DE68926779T2

DE68926779T2 - Zusammensetzung und Methoden zur Bestimmung der Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe, die in Verdacht steht, Amphetamine und/oder Metamphetamine zu enthalten

Info

Publication number: DE68926779T2
Application number: DE68926779T
Authority: DE
Inventors: James V Freeman; Chen-Jung Hsu; Mae Wan-Leng Hu; Cheng-I Lin; Marcel Pirio; Edwin F Ullman
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2009-12-22
Also published as: ATE140082T1; ES2091202T3; US5328828A; EP0375422A3; EP0375422A2; EP0375422B1; JP2902699B2; DE68926779D1; CA1333890C; US5135863A; JPH02231467A

Description

Diese Erfindung betrifft Immunoassay-Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält. Im besonderen umfassen die Immunoassay-Zusammensetzungen dieser Erfindung zur Bestimmung der Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, zwei Konjugate, die funktionell ähnliche Markierungen enthalten, wobei eines an ein Amphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist, und das andere an ein Methamphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist. Diese Immunoassay-Zusammensetzungen enthalten auch einen auf Amphetamin gerichteten, monoklonalen Antikörper und einen auf Methamphetamin gerichteten, monoklonalen Antikörper. Der monoklonale Antikörper weist eine mäßige Kreuzreaktivität mit dem Konjugat auf, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.
Eine große Anzahl von Patenten und Literaturangaben offenbart verschiedene Immunoassay-Verfahren. Die folgende Liste dient nur zur Veranschaulichung einiger dieser Verfahren, die in dieser Erfindung Anwendung finden können. Nachstehend wird eine Liste von U.S.-Patenten und eine allgemeine Angabe des beteiligten Markierungstyps aufgeführt
U.S.-Patent Nrn. 3646346, radioaktive Markierung; 3654090, 3791932 und 3817838, Enzymmarkierungen; 3996345, Fluoreszenz-löschende Markierungen; 4062733, radioaktive Markierung; 4067959, Fluoreszenzfarbstoff- oder Enzym-Markierungen; und 4160645, Markierung mit nicht enzymatischem Katalysator.
Typischerweise verwenden diese Immunoassays einen Antikörper, dessen Struktur den für diesen Antikörper spezifischen Analyten erkennt (eine Bindungsaffinität dafür aufweist). Der Immunoassay wird mit einem signalerzeugenden System durchgeführt, das nach der Bindung des Analyten an den Antikörper eine nachweisbare Änderung des Signals erzeugt. Folglich wird bei der Prüfung auf einen Analyten in einer Probe eine nachweisbare Änderung des Signals bezüglich des mit einer negativen Probe oder einem Kalibrator erzeugten Signals als positives Ergebnis für die Anwesenheit dieses Analyten in der Probe verstanden.
Es tritt jedoch ein Problem auf, wenn solche Verfahren zur Bestimmung von Amphetaminen in einer Probe angewendet werden, von der man vermutet, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält. Das Problem entsteht, weil diese Assays ein einzelnes Antiserum oder einen einzelnen Antikörper verwenden, das (der) sowohl Amphetamin als auch Methamphetamin erkennen kann. Zur Erkennung von sowohl Amphetamin als auch Methamphetamin ist es für diesen Antikörper erforderlich, daß er (a) einen besonderen räumlichen und polaren Aufbau erkennen kann, der Amphetamin und Methamphetamin gemeinsam ist; und (b) die strukturellen Eigenschaften von Amphetamin und Methamphetamin, die unterschiedlich sind, nicht spezifisch erkennt. Da ein solcher Antikörper strukturelle Eigenschaften, die diesen beiden Verbindungen gemeinsam sind, erkennt, jedoch die strukturellen Eigenschaften, die unterschiedlich sind, nicht spezifisch erkennt, kann er beide Verbindungen erkennen, und der Assay erzeugt ein positives Ergebnis für eine Probe, die Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält. Es wurde jedoch gefunden, daß alle Antikörper, die beide Verbindungen erkennen, andere Moleküle als Amphetamin und Methamphetamin erkennen, die einige aber nicht alle der gemeinsamen räumlichen und polaren Eigenschaften von Amphetamin und Methamphetamin teilen. Solche Antikörper können in dem Assay bestimmter Proben falsch-positive Ergebnisse, d. h. ein positives Ergebnis für Amphetamine in Abwesenheit von Amphetamin und Methamphetamin, hervorrufen. Tatsächlich sind handelsübliche Immunoassays für Amphetamine, die einen einzelnen Antikörper verwenden, entweder nur auf Amphetamin oder Methamphetamin empfindlich oder erkennen bestimmte verschreibungspflichtige Arzneistoffe und OTC-Arzneistoffe und normale Stoffwechselprodukte, die Amphetamin und Methamphetamin strukturell ähnlich sind, umfassend Arzneistoffe, wie Phenylpropanolamin, Pseudoephedrin, Phentermin, Mephentermin etc., und das Stoffwechselprodukt Tyramin. Folglich können Testproben, die einen oder mehrere dieser Arzneistoffe oder Stoffwechselprodukte enthalten, falsch-positive Ergebnisse für Amphetamine hervorrufen.
Dieses Problem falsch-positiver Ergebnisse, das durch die Prüfung auf Amphetamine unter Verwendung eines einzelnen Antikörpers entsteht, ist besonders störend, da bei der tatsächlichen Anwendung jedes positive Testergebnis zur Bestätigung der Anwesenheit von Amphetaminen einen nachfolgenden Test erfordert. Solche nachfolgenden Tests tragen natürlich zu zusätzlicher Laborzeit und Kosten für den Immunoassay bei, besonders wenn ein wesentlicher Teil dieser positiven Ergebnisse falsch-positiv ist. Obwohl im Prinzip getrennte Tests durchgeführt werden können, wobei jeder einen für einen Arzneistoff spezifischen Antikörpers verwendet, erhöht dies auch die Zahl der durchzuführenden Tests. Folglich ist es besonders wünschenswert, einen Immunoassay zu entwickeln, der Amphetamine bestimmen kann, während er gleichzeitig ein weitgehend reduziertes Auftreten falsch-positiver Ergebnisse zur Folge hat, die durch mit Amphetaminen strukturell verwandte Verbindungen entstehen.
Dies wäre kein schwieriges Problem, wenn Antikörper hergestellt werden könnten, die für Amphetamin ganz spezifisch sind und an kein Methamphetamin-Ligand-Analogon binden, das an eine nachweisbare Markierung gebunden ist, und für Methamphetamin spezifische Antikörper erhältlich wären, die an kein Amphetamin-Ligand-Analogon binden, das an eine nachweisbare Markierung gebunden ist. Wenn solche Antikörper hergestellt werden könnten, könnten zur Bereitstellung eines Einzelassays für Amphetamine die Komponenten von zwei spezifischen Assays kombiniert werden. Solche Antikörper sind jedoch nicht verfügbar, und von der Bindung eines Antikörpers an das Konjugat aus einer Markierung und einem Ligand-Analogon des anderen Arzneistoffes könnte man annehmen, daß sie den Aufbau eines verwendbaren Assays verhindert.
Was wir fanden und worauf die vorliegende Erfindung gerichtet ist, ist eine Immunoassay-Zusammensetzung, die die Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe bestimmen kann, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, während sie deutlich weniger falsch-positive Ergebnisse hervorruft, in der zwei Antikörper zusammen mit Konjugaten aus einem Ligand-Analogon jedes Arzneistoffes und einer Markierung verwendet werden.
Das U.S.-Patent Nr. 4329281 offenbart 4-[4-[2-(Aminopropyl)]phenyl]butansäure und ihre N-Methylderivate, die zur Herstellung von Immunogenen verwendbar sind, die wiederum zur Erzeugung polyklonaler Antikörper verwendet werden können, die für Amphetamin und Methamphetamin selektiv sind. Diese Antikörper werden dann in Immunoassays verwendet.
Das U.S.-Patent Nr. 4041076 offenbart Amphetamin- und Methamphetamin-Derivate, die an der para-Stellung des Phenyl- Ringes mit -O(CH&sub2;)nCO&sub2;H substituiert sind, worin n 1 bis 3 ist. Diese Derivate sind zur Herstellung von Immunogenen verwendbar, die zur Erzeugung polyklonaler Antikörper verwendet werden können, die für Amphetamin und Methamphetamin selektiv sind. Diese Antikörper werden dann in Immunoassays verwendet.
Das U.S.-Patent Nr. 4067774 offenbart Amphetamine, die durch eine -OZC(O)-Gruppe am Phenyl-Ring an Enzyme gebunden sind, worin Z ein Kohlenwasserstoff mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist. Diese an Enzyme gebundenen Verbindungen werden in Immunoassays verwendet.
Die U.S.-Patente Nrn. 3996344 und 4016146 offenbaren die Herstellung von Amphetamin- und Methamphetamin-Analoga, die zur Herstellung von Immunogenen verwendbar sind, die zur Erzeugung polyklonaler Antikörper verwendet werden können, die für Amphetamin und Methamphetamin selektiv sind. Die so offenbarten Verbindungen sind an der Phenylgruppe mit HOOCCH&sub2;CH&sub2;C(O)- substituiert.
Schließlich wurde N-Carboxymethylamphetamin zur Herstellung von Immunogenen verwendet, die zur Erzeugung eines polyklonalen Antikörpers verwendet werden können, der Amphetamin und Methamphetamin erkennt.
EP-A-0279213 offenbart einen Assay für Amphetamine, in welchem gegen Amphetamin beziehungsweise Methamphetamin gerichtete polyklonale Seren mit der Probe und Fluorescein-markierten Amphetamin- und Methamphetamin-Analoga umgesetzt werden.
In einer ihrer Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die zwei Konjugate umfaßt, von denen jedes funktionell ähnliche Markierungen enthält, wobei eine Markierung an ein Amphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist, und die andere Markierung an ein Methamphetamin-Ligand- Analogon gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung für den Assay von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, welche eine wäßrige Lösung umfaßt, die zusätzlich zu diesen Konjugaten einen auf Amphetamin gerichteten, monoklonalen Antikörper und einen auf Methamphetamin gerichteten, monoklonalen Antikörper enthält.
Bei der Verwendung in einem Immunoassay kann diese Zusammensetzung zusätzlich irgendwelche anderen erforderlichen Komponenten eines signalerzeugenden Systems, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals erforderlich sind, enthalten, wobei die Signalmenge zur Menge an Amphetaminen in der Probe in Beziehung steht.
Die Immunoassay-Zusammensetzung dieser Erfindung ist besonders zur Bestimmung von Amphetaminen verwendbar, wohingegen sie deutlich weniger falsch-positive Ergebnisse als Immunoassays, die einen einzelnen Antikörper verwenden, der sowohl Amphetamin als auch Methamphetamin erkennt, erzeugt. Ferner kann die Zusammensetzung zur Bestimmung von Amphetaminen verwendet werden, obwohl der monoklonale Antikörper eine mäßige Kreuzreaktivität (wie später definiert) mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden werden kann.
In ihrem Verfahrensaspekt betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für den Assay von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, umfassend:
A) die Vereinigung in einem wäßrigen Medium von (a) der Probe; (b) monoklonalem Antikörper, der auf Amphetamin gerichtet ist, und monoklonalem Antikörper, der auf Methamphetamin gerichtet ist; und (c) zwei Konjugaten, wobei jedes eine Markierung enthält, die der anderen funktionell ähnlich ist, wobei eine Markierung an ein Ligand-Analogon von Amphetamin konjugiert ist, und die andere Markierung an ein Ligand-Analogon von Methamphetamin konjugiert ist, unter Bedingungen, die es den Antikörpern erlauben, sich an die Konjugate zu binden;
B) das Kontaktieren der aus Stufe A erhaltenen Konjugate mit irgendwelchen erforderlichen Komponenten des signalerzeugenden Systems, mit oder ohne Abtrennung der gebundenen oder nicht gebundenen Konjugate aus dem aus Stufe A erhaltenen Medium, wobei ein Signal erzeugt wird, das zur Anwesenheit von Amphetaminen in der Probe in Beziehung steht; und
C) die Bestimmung des Signals.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen in dem Assay verwendbaren Testsatz. Ein solcher Testsatz umfaßt die folgenden Komponenten:
(a) monoklonalen Antikörper, der auf Amphetamin gerichtet ist, und monoklonalen Antikörper, der auf Methamphetamin gerichtet ist;
(b) zwei Konjugate, wobei jedes eine Markierung enthält, die der anderen funktionell ähnlich ist, wobei eine an ein Amphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist, und die andere an ein Methamphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung verwenden Antikörper und Konjugate aus Ligand-Analoga und Markierungen zur Verwendung in einem Amphetamin-/Methamphetamin-Assay. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in dieser Hinsicht bestimmte Verbindungen, die in dem Assay verwendet werden können oder Vorstufen von Verbindungen sind, die verwendet werden können. Daher betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in ihrem Verbindungsaspekt eine Verbindung der Formel:
worin:
R für Wasserstoff oder Methyl steht;
X für Sauerstoff, Schwefel steht oder eine Bindung bedeutet;
R&sub1; Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
R&sub2; Alkylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
n 0 oder 1 ist;
R&sub3; Wasserstoff, -SR&sub4;, worin R&sub4; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, ist oder für (A)pZ steht, wobei A von einer Funktionalität abgeleitet ist, die mit einer Thiolgruppe unter Bildung einer Bindung zwischen dem Schwefelatom der Thiolgruppe und A reagieren kann, und Z eine Poly(aminosäure) ist;
p 1 ist, wenn R&sub3; für Wasserstoff oder -SR&sub4; steht, und eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht der Poly(aminosäure), dividiert durch 500, ist, wenn R&sub3; für (A)pZ steht; mit der Maßgabe, daß wenn n 0 ist, R&sub1; Alkylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und mit der weiteren Maßgabe, daß der Benzol- Ring in der meta- oder der para-Stellung zur Gruppe
an X gebunden ist, und wenn X eine Bindung ist, der Benzol-Ring in der para-Stellung an X gebunden ist.
Abbildung 1 stellt die Assay-Antworten auf Amphetamin und Methamphetamin in Assays, die einen monoklonalen Antikörper für Amphetamin verwenden, graphisch dar, wobei ein Assay ferner ein Konjugat aus einem Amphetamin-Ligand-Analogon und Glucose- 6-phosphatdehydrogenase verwendet, und der andere ferner ein Konjugat aus einem Methamphetamin-Ligand-Analogon und Glucose- 6-phosphatdehydrogenase verwendet.
Abbildung 2 stellt die Assay-Antworten auf Amphetamin und Methamphetamin in Assays, die einen monoklonalen Antikörper für Methamphetamin verwenden, graphisch dar, wobei ein Assay ferner ein Konjugat aus einem Amphetamin-Ligand-Analogon und Glucose-6-phosphatdehydrogenase verwendet, und der andere ferner ein Konjugat aus einem Methamphetamin-Ligand-Analogon und Glucose-6-phosphatdehydrogenase verwendet.
Abbildung 3 stellt die für bestimmte Amphetamin- und Methamphetaminmengen durch das Verfahren dieser Erfindung erzeugten Signale graphisch dar.
Eine Immunoassay-Zusammensetzung, die zur Untersuchung der Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, verwendbar ist, wohingegen sie einen weitgehend reduzierten Anteil falsch-positiver Ergebnisse hervorruft, wird bereitgestellt.
Die Assay-Zusammensetzung dieser Erfindung ist bei einer großen Anzahl früher verwendeter sowohl homogener als auch heterogener Immunoassay-Verfahren verwendbar. Die Bedingungen, unter denen diese Immunoassays durchgeführt wurden, sind gewöhnlich bei der vorliegenden Zusammensetzung anwendbar. Somit können die Zusammensetzungen dieser Erfindung in Immunoassays des Standes der Technik verwendet werden, so daß Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, bereitgestellt werden. Durch die geeignete Wahl der Komponenten zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals, kann das nachweisbare Signal visuell oder durch verschiedene Geräte, d. h. Nachweismittel, wie Spektralphotometer, Fluorometer, Szintillationszähler etc., beobachtet werden.
In der Assay-Zusammensetzung werden zwei oder mehrere Reagenzien verwendet, die das signalerzeugende System umfassen. Schlüsselreagenzien in dem signalerzeugenden System sind zwei Konjugate, die jeweils eine Markierung enthalten, die an ein Ligand-Analogon konjugiert ist. Die Wahl der Vorschrift bestimmt, ob eine Zunahme oder eine Abnahme der Signalmenge, die durch das signalerzeugende System erzeugt wird, die Menge der Amphetamine in der Assayprobe bestimmt.
Vor der weiteren Beschreibung der speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Reihe von Begriffen definiert.
Amphetamine - die Arzneistoffe Amphetamin und Methamphetamin.
Analyt - die zu messenden Amphetamine. Die Analyten (Amphetamine) sind Liganden und Mitglieder getrennter spezifischer Bindungspaare (sbp), bestehend aus dem Liganden und einem Antikörper für den Liganden.
Ligand-Analogon - ein modifizierter Ligand, welcher bei der Bindung an ein anderes Molekül mit dem analogen Liganden oder Analyten um die Bindung an den Antikörper konkurrieren kann, wobei die Modifizierung Mittel zur Bindung eines Ligand- Analogons an ein anderes Molekül bereitstellt. Das Ligand-Analogon unterscheidet sich in der Regel, jedoch nicht zwangsläufig, um mehr als durch den Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung, welche das Ligand-Analogon an ein Zentrum oder eine Markierung bindet, von dem Liganden. Von dem Begriff Ligand-Analoga werden Poly(ligand-Analoga) umfaßt, die eine Mehrzahl von Ligand-Analoga sind, die gewöhnlich über einen Zentrumskern kovalent aneinander gebunden sind. Der Zentrumskern ist ein polyfunktionelles, gewöhnlich polymeres Material, das in der Regel eine Mehrzahl funktioneller Gruppen, z. B. Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Mercapto-, Ethylengruppen etc., als Bindungsstellen aufweist. Der Zentrumskern kann wasserlöslich oder -unlöslich sein, vorzugsweise wasserlöslich, und weist gewöhnlich ein Molekulargewicht von mindestens etwa 30000 auf und kann ein Molekulargewicht von 10 Millionen oder mehr besitzen. Beispiele von Zentrumskernen umfassen Polysaccharide, Polypeptide (umfassend Proteine), Nukleinsäuren, Anionenaustauscherharze und dergleichen. Wasserunlösliche Zentrumskerne können die Wände von Behältern, z. B. aus Glas oder Kunststoff, Glaskügelchen, Additions- und Kondensationspolymere, Sephadex®- und Agarose®-Kügelchen und dergleichen umfassen.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp-Mitglied") - ein oder zwei verschiedene Moleküle, die einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhle aufweisen, der spezifisch an einen besonderen räumlichen und polaren Aufbau des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär zu diesem definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor bezeichnet. Diese sind in der Regel Mitglieder eines immunologischen Paares, wie Antigen- Antikörper.
Ligand - irgendeine organische Verbindung, für die von Natur aus ein Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann. Wenn der Rezeptor ein Antikörper ist, wird der Ligand als Antigen bezeichnet.
Antikörper - ein Immunglobulin oder ein Derivat oder ein Fragment davon, das einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhle aufweist, der spezifisch an einen besonderen räumlichen und polaren Aufbau eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär zu diesem definiert ist. Ein monoklonaler Antikörper kann durch Verfahren, die in dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, wie zum Beispiel Immunisierung eines Wirtes und Hybridzellinientechnologie, hergestellt werden.
Antikörper für Amphetamin - ein monoklonaler Antikörper, der für Amphetamin hoch spezifisch ist und eine minimale Erkennung von Methamphetamin aufweist. Der Antikörper für Amphetamin kann Amphetamin und Konjugate aus einem Amphetamin-Ligand-Analogon und einer Markierung erkennen.
Antikörper für Methamphetamin - ein monoklonaler Antikörper, der für Methamphetamin hoch spezifisch ist und eine minimale Erkennung von Amphetamin aufweist. Der Antikörper für Methamphetamin kann Methamphetamin und Konjugate aus einem Methamphetamin-Ligand-Anaiogon und einer Markierung erkennen.
Minimale Erkennung - die Bindungskonstante für einen Antikörper, der an ein nicht-komplementäres Antigen bindet, d. h. die Bindungskonstante für Amphetamin, das an den Antikörper für Methamphetamin bindet, oder die Bindungskonstante für Methamphetamin, das an den Antikörper für Amphetamin bindet, beträgt weniger als 20% und häufig weniger als 10% der Bindungskonstante des Antikörpers für sein komplementäres Antigen.
Markierung - ein Mitglied des signalerzeugenden Systems, das an den Liganden oder einen Antikörper konjugiert ist. Die Markierung kann isotopisch oder nicht isotopisch, in der Regel nicht isotopisch, sein, umfassend Katalysatoren, wie ein Enzym, ein Chromogen, wie einen Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff oder Chemolumineszenzfarbstoffe, eine radioaktive Substanz, ein Partikel und so weiter. Identische oder funktionell ähnliche Markierungen werden konjugiert, das heißt, sie werden kovalent oder nicht kovalent an Amphetamin und Methamphetamin oder deren Ligand-Analoga gebunden. Funktionell ähnliche Markierungen sind Markierungen, die Signale bereitstellen, die, außer in der Intensität, weitgehend identisch sind, wie dieselben oder sehr ähnliche Derivate eines Enzyms, eines Fluorophors etc.
Kreuzreaktivität - das Verhältnis der Bindungskonstante eines Antikörpers und eines Liganden zu der Bindungskonstante desselben Antikörpers zu seinem homologen Liganden oder Antigen. Wenn der homologe Ligand ein Analyt ist, erzeugt ein kreuzreaktiver Ligand in einem Assay ein Signal, das seiner Kreuzreaktivität mit dem Antikörper entspricht.
Mäßig kreuzreaktiv - ein Antikörper, der vorzugsweise ein erstes Konjugat aus einem Ligand-Analogon und einer Markierung bindet, heißt mäßig kreuzreaktiv mit einem zweiten Konjugat aus einem unterschiedlichen Ligand-Analogon und einer Markierung, und das zweite Konjugat wird als mäßig kreuzreaktiv mit dem Antikörper bezeichnet, wenn die Konstante der Bindung zu dem zweiten Konjugat im Bereich von etwa 20% bis etwa 80% der Konstante der Bindung zu dem ersten Konjugat liegt; das heißt, es weist eine Kreuzreaktivität von etwa 20% bis etwa 80% auf.
Signalerzeugende Mittel - Mittel, die mit der Markierung wechselwirken können, wobei ein nachweisbares Signal erzeugt wird. Solche Mittel umfassen zum Beispiel elektromagnetische Strahlung, Wärme, chemische Reagenzien und dergleichen. Die chemischen Reagenzien können Substrate, Coenzyme, Beschleuniger, zweite Enzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, Substanzen für spezifische Bindungen, die zur Bindung signalerzeugender Substanzen erforderlich sind, und dergleichen sein.
