CN104262486B - 杂交瘤细胞株fq‑2g3，其产生的抗甲基毒死蜱单克隆抗体及免疫层析试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及杂交瘤细胞株FQ‑2G3，该细胞株分泌的抗甲基毒死蜱单克隆抗体及检测甲基毒死蜱的免疫层析试纸条。杂交瘤细胞株FQ‑2G3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C2014106。其分泌产生的单克隆抗体可识别甲基毒死蜱，灵敏度高、特异性好。由该单克隆抗体研制的免疫层析试纸条可实现水、青菜和土壤中甲基毒死蜱的检测，对检测溶液中甲基毒死蜱含量的最低检测限可达12.5ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞株FQ-2G3，其分泌的抗甲基毒死蜱的单克隆抗体及检测甲基毒死蜱的免疫层析试纸条。
背景技术
甲基毒死蜱是一种广谱的有机磷杀虫剂，用于防止储藏谷物中的害虫和各种叶类作物上的害虫，也用来防治蚊成虫、蝇类、水生幼虫和卫生害虫，目前仍在广泛应用。其作用机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱是神经递质，过量的乙酰胆碱过度刺激乙酰胆碱受体，导致靶生物死亡。同时，由于环境和农产品中农药残留的增加，一些不是预定目标的生物也遭到了毒害，包括人、鱼等其他生物。
目前，农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法的检测限低、灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考，但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。
免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。要建立免疫检测方法，特别是针对农药小分子的免疫检测方法，筛选出高效单克隆抗体最为关键。本发明即为实现环境与农产品中甲基毒死蜱的免疫检测方法，化学合成针对甲基毒死蜱的多种半抗原，与载体蛋白结合成为免疫原或包被原，并筛选出能够分泌针对甲基毒死蜱的高效单克隆抗体的杂交瘤细胞株FQ-2G3。并利用该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体建立了针对环境与农产品中甲基毒死蜱的免疫层析试纸条检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供杂交瘤细胞株FQ-2G3，其分泌的抗甲基毒死蜱的单克隆抗体，及检测甲基毒死蜱的免疫层析试纸条。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
1.本发明提供的杂交瘤细胞株FQ-2G3，已于2014年5月30号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCCNO.C2014106。
2.抗甲基毒死蜱单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C2014106的杂交瘤细胞株FQ-2G3分泌产生。
3.上述杂交瘤细胞株FQ-2G3，是通过以下方法筛选得到：
3.1人工抗原的合成
通过化学合成手段合成甲基毒死蜱半抗原：O-甲基-O-(3，5，6-三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(H1)。利用活泼酯法将具有羧基末端的半抗原偶联到大分子蛋白质上(BSA或者OVA)。其中H1-BSA作为免疫原，H1-OVA作为包被原。
3.2杂交瘤细胞株的筛选
以100μg每只的抗原量免疫6-8周龄健康的雌性BALB/C小鼠。每次间隔时间为2-3周，最后一次加强免疫后3天，无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞以5∶1的细胞数量用PEG介导的方法融合。融合后置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养细胞长至培养孔1/3-1/2时，用间接竞争ELISA法筛选出效价高、抑制率高、细胞生长旺盛的培养孔进行亚克隆。经过3-5次亚克隆后，扩大培养，建立杂交瘤细胞株。
3.3单克隆抗体的制备
将获得的杂交瘤细胞株FQ-2G3注射预先用无菌石蜡油处理过的BALB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸铵法对收集的腹水进行纯化处理得到抗甲基毒死蜱单克隆抗体。
4检测甲基毒死蜱的免疫层析试纸条，它包括纸板，纸板的一面从上到下依次黏贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接；所述检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设置质控线和检测线；所述质控线包被有兔抗鼠IgG；所述检测线包被有甲基毒死蜱-鸡卵清白蛋白偶联物；所述金标垫喷涂有纳米金标记的抗甲基毒死蜱单克隆抗体，所述的抗甲基毒死蜱单克隆抗体为由杂交瘤细胞株FQ-2G3分泌产生的单克隆抗体。
5上述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，吸水垫长21mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；金标垫长5mm，宽4mm；样品垫长13mm，宽4mm，相邻各垫的交叠长度为1mm。
6上述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，检测线与硝酸纤维素膜上沿的距离为8.3mm，检测线与质控线间的距离为7.3mm。
7上述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，检测垫上检测线上所喷涂的甲基毒死蜱-鸡卵清白蛋白偶联物为516ng；质控线上所喷涂的兔抗鼠IgG为640ng。
8上述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，金标垫中所用的纳米金粒径为40nm；所述金标垫上所喷涂的金标记的抗甲基毒死蜱单克隆抗体为96ng。
9上述试纸条的结果评估：(1)阳性：待测样品检测试纸条的质控线显示出明显的红色线条，检测线不显色；(2)阴性：待测样品检测试纸条的质控线显示出明显的红色线条，检测线也显示出明显红色线条；(3)临界值：待测样品检测试纸条的质控线显示出明显的红色线条，检测线出现对比对照试纸条检测线颜色稍浅的红色线条。
有益效果
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体稳定性高：杂交瘤细胞冻存于液氮至少保持5年，抗体的稳定性也会比较好，纯化的抗体-20℃冰箱至少可以存放2年。
(2)本发明提供的单克隆抗体灵敏度高：本发明提供的抗甲基毒死蜱单克隆抗体对甲基毒死蜱的最低检测限可达12.5ng/mL。
Claims (7)
1.一种用于检测甲基毒死蜱的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO：C2014106的杂交瘤细胞株FQ-2G3产生。
2.产生权利要求1所述的用于检测甲基毒死蜱的单克隆抗体的杂交瘤细胞株FQ-2G3，于2014年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2014106。
3.检测甲基毒死蜱的免疫层析试纸条，其特征在于：它包括纸板，纸板的一面从上到下依次黏贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接；所述检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设置质控线和检测线；所述质控线包被有兔抗鼠IgG；所述检测线包被有甲基毒死蜱-鸡卵清白蛋白偶联物；所述金标垫喷涂有纳米金标记的抗甲基毒死蜱单克隆抗体，所述的抗甲基毒死蜱单克隆抗体为由权利要求2所述的杂交瘤细胞株FQ-2G3分泌产生的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长21mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；金标垫长5mm，宽4mm；样品垫长13mm，宽4mm，相邻各垫的交叠长度为1mm。
5.根据权利要求3所述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测线与硝酸纤维素膜上沿的距离为8.3mm，检测线与质控线间的距离为7.3mm。
6.根据权利要求3所述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上检测线上所喷涂的甲基毒死蜱-鸡卵清白蛋白偶联物为516ng；质控线上所喷涂的兔抗鼠IgG为640ng。
7.根据权利要求3所述的检测甲基毒死蜱免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金粒径为40nm；所述金标垫上所喷涂的金标记的抗甲基毒死蜱单克隆抗体为96ng。
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