. Immunoassay-Testkit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die gegen das Protein-Hapten-Konjugat gerichteten Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert sind.

23. Immunoassay-Testkit nach einem der Ansprüche 19 bis 22, der außerdem 0 bis 50 % Methanol enthaltende Puffer, Blockiermittel und/oder Farbentwickler aufweist.

24. Verfahren zur Durchmusterung auf das Vorliegen von Methacrifos, Fenitrothion, Propetamphos, Dichlorvos, Dimethoat, Chlorfenvinphos, Etrimphos, Chlorpyrifos- methyl, Tetrachlorvinphos, Pirimiphos-methyl oder Malathion, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Verbindung an einen Antikörper nach einem der Ansprüche 12 bis 18 festgestellt wird.