Signalerzeugendes System - das signalerzeugende System kann zwei oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens zwei Komponenten Konjugate sind, die funktionell ähnliche Markierungen enthalten. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das in Anwesenheit aller Assay-Komponenten eine Funktion der Anwesenheit oder der Menge von Amphetaminen in einer Probe ist. Das signalerzeugende System umfaßt alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind. Mindestens zwei Mitglieder des signalerzeugenden Systems sind an die Liganden oder Antikörper, in der Regel Liganden, gebunden. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Substrate, Beschleuniger, Aktivatoren, Chemolumineszenzverbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, Substanzen für spezifische Bindungen, die zur Bindung signalerzeugender Substanzen erforderlich sind, und dergleichen umfassen. Weitere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Coenzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dergleichen sein. Das signalerzeugende System stellt ein Signal bereit, das durch äußere Mittel, vorzugsweise durch elektromagnetische Strahlung, in der Regel photometrisch, wie durch Extinktion oder Fluoreszenzpolarisation, oder durch den Aggregationsgrad von Partikeln, wünschenswerterweise durch visuelle Untersuchung, nachweisbar ist. In den meisten Fällen beinhalten die anderen Komponenten des signalerzeugenden Systems ein chromophores Substrat, ein Enzym und für die Enzymaktivität erforderliche Hilfsreagenzien, wobei chromophore Substrate enzymatisch in Farbstoffe, welche Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphoreszenz-, Fluoreszenz- oder Chemolumineszenzfarbstoffe umgewandelt werden.
Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator, in der Regel ein Enzym, und mindestens ein Substrat enthalten und kann zwei oder mehrere Katalysatoren und eine Mehrzahl von Substraten enthalten und kann eine Kombination von Enzymen, wobei das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist, enthalten. Die Arbeitsweise des signalerzeugenden Systems ist die Erzeugung eines Produkts, das ein nachweisbares Signal bereitstellt, das zu der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht.
Eine große Anzahl in einem signalerzeugenden System verwendbarer Enzyme und Coenzyme ist in dem U.S.-Patent Nr. 4275149, Spalten 19 bis 23, und in dem U.S.-Patent Nr. 4318980, Spalten 10 bis 14 aufgeführt. Eine Reihe von Enzymkombinationen ist in dem U.S.-Patent Nr. 4275149, Spalten 23 bis 28, deren Kombinationen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, angegeben.
Von besonderem Interesse sind Redoxenzyme, besonders Dehydrogenasen, wie Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase etc., und Enzyme, welche an der Bildung von Wasserstoffperoxid und der Verwendung von Wasserstoffperoxid zur Oxidation einer Farbstoffvorstufe zu einem Farbstoff beteiligt sind. Besondere Kombinationen umfassen Saccharidoxidasen, z. B. Glucose- und Galactoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, wie Uricase- und Xanthinoxidase, die mit einem Enzym gekoppelt sind, welches unter Verwendung von Wasserstoffperoxid eine Farbstoffvorstufe oxidiert, das heißt, eine Peroxidase, wie Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase. Weitere Enzymkombinationen können in dem durch Bezugnahme eingeschlossenen Gegenstand gefunden werden. Wenn ein einzelnes Enzym als Markierung verwendet wird, können andere Enzyme, wie Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen, vorzugsweise Hydrolasen, wie alkalische Phosphatase und β-Galactosidase, verwendet werden. Alternativ können Luciferasen, wie Leuchtkäfer- Luciferase und bakterielle Luciferase, verwendet werden.
Beispiele verwendbarer Coenzyme umfassen NAD[H]; NADP[H]; Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H] etc., in der Regel Coenzyme, die an Zyklusreaktionen beteiligt sind, siehe besonders das U.S.-Patent Nr. 4318980.
Das Produkt der Enzymreaktion ist in der Regel ein Farbstoff oder Fluoreszenzfarbstoff. Viele Beispiele von Fluoreszenzfarbstoffen sind in dem U.S.-Patent Nr. 4275149, Spalten 30 und 31, dargestellt.
Wenn die Markierung ein Enzym ist, dann können zur Herstellung des nachweisbaren Signals in diesem signalerzeugenden System zusätzliche Komponenten, wie Substrate, Beschleuniger, Aktivatoren, Coenzyme, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger etc. erforderlich sein. Die für ein besonderes signalerzeugendes System erforderlichen Komponenten sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt.
Hilfsmaterialien - verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in dem nach der vorliegenden Erfindung durchgeführten Assayverfahren verwendet. Zum Beispiel liegen in dem Assaymedium gewöhnlich Puffer sowie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten vor. Häufig können zusätzlich zu diesen Zusätzen weitere Proteine, wie Albumine, oder Tenside, besonders nicht-ionische Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole, oder dergleichen enthalten sein.
Wie vorangehend gezeigt, betrifft die vorliegende Erfindung eine Immunoassay-Zusammensetzung, die in dem Assay zur Bestimmung der Anwesenheit von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, verwendet wird, wohingegen sie einen weitgehend reduzierten Anteil falsch-positiver Ergebnisse hervorruft. Die Immunoassay-Zusammensetzung dieser Erfindung kann das Auftreten einer beträchtlichen Anzahl falsch-positiver Ergebnisse durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers für Amphetamin und eines monoklonalen Antikörpers für Methamphetamin ausschließen. Der Immunoassay kann homogen oder heterogen sein und kann eine Markierung, die katalytisch, chromophor, fluoreszierend, radioaktiv und so weiter ist, umfassen. Die Immunoassay- Zusammensetzung dieser Erfindung ist besonders in dem Verfahren, das in dem U.S.-Patent Nr. 3817837 beschrieben ist, verwendbar. Andere Verfahren, in welchen der vorliegende Immunoassay verwendet werden kann, umfassen beispielsweise und ohne Einschränkung die in "Enzyme-Immunoassay" von Edward T. Maggio, CRC Press Inc., Boca Baton, Florida, 1980 und in den U.S.-Patenten Nrn. 3690834; 3791932; 3859578; 3853987; 3867517; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; und 4098876 beschriebenen.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen im allgemeinen zwei Konjugate, die funktionell ähnliche Markierungen enthalten, die Teil eines signalerzeugenden Systems sind, wobei ein Konjugat eine Markierung enthält, die an ein Ligand-Analogon von Amphetamin gebunden ist, und das andere Konjugat eine Markierung enthält, die an ein Ligand-Analogon von Methamphetamin gebunden ist. Die Zusammensetzungen können zusätzlich zu den Konjugaten einen monoklonalen Antikörper, der auf Amphetamin gerichtet ist, und einen monoklonalen Antikörper, der auf Methamphetamin gerichtet ist, in einem wäßrigen Medium und gegebenenfalls andere Komponenten des signalerzeugenden Systems enthalten. In Abwesenheit von Amphetaminen binden die Konjugate an die Antikörper, wenn sie in wäßriger Lösung mit den Antikörpern vereinigt werden. Wenn in der Lösung eine Probe enthalten ist, die Amphetamin oder Methamphetamin enthält, binden diese Arzneistoffe an ihre jeweiligen komplementären Antikörper und konkurrieren mit der Bindung der Antikörper an die Konjugate, wodurch nicht gebundene Konjugate erzeugt werden, die zu der Menge der in der Probe enthaltenen Amphetamine in Beziehung stehen. Das nicht gebundene Konjugat kann intrinsisch ein unterschiedliches Signal als das gebundene Konjugat erzeugen oder kann ein unterschiedliches Signal als Ergebnis der Trennung der gebundenen und nicht gebundenen Konjugate erzeugen, und daher tritt eine größere Signaländerung auf, je mehr Konjugat freigesetzt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung dieser Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der auf Amphetamin gerichtet ist, einen monoklonalen Antikörper, der auf Methamphetamin gerichtet ist, und Konjugate, welche Ligand-Analoga von Amphetamin und Methamphetamin sind und jeweils kovalent oder nicht kovalent an eine funktionell ähnliche Markierung gebunden sind, wobei der monoklonale Antikörper eine mäßige Kreuzreaktivität mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird. Gegebenenfalls umfaßt die Zusammensetzung andere erforderliche Komponenten des signalerzeugenden Systems.
Die Verwendbarkeit der Zusammensetzung dieser Erfindung für den Assay von Amphetaminen, wobei eine mäßige Kreuzreaktivität zwischen einem monoklonalen Antikörper und seinem nichtkomplementären Konjugat besteht, ist unerwartet, da zum Beispiel das Konjugat aus der Markierung und einem Amphetamin-Ligand-Analogon, welches in einem Assay mit einem Antikörper und einem Konjugat aus der Bindung freigesetzt wird, wenn Amphetamin an den Antikörper bindet, von dem mäßig kreuzreaktiven Antimethamphetamin-Antikörper, der in der Assay-Zusammensetzung dieser Erfindung vorliegt, gebunden werden kann. Da die Menge des nicht gebundenen Konjugats zu der Menge der Amphetamine in der Probe in Beziehung steht, könnte dann erwartet werden, daß die Assay-Antwort abgeschwächt wird. In dieser Hinsicht wird auf die Abbildungen 1, 2 und 3 Bezug genommen. Was die Abbildung 1 betrifft, veranschaulicht diese Abbildung graphisch die Signaländerung, die sich aus der Vereinigung verschiedener Amphetamin- und Methamphetaminmengen mit, in dem ersten Diagramm, einem monoklonalen Antikörper für Amphetamin, der als 26H8-AMPH bezeichnet wird, und einem Konjugat, welches ein Ligand-Analogon von d,l-Amphetamin mit einer daran konjugierten Markierung ist, und, in dem zweiten Diagramm, demselben monoklonalen Antikörper für Amphetamin und einem Konjugat, welches ein Ligand- Analogon von d-Methamphetamin mit einer daran konjugierten Markierung ist, ergibt. Beide Konjugate verwenden ein Enzym, besonders Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH), als Markierung. In diese Assays wurden andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems, umfassend die Coenzyme NAD und Glucose-6-phosphat, gegeben. Die y-Achsen entsprechen der Enzymaktivität, die als die Änderung der optischen Dichte (Extinktion) während 30 Sekunden bei einer Wellenlänge von 340 nm einer Lösung angegeben wird, wobei die Weglänge des Lichts 2,66 cm beträgt; während die x-Achsen den Amphetamin- oder Methamphetaminkonzentrationen in µg/ml entsprechen. Wenn Amphetamin zu der Testprobe gegeben wird, konkurriert es in dem Assay mit den Konjugaten um die Bindung an den monoklonalen Antikörper, und dies führt daher zu einer Zunahme der Menge an nicht gebundenen Konjugaten. Dies führt zu einer Zunahme der Enzymaktivität, da nicht gebundene Konjugate eine größere Enzymaktivität als gebundene Konjugate aufweisen. Wie aus dem ersten Diagramm ersichtlich ist, korreliert die Zunahme der Enzymaktivität mit der Amphetaminkonzentration. Eine Amphetaminkonzentration von 0,3 µg/ml stellt zum Beispiel eine Änderung des Signals, d. h. des in Abwesenheit von irgendwelchen Amphetaminen durch das signalerzeugende System erzeugten Signals, um mehr als 60 Einheiten bezogen auf die Grundlinie bereit, während eine Amphetaminkonzentration von 1,0 µg/ml eine Änderung des Signals um mehr als 90 Einheiten bezogen auf die Grundlinie bereitstellt.
Andererseits zeigt das erste Diagramm ferner, daß die Zugabe von Methamphetamin zu keiner erkennbaren Änderung der Enzymaktivität führt. Dies ist nicht überraschend, da der verwendete monoklonale Antikörper für Amphetamin spezifisch ist, und daher in keinem signifikanten Maß an Methamphetamin bindet. Da keine signifikante Bindung des monoklonalen Antikörpers an Methamphetamin stattfindet, sollte es durch die Zugabe von Methamphetamin zu keiner Zunahme der Menge an nicht gebundenem Konjugat und daher zu keiner Änderung der Enzymaktivität kommen. Daher ist die Abwesenheit einer nennenswerten Änderung der Enzymaktivität ein deutlicher Beweis, daß Methamphetamin in keinem signifikanten Maß an den monoklonalen Antikörper für Amphetamin bindet.
Das zweite Diagramm der Abbildung 1 verwendet einen monoklonalen Antikörper für Amphetamin, der als 26H8-AMPH bezeichnet wird, und ein Konjugat aus einem Ligand-Analogon von d-Methamphetamin und Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Wenn das Konjugat von dem monoklonalen Antikörper nicht erkannt würde, würde weder die Zugabe von Amphetamin noch diejenige von Methamphetamin zu einer Zunahme der Enzymaktivität führen, da sogar in Abwesenheit von Amphetaminen das gesamte Konjugat nicht gebunden wäre. Wie in dem zweiten Diagramm gezeigt wird, führt jedoch die Zugabe von Amphetamin zu einer nennenswerten Zunahme der Enzymaktivität. Diese Zunahme ist ein deutlicher Beweis, daß das Konjugat, das dieses Ligand-Analogon enthält, eine Kreuzreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper für Amphetamin aufweist, und daß es nach der Zugabe von Amphetamin durch dieses von dem Antikörper verdrängt wird. Andererseits zeigt dieses zweite Diagramm ferner, daß die Zugabe von Methamphetamin zu keiner merklichen Änderung der Enzymaktivität führt. Dies zeigt, daß das Konjugat, das das Ligand-Analogon von Methamphetamin enthält, eine Kreuzreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper für Amphetamin aufweist, während Methamphetamin selbst diese Kreuzreaktivität nicht aufweist.
Was die Abbildung 2 betrifft, veranschaulicht diese Abbildung graphisch die Signaländerung, die sich aus der Vereinigung verschiedener Amphetamin- und Methamphetaminmengen mit, in dem ersten Diagramm, einem monoklonalen Antikörper für Methamphetamin, der als 10E12-METH bezeichnet wird, und einem Konjugat, welches ein Ligand-Analogon von d-Methamphetamin mit einer daran konjugierten Markierung ist, und in dem zweiten Diagramm, demselben monoklonalen Antikörper für Methamphetamin und einem Konjugat, das ein Ligand-Analogon von d,l-Amphetamin mit einer daran konjugierten Markierung ist, ergibt. Beide Konjugate verwenden ein Enzym, konkret Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH), als Markierung. In diesen Assays wurden andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems, umfassend NAD und Glucose-6-phosphat, zugegeben. Die y-Achsen entsprechen der Enzymaktivität, die als die Änderung der optischen Dichte (Extinktion) während 30 Sekunden bei einer Wellenlänge von 340 nm einer Lösung angegeben wird, wobei die Weglänge des Lichts 2,66 cm beträgt; während die x-Achse entweder der Amphetamin- oder der Methamphetaminkonzentration in µg/ml entspricht. Wenn Methamphetamin zu der Testprobe gegeben wird, konkurriert es in dem Assay mit den Konjugaten um die Bindung an den monoklonalen Antikörper, und dies führt daher zu einer Zunahme der Menge an nicht gebundenen Konjugaten. Dies führt zu einer Zunahme der Enzymaktivität, da nicht gebundene Konjugate eine größere Enzymaktivität als gebundene Konjugate aufweisen. Wie aus dem ersten Diagramm ersichtlich ist, korreliert die Zunahme der Enzymaktivität mit der Methamphetaminkonzentration.
Andererseits zeigt das erste Diagramm ferner, daß die Zugabe von Amphetamin die Enzymaktivität nicht erkennbar ändert. Dies ist nicht überraschend, da der verwendete monoklonale Antikörper für Methamphetamin spezifisch ist, und daher in keinem signifikanten Maß an Amphetamin bindet. Da keine signifikante Bindung des monoklonalen Antikörpers an Amphetamin stattfindet, kommt es durch die Zugabe von Amphetamin zu keiner Zunahme der Menge an nicht gebundenem Konjugat und daher zu keiner Änderung der Enzymaktivität. Daher ist die Abwesenheit einer nennenswerten Änderung der Enzymaktivität ein deutlicher Beweis, daß Amphetamin in keinem signifikanten Maß an den monoklonalen Antikörper für Methamphetamin bindet.
Das zweite Diagramm der Abbildung 2 verwendet einen monoklonalen Antikörper für Methamphetamin, der als 10E12-METH bezeichnet wird, und ein Konjugat aus einem Ligand-Analogon von d,l-Amphetamin und Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Wenn das Konjugat von dem monoklonalen Antikörper nicht erkannt würde, würde weder die Zugabe von Amphetamin noch diejenige von Methamphetamin zu einer Zunahme der Enzymaktivität führen, da sogar in Abwesenheit von Amphetaminen das gesamte Konjugat nicht gebunden wäre. Wie in dem zweiten Diagramm gezeigt wird, führt jedoch die Zugabe von Methamphetamin zu einer nennenswerten Zunahme der Enzymaktivität. Diese Zunahme ist ein deutlicher Beweis, daß das Konjugat, das dieses Ligand-Analogon enthält, eine Kreuzreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper für Methamphetamin aufweist, und daß es nach der Zugabe von Methamphetamin durch dieses von dem Antikörper verdrängt wird. Andererseits zeigt das zweite Diagramm ferner, daß die Zugabe von Amphetamin zu kleiner merklichen Änderung der Enzymaktivität führt. Dies wird als weiterer Beweis dafür genommen, daß das Konjugat, das das Ligand-Analogon von Amphetamin enthält, eine Kreuzreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper für Methamphetamin aufweist, während Amphetamin selbst diese Kreuzreaktivität nicht aufweist.
Im Hinblick auf das Vorangehende glaubte man, daß die Kreuzreaktivität beider Konjugate mit jedem Antikörper die als Ergebnis der Anwesenheit von Amphetamin oder Methamphetamin erzeugte Signaländerung beeinflussen würde, da der Antikörper, der den Arzneistoff in der Probe nicht erkannte, an das Konjugat binden und dessen Aktivität hemmen konnte, obwohl der für den Arzneistoff spezifische Antikörper wirksam daran gehindert wurde, an das Konjugat zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß die Beeinflussung durch Kreuzreaktivität anscheinend durch die Vereinigung des Konjugats aus der Markierung und dem Ligand-Analogon von Amphetamin und des Konjugats aus der Markierung und dem Ligand- Analogon von Methamphetamin mit den für Amphetamin und Methamphetamin spezifischen monoklonalen Antikörpern neutralisiert wird. In dieser Hinsicht wird auf Abbildung 3 Bezug genommen. Diese Abbildung veranschaulicht graphisch die Signaländerung, die sich aus der Vereinigung von entweder Amphetamin oder Methamphetamin mit einem monoklonalen Antikörper für Amphetamin (als 26H8-AMPH bezeichnet), einem Konjugat aus einem Ligand- Analogon von d,l-Amphetamin und einer Markierung, einem monoklonalen Antikörper für Methamphetamin (als 10E12-METH bezeichnet) und einem Konjugat aus einem Ligand-Analogon von d-Methamphetamin und einer Markierung und der Zugabe anderer Vertreter des signalerzeugenden Systems ergibt. Beide Konjugate verwenden ein Enzym, konkret Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH), als Markierung, und andere Vertreter des signalerzeugenden Systems umfassen NAD und Glucose-6-phosphat. Wie in den Abbildungen 1 und 2 gezeigt ist, weisen sowohl der monoklonale Antikörper für Amphetamin als auch der monoklonale Antikörper für Methamphetamin eine Kreuzreaktivität mit den zwei Konjugaten auf, die das Amphetamin-Ligand-Analogon und das Methamphetamin-Ligand-Analogon enthalten. In dem Diagramm dieser Abbildung entsprechen die x- und y-Achse denselben Parametern wie in den vorangehenden Diagrammen.
Wie in den vorangehenden Assays erzeugt eine Zunahme der Menge an nicht gebundenem Konjugat eine Zunahme der Enzymaktivität. Die erste Kurve in diesem Diagramm veranschaulicht die Beziehung zwischen der Amphetaminkonzentration und der Enzymgeschwindigkeit, während die zweite Kurve die Beziehung zwischen der Methamphetaminkonzentration und der Enzymgeschwindigkeit veranschaulicht. In beiden Fällen veranschaulichen die Kurven, daß ein starkes Signal erzeugt wird, das sowohl zu der Amphetaminkonzentration als auch zu der Methamphetaminkonzentration in Beziehung steht. Folglich zeigt Abbildung 3, daß die Zusammensetzung dieser Erfindung zur Bestimmung von Amphetaminen verwendet werden kann, indem ein monoklonaler Antikörper für Amphetamin, ein monoklonaler Antikörper für Methamphetamin und zwei Konjugate verwendet werden, wobei jedes eine funktionell ähnliche Markierung enthält, wobei eine Markierung an ein Ligand-Analogon von Amphetamin gebunden ist und die andere Markierung an ein Ligand-Analogon von Methamphetamin gebunden ist, wobei eine mäßige Kreuzreaktivität zwischen beiden monoklonalen Antikörpern und den Konjugaten, die nicht-komplementäre Ligand- Analoga verwenden, besteht.
Ferner kann die Zusammensetzung dieser Erfindung auch zur Untersuchung einer Probe verwendet werden, die sowohl Amphetamin als auch Methamphetamin enthält. Während die Bestimmung, ob die Signalzunahme aufgrund des Amphetamins, Methamphetamins oder deren Kombination auftrat, nicht möglich sein würde, wäre die Zunahme des Signals dennoch ein positiver Hinweis auf die Anwesenheit von Amphetaminen in der Probe.
Dies ist ein geeigneter Punkt zur Diskussion des maximalen Grades der durch die Zusammensetzung dieser Erfindung erlaubten Kreuzreaktivität, welche Konjugate verwendet, die an funktionell äquivalente Markierungen gebundene Ligand-Analoga von Amphetamin und Methamphetamin sind. Im besonderen wird angemerkt, daß die Definition der mäßigen Kreuzreaktivität einen Bereich von 20-80% verwendet. Die obere Grenze von 80% ist erforderlich, da an diesem Punkt so viel Antikörper an das Konjugat mit mäßiger Kreuzreaktivität binden kann, daß nach der Zugabe des Arzneistoffes, der an den Antikörper bindet, der zu dem Konjugat mit mäßiger Kreuzreaktivität komplementär ist, ein großer Teil des Konjugats, der sonst nicht mehr gebunden wäre, von dem Antikörper mit Kreuzreaktivität gebunden wird. Somit tritt sogar in Anwesenheit des Arzneistoffes eine sehr kleine Signaländerung auf. Im Hinblick auf das Vorangehende ist es in einer Zusammensetzung, die zwei Antikörper und zwei Konjugate verwendet, erforderlich, daß die mäßige Kreuzreaktivität 80% nicht übersteigt und vorzugsweise etwa 60% nicht übersteigen sollte und besonders bevorzugt etwa 50% nicht übersteigen sollte.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden die Konzentrationen der Antikörper und Konjugate so eingestellt, daß dieselbe Signaländerung für eine vorher festgesetzte minimale Amphetaminmenge und für eine vorher festgesetzte minimale Methamphetaminmenge bereitgestellt wird. In einem solchen Fall kann die den Assay durchführende Person, ohne Berücksichtigung, welcher Arzneistoff tatsächlich vorliegt, bestimmen, ob die Probe für die Anwesenheit von mindestens der vorher festgesetzten minimalen Menge an Amphetamin oder Methamphetamin positiv ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden Konjugate mit einer Enzymmarkierung ("Enzym-Konjugate") verwendet, die eine stark reduzierte Enzymaktivität aufweisen, wenn sie durch den Anti-Ligand-Antikörper gebunden werden. Vorzugsweise beträgt der Bruchteil der Hemmung der Enzym-Konjugate durch den Antikörper mindestens 0,50 und besonders bevorzugt mindestens 0,65-0,80. Der hier verwendete Begriff "Bruchteil der Hemmung eines Enzym-Konjugats" bedeutet 1 minus dem Verhältnis der minimalen Enzymgeschwindigkeit, die beobachtet wird, wenn zunehmende Mengen des Antikörpers zu dem Konjugat gegeben werden, dividiert durch die Geschwindigkeit in Abwesenheit des Antikörpers.
Die Art und Weise der Durchführung eines Assays für Amphetamine in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, umfaßt die Vereinigung in einem wäßrigen Medium von (a) der Probe; (b) Antikörper, der auf Amphetamin gerichtet ist, und Antikörper, der auf Methamphetamin gerichtet ist, wobei mindestens einer der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist; (c) zwei Konjugaten, die jeweils eine funktionell ähnliche Markierung enthalten, wobei eine an ein Ligand-Analogon von Amphetamin gebunden ist und die andere an ein Ligand-Analogon von Methamphetamin gebunden ist; und (d) irgendwelchen anderen erforderlichen Komponenten des signalerzeugenden Systems unter Bedingungen, die es den Antikörpern erlauben, sich als eine Funktion der Amphetamin- und Methamphetaminmenge in der Probe an die Konjugate zu binden, wobei ein Signal erzeugt wird, das zu der Menge der Amphetamine in der Probe in Beziehung steht, und die Bestimmung des Signals.
Das Lösungsmittel für diesen Assay ist ein wäßriges Medium, das bis zu etwa 40 Gewichtsprozent andere polare Lösungsmittel, besonders sauerstoffhaltige Lösungsmittel, mit 1 bis 6, häufiger mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, umfassend Alkohole, Ether und dergleichen, enthalten kann. In der Regel liegen die Colösungsmittel in weniger als etwa 20 Gewichtsprozent vor. Unter gewissen Umständen, die von der Art der Probe abhängen, kann ein Teil oder das gesamte wäßrige Medium durch die Probe selbst bereitgestellt werden.
Der pH-Wert für das Medium liegt in der Regel im Bereich von 4-11, häufiger 5-10, und vorzugsweise im Bereich von etwa 6-9. Der pH-Wert wird gewählt, um eine optimale Bindung der Bindungs-Mitglieder und eine optimale Erzeugung des Signals durch das signalerzeugende System bereitzustellen. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen und um ihn während des Assays aufrechtzuerhalten. Beispiele von Puffern umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch, aber in einzelnen Assays kann ein Puffer einem anderen vorgezogen werden.
Für bestimmte Assayvorschriften sind wünschenswerterweise etwa 0,05 bis 0,5 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen Detergens in der Probe enthalten. Verschiedene Polyoxyalkylenverbindungen von etwa 200 bis 20000 Dalton können verwendet werden.
Zur Durchführung des Assays werden gewöhnlich gemäßigte Temperaturen verwendet. Die Temperaturen für den Assay und die Erzeugung eines nachweisbaren Signals liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 4-50ºC, meistens im Bereich von etwa 10-40ºC, und häufig bei Umgebungstemperaturen, das heißt etwa 15-25ºC.
Die Konzentration der Amphetamine in der wäßrigen Testlösung, die bestimmt werden kann, variiert im allgemeinen von etwa 10&supmin;&sup4; bis etwa 10&supmin;¹&sup0; M, häufiger von etwa 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup9; M. Überlegungen, wie die verwendete Vorschrift, bestimmen gewöhnlich die Konzentration der anderen Reagenzien.
Während die Konzentrationen vieler der verschiedenen Reagenzien in der Probe und in den Reagenslösungen im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Analyten bestimmt werden, wird die endgültige Konzentration jedes der Reagenzien zur Optimierung der Empfindlichkeit des Assays über den interessierenden Bereich gewöhnlich empirisch bestimmt. Bei bestimmten Vorschriften können einzelne Reagenzien in beträchtlichem Überschuß verwendet werden, ohne daß die Empfindlichkeit des Assays nachteilig beeinflußt wird.
Bei der Durchführung des Assays ist die Reihenfolge der Zugabe nicht kritisch, obwohl die Vorschrift gewöhnlich zuerst die Vereinigung der Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamine enthält, in einem wäßrigen Medium mit den Antikörpern für Amphetamin und Methamphetamin und anschließend die Zugabe der zwei Konjugate umfaßt. Alternativ können die Konjugate und Antikörper gleichzeitig zu der Probe gegeben werden oder die Probe und die Konjugate können vereinigt und anschließend die Antikörper zugegeben werden. Das Gemisch wird anschließend unter Bedingungen gehalten, die es den Antikörpern erlauben, sich als Funktion der Amphetamin- und Methamphetaminmenge in der Probe an das Konjugat zu binden. Wie vorangehend diskutiert, wird dies erreicht, indem die Probe für eine Zeitdauer von im allgemeinen weniger als 1 Stunde und vorzugsweise etwa 2 Sekunden bis 10 Minuten bei einer geeigneten Temperatur, geeignetem pH-Wert etc. gehalten wird. Wenn das Assayverfahren homogen ist, dann werden zu diesem Zeitpunkt irgendwelche erforderlichen Komponenten des signalerzeugenden Systems, die noch nicht vorliegen, zu der Probe gegeben, und das Signal wird anschließend bestimmt. Wenn andererseits das Assayverfahren heterogen ist, dann werden zu diesem Zeitpunkt die an den Antikörper gebundenen Konjugate von den nicht gebundenen Konjugaten abgetrennt. Irgendwelche erforderlichen Komponenten des signalerzeugenden Systems werden dann zu einer der abgetrennten Fraktionen gegeben, und das Signal wird anschließend bestimmt. In beiden Fällen steht das resultierende Signal in Beziehung zu dem durch eine Probe oder einen Kalibrator mit einer vorher festgesetzten Menge des vorliegenden Amphetamins und/oder Methamphetamins oder durch eine negative Probe oder einen negativen Kalibrator erzeugten Signal. Die Bestimmung des Signals wird erreicht, indem die Probe den signalerzeugenden Mitteln ausgesetzt wird.
Wie vorangehend ebenfalls diskutiert, können die Mengen jeder der in dem Assay verwendeten Komponenten auf der Grundlage der vorher festgesetzten minimalen Amphetamin- und Methamphetaminmengen, die der Assay bestimmt, sowie der Höhe des erwünschten Signals ausgewählt werden. Das Ergebnis des Assays zeigt, ob irgendwelche Amphetamine vorliegen, jedoch nicht welches.
Bequemerweise kann die Assay-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem Testsatz in einer abgepackten Kombination mit vorher festgesetzten Mengen der zur Bestimmung von Amphetaminen verwendeten Reagenzien bereitgestellt werden. Wie vorangehend angemerkt, umfassen diese Komponenten einen Antikörper für Amphetamin, einen Antikörper für Methamphetamin, Konjugate, die zu diesen Antikörpern komplementäre Ligand-Analoga verwenden, und irgendwelche erforderlichen Komponenten des signalerzeugenden Systems, wobei mindestens einer der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist. Zusätzlich können andere Zusätze, wie Hilfsreagenzien, zum Beispiel Stabilisatoren, Puffer und dergleichen, enthalten sein. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können breit variiert werden, um Konzentrationen in der Reagenslösung bereitzustellen, welche die Empfindlichkeit des Assays weitgehend optimieren. Die Reagenzien können in Lösung oder als Trockenpulver, in der Regel lyophilisiert, umfassend Excipientien, bereitgestellt werden, welche beim Auflösen eine Reagenslösung mit den geeigneten Konzentrationen zur Durchführung des Assays bereitstellen.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung betreffen Konjugate und Antikörper zur Verwendung in einem Amphetamin-/Methamphetamin-Assay. Folglich betrifft in dieser Hinsicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestimmte Verbindungen, welche in dem Assay verwendet werden können oder Vorstufen der so verwendeten Verbindungen sind. Daher betrifft die vorliegende Erfindung in ihrem Verbindungsaspekt eine Verbindung der Formel I:
worin:
R für Wasserstoff oder Methyl steht;
X für Sauerstoff, Schwefel steht oder eine Bindung bedeutet;
R&sub1; Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
R&sub2; Alkylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
n 0 oder 1 ist;
R&sub3; Wasserstoff, -SR&sub4;, worin R&sub4; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, ist oder für (A)pZ steht, wobei A von einer Funktionalität abgeleitet ist, die mit einer Thiolgruppe unter Bildung einer Bindung zwischen dem Schwefelatom der Thiolgruppe und A reagieren kann, und Z eine Poly(aminosäure) ist; und
p 1 ist, wenn R&sub3; für Wasserstoff oder -SR&sub4; steht, und eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht der Poly(aminosäure), dividiert durch 500, ist, wenn R&sub3; für (A)pZ steht;
und mit der Maßgabe, daß wenn n 0 ist, R&sub1; Alkylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt; und mit der weiteren Maßgabe, daß der Benzol-Ring in der meta- oder der para-Stellung zur
Gruppe -CH&sub2;CHCH&sub3; an X gebunden ist, und wenn X eine Bindung ist, der Benzol-Ring in der para-Stellung an X gebunden ist.
Wenn n 0 ist, und R&sub3; -SR&sub4; bedeutet, weisen die Verbindungen dieser Erfindung die folgende Formel II:
auf, worin R, R&sub1;, R&sub4; und X wie vorangehend definiert sind. Wenn X Sauerstoff oder Schwefel ist, können die Verbindungen der Formel II aus 3-Hydroxyphenylaceton, 3-Mercaptophenylaceton, 4- Hydroxyphenylaceton und 4-Mercaptophenylaceton hergestellt werden, die ihrerseits durch Acetylieren der 3- oder 4-Hydroxyphenylessigsäure oder der 3- oder 4-Mercaptophenylessigsäure und anschließende Decarboxylierung und Hydrolyse hergestellt werden können. 3- oder 4-Hydroxyphenylaceton oder 3- oder 4-Mercaptophenylaceton wird dann mit Natrium- oder Kaliumcarbonat behandelt und anschließend mit YR&sub1;SSR&sub4; umgesetzt, worin Y Halogen, vorzugsweise Chlor oder Brom, ist, und R&sub1; und R&sub4; wie vorangehend definiert sind. Das entstandene Produkt wird dann mit Ammoniumacetat oder Methylamin und anschließend mit einem Reduktionsmittel, wie Natriumcyanoborhydrid umgesetzt, wobei das Amphetamin-Analogon oder das Methamphetamin-Analogon der vorangehenden Formel II gebildet wird. Die Verbindung YR&sub1;SSR&sub4; kann durch die Umsetzung von YR&sub1;SH und R&sub4;SS(O)&sub2;CH&sub3; unter Bedingungen zur Bildung des erwünschten Disulfidprodukts hergestellt werden.
Alternativ können die Verbindungen der vorangehenden Formel II, worin X S bedeutet, aus 3- oder 4-Nitrophenylaceton hergestellt werden, das seinerseits durch Acetylieren der 3- oder 4-Nitrophenylessigsäure und anschließende Decarboxylierung und Hydrolyse hergestellt werden kann. Das 3- oder 4-Nitrophenylaceton wird mit Ammoniumacetat oder Methylamin und anschließend mit einem Reduktionsmittel, wie Natriumcyanoborhydrid, umgesetzt, wobei das Nitroamphetamin- oder Nitromethamphetamin- Analogon gebildet wird. Als nächstes wird die Nitrogruppe durch die Umsetzung mit Natriumdithionit zu dem Amin reduziert, das dann durch die Umsetzung mit Salpetersäure in verdünnter Schwefelsäure in das Diazoniumsalz umgewandelt wird. Die Umsetzung des Diazoniumsalzes mit HSR&sub1;SH und die anschließende Bildung eines Disulfids durch die Umsetzung mit R&sub4;SS(O)&sub2;CH&sub3; ergibt das Disulfidderivat der Formel II. In der Formel I, wenn R&sub3; Z ist, d. h. eine Poly(aminosäure), kann der Umsetzung des Diazoniumsalzes mit HSR&sub1;SH die Umsetzung mit einer so funktionalisierten Poly(aminosäure) folgen, daß (A)pZ gebildet wird, so daß eine Reaktion mit Thiolgruppen erfolgen kann. A kann zum Beispiel Brom- oder Iodacetyl, (N-Maleinimidyl)cyclohexylcarbonyl oder (N-Maleinimidylmethyl)benzoyl sein, das an eine Aminogruppe der Polyaminosäure gebunden ist, wobei ein stabiles Amid gebildet wird.
Wenn X eine Bindung ist, können die Verbindungen der Formel II durch Derivatisieren der Carbonsäuregruppe in der meta- oder der para-Stellung der meta- oder para-Carboxylphenylessigsäure unter Verwendung von in dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Alternativ können diese Verbindungen, ausgehend von meta- oder para-Halogenphenylessigsäure, durch die Umsetzung dieser Verbindungen mit einem Alkylmetall oder Metallhydrid, wie Alkyllithium oder Kaliumhydrid, hergestellt werden, welches ein Metallsalz bildet, das dann durch die Umsetzung mit YR&sub1;SSR&sub4;, worin Y, R&sub1; und R&sub4; wie vorangehend definiert sind, in die geeignete Seitenkette umgewandelt wird. In jedem der beiden Fälle wird anschließend die Essigsäureeinheit durch die vorangehend angegebenen Verfahren in eine Amphetamin- oder Methamphetaminseitenkette umgewandelt.
Wenn n 1 ist, X eine Bindung bedeutet, und R&sub3; für -SR&sub4; steht, weisen die Verbindungen dieser Erfindung die folgende Formel III:
auf, worin R, R&sub1;, R&sub2; und R&sub4; wie vorangehend definiert sind. Die Verbindungen der Formel III können aus Amphetamin und Methamphetamin hergestellt werden, indem zuerst die Amino- oder Methylaminogruppe mit einer geeigneten Blockierungsgruppe geschützt wird, und anschließend die Umsetzung mit Aluminiumtrichlorid und YC(O)R&sub1;C(O)&sub2;R&sub5; folgt, worin R&sub1; und Y wie vorangehend definiert sind, und R&sub5; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wobei der -C(O)R&sub1;C(O)&sub2;R&sub5;-Ester an der para-Stellung der Phenylgruppe gebildet wird, der anschließend hydrolysiert wird, wobei die Säure, d. h. -C(O)R&sub1;C(O)&sub2;H, gebildet wird. Als nächstes wird die Carbonylgruppe reduziert, und anschließend wird die Säurefunktionalität, zum Beispiel durch die Bildung eines aktivierten Esters, aktiviert, der dann mit NH&sub2;R&sub2;SSR&sub4; umgesetzt wird, wobei das Amid gebildet wird. Die Schutzgruppe wird anschließend entfernt, wobei zusätzlich die Disulfidgruppe, d. h. R&sub3;=SR&sub4;, in die Thiolgruppe, d. h. R&sub3;=H, umgewandelt werden kann. Wenn R&sub3; eine Poly(aminosäure) sein soll, kann die Thiolverbindung sofort mit einer so funktionalisierten Poly(aminosäure) umgesetzt werden, daß sie mit Thiolgruppen reagieren kann, oder, wenn eine Lagerung dieses Produkts für eine zukünftige Verwendung gewünscht wird, kann es durch die Umsetzung mit R&sub4;SS(O)&sub2;CH&sub3; in ein Dithioprodukt der vorangehenden Formel III umgewandelt werden.
Die Verbindungen der Formel NH&sub2;R&sub2;SSR&sub4; werden durch die Umsetzung von NH&sub2;R&sub2;SH mit R&sub4;SS(O)&sub2;CH&sub3; unter Bedingungen zur Bildung des gewünschten Disulfidprodukts hergestellt.
Wenn R&sub1; Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, n 1 ist, R&sub3; -SR&sub4; darstellt und X keine Bindung ist, weisen die Verbindungen dieser Erfindung die folgende Formel IV:
auf, worin R, R&sub1;, R&sub2; und R&sub4; wie vorangehend definiert sind, und X' für Sauerstoff oder Schwefel steht. Die Verbindungen der Formel IV können aus 3-Hydroxyphenylaceton, 3-Mercaptophenylaceton, 4-Hydroxyphenylaceton und 4-Mercaptophenylaceton, hergestellt werden, indem zuerst 3- oder 4-Hydroxyphenylaceton oder 3- oder 4-Mercaptophenylaceton mit YR&sub1;CO&sub2;R&sub5; umgesetzt wird, worin Y Halogen bedeutet, vorzugsweise Brom oder Chlor, und R&sub5; Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise t-Butyl, darstellt. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, daß vor der Umsetzung mit YR&sub1;CO&sub2;R&sub5; zuerst Natrium- oder Kaliumcarbonat zugegeben wird. Auf jeden Fall wird das entstandene Produkt hydrolysiert, wobei die Säure gebildet wird, welche anschließend zum Beispiel durch die Bildung eines aktivierten Esters aktiviert und zur Bildung des entsprechenden Amids mit NH&sub2;R&sub2;SSR&sub4; umgesetzt wird. Das Produkt wird dann mit Ammoniumacetat oder Methylamin und anschließend mit einem Reduktionsmittel, wie Natriumcyanoborhydrid, zur Bildung des Amphetamin- oder des Methamphetamin-Analogons der vorangehenden Formel IV umgesetzt.
Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung, die optische Isomere des Amphetamins oder Methamphetamins sind, können hergestellt werden. Solche optischen Isomere können aus optischen Isomeren des Amphetamins, Methamphetamins oder deren optisch aktiven Vorstufen, d. h. d-meta-Hydroxyephedrin, d-Metaraminol etc., hergestellt werden, welche durch in dem Fachgebiet anerkannte Verfahren in optische Isomere des Amphetamins oder Methamphetamins umgewandelt werden. In solchen Fällen wird das an das optisch aktive Kohlenstoffatom gebundene Amin (oder Methylamin) zuerst mit einer allgemein üblichen Schutzgruppe, wie t- Butoxycarbonyl (t-boc) geschützt, und die Verbindung wird dann durch die vorangehend angegebenen Verfahren derivatisiert, wobei in der meta- oder der para-Stellung der Phenylgruppe eine geeignete Substituentengruppe bereitgestellt wird, und anschließend wird die Schutzgruppe entfernt, wobei sich das entsprechende optisch aktive Isomer ergibt.
Wenn R&sub3; für (A)pZ steht, sind die Amphetamin- und Methamphetamin-Analoga durch die Bindungsgruppe A, wobei A von einer Funktionalität abgeleitet ist, die mit einer Thiolgruppe reagieren kann, an eine Poly(aminosäure) Z gebunden.
Das Molekulargewicht der Poly(aminosäuren) beträgt im allgemeinen mindestens etwa 5000 und weist keine Obergrenze auf, wobei es gewöhnlich weniger als 10000000 und in der Regel nicht mehr als etwa 600000 beträgt. Abhängig davon, ob ein Antigen oder ein Enzym beteiligt ist, liegen in der Regel verschiedene Bereiche vor. Mit Antigenen beträgt der Bereich des Molekulargewichts etwa 5000 bis 10000000, in der Regel etwa 20000 bis 600000, und häufiger etwa 25000 bis 250000. Mit Enzymen beträgt der Bereich des Molekulargewichts etwa 10000 bis 600000 und meistens etwa 10000 bis 300000. Sowohl für Antigene als auch für Enzyme liegt in der Regel mindestens etwa 1 Amphetamin- oder Methamphetamin-analoge Gruppe pro einem Molekulargewicht von 200000, üblicher mindestens 1 pro einem Molekulargewicht von 50000, vor. Im Fall von Antigenen mit einem mittleren Gewicht (35000 bis 600000) beträgt die Zahl der Amphetamin- oder Methamphetamin-analogen Gruppen im allgemeinen etwa 2 bis 250, üblicher 10 bis 100. Bei Antigenen mit einem niedrigeren Molekulargewicht (unter 35000) liegt die Zahl der Amphetamin- oder Methamphetamin-analogen Gruppen im allgemeinen im Bereich von etwa 2 bis 10, in der Regel im Bereich von 2 bis 5.
Verschiedene Proteinarten können als antigenes Poly(aminosäure)material verwendet werden. Diese Arten umfassen Albumine, Serumproteine, z. B. Globuline, Proteine der Augenlinse, Lipoproteine und dergleichen. Beispiele von Proteinen umfassen Rinderserumalbumin, Hämocyanin der Schlüssellochschnekke, Eieralbumin, Rinder-γ-globulin und dergleichen. Alternativ können synthetische Poly(aminosäuren) mit ausreichend verfügbaren Aminogruppen, z. B. Lysine, hergestellt werden.
Die Enzyme können, abhängig von der Konjugationsfähigkeit, Umsatzrate und der physiologischen Flüssigkeit, in welcher die Amphetamine gemessen werden sollen, breit variieren. Geeignete Enzyme sind vorangehend angegeben. Besonders bevorzugt sind die Enzyme, die Nikotinamidadenindinucleotid (NAD) oder dessen Phosphat (NADP), besonders das erstere, als Co-Faktor verwenden, oder deren reduzierte Formen. Ein Beispiel dieser Enzyme ist Glucose-6-phosphatdehydrogenase.
Die Antigen- und Enzym-Konjugate können bequem hergestellt werden, indem diese Poly(aminosäuren) zuerst mit einer Bindungsgruppe, die auch mit einer Thiolgruppe reagieren kann, d. h. Bromessigsäure, Chloressigsäure, deren aktivierte Ester etc., umgesetzt werden. Das entstandene Produkt weist ein aktives Halogenatom auf, das mit der Thiolgruppe der Formel I, d. h. R&sub3;=H, reagieren kann. Die Thiolgruppe der Formel I wird durch die Umsetzung des Disulfids, d. h. R&sub3;=SR&sub4;, unter zur Bildung des Thiols geeigneten Reduktionsbedingungen, leicht hergestellt. Das Thiolprodukt wird im allgemeinen zur Vermeidung der unerwünschten Disulfidbildung kurz vor der Umsetzung mit der funktionalisierten Poly(aminosäure) gebildet.
Durch die Anwendung der am Beispiel zu veranschaulichenden Verfahren werden die am Amphetamin beziehungsweise Methamphetamin vorliegenden Amin- und Methylamineinheiten während des Konjugationsverfahrens beibehalten. Diese Einheiten, welche eine Unterscheidung zwischen sehr ähnlichen Verbindungen bereitstellen, werden exponiert und führen zur Bildung von Antikörpern mit einer geringen oder minimalen Erkennung von strukturell ähnlichen Verbindungen.
In dieser Erfindung verwendbare monoklonale Antikörper können nach den Standardverfahren von Kohler und Milstein, Nature 265 : 495-497, 1975 hergestellt werden. Das Antigen-Konjugat wird zum Beispiel einer Maus injiziert, und nach einer ausreichenden Zeit wird die Maus getötet, und die Milzzellen werden gewonnen. Die Milzzellchromosomen, die die Basensequenzen für die gewünschten Immunglobuline kodieren, werden durch das Fusionieren der Milzzellen, im allgemeinen in Anwesenheit eines nicht-ionischen Detergens, zum Beispiel Polyethylenglykol, unsterblich gemacht. Die entstandenen Zellen, die die fusionierten Hybridoma enthalten, läßt man in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, wachsen, und die überlebenden Zellen läßt man in einem solchen Medium unter Verwendung limitierender Verdünnungsbedingungen wachsen. Man läßt die Zellen in einem geeigneten Behälter, z. B. Mikrotitervertiefungen, wachsen, und der Überstand wird auf monoklonale Antikörper mit der erwünschten Spezifität untersucht.
Zur Erhöhung der Ausbeute der monoklonalen Antikörper existieren verschiedene Verfahren, wie die Injektion von Hybridomzellen in die Bauchhöhle eines Säugerwirtes, der die Zellen annimmt, und das Sammeln der Bauchwasserflüssigkeit. Wenn sich der monoklonale Antikörper in nicht ausreichender Menge in der Bauchwasserflüssigkeit ansammelt, wird der Antikörper aus dem Blut des Wirtes gewonnen. Verschiedene, allgemein übliche Wege zur Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper von anderen Proteinen und weiteren Verunreinigungen existieren (siehe Kohler und Milstein, oben).
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angegeben.
In diesen Beispielen betrifft der Bezug auf Teile pro Million (ppm) in den Spektren der magnetischen Kernresonanz (NMR) die ppm-Werte feldabwärts von Tetramethylsilan (TMS).
Wenn es nicht anders angegeben ist, sind alle Temperaturen Celsiusgrade.
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
G6PDH - Glucose-6-phosphatdehydrogenase;
BSA - Rinderserumalbumin;
KLH - Hämocyanin der Schlüssellochschnecke;
DC - Dünnschichtchromatographie;
G6P - Glucose-6-phosphat;
NAD - Nikotinamidadenindinucleotid;
NADH - reduziertes Nikotinamidadenindinucleotid;
RSA - Kaninchenserumalbumin;
CDCl&sub3; - deuteriertes Chloroform;
CD&sub3;OD - deuteriertes Methanol;
DMSO - Dimethylsulfoxid;
D&sub2;O - deuteriertes Wasser;
CFA - komplettes Freund-Adjuvans;
DMEM - von Dulbecco modifiziertes Medium nach Eagle;
ELISA - enzymgekoppelter Immunabsorptions-Assay;
HBSS - gepufferte Salzlösung nach Hanks;
HT-Medium - Super-DMEM mit 0,1 mM Hypoxanthin, 16 µM Thymidin (50 · Stammlösung von Sigma);
HAT-Medium - HT-Medium mit 0,8 µM Aminopterin (50 · HAT- Stammlösung von Sigma);
ip - intraperitoneale Injektion;
iv - intravenöse Injektion;
sc - subkutane Injektion;
IFA - inkomplettes Freund-Adjuvans;
NSS - normales Schafsserum;
PBS - phosphatgepufferte Salzlösung, pH-Wert 7,2;
Super DMEM - DMEM mit 10% fötalem Kälberserum, 10% NCTC 109, 50 mg/ml Gentamicin, 4,0 mM L- Glutamin, 1,0 mM Oxalessigsäure, 0,45 mM Pyruvat, 2,5 IU/l Rinderinsulinwaschpuffer und 0,05% Tween 20 in PBS.

EXPERIMENTELLER TEIL

VERBINDUNGEN

1. Herstellung von d,l-meta- (Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin

A. Herstellung von meta-Hydroxyphenylaceton

Eine Lösung von 60 g (0,395 mol) meta-Hydroxyessigsäure in 146 ml Essigsäureanhydrid und 146 ml Pyridin wurde unter Verwendung eines Rundkolbens, der mit einem Rückflußkühler und einem Calciumsulfattrockenrohr verbunden war, über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Die vollständige Umsetzung wurde durch das Verschwinden des Ausgangsmaterials unter Verwendung von DC (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) beobachtet. Das Produkt wurde anschließend unter Vakuum bei 400 bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch die Zugabe von 225 ml wasserfreiem Ethanol und 22,5 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert, und die braune Lösung wurde dann 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt, anschließend abgekühlt und aus Gründen der Bequemlichkeit über Nacht im Gefrierschrank aufbewahrt.
Die entstandene Lösung wurde mit Wasser verdünnt, und die wäßrige Lösung wurde mit einer Gesamtmenge von 600 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit 1 · 20 ml gesättigter Natriumchloridlösung, 1 · 20 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und 1 · 30 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Methylenchloridlösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei sich die Titelverbindung als öliges Produkt ergab.
Eine kleine Menge dieses Produkts wurde durch Chromatographie auf präparativen Dickschichtchromatographieplatten, die mit 1 : 1 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiert wurden, gereinigt. Die gewünschte Bande wurde gewonnen, mit Essigsäureethylester ausgewaschen, und die Lösung wurde unter Vakuum eingedampft, wobei sich die reine Titelverbindung ergab. Das NMR-Spektrum in CDCl&sub3; zeigt ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,35 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 3,65 ppm; ein Multiplett mit 2 Protonen bei 6,65-6,85 ppm; ein Dublett von Dubletts mit 1 Proton bei 7,3 ppm; ein Singulett mit 1 Proton bei 8 ppm. Das UV-Spektrum des Produkts zeigt eine bathochrome Verschiebung bei einem pH-Wert von 8 und in alkalischer Lösung (λmax 273 nm - pH 8; λmax 293 nm - 1 N NaOH).

B. Herstellung von meta-(t-Butylcarboxymethoxy)phenylaceton

7 g Kaliumcarbonat und 12 ml Bromessigsäure-t-butylester wurden zu einer Lösung von 10,0 g meta-Hydroxyphenylaceton (ungereinigtes Produkt aus A vorangehend) in 100 ml Tetrahydrofuran gegeben. Man ließ die entstandene Suspension bei Raumtemperatur über Nacht rühren. Ein aliquoter Teil des Reaktionsgemisches wurde entnommen und auf DC getüpfelt (mit 1 : 4 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiertes Silicagel). Sie zeigte die Bildung einer nur kleinen Menge des neuen Produkts. Daher wurden zusätzliche Mengen von Kaliumcarbonat (3 g) und Bromessigsäure-t-butylester (8 ml) zugegeben. Man ließ das entstandene System bei Raumtemperatur rühren, bis die vollständige Umsetzung beobachtet wurde (oder bis zu maximal 4 Tage). Die Niederschläge wurden abfiltriert, und zu der Lösung wurden etwa 30 g Silicagel gegeben (EM-Flashsäulensilicagel). Die entstandene Suspension wurde auf eine Silicagelsäule (2 Inch · 8 Inch) aufgebracht und bis zur vollständigen Elution der Ausgangssubstanz Bromessigsäure-t-butylester mit Hexan eluiert. Anschließend wurde die Säule unter Verwendung von 1 : 19 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiert, bis der größte Teil des gewünschten Produkts, meta-(t-Butylcarboxymethoxy)phenylaceton, eluiert war. Essigsäureethylester wurde anschließend zur Elution der kleinen, auf der Säule verbliebenen Produktmenge verwendet. Das Produkt wurde zu zwei Fraktionen vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft: eine Fraktion mit 6,7 g der reinen Titelverbindung und eine andere Fraktion mit 4,8 g der Titelverbindung, welche eine kleine Menge an Verunreinigungen enthielt. Falls erforderlich, könnte diese zweite Fraktion weiter gereinigt werden. Das NMR-Spektrum der reinen Verbindung in CDCl&sub3; zeigt ein Singulett mit 9 Protonen bei 1,49 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,14 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 3,65 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 4,51 ppm; ein Multiplett mit 3 Protonen bei 6,69 ppm und ein Multiplett mit 1 Proton bei 7,26 ppm. Das UV-Spektrum des Titelprodukts zeigte keine bathochrome Verschiebung bei einem pH-Wert von 8 und in 0,1 N NaOH (λmax 271 nm in beiden Fällen).

C. Herstellung von meta-(Carboxymethoxy)phenylaceton

40 ml Trifluoressigsäure wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff zu 6,7 g meta-(t-Butylcarboxymethoxy)phenylaceton gegeben. Nach fünf Minuten wurde durch DC (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) festgestellt, daß die Umsetzung beendet war, und das Lösungsmittel wurde anschließend bis zur Trockene abgedampft. Das entstandene braune Öl zeigte auf DC das gewünschte Produkt und eine Spur des Ausgangsmaterials. Das IR-Spektrum zeigte ein charakteristisches Carbonsäuresignal bei 3600-2450 cm&supmin;¹.

D. Herstellung von Methyldithioethylaminhydrochlorid

Eine Lösung von 6 g (0,0396 mol) Methanthiolsulfönsäuremethylester in 10 ml Methanol (durch mindestens 10-minütiges Einleiten von Stickstoff entgast) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 4,3 g (0,0380 mol) 2-Aminoethanthiolhydrochlorid in 10 ml Methanol (ebenfalls entgast) gegeben. Die Zugabe dauerte etwa 0,5 Stunden. Anschließend ließ man die entstandene Lösung bei Raumtemperatur 2 Stunden rühren, und die DC (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) eines aliquoten Teils der Lösung zeigte eine vollständige Umsetzung. Die entstandene Lösung wurde anschließend bis zur Trockene eingedampft, und der so erhaltene weiße Feststoff wurde anschließend unter Verwendung von 100 ml Ether verrieben, und das Rohprodukt wurde durch Saugfiltration aufgenommen und über Nacht unter Vakuum getrocknet. 6,2 g des Rohprodukts wurden in Methanol gelöst und mit 20 g silanisiertem Silicagel RP-2 (EM-Reagens, 70-230 mesh) gemischt. Die entstandene Suspension wurde anschließend bis zur Trockene eingedampft und dann auf eine Säule mit silanisiertem Silicagel (RP-2; 2 Inch · 8 Inch, EM- Reagens, Partikelgröße 70-230 mesh) aufgebracht. Die Säule wurde unter Verwendung von 1 1 Methylenchlorid und anschließend 1 : 19 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiert, bis die Titelverbindung erhalten wurde. Das Abdampfen des Lösungsmittels ergab 4,8 g der Titelverbindung als weißen Feststoff. Das NMR-Spektrum dieses Produkts in CD&sub3;OD zeigt ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,45 ppm; ein Triplett mit 2 Protonen bei 3,06 ppm und ein Multiplett mit 2 Protonen bei 3,3 ppm.

E. Herstellung von meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)phenylaceton

6,1 g (0,032 mol) pulverisiertes 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCI) und 3,7 g (0,032 mol) N-Hydroxysuccinimid wurden unter Stickstoff bei 50 zu einer Lösung von 6,1 g (0,029 mol) meta-(Carboxymethoxy)phenylaceton in 56 ml N,N-Dimethylformamid (über einem Molekularsieb mit 3 Å getrocknet) gegeben. Man ließ das entstandene Reaktionsgemisch bei 5º über Nacht rühren. Die vollständige Bildung von N-Hydroxysuccinimidsäureester wurde beobachtet. Zur Einstellung des pH-Wertes auf 8,5 wurde Triethylamin zu 4,7 g (0,029 mol) des Methyldithioethylamidhydrochlorids (oben in D hergestellt) in 20-50 ml Wasser gegeben. Anschließend wurde der N-Hydroxysuccinimidsäureester des meta-(Carboxymethoxy)phenylacetons tropfenweise zu der Methyldithioethylaminlösung gegeben, wobei der pH-Wert auf 8,5 eingestellt war, und man ließ die entstandene Lösung bei 50 l Stunde rühren. Zusätzliche Reagenzien, 2 g (0,0125 mol) Methyldithioethylaminhydrochlorid und 3,0 g (0,0156 mol) EDCI, wurden zugegeben, der pH-Wert der entstandenen Lösung wurde auf 6,5 eingestellt, und man ließ das Reaktionsgemisch bei 5º über Nacht rühren.
Das Produkt wurde mit Wasser verdünnt, und die entstandene Lösung wurde unter Verwendung von Methylenchlorid extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet, und die Lösungsmittel wurden unter Vakuum abgedampft, wobei sich ein dunkles Öl ergab, das anschließend in einer minimalen Menge Methylenchlorid gelöst wurde. Die entstandene Lösung wurde dann zu 20 g Silicagel (EM-Flashsäulensilicagel) gegeben. Die so erhaltene Suspension wurde bis zur Trockene eingedampft, und das getrocknete Silicagel wurde auf eine Säule mit Silicagel (2 Inch · 8 Inch, EM-Flashsäulensilicagel) aufgebracht, und anschließend wurde Sand ( 0,5-1,0 Inch) von oben auf das Silicagel gegeben. Die Säule wurde dann unter Verwendung von 1 : 1 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiert. 4,6 g des Titelprodukts wurden erhalten, welches auf präparativen Dickschichtsilicagelplatten (mit 1 : 1 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiertes Silicagel GF) weiter gereinigt wurde. Die gewünschte Bande wurde gewonnen, mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid ausgewaschen, und die Lösung wurde eingedampft, wobei sich 4,3 g des Titelprodukts ergaben. Das NMR-Spektrum in CDCl&sub3; zeigt ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,18 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,41 ppm; ein Triplett mit 2 Protonen bei 2,85 ppm; ein Multiplett mit 4 Protonen bei 3,69 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 4,50 ppm; ein Multiplett mit 3 Protonen bei 6,69- 6,91 ppm und ein Multiplett mit 1 Proton bei 7,40 ppm.

F. Herstellung von d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)amphetamin

834 mg (10,8 mmol) Ammoniumacetat wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff zu einer Lösung von 680 mg (2,17 mmol) meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)phenylaceton in 21 ml Methanol (durch 15-minütiges Einleiten von Stickstoff entgast) gegeben. Nach 0,5 Stunden wurden 152 mg (2,42 mmol) Natriumcyanoborhydrid unter Stickstoff in die entstandene Lösung gegeben. Nach 2,5 Stunden wurde das Verschwinden des Ausgangsmaterials mit DC (Silicagel oder Aluminiumoxid, 1 : 9 Volumenteile Methanol:Methylenchlorid) beobachtet. Anschließend wurden zur Einstellung des pH-Wertes des Systems auf 4,6 12 ml Eisessig langsam zu dem Reaktionsprodukt gegeben. Das entstandene Produkt wurde zur Entfernung des Methanols unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingeengt, und etwa 1 g Natriumchlorid und etwa 5 ml Wasser wurden zu der so erhaltenen Lösung gegeben. Die entstandene Lösung wurde anschließend unter Verwendung von Methylenchlorid extrahiert, und die entstandene Methylenchloridlösung wurde über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde dann eingedampft, wobei sich ein hellgelbes Öl ergab, das durch Chromatographie auf präparativen Dickschichtchromatographieplatten (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes EM-Aluminiumoxid) gereinigt wurde. Die gewünschte Bande wurde gewonnen, mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid ausgewaschen, und die Lösung wurde eingedampft und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich 234 mg des Titelprodukts ergaben. Das NMR-Spektrum dieses Produkts in CDCl&sub3; zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,26 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,41 ppm; ein Multiplett mit 4 Protonen bei 2,86 ppm; ein Multiplett mit 1 Proton bei 3,52 ppm; ein Triplett mit 2 Protonen bei 3,61 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 4,53 ppm, ein Multiplett mit 3 Protonen bei 6,90 ppm und ein Triplett mit 1 Proton bei 7,3 ppm.
Diese Verbindung wurde anschließend unter Argon bei 0º aufbewahrt.

G. Herstellung von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin

14 mg (0,090 mmol) Dithioerythrit (DTE) in 1 ml Methanol (mit Argon entgast) und anschließend 12 µl Triethylamin wurden unter Argon bei Raumtemperatur zu 30 mg (0,096 mmol) d,l-meta- (Methyldithioethylamidomethoxy)amphetamin (aus F vorangehend) in 0,64 ml Methanol (mit Argon entgast) gegeben. Nach 2 Stunden wurde ein aliquoter Teil entnommen und auf DC (mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) getüpfelt; sie zeigte die Bildung der Titelverbindung, wenn die DC unter Verwendung von Ellmans Reagens besprüht wurde (gelber Fleck).
Das Lösungsmittel wurde anschließend bis zur Trockene abgedampft, dann wurde eine zusätzliche Menge von 1 ml Methanol (mit Argon entgast) zugegeben, und das Lösungsmittel wurde erneut abgedampft. Das entstandene Produkt wurde anschließend unter reduziertem Druck unter Verwendung einer Vakuumpumpe bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich die Titelverbindung ergab.

2. Herstellung von d,l-meta- (Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin

A. Herstellung von d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)methamphetamin

818 mg (12,1 mmol) Methylaminhydrochlorid wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff zu einer Lösung von 680 mg (2,17 mmol) meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)phenylaceton (auf ähnliche Art und Weise wie in den Stufen A-E von Beispiel 1 hergestellt) in 21 ml Methanol (durch 15-minütiges Einleiten von Stickstoff entgast) gegeben. Nach 1 Stunde wurden 136 mg (2,17 mmol) Natriumcyanoborhydrid zugegeben, und man ließ die entstandene klare Lösung bei Raumtemperatur unter Stickstoff stehen. Nach 3 Stunden wurde das Verschwinden des Ausgangsmaterials mit DC (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel; mit 1 : 24 Volumenteilen Methanol: Methylenchlorid eluiertes Aluminiumoxid, Typ E60F-254) verfolgt. Anschließend wurde zur Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 4-4,2 langsam Eisessig zu dem Reaktionsprodukt gegeben. Das entstandene Produkt wurde zur Entfernung des Methanols unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingeengt, und anschließend wurde eine kleine Wassermenge von etwa 5 ml zugegeben. Die entstandene Lösung wurde dann unter Verwendung von Methylenchlorid extrahiert. Das Abdampfen der Lösungsmittel ergab die Titelverbindung als rohes, öliges Produkt.
Das Produkt wurde gereinigt, indem es zuerst in einer kleinen Methylenchloridmenge gelöst und diese Lösung auf präparativen Dickschichtchromatographieplatten (mit 1 : 24 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes EM-Aluminiumoxid, Typ E) chromatographiert wurde. Die Hälfte der Platten zeigte ein hoch reines Produkt, und die gewünschte Bande wurde gewonnen, mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol :Methylenchlorid ausgewaschen, und die Lösung wurde eingedampft, wobei sich 167 mg des Titelprodukts ergaben. Das Titelprodukt wurde auch aus den anderen übrigen Platten gewonnen und unter denselben Bedingungen, die vorangehend beschrieben wurden, erneut chromatographiert, wobei sich 232 mg zusätzliche Verbindung ergaben. Gesamtausbeute = 399 mg. Das NMR-Spektrum in CD&sub3;OD zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,20 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,40 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,71 ppm; ein Triplett mit 2 Protonen bei 2,84 ppm; ein Triplett mit 3 Protonen bei 3,60 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 4,54 ppm, ein Multiplett mit 3 Protonen bei 6,90 ppm und ein Triplett mit 1 Proton bei 7,3 ppm.

B. Herstellung von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin

13,5 mg (0,0875 mmol) Dithioerythrit (DTE) und 13,9 µl Triethylamin wurden bei Raumtemperatur unter Argon zu 30 mg (0,092 mmol) d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)methamphetamin (aus dem vorangehenden Beispiel A) in 3,65 ml Methanol (15 Minuten mit Argon entgast) gegeben. Nach 2 Stunden wurde ein aliquoter Teil entnommen und auf DC (mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) getüpfelt, welche die Bildung der Titelverbindung zeigte, wenn die DC unter Verwendung von Ellmans Reagens besprüht wurde. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, und die zusätzliche Menge von 1 ml Methanol (15 Minuten mit Argon entgast) wurde zugegeben. Das Lösungsmittel wurde erneut abgedampft, und das entstandene Produkt wurde unter reduziertem Druck unter Verwendung einer Vakuumpumpe bei Raumtemperatur 1 Stunde getrocknet, wobei sich die Titelverbindung ergab.
Diese Verbindung wurde anschließend unter Argon bei 0º aufbewahrt.

3. Herstellung von d-para- (Methyldithioethylamidomethyl)methamphetamin

A. Herstellung von N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)methamphetamin

12 g (0,064 mol) D-Methamphetaminhydrochlorid wurden in 70 ml Wasser in einem 500 ml Rundkolben, der mit einem Rührstäbchen ausgestattet war, gelöst. 13,5 g (0,128 mol) Natriumcarbonat wurden zu dieser Lösung gegeben. Nach dem Auflösen des Natriumcarbonats wurden 70 ml Tetrahydrofuran, und anschließend tropfenweise 10,7 ml Trichlorethylchlorformiat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde kräftig gerührt.
Anschließend wurde das System mit konzentrierter HCl bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Das Tetrahydrofuran wurde durch Einengen auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Die entstandene wäßrige Lösung wurde mit 3 · 100 ml Methylenchlorid extrahiert, und die organischen Lösungen wurden vereinigt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt, wobei sich 20 g der Titelverbindung ergaben. Das NMR- Spektrum dieses Produkts in CDCl&sub3; zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,2 ppm; ein Multiplett mit 5 Protonen bei 2,85 ppm; ein Multiplett mit 3 Protonen bei 4,6 ppm; und ein Singulett mit 5 Protonen bei 7,2 ppm.

B. Herstellung von N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para- (ethylcarboxycarbonyl)methamphetamin

In einen 500 ml Rundkolben, der mit einem Rührer und einem Calciumchloridtrockenrohr ausgestattet war, wurden 17,0 g (0,052 mol) N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)methamphetamin und 300 ml getrocknetes Methylenchlorid gegeben. 11,4 ml Ethyloxa- Iylchlorid wurden zu diesem System gegeben. Das System wurde in einem Eisbad auf 0º gekühlt, und 30 g Aluminiumchlorid (5 · 6 g alle 15 Minuten) wurden zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe ließ man das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur erwärmen und rührte über Nacht. Das Reaktionssystem wurde dann zu 600 ml Wasser bei etwa 0º gegeben, und anschließend wurde ausreichend Natriumhydrogencarbonat zu dem System gegeben, um einen pH-Wert von etwa 8-9 zu erreichen. Die entstandene Lösung wurde dann zur Entfernung von Feststoffen filtriert, und die organische Phase wurde isoliert. Die wäßrige Phase wurde erneut mit 200 ml Methylenchlorid extrahiert, und die organischen Phasen wurden vereinigt. Die organische Lösung wurde anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt, wobei sich 15,9 g der Titelverbindung ergaben.

C. Herstellung von N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para- (carboxycarbonyl)methamphetamin

17 g N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para-(ethylcarboxycarbonyl)methamphetamin wurden zu einer Lösung von Methanol: Tetrahydrofuran:1 N NaOH (1 : 1 : 0,5) gegeben. Das System wurde dann 16 Stunden gerührt. Anschließend wurden 100 ml Wasser zu dem System gegeben, und die organischen Lösungsmittel wurden durch einen Rotationsverdampfer entfernt. Die entstandene wäßrige Lösung wurde dann mit 2 · 50 ml Essigsäureethylester extrahiert und durch die Zugabe von konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert. An diesem Punkt begann das Produkt auszufallen. Dieser Niederschlag wurde an der Luft getrocknet, wobei sich die Titelverbindung ergab. Das NMR-Spektrum dieses Produkts in CDCl&sub3;/CD&sub3;OD zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,1 ppm; ein Multiplett mit 5 Protonen bei 2,8 ppm; ein Multiplett mit 3 Protonen bei 4,6 ppm; ein Multiplett mit 2 Protonen bei 7,2 ppm und ein Dublett mit 2 Protonen bei 8,1 ppm.

D. Herstellung von N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para- (carboxymethyl)methamphetamin

2,5 g N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para-(carboxycarbonyl)methamphetamin, 1 g 10%iges Palladium auf Kohle, 40 ml Eisessig und 1 ml Perchlorsäure wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben. Das Gefäß wurde mit Stickstoff entgast und dreimal gespült und anschließend mit 50 psi Wasserstoff 20 Stunden einer Hydrogenolyse unterzogen. Die Umsetzung wurde anschließend beendet, und das Reaktionssystem wurde filtriert. Das Filtrat wurde auf einem Rotationsverdampfer und anschließend unter Vakuum eingeengt. Der entstandene Rückstand wurde auf präparativen Dickschichtchromatographieplatten (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) gereinigt. Die gewünschte Bande wurde ausgewaschen (3 : 7 Volumenteile Methanol: Methylenchlorid) und eingeengt, wobei sich 1,9 g eines Produktes ergaben, das durch Dickschichtchromatographie (mit 1,5 : 100 Volumenteilen Essigsäure zu 7 : 3 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiertes Silicagel) weiter gereinigt wurde. Die gewünschte Bande wurde ausgewaschen, eingeengt und getrocknet, wobei sich 1,8 g des Titelprodukts ergaben.

E. Herstellung von N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para- (methyldithioethylamidomethyl)methamphetamin

1,25 g N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para-(carboxymethyl)methamphetamin wurden in 25 ml trockenem Methylenchlorid mit 0,865 g N,N-Dicyclohexylcarbodiimid und 0,483 g N-Hydroxysuccinimid vereinigt. Es bildete sich nahezu sofort ein Niederschlag, und man ließ die Umsetzung 6 Stunden bei Umgebungstemperatur weiter ablaufen. Zu diesem Zeitpunkt wurde diese Lösung tropfenweise unter Rühren zu einer Lösung von 1,08 g Methyldithioethylaminhydrochlorid und 1,06 g Triethylamin in 25 ml Methylenchlorid gegeben. Die Umsetzung wurde über Nacht fortgesetzt, die Lösung wurde anschließend filtriert, und das Filtrat wurde mit 2 · 50 ml Wasser gewaschen. Die organische Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Produkt wurde durch Dickschichtchromatographie (mit 1 : 1 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiertes Silicagel) gereinigt. Die gewünschte Bande wurde isoliert, ausgewaschen, und die entstandene Lösung wurde eingeengt, wobei sich 1,4 g des Titelprodukts ergaben.

F. Herstellung von para-(Methyldithioethylamidomethyl)methamphetamin

750 mg N-(2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl)-para-(methyldithioethylamidomethyl)methamphetamin und 975 mg metallisches Zink wurden zu 25 ml einer 10%igen Essigsäurelösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, und anschließend wurde das System filtriert, und die entstandene Lösung wurde eingeengt. 20 ml Wasser und 20 ml Tetrahydrofuran wurden zu dem entstandenen Rückstand gegeben. Diese Lösung wurde dann tropfenweise zu 680 mg Methanthiosulfonsäuremethylester gegeben, und das entstandene System wurde über Nacht gerührt. Das System wurde anschließend zur Entfernung des Anteils des organischen Lösungsmittels behandelt, und die entstandene wäßrige Lösung wurde mit Natriumcarbonat basisch gestellt und mit 4 · 30 ml Methylenchlorid extrahiert, wobei sich 325 mg eines rohen Rückstandes ergaben. Dieser Rückstand wurde durch Dickschichtchromatographie (mit 1 : 9 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Aluminiumoxid) gereinigt. Die gewünschte Bande wurde isoliert und mit Methanol:Methylenchlorid, 2 : 8 ausgewaschen. Die entstandene Lösung wurde bis zur Trockene eingeengt und anschließend unter Vakuum weiter getrocknet, wobei sich 300 mg der Titelverbindung ergaben. Das NMR-Spektrum dieses Produkts in CDCl&sub3; zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,09 ppm; ein Singulett mit 1 Proton bei 1,35 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,37 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,42 ppm; ein Multiplett mit 5 Protonen bei 2,81 ppm; ein Multiplett mit 4 Protonen bei 3,6 ppm; ein breites Signal mit 1 Proton bei 6,09 ppm und ein Singulett mit 4 Protonen bei 7,2 ppm.
Auf ähnliche Art und Weise, wie in den vorangehenden Stufen A bis F aufgeführt, wurde auch d-para-Methyldithioethylamidomethylamphetamin hergestellt.

4. Herstellung von meta-(β-Mercaptoethylthio)methamphetamin

A. Herstellung von meta-Nitrophenylaceton

Ein Gemisch aus 20 g 3-Nitrophenylessigsäure, 44 g Pyridin und 106 g Essigsäureanhydrid wurde 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials wurde durch DC (mit 1 : 1 Volumenteilen Diethylether:Hexan eluiertes Silicagel) beobachtet, und die braune Lösung wurde anschließend im Vakuum bei 400 bis zur Trockene eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde in Gegenwart von 7,5 ml konzentrierter HCl und 78 ml Ethanol 1 Stunde eingeengt; und 400 ml Eiswasser wurden zu dem Hydrolyseprodukt gegeben, und das gefällte 3-Nitrophenylaceton wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Zusätzliches Produkt wurde durch das Extrahieren des Filtrats mit Methylenchlorid, das Trocknen über Natriumsulfat, und das Abdampfen der organischen Lösungsmittel erhalten. Die Rohprodukte wurden vereinigt und in einer minimalen Menge von Methanol:Methylenchlorid (1 : 1 Volumenteile) gelöst. 30-50 g Silicagel (Flashchromatographie, EM 230-400 mesh) wurden zugegeben, und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Das getrocknete Silicagel wurde auf eine Säule (3 Inch · 6 Inch) aufgebracht, die dasselbe Silicagel enthielt, und mit 4 : 6 Volumenteilen Essigsäureethylester:Hexan eluiert. Die Lösung, die das gewünschte Produkt enthielt, wurde eingedampft, wobei sich die Titelverbindung ergab. Das NMR-Spektrum für dieses Produkt (in CDCl&sub3;) zeigt ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,34 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 3,63 ppm; ein Multiplett mit 2 Protonen bei 7,5 ppm und ein Multiplett mit 2 Protonen bei 8,0 ppm.

B. Herstellung von d,l-meta-Nitromethamphetamin

Eine Lösung von 10,4 g Methylaminhydrochlorid in 100 ml Wasser wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur zu 8,4 g meta- Nitrophenylaceton (in der vorangehenden Stufe A hergestellt) in einem Gemisch aus 200 ml Isopropanol und 180 ml Tetrahydrofuran gegeben. 7,2 g Natriumacetat und 2,9 g Natriumcyanoborhydrid wurden anschließend zu der entstandenen Lösung gegeben, und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 7 eingestellt. Nach 18 Stunden wurde festgestellt, daß die Umsetzung nicht beendet war, und es wurden weitere Reagenzien, 5,2 g Methylaminhydrochlorid und 1,5 g Natriumcyanoborhydrid, zugegeben. Man ließ das Gemisch über Nacht rühren, und anschließend wurden die organischen Lösungsmittel abgedampft. Das Produkt wurde in etwa 50 ml 2%iger HCl-Lösung gelöst, und der pH-Wert wurde auf 2 eingestellt. Die wäßrige Lösung wurde mit Hexan:Ether (1 : 1 Volumenteile) und anschließend Ether extrahiert, und die wäßrige Lösung wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei sich die Titelverbindung ergab. Dieses Produkt wurde gereinigt, indem es in einer minimalen Menge von Methylenchlorid:Methanol gelöst wurde, zu der Silicagel gegeben wurde (Flashchromatographie). Das Gemisch wurde bis zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde auf eine Säule (3 Inch · 6 Inch) aus Silicagel (Flashchromatographie, EM 230-400 mesh) aufgebracht. Die Säule wurde nacheinander mit Methylenchlorid, 1 : 19 Volumenteilen Methanol :Methylenchlorid, 1 : 9 Volumenteilen Methanol : Methylenchlorid und 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiert. Die Fraktionen des gewünschten Produkts wurden aufgenommen und eingedampft, wobei sich 3,6 g des Titelprodukts ergaben. Das NMR-Spektrum für dieses Produkt (in CDCl&sub3;) zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,05 ppm; ein Singulett mit 1 Proton bei 2,08 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,43 ppm; ein Multiplett mit 3 Protonen bei 2,85 ppm, ein Multiplett mit 2 Protonen bei 7,5 ppm und ein Multiplett mit 2 Protonen bei 8,0 ppm.

C. Herstellung von d,l-meta-Aminomethamphetamin

21,9 g pulverisiertes Natriumdithionit und 175 ml Phosphatpuffer (pH 7) wurden zu 3,5 g meta-Nitromethamphetamin, das in einem Gemisch aus 68 ml Methanol und 68 ml Tetrahydrofuran gelöst war, gegeben. Man ließ das trübe Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 1 Stunde rühren, und die vollständige Umsetzung wurde mit DC (mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) beobachtet.
Das Produkt wurde anschließend bis zur Trockene eingedampft, der Rückstand wurde zu etwa 50 ml Methanol gegeben, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von 1 N NaOH auf 9 eingestellt. Die anorganischen Salze wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde erneut mit Methanol behandelt, und die anorganischen Salze wurden abfiltriert. Der so erhaltene Rückstand wurde in einer minimalen Menge von 1 : 1 Volumenteilen Wasser:Methanol gelöst und mit etwa 10 g Silicagel (Flashchromatographie) gemischt. Die Silicagelsuspension wurde bis zur Trockene eingedampft und auf eine Säule (3 Inch · 6 Inch) aus Silicagel (Flashchromatographie, EM 230-400 mesh) aufgebracht. Die Säule wurde anschließend nacheinander mit 200 ml 3 : 97 Volumenteilen Methanol: Methylenchlorid, 500 ml 1 : 9 Volumenteilen Methanol: Methylenchlorid und 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiert, bis das gewünschte Produkt aus der Säule eluiert war. Die Fraktionen des gewünschten Produkts wurden aufgenommen, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei sich 3,6 g des gewünschten Produkts ergaben.
In dieser Umsetzung wurden alle Lösungsmittel mindestens 15 Minuten vor der Verwendung mit Stickstoff entgast.

Herstellung von d,l-meta-(Methyldithioethylthio)methamphetamin

Eine Lösung von 89 mg (1,29 mmol) Natriumnitrit in 1,14 ml Wasser wurde bei -5º bis 0º während einer Dauer von 1 Stunde zu 211 mg (1,3 mmol) d,l-meta-Aminomethamphetamin, das in einem Gemisch aus 0,306 ml konzentrierter Schwefelsäure und 20 ml Wasser gelöst war, gegeben. Nach weiteren 0,5 Stunden wurde die vollständige Umsetzung durch DC eines aliquoten Teils des Reaktionsgemisches, welcher vor dem Tüpfeln auf DC basisch gestellt wurde, beobachtet.
539 µl 1,2-Dithioethan wurden zu dem entstandenen Diazoniumsalz gegeben, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von 10%iger NaOH bei Raumtemperatur auf 8,5 eingestellt. Nach 10 Minuten wurde ein kleiner aliquoter Teil entnommen und zu einer Lösung aus Essigsäureethylester und 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben. Die DC der Essigsäureethylesterphase (mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) zeigte einen neuen Fleck, der gelb wurde, wenn das Sprühreagens von Ellman verwendet wurde, und purpurbraun, wenn Ninhydrinspray verwendet wurde. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden 1,3 ml Methanthiosulfonsäuremethylester in 116 ml Methanol (durch Einleiten von Stickstoff entgast) zugegeben, und man ließ das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden rühren. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 3 eingestellt, und sie wurde zur Entfernung von nicht-basischer Thiolverbindung mit Ether extrahiert. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde auf 8,5 eingestellt, und die Lösung wurde mit Methylenchlorid extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde eingedampft, und das Rohprodukt wurde durch präparative Dickschichtchromatographie (mit Methanol:Methylenchlorid, 1 : 4, eluiertes Silicagel) gereinigt. Die gewünschte Bande wurde aufgenommen und ausgewaschen, wobei sich 10 mg der Titelverbindung ergaben. Das NMR-Spektrum für dieses Produkt (in CDCl&sub3;-D&sub2;O) zeigt ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,2 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,4 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 2,67 ppm; ein Multiplett mit 7 Protonen bei 2,5-3,4 ppm und ein Multiplett mit 4 Protonen bei 7,4 ppm.

E. Herstellung von d,l-meta-(β-Mercaptoethylthio)methamphetamin

7,1 mg (0,046 mmol) Dithioerythrit und 6,8 µl Triethylamin wurden unter Stickstoff bei Raumtemperatur zu 14 mg (0,049 mmol) d,l-meta-(Methyldithioethylthio)methamphetamin (auf ähnliche Art und Weise wie in den Stufen A-D dieses Beispiels 4 hergestellt), das in 1 ml Methanol gelöst war, gegeben. Nach 2 Stunden wurde die Bildung des Mercaptoprodukts mit DC (mit 1 : 4 Volumenteilen Methanol:Methylenchlorid eluiertes Silicagel) beobachtet. Die Lösung wurde anschließend bei Raumtemperatur und reduziertem Druck eingedampft, wobei sich die Titelverbindung ergab.
In diesem Beispiel wurden alle verwendeten Lösungsmittel zuerst mit Stickstoff entgast.

5. Herstellung von d,l-meta-(β-Mercaptoethoxy)amphetamin

A. Herstellung von Methyldithioethylchlorid

Eine Lösung von 6 g (0,0396 mol) Methanthiolsulfonsäuremethylester in 10 ml Methanol (durch mindestens 10-minütiges Einleiten von Stickstoff entgast) wird tropfenweise zu einer Lösung von 3,8 g (0,0396 mol) 2-Chlorethanthiol in 10 ml Methanol (ebenfalls durch mindestens 10-minütiges Einleiten von Stickstoff entgast) gegeben. Nach der Zugabe läßt man die entstandene Lösung bei Raumtemperatur rühren, bis die Umsetzung beendet ist. Die Lösung wird anschließend eingedampft, und das Titelprodukt wird durch Chromatographie gereinigt.

B. Herstellung von meta-(Methyldithioethoxy)phenylaceton

0,46 g Kaliumcarbonat werden unter Stickstoff bei 0º zu 3,0 g meta-Hydroxyphenylaceton (wie in Stufe A von Beispiel 1 hergestellt) in 200 ml N,N-Dimethylformamid gegeben. Nach der Zugabe läßt man das System auf Raumtemperatur erwärmen und rührt [bis das gesamte Natrium gelöst ist]. An diesem Punkt werden 2,84 g Methyldithioethylchlorid, das in 10 ml N,N-Dimethylformamid gelöst ist, tropfenweise zu dem System gegeben. Nach der vollständigen Zugabe des Methyldithioethylchlorids wird das Reaktionsgemisch bis zur Beendigung der Umsetzung bei Raumtemperatur gerührt. An diesem Punkt wird das Lösungsmittel abgedampft, und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei sich die Titelverbindung ergibt.

C. Herstellung von d,l-meta-(Methyldithioethoxy)amphetamin

3,85 g (0,05 mol) Ammoniumacetat werden bei Raumtemperatur unter Stickstoff zu einer Lösung von 2,2 g (0,01 mol) meta- (Methyldithioethoxy)phenylaceton in 70 ml Methanol (durch 15- minütiges Einleiten von Stickstoff entgast) gegeben. Nach 0,5 Stunden werden 724,5 mg (0,0115 mol) Natriumcyanoborhydrid unter Stickstoff in das System gegeben. Nachdem die Umsetzung beendet ist, wird zur Einstellung des pH-Wertes des Systems auf etwa 4,5 langsam Eisessig zugegeben. Das entstandene Produkt wird zur Entfernung des Methanols unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingeengt, und 3,3 g Natriumchlorid und 16 ml Wasser werden zu der so erhaltenen Lösung gegeben. Die entstandene Lösung wird anschließend unter Verwendung von Methylenchlorid extrahiert, und die entstandene Methylenchloridlösung wird über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird anschließend eingedampft, und der Rückstand wird durch Chromatographie gereinigt, wobei sich die Titelverbindung ergibt.

D. Herstellung von d,l-meta-(β-Mercaptoethoxy)amphetamin

15,4 mg (0,1 mmol) Dithioerythrit (DTE) in 1 ml Methanol (mit Argon entgast) und anschließend 13,3 µl Triethylamin werden unter Argon zu 25,7 mg (0,1 mmol) d,l-meta-(Methyldithioethoxy)amphetamin in 0,7 ml Methanol (mit Argon entgast) gegeben. Das System wird bis zur Beendigung der Umsetzung gerührt, und anschließend wird das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wird in 1,3 ml Methanol (mit Argon entgast) gelöst, und das Lösungsmittel wird erneut abgedampft. Das entstandene Produkt wird dann unter reduziertem Druck unter Verwendung einer Vakuumpumpe bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich die Titelverbindung ergibt.

6. Herstellung von d,l-para-(Carboxymethoxy)-N-trifluoracetylmethamphetamin

A. Herstellung von d,l-para-(Methylcarboxymethoxy)-N- trifluoracetylamphetamin

Ein Gemisch aus 0,5 g N-Trifluoracetyl-para-hydroxyamphetamin (durch Umsetzung von para-Hydroxyamphetamin entweder als freie Base oder als Hydrobromidsalz mit Trifluoressigsäureanhydrid hergestellt), 1,5 g wasserfreiem Kaliumcarbonat, 1 ml Chloressigsäuremethylester und 30 ml trockenem Aceton wurde über Nacht unter Feuchtigkeitsausschluß unter Rückfluß erhitzt. Das gekühlte Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde eingedampft, wobei sich eine kristalline Masse ergab. Die Umkristallisation aus Chloroform-Hexan ergab 555 mg der Titelverbindung in Form,, von langen Nadeln. Das NMR-Spektrum dieses Produkts (in CDCl&sub3;) zeigte ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,3 ppm; ein Dublett mit 2 Protonen bei 2,8 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 3,9 ppm; ein Singluett mit 2 Protonen bei 4,7 ppm; ein breites Signal mit 1 Proton mit dem Zentrum bei 6,4 ppm und ein Dublett von Dubletts mit 4 Protonen bei 7,0 ppm.

B. Herstellung von d,l-para-(Methylcarboxymethoxy)-N- trifluoracetylmethamphetamin

112 mg (2 mmol) Kaliumhydroxid wurden zu einem unter Rückfluß erhitzten Gemisch aus 160 mg (0,5 mmol) para- (Methylcarboxymethoxy)-N-trifluoracetylamphetamin und 285 mg (2 mmol) Methyliodid in 5 ml trockenem Aceton gegeben. Das Erhitzen wurde 8 Minuten fortgesetzt. 2 ml Essigsäure wurden zu dem gekühlten (Eis) Reaktionsgemisch gegeben, und das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft. Der Rückstand wurde durch präparative Dickschichtchromatographie (mit Ether eluierte Kieselsäure) gereinigt, wobei sich 95 mg der Titelverbindung ergaben. Das NMR-Spektrum dieses Produkts zeigte ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,3 ppm; ein Multiplett mit 5 Protonen bei 3,0 ppm; ein Singulett mit 3 Protonen bei 3,9 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 4,7 ppm und ein Multiplett mit 4 Protonen bei 7,1 ppm.

C. Herstellung von d,l-para-(Carboxymethoxy)-N- trifluoracetylmethamphetamin

1 g rohes para-(Methylcarboxymethoxy)-N-trifluoracetylmethamphetamin wurde mit 30 ml 1 N NaOH gemischt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 80º gehalten. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, der braune Rückstand wurde in 2 N HCl aufgenommen, und die klare Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft. Der gut getrocknete (P&sub2;O&sub5;) Rückstand wurde mit 2 · 50 ml siedendem Isopropanol extrahiert, und die braune Lösung wurde mit Norit behandelt und filtriert. Das Abdampfen des Lösungsmittels ließ ein hellbraunes Öl zurück, das mit 20 ml Trifluoressigsäureanhydrid gemischt wurde, und das Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Das Abdampfen des Lösungsmittels ließ einen gummiartigen Rückstand zurück, der mit siedendem Wasser behandelt und anschließend mit Ether extrahiert wurde. Der Ether wurde getrocknet und abgedampft, wobei sich 600 mg des Titelprodukts ergaben. Das NMR-Spektrum dieses Produkts in CDCl&sub3; zeigte ein Dublett mit 3 Protonen bei 1,2 ppm; ein Multiplett mit 5 Protonen bei 2,8 ppm; ein Singulett mit 2 Protonen bei 4,6 ppm; ein Multiplett mit 4 Protonen bei 7,0 ppm und ein Singulett mit 1 Proton bei > 8,0 ppm.

KONJUGATE

7. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin an KLH

A. Herstellung von Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester

8,28 g (0,072 mol) N-Hydroxysuccinimid und 14,9 g (0,072 mol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu einer Lösung von 10 g (0,072 mol) Bromessigsäure in 255 ml trockenem Tetrahydrofuran (über einem Molekularsieb mit 3 Å getrocknet) gegeben, und man ließ die entstandene weiße Suspension bei Raumtemperatur über Nacht rühren. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde anschließend bis zur Trockene eingedampft, wobei sich roher Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester ergab. Der entstandene Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde dann in einer minimalen Methylenchloridmenge bei Raumtemperatur gelöst, und Hexan wurde zugegeben, bis eine Trübung eintrat. Das entstandene Produkt wurde bei 5ºC über Nacht gekühlt, wobei sich 12 g umkristallisierter Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester ergaben.

B. Herstellung von Bromacetyl-KLH

Man ließ eine Suspension von 618 mg KLH in 60 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,5, 0,1 M Natriumchlorid) bei 5ºC 2 Stunden rühren. Zur Einstellung des pH-Wertes des Systems auf 10 wurde ausreichend 1 N NaOH-Lösung zu dem trüben Gemisch gegeben. Man ließ das entstandene System bei 5ºC über Nacht rühren und zentrifugierte anschließend 10 Minuten mit 8000 Umdrehungen pro Minute (UpM) bei 4ºC. Der Überstand wurde dekantiert, und der pH-Wert dieser Lösung wurde unter Verwendung von 1 N HCl auf 8,5 eingestellt. 267 mg Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester (in Stufe A dieses Beispiels 7 hergestellt), der in 3 ml N,N- Dimethylformamid gelöst war, wurden bei 5ºC während einer Dauer von 30 Minuten zu dieser Lösung gegeben, während der pH-Wert bei 8 gehalten wurde. Das entstandene Konjugat wurde bei 5ºC 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde die Lösung unter Verwendung einer Diaflo®-Ultrafiltrationsmembran (PM 10, 43 mm - von Amicon Corporation, Scientific Systems Division, Danvers, MA. erhältlich) auf 30 ml eingeengt und dann durch Sephadex®G50 (unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, eluiert) geleitet. Die Proteinfraktionen wurden vereinigt, wobei sich eine Lösung des Titelprodukts ergab.

C. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin an KLH

Eine Lösung von 20 mg (0,130 mmol) Dithioerythrit in 127 Htl Methanol und anschließend 19,3 µl Triethylamin wurden unter Argon zu 41,4 mg (0,132 mmol) d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)amphetamin (in Stufe F von Beispiel 1 hergestellt) in 5 ml Methanol gegeben. Anschließend ließ man die entstandene Lösung bei Raumtemperatur 2 Stunden rühren. Das Lösungsmittel wurde dann bis zur Trockene abgedampft, und anschließend wurde eine zusätzliche Methanolmenge zugegeben. Das Lösungsmittel wurde erneut abgedampft, und das entstandene Produkt wurde anschließend unter reduziertem Druck unter Verwendung einer Vakuumpumpe bei Raumtemperatur getrocknet, wobei sich d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin als öliges Produkt ergab. Dieses Produkt wurde dann in N,N-Dimethylformamid gelöst, und anschließend zu der gesamten, in Stufe B dieses Beispiels 7 hergestellten Bromacetyl-KLH-Lösung gegeben. Nach 72 Stunden wurde dann das entstandene Konjugat unter Verwendung einer Diaflo®-Ultrafiltrationsmembran (PM 10, 43 mm) auf 30 ml eingeengt und anschließend durch Sephadex®G50 (unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,1 M Natriumchlorid eluiert) geleitet. Die Proteinfraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung von 3 · 2 l Wasser-Ammoniak dialysiert und lyophilisiert, wobei sich 402 mg des Konjugats aus KLH und d,l-meta-(Thioethylamidomethoxy)amphetamin mit einer Haptenzahl von 1024 ergaben. (Alle in dieser Stufe C verwendeten Lösungsmittel wurden durch 15-minütiges Einleiten von Argon vor der Verwendung entgast.)
Die Haptenzahl des Konjugats aus KLH und d,l-meta- (Thioethylamidomethoxy)amphetamin wurde durch den Vergleich der UV-Extinktion mit einem mechanischen Gemisch aus d,l-meta- (Methyldithioethylamidomethoxy)amphetamin und nicht konjugiertem KLH in 0,01 N NaOH bei λ = 276 nm berechnet.

8. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin an KLH

A. Herstellung von Bromacetyl-KLH

Eine Lösung von 200 mg Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester (in Stufe A von Beispiel 7 hergestellt) in 2,25 ml trockenem N,N-Dimethylformamid wurde während einer Dauer von 40 Minuten bei einem pH-Wert von 8 und bei 5ºC zu 463 mg KLH in 45 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,5, 0,1 M Natriumchlorid) gegeben. Man ließ die entstandene Lösung über Nacht bei 5ºC rühren und leitete sie anschließend durch Sephadex®G50 (unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,1 M Natriumchlorid eluiert). Die Proteinfraktionen wurden vereinigt, wobei sich eine Lösung der Titelverbindung ergab.

B. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin an KLH

d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin (in Stufe B von Beispiel 2 hergestellt) in 2 ml N,N-Dimethylformamid wurde zu dem in der vorangehenden Stufe A hergestellten Bromacetyl-KLH gegeben. Man ließ die entstandene Lösung bei 5ºC 48 Stunden rühren. Das entstandene Konjugat wurde anschließend unter Verwendung einer Diaflo®-Ultrafiltrationsmembran (PM 10, 43 mm) auf 30 µl eingeengt, dann durch Sephadex®G25 (unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8 eluiert) geleitet und anschließend gegen wäßriges Ammoniumhydroxid (pH 8) dialysiert. Das Konjugat wurde dann lyophilisiert, wobei sich 268 mg des Konjugats aus KLH und d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin mit einer Haptenzahl von 612 ergaben.
Die Haptenzahl des Konjugats aus KLH und d,l-meta- (Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin wurde durch den Vergleich der UV-Extinktion mit einem mechanischen Gemisch aus dem nicht konjugierten KLH und d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)methamphetamin in 0,1 N NaOH bei λ = 276 nm berechnet.

9. Konjugation von d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin an Bromacetylglycin-KLH

A. Herstellung von Bromacetylglycin-KLH

Eine Lösung von Bromessigsäureglycin-N-hydroxysuccinimidester (durch Umsetzung von 0,121 g Bromacetylglycin, 0,150 g Dicyclohexylcarbodiimid und 0,084 g N-Hydroxysuccinimid in 5 ml N,N-Dimethylformamid über Nacht bei Raumtemperatur und anschließendes Filtrieren der Lösung durch Glaswolle in die KLH-Lösung hergestellt) wurde tropfenweise zu 1 g 60,5%igem KLH in 0,1 M Natriumcarbonat und Natriumhydrogencarbonat bei einem pH-Wert von 8,5 gegeben. Die Zugabe wurde mit einem pH- Meter überwacht, und der pH-Wert wurde wie erforderlich eingestellt, um ihn zwischen 8 und 8,5 zu halten. Nach der Beendigung der Zugabe wurde der pH-Wert 20 Minuten bei 8 gehalten und anschließend durch die Zugabe von 0,1 N HCl auf 7 eingestellt. Das entstandene Produkt wurde durch Sephadex®G50 (mit destilliertem Wasser eluiert) geleitet, und die Proteinfraktionen wurden vereinigt, wobei sich eine Lösung der Titelverbindung ergab.

B. Konjugation von d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin an Bromacetylglycin-KLH

i) Herstellung von d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin

23,7 mg d-para-(Methyldithioethylamidomethyl)methamphetamin wurden mit 10,5 mg Dithioerythrit in 2,5 ml Methanol (durch Vakuum entgast und anschließend fünfmal mit Argon gespült) vereinigt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 5 µl Triethylamin zugegeben. Die Umsetzung lief 2 Stunden ab, und DC zeigte die Beendigung der Umsetzung (Besprühen mit Ellmans Reagens ergab einen gelben Fleck). Die Lösung wurde eingeengt, und der Rückstand wurde 3 Stunden unter Hochvakuum gehalten, wobei sich dpara-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin ergab.

ii) Konjugation

Das gesamte, vorangehend in i) hergestellte d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin wurde in 2 ml N,N-Dimethylformamid (mit Argon entgast) gelöst, und die entstandene Lösung wurde tropfenweise zu 25 ml einer Bromacetylglycin-KLH- Lösung (die dadurch hergestellt wurde, daß die ausreichende Menge der in der vorangehenden Stufe A hergestellten Bromacetylglycin-KLH-Lösung zur Bereitstellung von 200 mg (15 ml) Konjugat verwendet wurde, zu dieser Lösung 10 ml 0,2 M Phosphatpuffer gegeben wurden, und anschließend die entstandene Lösung mit Argon entgast) gegeben. Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von 0,1 N HCl wie erforderlich zwischen 7,0 und 7,2 gehalten. Anschließend wurde das System durch Sephadex®G50 (mit destilliertem Wasser, pH 7, eluiert) filtriert. Die Proteinfraktionen wurden vereinigt und anschließend lyophilisiert, wobei sich das Konjugat von d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin an Bromacetylglycin-KLH ergab, das eine Haptenzahl von 186 aufwies.
Die Haptenzahl dieses Konjugats wurde durch die Umsetzung des Bromacetylglycin-KLH-Konjugats mit Ellmans Reagens und den anschließenden Vergleich der UV-Extinktion der entstandenen Verbindung mit freiem KLH, welcher zeigte, daß 186 Bromacetylglycine an KLH gebunden waren, bestimmt. Da das d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin in der vorangehenden Konjugationsreaktion in deutlichem Überschuß zu dem Bromacetylglycin- KLH verwendet wurde, vermutete man, daß alle Bromatome an dem Bromacetylglycin-KLH-Konjugat mit d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin reagieren, und folglich die Haptenzahl des entstandenen Produkts dieselbe wie die Haptenzahl für das Bromacetylglycin-KLH ist.

10. Konjugation von d,l-meta-(β-Mercaptoethylthio)methamphetamin an KLH

d,l-meta-(β-Mercaptoethylthio)methamphetamin (in Stufe E von Beispiel 4 hergestellt) wurde bei 0-5ºC zu Bromacetyl-KLH (gemäß Stufe A von Beispiel 8 hergestellt) in einer Lösung aus 10 ml N,N-Dimethylformamid und 45 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7) gegeben, und das System wurde über Nacht bei 5ºC gerührt. Anschließend wurden 35 µl Mercaptoethanol zu dem Konjugat gegeben, und man ließ das System bei Raumtemperatur 1 Stunde stehen. Das entstandene Konjugat wurde durch Sephadex®G25 (mit einer wäßrigen Ammoniumhydroxidlösung, pH 8,5, eluiert) geleitet. Die Proteinfraktionen wurden vereinigt, fünfmal gegen 4 l Wasser (NH&sub4;OH, pH 8) dialysiert und lyophilisiert, wobei sich 46,6 mg des Titelprodukts mit einer Haptenzahl von 494 ergaben.
Die Haptenzahl des Konjugats aus KLH und d,l-meta-(β- Mercaptoethylthio)methamphetamin wurde durch den Vergleich der UV-Extinktion mit einem mechanischen Gemisch aus d,l-meta-(Methyldithioethylthio)methamphetamin und nicht konjugiertem KLH in 0,05 N NaOH bei λ = 282 nm bestimmt.

11. Konjugation von d,l-para-(Carboxymethoxy)methamphetamin an BSA

Trockenes Triethylamin wurde zu einer in einem Eis-Salz- Bad ( 10&sup0;c) gekühlten Lösung von 350 mg (1,1 mmol) d,l-para- (Carboxymethoxy)-N-trifluoracetylmethamphetamin in trockenem N,N-Dimethylformamid gegeben, und nach 2-minütigem Rühren wurde Isobutylchlorformiat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei -10ºC bis -6ºC und 15 Minuten bei 0ºC gerührt. Das so erhaltene gemischte Anhydrid wurde unter schnellem Rühren zu einer Lösung von 1 g BSA in einem in Eis gekühlten Gemisch aus Wasser, Natriumhydrogencarbonat und Methanol gegeben. Die klare Lösung wurde über Nacht bei 0ºC gehalten. Piperidin wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei 0ºC 2 Stunden gerührt (dies entfernt die Trifluoracetyl-Schutzgruppe). Das Konjugat wurde durch Dialyse gereinigt (4 Tage). Die Ausbeute der Titelverbindung mit einer Haptenzahl von 9 betrug 700 mg.
Die Haptenzahl des Konjugats aus BSA und d,l-para- (Carboxymethoxy)methamphetamin wurde durch den Vergleich der UV-Extinktion mit einem mechanischen Gemisch aus d,l-para- (Carboxymethoxy)methamphetamin und nicht konjugiertem BSA in 0,1 N NaOH bei λ = 290 nm bestimmt.

12. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin an G6PDH

A. Vorbehandlung der G6PDH-Ammoniumsulfatsuspension

20 ml G6PDH-Ammoniumsulfatsuspension mit 9,98 mg/ml wurden 20 Minuten mit 10000 UpM (Sorvall RC-5B) zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und das verbliebene Enzym wurde in 20 ml Puffer (1% RSA und 0,9% Natriumchlorid in einer Pufferlösung mit 0,055 M Tris, 0,005% Thimerosol und 0,5% NaN&sub3; bei einem pH-Wert von 8 - nachstehend "Puffer A") gelöst,. Diese Lösung wurde anschließend gegen 3 Wechsel des Puffers A (jeweils 4,0 l) dialysiert. Das Endvolumen der Enzymzubereitung betrug bei einer Konzentration von 3,7 mg/ml 45 ml.

B. Konjugation von G6PDH an Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester zur Bildung von Bromacetyl-G6PDH

1800 mg G6P-Dinatriumsalz und 1800 mg NADH wurden bei 4ºC zu 166 mg G6PDH in 45 ml Puffer A gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8,02 eingestellt. Ein aliquoter Teil von 10 µl wurde anschließend entnommen, und die Enzymaktivität wurde bestimmt. 130 mg Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester (in Stufe A von Beispiel 7 hergestellt) wurden in 2,62 ml trockenem N,N-Dimethylformamid gelöst. Unter Verwendung einer Hamilton- Spritze für 100 µl wurden aliquote Teile des Bromessigsäure-N- hydroxysuccinimidesters zu der Lösung gegeben, und die Enzymaktivität wurde nach jeder Zugabe bestimmt. 77% des Enzyms wurden durch die Zugabe einer Gesamtmenge von 45 mg Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester inaktiviert, und das Konjugationsverfahren wurde beendet. Das Produkt wurde anschließend gegen 2 Wechsel von 4,0 l entgastem, mit Argon gespültem Puffer A dialysiert, wobei sich eine Lösung der Titelverbindung ergab. Die Dialyse führte bei Korrektur des Volumens zu keinem Verlust der Enzymaktivität.

C. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin an Bromacetyl-G6PDH

Alle in der folgenden Umsetzung verwendeten Lösungen wurden zuerst mit Argon gespült. Eine Lösung von 0,433 mmol Dithioerythrit und 60 µl Triethylamin in 1,0 ml Methanol wurde unter Argon zu 135 mg (0,433 mmol) d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)amphetamin (in Stufe F von Beispiel 1 hergestellt) in 1,0 ml Methanol gegeben. Das System wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wurde ein aliquoter Teil entnommen und auf DC (mit Methanol:Methylenchlorid 1 : 4 eluiertes Silicagel) getüpfelt. Sie zeigte die Bildung der Sulfhydrylverbindung, wenn die DC-Platte unter Verwendung von Ellmans Reagens besprüht wurde (gelber Fleck). Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft, und eine zusätzliche Menge von 1 ml Methanol wurde zugegeben, und das Lösungsmittel wurde erneut abgedampft. Das entstandene Produkt wurde unter reduziertem Druck unter Verwendung einer Vakuumpumpe 1 Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Das entstandene d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin wurde in 0,5 ml N,N-Dimethylformamid (entgast, trocken) gelöst, welches zu der Lösung von Bromacetyl-G6PDH (in Stufe B dieses Beispiels 12 hergestellt und mit Argon gespült) gegeben wurde, und das System reagierte über Nacht bei 4º. Eine Sephadex®G25-Säule (5 · 60 cm, Bettvolumen 300 ml) wurde mit 1000 ml Puffer A äquilibriert. Das Reaktionssystem wurde auf die Säule aufgebracht, und die Proteinfraktionen wurden vereinigt. Die vereinigen Fraktionen wurden gegen 3 Wechsel des Puffers A (jeweils 6,0 l) dialysiert, wobei sich eine Lösung des Titelkonjugats ergab. Dieses Konjugat wies eine 81%ige Hemmung des Enzyms auf, wenn es mit dem monoklonalen Anti-Amphetamin-Antikörper 26H8-AMPH kombiniert wurde.

13. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin an G6PDH

A. Vorbehandlung der G6PDH-Ammoniumsulfatsuspension

20 ml G6PDH-Ammoniumsulfatsuspension mit 9,98 mg/ml wurden 20 Minuten mit 10000 UpM (Sorvall RC-SB) zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und das verbliebene Enzym wurde in 20 ml Puffer A gelöst. Diese Lösung wurde gegen 3 Wechsel des Puffers A (jeweils 4,0 l) dialysiert. Das Endvolumen der Enzymzubereitung betrug bei einer Konzentration von 3,7 mg/ml 45 ml.

1600 mg G6P-Dinatriumsalz und 1800 mg NADH wurden bei 4ºC zu 200 mg G6PDH in 40 ml Puffer A gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8,0 eingestellt. Ein aliquoter Teil von 10 µl wurde anschließend entnommen, und die Enzymaktivität wurde bestimmt. 50 mg Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester (in Stufe A von Beispiel 7 hergestellt) wurden in 1,0 ml trockenem N,N- Dimethylformamid gelöst. Unter Verwendung einer Hamilton- Spritze für 100 µl wurden aliquote Teile des Bromessigsäure-N- hydroxysuccinimidesters zu der Lösung gegeben, und die Enzymaktivität wurde nach jeder Zugabe bestimmt. 66% des Enzyms wurden durch die Zugabe einer Gesamtmenge von 30 mg Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester inaktiviert, und das Konjugationsverfahren wurde beendet. Das Produkt wurde anschließend gegen 2 Wechsel von 4,0 l entgastem, mit Argon gespültem Puffer A dialysiert. Die Dialyse führte bei Korrektur des Volumens zu keinem Verlust der Enzymaktivität.

C. Konjugation von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin an Bromacetyl-G6PDH

Alle in der dieser Umsetzung verwendeten Lösungen wurden zuerst mit Argon gespült. Eine Lösung von 0,354 mmol Dithioerythrit und 57 µl Triethylamin in 1,0 ml Methanol wurde unter Argon zu 120 mg (0,368 mmol) d,l-meta-(Methyldithioethylamidomethoxy)methamphetamin (in Stufe A von Beispiel 2 hergestellt) in 1,0 ml Methanol gegeben. Das System wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wurde ein aliquoter Teil entnommen und auf DC (mit Methanol:Methylenchlorid 1 : 4 eluiertes Silicagel) getüpfelt. Sie zeigte die Bildung der Sulfhydrylverbindung, wenn die DC-Platte unter Verwendung von Ellmans Reagens besprüht wurde (gelber Fleck). Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft, und eine zusätzliche Menge von 1 ml Methanol wurde zugegeben, und das Lösungsmittel wurde erneut abgedampft. Das entstandene Produkt wurde unter reduziertem Druck unter Verwendung einer Vakuumpumpe 1 Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Das entstandene d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin wurde in 1,0 ml N,N-Dimethylformamid (entgast, trocken) gelöst, welches zu der Lösung von Bromacetyl-G6PDH (in Stufe B dieses Beispiels 13 hergestellt und mit Argon gespült) gegeben wurde, und das System reagierte über Nacht bei 40 Eine Sephadex®G25-Säule (5 · 60 cm, Bettvolumen 300 ml) wurde mit 1000 ml Puffer A äquilibriert. Das Reaktionssystem wurde auf die Säule aufgebracht, und die Proteinfraktionen wurden vereinigt. Die vereinigen Fraktionen wurden gegen 3 Wechsel des Puffers A (jeweils 6,0 l) dialysiert, wobei sich eine Lösung des Titelkonjugats ergab. Dieses Konjugat wies eine 65%ige Hemmung des Enzyms auf, wenn es mit dem monoklonalen Anti-Methamphetamin-Antikörper 10E12-METH kombiniert wurde.

14. Konjugation von d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin und d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)amphetamin an Bromacetylglycin-KLH

Auf ähnliche Art und Weise wie in den Verfahren, die in den vorangehenden Beispielen 12 und 13 angegeben sind, wurden d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin und d-para- (Mercaptoethylamidomethyl)amphetamin an G6PDH konjugiert. Die Mengen der in diesen Verfahren verwendeten Reagenzien waren folgende: Methamphetamin Amphetamin G6PDH G6P-Dinatriumsalz NADH Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester Dithioerythrit Triethylamin d-para-(Methyldithioethylamidomethyl)methamphetamin d-para-(Methyldithioethylamidomethyl)amphetamin Bromacetyl-G6PDH
Bei der Herstellung der Methamphetaminderivate führte die Konjugation mit Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester zur Bildung des Bromacetyl-G6PDH zu einer 62%igen Enzyminaktivierung, während bei der Herstellung der Amphetaminderivate die Konjugation mit Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester zur Bildung des Bromacetyl-G6PDH zu einer 83%igen Enzyminaktivierung führte. Die Konjugation zur Bildung des Konjugats aus d-para- (Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin und G6PDH führte zu einem Konjugat mit einer 72%igen Hemmung des Enzyms, wenn es mit dem monoklonalen Anti-Methamphetamin-Antikörper 10E12-METH kombiniert wurde, während die Konjugation zur Bildung des Konjugats aus d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)amphetamin und G6PDH zu einem Konjugat mit einer 70%igen Hemmung des Enzyms führte, wenn es mit dem monoklonalen Anti-Amphetamin-Antikörper 26H8-AMPH kombiniert wurde.

ANTIKÖRPER

15. Herstellung des als 26H8 bezeichneten monoklonalen Antikörpers für Amphetamin

A. 5 Mäuse (Balb/c) wurden mit 2 verschiedenen Immunogenen, d. h. dem Konjugat von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin an KLH ("Immunogen A" - im vorangehenden Beispiel 8 C hergestellt) und dem Konjugat von d,l-meta-(β-Mercaptoethylthio)methamphetamin an KLH ("Immunogen B" - im vorangehenden Beispiel 10 hergestellt), nach dem folgenden Schema immunisiert: Immunisierungg Immunogen Menge Adjuvans Verabreichung Immunogen A Immunogen B Gemisch aus Immunogen A und Immunogen B, 1:1
B. Am Ende dieses Immunisierungsschemas wurden die Mäuse getötet, und die Milz wurde entfernt und war für die Fusion mit Myelom-Zellen bereit. Die für alle Fusionen verwendete, ursprüngliche Myelomlinie war P3X63 Ag 8.653. Etwa 3-3,5 · 10&sup7; Myelomzellen pro Milz wurden 8 Minuten mit 800 UpM zentrifugiert, und anschließend in 20 ml DMEM erneut suspendiert. Die entfernte Milz wurde in kleine Stücke geschnitten, in einem Gewebehomogenisator, der 7 ml DMEM enthielt, vorsichtig zerkleinert, und dann zu den Myelomzellen gegeben. Die Zellsuspension wurde 8 Minuten mit 800 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde abgegossen. Die Zellen wurden in 2 ml 50%iger wäßriger Polyethylenglykollösung/Milz, die während einer Zeitdauer von 3 Minuten unter schwachem Schwenken zugegeben wurden, erneut suspendiert, anschließend wurde 1 ml DMEM/Milz während einer Zeitdauer von 1,5 Minuten zugegeben, und während einer Zeitdauer von zusätzlichen 1,5 Minuten wurden 5 ml Super DMEM/Milz zugegeben. Die Zellen wurden 8 Minuten mit 800 UpM zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen, und die Zellen wurden in HAT- Medium, etwa 100 ml/Milz, erneut suspendiert. Die fusionierten Zellen wurden anschließend in 4 bis 6 Platten mit 96 Vertiefungen pro Milz angelegt und in einen CO&sub2;-Brutschrank gegeben. Die Platten wurden am 7. Tag mit HAT-Medium, am 10. Tag mit HT-Medium ernährt und am 12. Tag untersucht.
C. Die erste Untersuchung der Fusion war ein umgekehrtes ELISA-Verfahren, das so aufgebaut war, daß der monoklonale Antikörper durch Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Serum an die Platte des Enzymimmunoassays (EIA) gebunden wird, und positive Vertiefungen durch ihre Fähigkeit ausgewählt werden, Enzymkonjugate des speziellen, in Frage kommenden Arzneistoffes zu binden. Die Fusion wurde anfänglich sowohl mit dem Konjugat von d,l-meta- (Mercaptoethylamidomethoxy)amphetamin an G6PDH (im vorangehenden Beispiel 12 C hergestellt und in diesem Beispiel als Enzymkonjugat bezeichnet) als auch mit dem Konjugat von d,l-meta- (Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin an G6PDH (im vorangehenden Beispiel 13 C hergestellt und in diesem Beispiel auch als Enzymkonjugat bezeichnet) untersucht. Positive aus diesen ersten Untersuchungen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen überführt, man ließ sie mehrere Tage wachsen und anschließend wurden sie durch einen umgekehrten kompetitiven ELISA, untersucht, in dem das Enzymkonjugat mit dem freien Arzneistoff, d. h. Amphetamin, Methamphetamin, und Arzneistoffen, wie Phenylpropanolamin, Pseudoephedrin, Ephedrin etc., um Antikörperbindungsstellen konkurrieren muß. Wenn die Enzymaktivität, die gemessen wurde, wenn der freie Arzneistoff vorlag, geringer war, als die, die beobachtet wurde, wenn nur das Enzymkonjugat vorlag, dann bindet der Antikörper vorzugsweise den freien Arzneistoff besser als die mit dem Enzym konjugierte Form. Die Untersuchung doppelter Platten unter Verwendung von Lösungen mehrerer verschiedener freier Arzneistoffe ergab einen Hinweis auf die relative Bevorzugung jedes Arzneistoffes. Ausgewählte Vertiefungen aus der kompetitiven Untersuchung wurden durch mindestens viermalige Reihenverdünnung kloniert, wobei die Klonierungsplatten durch den umgekehrten ELISA untersucht wurden; gelegentliche umgekehrte kompetitive ELISAs wurden verwendet, um mehr monoklonale Antikörper während des Klonierungsverfahrens auszuschließen.
Positive aus der ersten Untersuchung wurden auf einem Cobas-Bio-Analysengerät in der EMIT®-Assaykonfiguration ebenfalls auf die Hemmung der Enzymkonjugate und die Kreuzreaktivität mit Lösungen verschiedener freier Arzneistoffe geprüft. Ausgewählte monoklonale Antikörper wurden erneut auf die Modulation und Kreuzreaktivität geprüft und nicht mehr berücksichtigt.
D. Alle Zellen wurden kloniert, und man ließ sie in mit Makrophagen behandeltem Medium wachsen. Dieses Medium wurde durch die Injektion von 10 ml Super DMEM in die Bauchhöhle einer schmerzlos getöteten Maus hergestellt. Die Makrophagenzellen wurden durch das Punktieren der Außenseite der Höhle freigesetzt, das Medium wurde entnommen und zu 200 ml Super DMEM gegeben. Man ließ die Zellen 3-4 Tage in einem CO&sub2;-Brutschrank wachsen, und anschließend wurde das Medium zur Entfernung aller Zellen durch ein Filter mit 0,22 µm filtriert. Der Überstand wurde mit 350 ml zusätzlichem Super DMEM gemischt. Dieses entstandene "Makrophagen-behandelte" Medium wurde bei 40 aufbewahrt. Es wurde innerhalb eines Monats verwendet. Klonierte Linien wurden eingefroren, bei -100º in 10%igem DMSO (in Super DMEM) aufbewahrt und zur Erzeugung von Aszites ebenfalls Mäusen injiziert.
E. Die Unterklassen der monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung einer Reihe von Testsätzen zur Isotypisierung monoklonaler Mausantikörper, am häufigsten denjenigen von Southern Biotechnology und von Zymed, bestimmt. Alle basieren auf ELISA, der Kulturüberstand wurde verwendet, kund die Anweisungen des Herstellers wurden befolgt.
F. Die durch das vorangehende Verfahren hergestellten, für Amphetamin spezifischen monoklonalen Antikörper werden wie folgt bezeichnet: 1E7, 1G4, 2G4, 5F7, 5H11, 6D1, 8H10, 9A12, 13B6, 15F1, 23D2, 24A12, 26H8. Der monoklonale Antikörper 26H8 wird manchmal als 26H8-AMPH bezeichnet, um zu kennzeichnen, daß er für Amphetamin spezifisch ist. Die Isotypen dieser Antikörper sind µ, γ1, γ1, nicht bestimmt, γ&sub1;, γ&sub1;, γ&sub1;, γ&sub3;, , γ2a, nicht bestimmt, γ2a, γ&sub1; oder A beziehungsweise γ&sub1;.

16. Herstellung des als 10E12 bezeichneten monoklonalen Antikörpers für Methamphetamin

A. 2 Mäuse (Balb/c) wurden mit einem Konjugat von d,l-para- (Carboxymethoxy)methamphetamin an BSA ("Immunogen C" - im vorangehenden Beispiel 11 hergestellt) nach dem folgenden Schema immunisiert: Immunisierung Immunogen Menge Adjuvans Verabreichung
Die in den Stufen B bis D angegebenen Verfahren des vorangehenden Beispiels 15 wurden mit nur den folgenden Änderungen wiederholt:
In Stufe C wurde die Fusion anfänglich nur mit dem Konjugat eines Ligand-Analogons von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethoxy)methamphetamin an G6PDH untersucht.
Der durch das vorangehende Verfahren hergestellte, für Methamphetamin spezifische monoklonale Antikörper wird als 10E12 bezeichnet, wobei er manchmal als 10E12-METH bezeichnet wird, um zu kennzeichnen, daß er für Methamphetamin spezifisch ist. Der Isotyp dieses Antikörpers ist γ&sub1;, .

17. Herstellung des als 8G5 bezeichneten monoklonalen Antikörpers für Methamphetamin

A. 2 Mäuse (CB6F1) wurden mit einem Konjugat von d-para- (Thioethylamidomethyl)methamphetamin an KLH ("Immunogen D" - im vorangehenden Beispiel 14 hergestellt) nach dem folgenden Schema immunisiert: Immunisierung Immunogen Menge Adjuvans Verabreichung
Die in den Stufen B bis D angegebenen Verfahren des vorangehenden Beispiels 15 wurden mit nur den folgenden Änderungen wiederholt:
In Stufe C wurde die Fusion anfänglich nur mit dem Konjugat eines Ligand-Analogons von d-para-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin an G6PDH untersucht.
Die durch das vorangehende Verfahren hergestellten, für Methamphetamin spezifischen monoklonalen Antikörper werden als 6B6, 8C4 und 8G5 bezeichnet, wobei sie manchmal als 6B6-METH, 8C4-METH und 8G5-METH bezeichnet werden, um zu kennzeichnen, daß diese Antikörper für Methamphetamin spezifisch sind. Der Isotyp von 8G5 ist γ&sub1;, . Die Isotypen der anderen Antikörper wurden nicht bestimmt.

ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN

18. Immunoassay für Amphetamine in Urin-Proben

Ein Immunoassay für Amphetamine, der eine Zusammensetzung dieser Erfindung verwendete, wurde an Proben, die mit bekannten Konzentrationen von entweder d-Amphetamin oder d-Methamphetamin versetzt waren, durchgeführt. Zusätzlich zu den Proben verwendete dieser Immunoassay zwei Reagenzien, d. h. "Reagens A" und "Reagens B", die folgendes umfaßten:
Reagens A. Eine wäßrige Reagenslösung mit einem pH-Wert von 5,2, die folgendes enthielt:
0,055 M Tris; 0,005% Thimersol;
0,5% Natriumazid; 0,04 M NAD;
0,066 M G6P;
1% Sol-U-Pro (ein Protein mit einem Molekulargewicht von 1500 Dalton, das aus Schweinehaut hergestellt wurde (erhältlich von DynaGel Inc., Calumet City, Illinois 60409))
14,4 µg (pro 50 µl Reagens A) eines als 26H8-AMPH bezeichneten monoklonalen Anti-Amphetamin-Antikörpers; und
2,7 µg (pro 50 µl Reagens A) eines als 10E12-METH bezeichneten monoklonalen Anti-Methamphetamin-Antikörpers.
Reagens B. Eine wäßrige Reagenslösung mit einem pH-Wert von 8,01, die folgendes enthielt:
0,055 M Tris; 0,005% Thimersol;
0,5% Natriumazid; 0,9% Natriumchlorid;
1% Sol-U-Pro;
0,3 µg des Konjugats von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethyl)amphetamin an G6PDH (Rmax=505);
0,3 µg des Konjugats von d,l-meta-(Mercaptoethylamidomethyl)methamphetamin an G6PDH (Rmax=502).
Rmax bedeutet die maximale optische Dichte (Signal), die das signalerzeugende System unter den Assaybedingungen erzeugen kann. Rmax wird durch die Messung der optischen Dichte bestimmt, die durch das Vereinigen der vorgegebenen Menge jedes Konjugats mit den vorgegebenen Mengen der anderen Komponenten des signalerzeugenden Systems in Abwesenheit irgendeines monoklonalen Antikörpers erzeugt wird. Das Rmax jedes Konjugats ist additiv, und daher beträgt das gesamte Rmax der Lösung B 1007.

Vorschrift

17,5 µl jeder Probe wurden zuerst mit 17,5 µl Reagens A und dann 17,5 µl Reagens B vereinigt. Die entstandene Lösung wurde anschließend zu 262,5 µl Verdünnungsmittel (eine wäßrige Lösung, die durch die Zugabe von 15 Volumenteilen destilliertem Wasser zu 1 Volumenteil EMIT® Drug Assay Buffer 6A128, erhältlich von Syva Company, 900 Arastradero Road, Palo Alto, CA 94303, hergestellt wurde; nachstehend "Verdünnungsmittel A") gegeben, und das System wurde dann 15 Sekunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde dann die Extinktion des Systems gemessen, und eine anschließende Extinktionsmessung wurde 30 Sekunden später durchgeführt. Das zweite Ergebnis wurde von dem ersten Ergebnis subtrahiert, und diese Differenz wurde als die Änderung der optischen Dichte für die spezielle Lösung angenommen. Dieses Ergebnis wurde anschließend mit dem Ergebnis verglichen, das auf dieselbe Art und Weise unter Verwendung eines negativen Kalibrators, d. h. einer Lösung, die wie vorangehend hergestellt wurde, jedoch keine Amphetamine enthielt, sowie eines niedrigen (grenzwertigen) Kalibrators, d. h. einer Probe, die entweder 300 ng Amphetamin oder 1000 ng Methamphetamin enthielt, erhalten wurde. Dieser Assay wurde bei 320 durchgeführt. Das vorangehende Verfahren kann auf vollautomatisierten Geräten, wie dem ETSTM-Analysengerät von Syva, das von Syva Company, 900 Arastradero Road, Palo Alto, CA 94303 erhältlich ist, durchgeführt werden. In dem vorliegenden Beispiel wurden zwei verschiedene ETSTM-Analysengeräte verwendet. Wenn es nicht anders angegeben ist, führte das erste Gerät nur einen Einzelassay für jede Probe durch, während das zweite Gerät Doppelassays für jede Probe durchführte.
Wenn Amphetamin oder Methamphetamin in der Probe vorliegt, konkurriert in diesem Assay der Arzneistoff mit dem Konjugat aus dem entsprechenden Ligand-Analogon und dem Enzym um die Bindung an den entsprechenden monoklonalen Antikörper, und dies erhöht folglich die Menge an nicht gebundenem Konjugat. Dies führt zu einer Erhöhung der Enzymaktivität, da nicht gebundenes Konjugat eine größere Enzymaktivität als gebundenes Konjugat aufweist.
In diesem speziellen Assay wird die Änderung der Enzymaktivität in der Testlösung als die Änderung der optischen Dichte (Extinktion) bei einer Wellenlänge von 340 nm, wobei die Länge des Lichtweges 1 cm beträgt, dargestellt. Die Vorschrift für diesen Assay setzt fest, daß ein positives Ergebnis eine Änderung der optischen Dichte um mindestens 40 EMIT®-Assay-Einheiten erfordert. Das heißt, daß die Lösung als Amphetamin-negativ festgelegt wird, wenn die Änderung der optischen Dichte einer speziellen Testlösung weniger als 40 EMIT®-Assay-Einheiten beträgt, während die Lösung als Amphetamin-positiv festgelegt wird, wenn die Änderung der optischen Dichte einer speziellen Testlösung gleich oder größer als 40 EMIT®-Assay-Einheiten ist. Dies entspricht einem Amphetamingrenzwert von 300 ng/ml oder einem Methamphetamingrenzwert von 1000 ng/ml.
Die Ergebnisse dieses Tests für mit d-Amphetamin versetzte Proben sind folgende (+ = positives Ergebnis für die Anwesenheit von Amphetaminen; - = negatives Ergebnis für die Anwesenheit von Amphetaminen): Proben-Nr. Sollkonzentration ETSTM-Analysengerät Nr. 1 ETSTM-Analysengerät Nr. 2
Die Ergebnisse dieses Tests für mit d-Methamphetamin versetzte Proben sind folgende (+ und - sind wie vorangehend): Proben-Nr. Sollkonzentration ETSTM-Analysengerät Nr. 1 ETSTM-Analysengerät Nr. 2
* - Bei der ersten Analyse stimmten die Doppelbestimmungen nicht überein (eine war positiv und eine war negativ). Bei der Wiederholung der Analyse stimmten die Doppelbestimmungen als negativ überein.
** - Eine Wiederholung mit dieser Probe war positiv; drei zusätzliche Wiederholungen waren alle negativ.
Die vorangehenden Ergebnisse beweisen, daß die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von Amphetaminen nützlich sind.

19. Spezifität des Immmunoassays

Ein Immunoassay, der ähnliche Reagenzien verwendet, wie im vorangehenden Beispiel 18 angegeben, wurde zur Bestimmung der Spezifität dieses Immunoassays mit verschreibungspflichtigen und OTC-Arzneistoffen verwendet. Dieses Beispiel bestimmte, welche Arzneistoffkonzentration erforderlich war, um ein dem niedrigen (Grenzwert) Kalibrator entsprechendes Signal zu erzeugen. Man ließ die Proben auf zwei Geräten, d. h. einem Auto- CarouselTM-Analysengerät von Syva und einem ETSTM-Analysengerät von Syva (die beide von Syva Company, 900 Arastradero Road, Palo Alto, CA 94304 erhältlich sind), laufen. Das AutoCarouselTM- Analysengerät verwendet eine ähnliche Vorschrift wie das ETSTM- Analysengerät, außer daß es verschiedene Verdünnungsverhältnisse von der Probe zu den Reagenzien A und B zu dem Verdünnungsmittel A verwendet.
Die Ergebnisse dieser Tests zeigen die minimale Arzneistoffkonzentration, die zur Erzeugung eines Signals erforderlich ist, das dem niedrigen Kalibrator entspricht, d. h. ein positives Ergebnis für die Anwesenheit von Amphetamin. Diese Ergebnisse wurden mit einem EMIT®-Amphetamin-Assay des Standes der Technik verglichen, welcher einen polyklonalen Antikörper und ein einzelnes Konjugat aus einem Amphetamin-Ligand-Analogon und Glucose-6-phosphatdehydrogenase verwendete. Der EMIT®-Immunoassay des Standes der Technik wurde auf nur einem Analysengerät, d. h. einem AutoCarouselTM-Analysengerät, durchgeführt. Der Immunoassay nach dieser Erfindung wurde als "Immunoassay A" bezeichnet, während der Immunoassay des Standes der Technik (der einen polyklonalen Antikörper verwendet) als "Immunoassay B" bezeichnet wird. Die Ergebnisse sind folgende: Verbindung Immunoassay A AutoCarouselTM-Analysengerät (µg/ml) ETSTM-Analysengerät Immunoassay B 1-Ephedrin Phentermin Phenmetrazin Phenylpropanlamin Nylidrin Isoxsuprin Mephentermin * MDA = Methylendioxyamphetamin ** MDMA = Methylendioxymethamphetamin
Die vorangehenden Werte beweisen, daß der Immunoassay, der ein Verfahren und eine Zusammensetzung nach dieser Erfindung verwendet, verglichen mit einem Immunoassay, der ein Verfahren und eine Zusammensetzung nach dem Stand der Technik verwendet, eine größere Spezifität für Amphetamine als für bestimmte verschreibungspflichtige und OTC-Arzneistoffe aufweist. Im besonderen wurden deutlich verbesserte Werte für 1-Ephedrin, Phenylpropanolamin, Phenmetrazin, Nylidrin, Isoxsuprin und Mephentermin erhalten, während er eine geringere Spezifität für Phentermin, MDA und MDMA zeigte. Im Hinblick auf MDA und MDMA ist die Spezifität für diese Arzneistoffe jedoch eine Verbesserung gegenüber den Immunoassays des Standes der Technik insofern, als diese zwei Arzneistoffe einem Mißbrauch unterliegen können.
Die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung wurden weiter geprüft, um ihre verbesserte Spezifität gegenüber Zusammensetzungen und Verfahren des Standes der Technik zu beweisen. Im Hinblick darauf wurden einhundertfünfzig (150) Patientenproben erhalten. 50 Proben wiesen ausreichende Amphetaminkonzentrationen auf, so daß ein positives Ergebnis erwartet wurde; 50 Proben wiesen keine Konzentrationen von Amphetaminen oder von Substanzen auf, welche in einem EMIT®-Immunoassay des Standes der Technik positive Ergebnisse für Amphetamine ergaben, aber welche keine Amphetaminkonzentrationen aufwiesen (wie hier als "Amphetamin-negativ ohne Substanz" verwendet); 50 Proben wiesen Konzentrationen von Substanzen auf, welche in einem EMIT®-Immunoassay des Standes der Technik positive Ergebnisse für Amphetamine ergaben, aber welche keine Amphetaminkonzentrationen aufwiesen (wie hier als "Amphetamin-negativ mit Substanz" verwendet) und korrekterweise ein negatives Ergebnis für Amphetamine ergeben sollten. Der Immunoassay, der Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendete (Immunoassay "A"), wurde mit einem EMIT®-Immunoassay des Standes der Technik verglichen, weicher einen polyklonalen Antikörper und ein einzelnes Konjugat aus einem Amphetamin-Analogon und Glucose-6- phosphatdehydrogenase verwendete (Immunoassay "B"). Beide Immunoassays wurden auf einem Cobas-Bio-Analysengerät durchgeführt.
Der jeweils korrekt bestimmte prozentuale Anteil der Proben war folgender: Immunoassay Amphetamin-positiv Amphetamin-negativ mit Substanz ohne Substanz
In einem anderen Vergleich wurden einhundert (100) Patientenproben erhalten, von denen bestätigt wurde, daß sie in einer solchen Konzentration mit Amphetaminen verunreinigt waren, daß ein positives Ergebnis, Amphetamin-negativ mit Substanz oder Amphetamin-negativ ohne Substanz erwartet wurde. Die Verteilung der Proben war folgende: 48 Proben wiesen eine solche Amphetaminkonzentration auf, daß ein positives Ergebnis erwartet wurde, 13 Proben wiesen entweder eine niedrigere Amphetaminkonzentration als die auf, welche ein positives Ergebnis erwarten ließ, oder waren Amphetamin-negativ ohne Substanz, und 39 Proben waren Amphetamin-negativ mit Substanz. Der Immunoassay, der Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendete (Immunoassay "A"), wurde mit einem EMIT®-Immunoassay des Standes der Technik wie vorangehend (Immunoassay "B") verglichen. Beide Immunoassays wurden auf einem ETSTM-Analysengerät durchgeführt. Der in jeder Gruppe korrekt bestimmte prozentuale Anteil der Proben war folgender: Immunoassay Amphetamin-positiv Amphetamin-negativ mit Substanz ohne Substanz
Die vorangehenden Ergebnisse beweisen, die die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung eine deutlich verbesserte Spezifität gegenüber Verfahren und Zusammensetzungen des Standes der Technik aufweisen.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend mindestens zwei Konjugate, in welchen in einem Konjugat ein Enzym an ein Amphetamin- Ligand-Analogon gebunden ist und in dem anderen Konjugat ein Enzym an ein Methamphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist, wobei die Enzyme hinsichtlich ihrer signalerzeugenden Aktivität funktionell ähnlich zueinander sind; und eine wäßrige Lösung, die einen für Amphetamin spezifischen monoklonalen Antikörper und einen für Methamphetamin spezifischen monoklonalen Antikörper enthält; wobei jeder der Antikörper eine mäßige Kreuzreaktivität, die 80% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher jeder der Antikörper eine Kreuzreaktivität, die 60% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welcher jeder der Antikörper eine Kreuzreaktivität, die 50% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.

4. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, welche weiter umfaßt irgendwelche anderen erforderlichen Komponenten des signalerzeugenden Systems, wobei das Signalerzeugende System ein nachweisbares Signal erzeugen kann und die Signalmenge in Beziehung zur Menge an Amphetaminen in der Lösung steht.

5. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in welcher in beiden Konjugaten dasselbe Enzym eingesetzt wird.

6. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren für den Assay von Amphetaminen und/oder Methamphetaminen.

7. Verfahren für den Assay von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, umfassend:

A) die Vereinigung in einem wäßrigen Medium von (a) der Probe; (b) monoklonalem Antikörper, der für Amphetamin spezifisch ist, und monoklonalem Antikörper, der für Methamphetamin spezifisch ist; und (c) zwei Konjugaten, in welchen in einem Konjugat ein Enzym an ein Ligand-Analogon von Amphetamin konjugiert ist und in dem anderen Konjugat ein Enzym an ein Ligand-Analogon von Methamphetamin konjugiert ist, unter Bedingungen, die es den Antikörpern erlauben, sich an die Konjugate zu binden; wobei jeder der Antikörper eine mäßige Kreuzreaktivität, die 80% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird; und wobei diese Enzyme bezüglich ihrer signalerzeugenden Aktivität einander funktionell ähnlich sind;

B) das Kontaktieren der aus Stufe A erhaltenen Konjugate mit jedweden erforderlichen Komponenten des Signalerzeugenden Systems, mit oder ohne Abtrennung der gebundenen oder nicht gebundenen Konjugate aus dem aus Stufe A erhaltenen Medium, wobei ein Signal erzeugt wird, das zur Anwesenheit von Amphetaminen in der Probe in Beziehung steht; und

C) die Bestimmung des Signals und das In-Beziehung Setzen des Signals zur Anwesenheit von Amphetamin und/oder Methamphetamin in der Probe.

8. Verfahren nach Anspruch 6, in welchem die Enzyme Glucose- 6-phosphatdehydrogenase sind.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in welchem weder gebundene noch nicht gebundene Konjugate in Stufe B von dem Medium abgetrennt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in welchem entweder gebundene oder nicht gebundene Konjugate in Stufe B von dem Medium abgetrennt werden.

11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10, in welchem jeder der Antikörper eine Kreuzreaktivität, die 60% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.

12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 11, in welchem jeder der Antikörper eine Kreuzreaktivität, die 50% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.

13. Verbindung der folgenden Formel

worin

R für Wasserstoff oder Methyl steht;

X für Sauerstoff, Schwefel steht oder eine Bindung bedeutet;

R&sub1; Alkylen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;

R&sub2; Alkylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt; n 0 oder 1 ist;

R&sub3; Wasserstoff, -SR&sub4;, worin R&sub4; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, ist oder für (A)pZ steht, wobei A von einer Funktionalität abgeleitet ist, die mit einer Thiolgruppe unter Bildung einer Bindung zwischen dem Schwefelatom der Thiolgruppe und Z reagieren kann, und

Z eine Poly(aminosäure) ist;

p 1 ist, wenn R&sub3; für Wasserstoff oder -SR&sub4; steht, und eine Zahl von 1 bis zum Molekulargewicht der Poly(aminosäure), dividiert durch 500, ist, wenn R&sub3; für (A)pZ steht; mit der Maßgabe, daß wenn n 0 ist, R&sub1; Alkylen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und mit der weiteren Maßgabe, daß der Benzol-Ring in der meta- oder der para- Stellung zur Gruppe

steht, und wenn X eine Bindung ist, der Benzol-Ring in der para-Stellung gebunden ist.

14. Verbindung nach Anspruch 13, in welcher Z ein Enzym ist, vorzugsweise in welcher das Enzym Glucose-6-phosphatdehydrogenase ist.

15. Verbindung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, in welcher X für Sauerstoff steht; R&sub1; Methylen darstellt; n gleich 1 ist; und R&sub2; Ethylen ist.

16. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15 zur Verwendung in einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 oder in einem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12.

17. Testsatz zur Verwendung in einem Assay für Amphetamine in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, umfassend die folgenden Komponenten:

(a) monoklonalen Antikörper, der für Amphetamin spezifisch ist, und monoklonalen Antikörper, der für Methamphetamin spezifisch ist, wobei jeder dieser Antikörper eine mäßige Kreuzreaktivität, die 80% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird;

(b) zwei Konjugate, in welchen in einem Konjugat ein Enzym an ein Amphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist und in dem anderen Konjugat ein Enzym an ein Methamphetamin-Ligand-Analogon gebunden ist, wobei die Enzyme hinsichtlich ihrer signalerzeugenden Aktivität einander funktionell ähnlich sind.

18. Testsatz nach Anspruch 17, in welchem jeder der Antikörper eine Kreuzreaktivität, die 60% nicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.

19. Testsatz nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, in welchem jeder der Antikörper eine Kreuzreaktivität, die 50% dicht übersteigt, mit dem Konjugat aufweist, das stärker von dem anderen Antikörper gebunden wird.